CN111107860A - 脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的技术问题在于提供一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂。本发明提供一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其含有粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物。

Description

脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂
技术领域
本发明涉及一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其含有粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物。
背景技术
近年来，饮食生活变得丰富，结果由于热量摄入过剩且运动不足，患有代谢综合征的人急剧增加。代谢综合征也被称为“内脏脂肪症候群”，与脂质代谢异常、糖代谢紊乱等多种疾病或异常有关，其结果，导致动脉硬化、脂肪肝、高脂血症、肥胖症、高血压、糖尿病等症状及疾病的可能性高。
脂肪肝的主要原因为大量饮酒与营养过剩。不经饮酒而呈现出肝病症状的非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，以下也称为NAFLD)被轻视为良性疾病且不会进展，但其引起肝炎、肝硬化、肝癌等的例子增加，逐渐成为不能忽视的疾病。
为了预防或治疗这种代谢综合征，迄今为止进行了药物开发，但这些药物大多表现出较强的副作用，在连续使用方面存在问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种脂肪相关疾病和/或炎症、纤维化的预防或治疗剂。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人为了解决上述技术问题而进行了认真研究，结果发现，粪杆菌属的细菌具有脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗效果。本申请的发明人进行了进一步研究，得到各种新见解，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的发明。
[1]一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其含有粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物。
[2]根据所述[1]所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其中，脂肪相关疾病为代谢综合征相关疾病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
[3]根据所述[1]或[2]所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其中，粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌为普拉梭菌ATCC27768(Faecalibacteriumprausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitziiATCC27766)或普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)。
[4]一种用于预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症的组合物，其含有所述[1]～[3]中任一项所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂。
[5]根据所述[4]所述的组合物，其为药物组合物、食品组合物及化妆品组合物中的任意一种。
[6]粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物在制备所述[1]～[5]中任一项所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂或者组合物中的应用。
[7]一种普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)或其处理物。
[8]脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗方法，其特征在于，该方法包括对人或除人以外的动物给药粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物的工序。
[8-2]根据所述[8]所述的方法，其中，脂肪相关疾病为代谢综合征相关疾病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
[8-3]根据所述[8]或[8-2]所述的方法，其中，粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌为普拉梭菌ATCC(注册商标)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)。
[9]粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物在预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症中的应用。
[9-2]根据所述[9]所述的应用，其中，脂肪相关疾病为代谢综合征相关疾病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
[9-3]根据所述[9]或[9-2]所述的应用，其中，粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌为普拉梭菌ATCC(注册商标)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)。
[10]一种粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物，其用于预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症。
[10-2]根据所述[10]所述的粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物，其中，脂肪相关疾病为代谢综合征相关疾病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
[10-3]根据所述[10]或[10-2]所述的粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物，其中，粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌为普拉梭菌ATCC(注册商标)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacteriumprausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)。
发明效果
本发明能够提供一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂。
附图说明
图1为表示对正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的体重变化进行测定的结果的图。
图2为表示对正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的摄食量进行测定的结果的图。
图3为表示采集自正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏重量的测定结果的图。
图4为表示采集自正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的附睾周围的脂肪重量的测定结果的图。
图5为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的HOMA-IR的计算结果的图。
图6为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的血浆中的总胆固醇量的测定结果的图。
图7为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的总胆固醇量的测定结果的图。
图8为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的甘油三酯量的测定结果的图。
图9为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的ALT值的测定结果的图。
图10为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的AST值的测定结果的图。
图11为表示对正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏组织切片进行油红O染色后的状态的图。
图12为表示对正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏组织切片进行天狼星红染色后的状态的图。
图13为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的胶原蛋白1α1的基因相对表达量的测定结果的图。
图14为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的αSMA的基因相对表达量的测定结果的图。
图15为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的TNFα的基因相对表达量的测定结果的图。
图16为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的肝脏中的IL-6的基因相对表达量的测定结果的图。
图17为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组的受试动物的血浆中的内毒素量的测定结果的图。
图18为表示正常组、对照组、普拉梭菌ATCC27768给药组或普拉梭菌TY-2给药组的受试动物的肝脏的纤维化状态的图。
具体实施方式
[粪杆菌属的细菌]
本发明中使用的粪杆菌属的细菌没有特别限定，例如可以为普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)等。作为普拉梭菌，例如可列举出普拉梭菌ATCC27768、普拉梭菌ATCC27766、普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)等。进一步，本发明中使用的粪杆菌属的细菌例如可以为如下细菌：将形态特征(例如，菌落的形状、细胞的形状等)、生理、生化特性(例如，糖的同化性、生长温度、最适pH等)、化学分类学的性状(菌体脂肪酸组成等)等性状与已知的粪杆菌属的细菌进行比较，根据该性状的比较结果而鉴定为相同或实质相同的细菌，也可以为根据16S rRNA基因的碱基序列的分析而鉴定为相同或实质相同的细菌。
[粪杆菌属的细菌的获取方法及培养方法]
粪杆菌属的细菌的获取方法没有特别限定，例如可以为按照公知或本身公知的方法，例如从人或非人动物的粪便等中获取的方法(例如，可参照本申请说明书的实施例1)，可以为从自然界或生物体内获取的方法，可以为从ATCC等机构等获得的方法，也可以为获取市售品的方法等。
此外，普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)已作为依照布达佩斯条约的国际保藏而在2018年6月11日被独立行政法人制品评价技术基盘机构生物技术中心专利微生物保藏中心(NPMD)(地址：邮编292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)接受。
该细菌可通过向上述保藏中心进行申请而获得，但其例如也可以为如下细菌：将形态特征(例如，菌落的形状、细胞的形状等)、生理、生化特性(例如，糖的同化性、生长温度、最适pH等)、化学分类学的性状(菌体脂肪酸组成等)等性状与普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)进行比较，根据该性状的比较结果而鉴定为相同或实质相同的细菌，还可以为根据16S rRNA基因的碱基序列的分析而鉴定为相同或实质相同的细菌。
在本发明中，粪杆菌属的细菌的培养方法例如可以为，向市售的培养基中添加细菌，在培养箱内进行培养等的公知或本身公知的方法。
[细菌或其处理物]
作为本发明的粪杆菌属的细菌(如上所述，包括普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)等；以下相同)，优选活菌，也可以使用细菌的处理物。细菌的处理物是指对粪杆菌属的细菌施加某些处理而获得的产物，该处理没有特别限定。作为该处理物，具体而言，可列举出该菌体的通过超声波等制成的破碎液、该菌体的培养液或培养上清、通过过滤或离心分离等固液分离手段对上述破碎液、培养液或培养上清进行分离而得到的固体残渣等。此外，该处理物可以为通过酶或机械手段去除了细胞壁的处理液、通过进行三氯醋酸处理或盐析处理等而得到的蛋白复合物(蛋白质、脂蛋白、糖蛋白等)或肽复合物(肽、糖肽等)等菌体内成分，也可以为细菌分泌至细胞膜外等的菌体外成分等。进一步，上述这些物质的浓缩物、上述这些物质的稀释物或上述这些物质的干燥物等也包含在该处理物中。此外，对该菌体的通过超声波等制成的破碎液、该细胞的培养液或培养上清等，例如进一步实施了基于各种层析的分离等处理的处理物也包含在本发明的该处理物中。本发明的粪杆菌属的细菌的活菌体或死菌体也包含在本发明的该处理物中。所述死菌体例如可通过酶处理、施加约100℃左右的热的加热处理、利用抗生素等药物的处理、利用福尔马林等化学物质的处理、利用γ射线等放射线的处理等而得到。
在本发明中使用的细菌可以为干燥物(菌体干燥物)，作为菌体干燥物，优选单微米(single micron)的菌体干燥物。菌体干燥物通常是指经过干燥的各个菌体或经过干燥的菌体的聚集体。此外，单微米是指对小数点后第1位进行四舍五入后为1～10μm。作为在本发明中使用的粪杆菌属的细菌，若使用单微米的菌体干燥物，则制剂中的活菌率得以提高，因此脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗效果得以提高。
对菌体干燥物的优选的制备方法进行说明。将上述菌体分散在溶剂中，制成菌体液。溶剂可使用在本领域中使用的公知溶剂，优选为水。此外，也可根据需要加入乙醇。通过加入乙醇，在最初乙醇发生汽化，接着水发生汽化，由此阶段性干燥成为可能。进一步，菌体液可以为混悬液。溶剂可以与上述所示的溶剂相同。此外，在使其混悬时，可使用混悬剂、例如海藻酸钠等。
此外，在上述菌体液中，可以以通常的掺合比例进一步添加保护剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂或抗静电剂等通常在本领域中使用的添加剂。
为了制备菌体干燥物，可对上述菌体液实施利用喷雾干燥装置的干燥操作。喷雾干燥装置优选为具备可形成单微米的喷雾液滴的雾化装置的喷雾干燥装置。若形成粒径非常小的喷雾液滴，则喷雾液滴的每单位质量的表面积变大，可更有效地进行与干燥热风的接触，因此生产率得以提高。
其中，单微米的液滴是指对小数点后第1位进行四舍五入后的喷雾液滴的粒径为1～10μm的液滴。
作为喷雾干燥装置，可列举出雾化装置例如为旋转雾化器(旋转圆盘)、加压喷嘴、或利用了压缩气体的力的二流体喷嘴或四流体喷嘴的喷雾干燥装置。
喷雾干燥装置只要能够形成单微米的喷雾液滴，则可以为上述形式中的任意一种喷雾干燥装置，优选使用具有四流体喷嘴的喷雾干燥装置。
在具有四流体喷嘴的喷雾干燥装置中，四流体喷嘴的结构为：将气体流路与液体流路作为一个系统，并将其对称设置在两个系统喷嘴边缘的结构，且在喷嘴边缘构成作为流体流动表面的斜面。
此外，优选使压缩气体与液体以朝向喷嘴边缘的前端的碰撞焦点的方式，从两侧集合于一点的外部混合方式的装置。若为此方式，则喷嘴不会堵塞，能够进行长时间喷雾。
作为压缩气体，例如可使用空气、碳酸气体、氮气或氩气等惰性气体等。在对易氧化的菌体等进行喷雾干燥时，特别优选使用碳酸气体、氮气或氩气等惰性气体。
压缩气体的压力通常约为1～15kg重/cm2，优选约为3～8kg重/cm2。
相对于1mm的喷嘴边缘，喷嘴的气体量通常约为1～100L/分钟，优选约为10～20L/分钟。
通常，在这之后，在干燥室中，通过使该喷雾液滴与干燥热风接触，从而使水分蒸发，得到菌体干燥物。
干燥室的入口温度通常约为2～400℃，优选约为5～250℃，更优选约为5～150℃。即使入口温度为约200～400℃的高温，但由于基于水分蒸发的蒸发热，干燥室内的温度也不会变得那么高，此外，通过缩短在干燥室内的滞留时间，能够在一定程度上抑制活菌的死亡或损伤。
出口温度通常约为0～120℃，优选约为5～90℃，更优选约为5～70℃。
如上所述，通过减小菌体干燥物的粒径，活菌率得以提高，具有能够提供活菌率高的制剂的优点。
即，为了得到单微米的菌体干燥物，优选喷雾单微米的喷雾液滴。若减小喷雾液滴的粒径，则喷雾液滴的每单位质量的表面积变大，因此能够有效地进行与干燥热风的接触，极力抑制干燥热风的热所造成的菌体的死亡或损伤。其结果，活菌率上升，可得到活菌数多的菌体干燥物。
[剂]
本发明的剂含有粪杆菌属的细菌或其处理物。并且，这种剂可用于预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症。
脂肪相关疾病例如可以为与脂肪相关的疾病，也可以为伴随与脂肪相关的疾病而发病等的疾病等。与脂肪相关的疾病例如可列举出由脂肪引起恶化或发病的疾病等。作为由脂肪引起恶化或发病的疾病，例如可列举出代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)(包括非酒精性脂肪肝炎(NASH))、高脂血症等。代谢综合征表现为多种疾病或异常叠加的状态，作为多种疾病或异常，例如包括肥胖症(例如，脂质代谢异常、脂肪肝等)、糖代谢紊乱、胰岛素抵抗异常、心绞痛或心肌梗塞等心脏病或动脉硬化疾病(例如，脑梗塞、闭塞性动脉硬化等)等。作为伴随与脂肪相关的疾病而发病等的疾病，例如可列举出肝硬化、肝癌等。
炎症没有特别限定，例如可以为突发性炎症，也可以为持续性炎症等。此外，炎症部位可以为全身，也可以为局部等。炎症的原因没有特别限定，例如可以为由外因引起的炎症，也可以为由内因引起的炎症。作为外因，例如可列举出物理因素(例如，机械刺激、热、紫外线等)、化学因素(例如，强酸、强碱、有害药品等)、生物学因素(例如，细菌、病毒、寄生虫等)等。作为内因，例如可列举出过敏、自身免疫异常(例如，特应性皮肤炎、关节风湿病等)、炎症物质的产生(例如，内毒素)、脏器的功能异常、压力(例如，腱鞘炎、变形性关节病)等。炎症的程度没有特别限定，例如可列举出轻度～重度的炎症。
本发明的剂所起到的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗效果，可通过公知或本身公知的方法进行确认。例如，通过测定体重或通过CT扫描等对肝脏的脂肪量或附睾周围的脂肪量等进行分析，在体重或脂肪量少或减少的情况下，能够确认起到了预防或改善肥胖的效果。此外，例如对肝脏组织的一部分进行病理分析来确认脂肪滴、纤维化的状态，在脂肪滴、纤维化的状态少或减少的情况下，能够确认起到了脂肪肝和/或肝脏的纤维化的预防或治疗效果。此外，例如通过使用定量即时PCR等对与肝细胞的纤维化相关的基因表达进行分析，在该基因表达低或减少的情况下，能够确认起到了肝脏的纤维化的预防或治疗效果。例如，在定量即时PCR中，可使用利用荧光色素进行了标记的TaqMan探针或分子信标(Molecular Beacon)等。TaqMan探针或分子信标为在寡核苷酸上结合有荧光色素与淬灭剂的探针，该寡核苷酸与通过PCR进行了扩增的区域的内部序列具有同源性，能够使所述TaqMan探针和分子信标在PCR反应中共存并进行使用。此外，例如测定血浆中所含的总胆固醇量、ALT、AST值，在这些量或值少或减少的情况下，能够确认起到了肝功能的维持或改善效果。此外，例如使用下述式(1)，根据血浆中所含的葡萄糖及胰岛素量计算HOMA-IR，在该值减少的情况下，能够确认起到了糖耐量改善效果。
[数学式1]
HOMA-IR＝禁食时血浆胰岛素(μU/mL)×禁食时血浆葡萄糖(mg/dL)/405…(1)
此外，例如测定血浆中所含的内毒素含量，在血液中的内毒素量少或减少的情况下，能够确认起到了炎症的预防或治疗效果。此外，例如对血浆中所含的炎性细胞因子等的基因表达进行分析，在该炎性细胞因子等的基因表达少或减少的情况下，能够确认起到了炎症的预防或治疗效果。
在本发明中，“预防”的程度没有特别限定，包括阻止发病、抑制进展等。此外，“治疗”中也包括改善等，该改善程度没有特别限定，还包括疾病的缓解、痊愈等。
本发明的剂只要包含粪杆菌属的细菌或其处理物即可，也可根据剂型、给药形态、所需的药效等适当含有其他成分。作为其他成分，可列举出其他药理活性成分、载体、添加剂(例如，防腐剂、表面活性剂、稳定剂、等渗剂、pH调节剂等)等。其他成分可以为单独一种，或者也可以组合两种以上。
[剂的给药方法、剂型等]
只要能够预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症，则本发明的剂的给药形态(或剂型)没有特别限定，例如可以为口服或非口服给药(剂)等。
作为口服剂，例如可列举出将本发明的剂与药学上可接受的载体进行混合的片剂(例如，糖衣片等)、丸剂、胶囊剂、散剂、包衣片剂、颗粒剂、锭剂等固体制剂；水剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等液体制剂，果冻状制剂等半固体制剂等。作为非口服剂，例如可列举出注射剂(例如，皮下注射剂、静脉注射剂、肌内注射剂、腹腔注射剂、点滴剂等)、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂等)、外用剂(例如，经皮制剂、软膏剂、经鼻给药制剂等)等。
本发明的剂的形状没有特别限定，例如可列举出液体状、流动状、凝胶状、半固体状、固体状等。此外，还包括通过临用时配制而制成液体状、流动状、凝胶状、半固体状、固体状等的剂。
[剂的剂量]
本发明的剂中所含的细菌或其处理物的含量没有特别限定，例如换算为细菌的干燥质量，相对于剂的总量可以为约0.0001质量％～约50质量％左右、约0.001质量％～约30质量％左右、约0.01质量％～约10质量％左右等，换算为细菌的处理物的干燥质量，相对于剂的总量可以为约0.0001质量％～约50质量％左右、约0.001质量％～约30质量％左右、约0.01质量％～约10质量％左右等。
本发明的剂的剂量可根据剂型、给药途径、给药对象、年龄、体重、给药间隔等进行适当选择。在口服给药的情况下，剂的剂量还根据给药对象(例如，成人)、给药间隔(例如，每天给药1次)等而不同，例如换算为本发明的细菌的干燥质量，可以为约0.0001mg～约100g、约0.001mg～约50g、约0.01mg～约20g、约0.1mg～约5g等，换算为本发明的细菌的处理物的干燥质量，可以为约0.0001mg～约100g、约0.001mg～约50g、约0.01mg～约20g、约0.1mg～约5g等。例如，当本发明的剂含有活菌时，以活菌的菌数计通常为约1～1012个/成人/次，优选为101～1011个/成人/次，更优选为102～1010个/成人/次。其中，制剂中的活菌数的测定根据菌体的不同而不同，例如能够通过后述的使用了添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基的平板培养法而容易地测定。在非口服给药的情况下，剂的剂量还根据给药对象(例如，成人)、给药间隔(例如，每天给药1次)等而不同，换算为本发明的细菌的干燥质量，例如可以为约0.0001mg～约100g、约0.001mg～约50g、约0.01mg～约20g、约0.1mg～约5g等，换算为本发明的细菌的处理物的干燥质量，例如可以为约0.0001mg～约100g、约0.001mg～约50g、约0.01mg～约20g、约0.1mg～约5g等。
此外，给药间隔也可根据剂型、给药对象等进行适当选择，例如可以为每天1～3次左右，也可以为数月1～3次左右。
给药次数也可根据剂型、给药对象等进行适当选择，例如可以为单次给药，也可以设置一定间隔而持续给药等。
本发明的剂构成各种形态的剂(组合物、药物组合物、食品组合物、化妆品组合物)。因此，本发明还包括含有所述剂的组合物。
[药物(药物组合物)]
本发明可用于含有本发明的剂的药物。
只要在原料中含有本发明的剂而进行制备，则对本发明的药物的制备方法没有特别限定，可根据以往公知或本身公知的方法进行制备。
只要能够预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症，则本发明的药物的给药形态(或剂型)没有特别限定，例如可以为口服或非口服给药(剂)等。
作为口服剂，例如可列举出将本发明的剂与药学上可接受的载体进行混合的片剂(例如，糖衣片等)、丸剂、胶囊剂、散剂、包衣片剂、颗粒剂、锭剂等固体制剂；水剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等液体制剂，果冻状制剂等半固体制剂等。作为非口服剂，例如可列举出注射剂(例如，皮下注射剂、静脉注射剂、肌内注射剂、腹腔注射剂、点滴剂等)、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂等)、外用剂(例如，经皮制剂、软膏剂、经鼻给药制剂等)等。
本发明的药物的形状没有特别限定，例如可列举出液体状、流动状、凝胶状、半固体状、固体状等。此外，还包括通过临用时配制而制成液体状、流动状、凝胶状、半固体状、固体状等的药物。
本发明的药物中所含的细菌或其处理物的含量没有特别限定，例如换算为细菌的干燥质量，相对于药物的总量，可以为约0.0001质量％～约50质量％左右、约0.001质量％～约30质量％左右、约0.01质量％～约10质量％左右等，换算为细菌的处理物的干燥质量，相对于药物的总量，可以为约0.0001质量％～约50质量％左右、约0.001质量％～约30质量％左右、约0.01质量％～约10质量％左右等。
本发明的药物的剂量可根据剂型、给药途径、给药对象、年龄、体重、给药间隔等进行适当选择。在口服给药的情况下，药物的剂量还根据给药对象(例如，成人)、给药间隔(例如，每天给药1次)等而不同，例如换算为本发明的细菌的干燥质量，可以为约0.0001mg～约10g、约0.001mg～约5g、约0.01mg～约1g、约0.1mg～约500mg等，换算为本发明的细菌的处理物的干燥质量，可以为约0.0001mg～约10g、约0.001mg～约5g、约0.01mg～约1g、约0.1mg～约500mg等。在非口服给药的情况下，药物的剂量还根据给药对象(例如，成人)、给药间隔(例如，每天给药1次)等而不同，换算为本发明的细菌的干燥质量，例如可以为约0.0001mg～约10g、约0.001mg～约5g、约0.01mg～约1g、约0.1mg～约500mg等，换算为本发明的细菌的处理物的干燥质量，例如可以为约0.0001mg～约10g、约0.001mg～约5g、约0.01mg～约1g、约0.1mg～约500mg等。
此外，给药间隔也可根据剂型、给药对象等进行适当选择，例如可以为每天1～3次左右，也可以为数月1～3次左右。
给药次数也可根据剂型、给药对象等进行适当选择，例如可以为单次给药，也可以设置一定间隔而持续给药等。
无论本发明的药物为哪一种剂型，除了本发明的剂，都可含有药学上可接受的基质或载体(例如，水性溶剂、固体载体、多元醇、植物油、油性基质等)、药学上可接受的添加剂(例如，表面活性剂、香料或凉味剂、防腐剂、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、等渗剂、螯合剂、缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、增稠剂等)、除本发明的剂以外的其他生理活性成分(例如，维生素类、氨基酸类、糖类、高分子化合物等)或药理活性成分(例如，抗菌药成分、杀菌药成分等)等。
[食品(食品组合物)]
此外，本发明的剂可用于食品领域。即，本发明的剂可以为食品用添加剂等。这样的食品用添加剂构成食品。因此，本发明还包括含有所述剂的食品(食品组合物)。
作为食品，例如可列举出营养补充剂、营养均衡食品、健康食品、营养功能性食品、特定保健用食品、功能性表示食品、患者用食品等饮食品。只要能够得到脂肪相关疾病和/或炎症的预防或改善效果，则这些食品的制造方法没有特别限定。作为该食品的优选具体例，可例示出具有粉末、颗粒、胶囊、片剂等形态的补剂(supplement)。此外，除了上述形态以外，作为该食品，可列举出酸奶、奶酪等发酵食品(乳制品)、口香糖、糖果、橡皮糖、压片糖、曲奇、蛋糕，巧克力、冰淇淋、果冻、慕斯、布丁、饼干、玉米片、咀嚼片、威化饼干、米饼等点心类；碳酸饮料、清凉饮料、乳饮料、咖啡饮料、红茶饮料、果汁饮料、营养饮料、酒精饮料、矿泉水等饮料类；粉末果汁、粉末汤等粉末饮料；色拉调料(dressings)、沙司等调味料；面包类；面类；鱼糕等糜制品；味岛香松(ふリかけ)等。此外，除了用于口服摄取的形态以外，也可制成用于鼻饲摄取(流食等)的形态。
本发明的食品中的剂的含有比例可根据对象的年龄、性别、健康状态、其他条件等进行适当选择，可根据使用量或食品的形态等进行适当调节。此外，为了更有效地表现出本发明的剂所带来的改善或预防效果，也可制成大量含有剂的食品而进行提供。
本发明的食品的制备方法只要为含有本发明的剂作为原料的方法则没有特别限定，可使用以往公知或本身公知的方法。可根据常规方法，在本发明的食品的制备过程中添加或掺合本发明的剂。
本发明的食品中所含的剂的掺合量没有特别限定，可根据食品的种类或成分等进行适当变更。
在本发明的食品的摄取中，本发明的剂的摄取量没有特别限定，可根据使用对象、年龄、性别、食品的种类、成分等进行适当变更。
[化妆品(化妆品组合物)]
此外，本发明的剂可用于化妆品领域。由于本发明的剂具有抗炎症效果，因此含有本发明的剂的本发明的化妆品能够对皮肤的炎症等进行预防或治疗等。
作为本发明的化妆品，只要含有本发明的剂则没有特别限定，包括药用化妆品等在日本药事法(JPAL)的定义中被分类为准药品(quasi drug)的产品。
本发明的化妆品的形状、形态、用途、使用方法等没有特别限定，可根据使用对象、年龄、性别等进行适当选择。
本发明的化妆品的制备方法只要为使用本发明的剂作为成分的方法则没有特别限定，可使用以往公知或本身公知的方法。此外，只要起到本发明的效果，则可向本发明的化妆品中掺合本发明的剂，并同时掺合通常能够用于化妆品的基质或载体、及根据需要的添加剂(例如，抗氧化剂、表面活性剂、增稠剂、保存剂、pH调节剂、防腐剂、着色剂、香料等)或其他有效成分(例如，保湿成分、抗炎症成分、抗菌或杀菌成分、维生素类、细胞活化成分、血液循环促进成分、角质软化成分、美白成分、收敛成分等)。
上述本发明的化妆品、食品及药物通常可通过常规方法收纳在容器或袋等中。容器或袋等只要能够用作化妆品、食品及药物的容器则没有特别限定，可根据本发明的剂、化妆品、食品及药物的形态、形状、剂型来适当选择并使用以往公知或本身公知的容器或袋。
作为本发明的对象的动物，可以为人、非人动物中的任意一种，没有特别限定，例如可列举出哺乳动物。作为哺乳动物，例如可列举出人、猴、猩猩、黑猩猩、大猩猩等灵长类，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类或兔等实验动物，牛、马、猪、绵羊、山羊等家畜，狗、猫等宠物，鸡、家鸭、鹅等鸟类等。哺乳动物优选为灵长类(人等)或宠物，更优选为人、狗或猫，进一步优选为人。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例为本发明的一个例子，本发明的技术范围并不受这些实施例限定。
[稀释液、添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基及添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆肉汤的制备]
按照日本药局方外医药品规格“双歧杆菌”项中记载的方法，通过以下方式制备稀释液。将无水磷酸氢二钠：6.0g、磷酸二氢钾：4.5g、聚山梨酯80：0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐：0.5g、琼脂：1.0g混合于1000mL的纯净水，使用高压蒸汽灭菌器，以121℃加热灭菌15分钟，将pH调节至6.8～7.0。
通过以下方式制备添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基。将40.0g的胰蛋白胨大豆琼脂培养基(Daher International Food Company制造)溶解于950mL的蒸馏水后，以121℃加热灭菌15分钟。在冷却至约47℃的胰蛋白胨大豆琼脂培养基中添加50mL的脱纤维羊血(NIPPON BIO-TEST LABORATORIES INC.制造)后，适量添加在无菌皿上，制备添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基(有时也称为琼脂平板培养基A等)。
通过以下方式制备添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆肉汤。将30.0g的胰蛋白胨大豆肉汤(和光纯药工业株式会社制造)溶解于950mL的蒸馏水后，以121℃加热灭菌15分钟。在冷却至约47℃的胰蛋白胨大豆肉汤(和光纯药或NIPPON BIO-TEST LABORATORIESINC.)中添加50mL的脱纤维羊血，制备添加有5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆肉汤(有时也称为胰蛋白胨大豆肉汤B等)。
将上述制备而成的物质用于之后的实施例中。
[实施例1]粪杆菌属的细菌的分离
在900μL的所述稀释液中，加入100mg的人粪便试样，使用涡旋混合器(vortexmixer)混合至均匀。进一步使用所述稀释液，制备以10倍逐级稀释而成的溶液后，使用细菌涂布棒在琼脂平板培养基A上各涂布100μL所述溶液。使用厌氧菌培养装置(株式会社HIRASAWA)，将涂布后的琼脂平板培养基A迅速地在厌氧条件下、以37℃分离培养48～96小时。在培养后使用牙签及接种环，将出现在琼脂平板培养基A上的菌落划线涂布在新的琼脂平板培养基A上之后，迅速地在厌氧条件下、以37℃纯培养48～96小时。再次重复进行相同的纯培养处理后，挑取出现的菌落，将其混悬于20％丙三醇与等量的液体培养基的混合液中，以-80℃进行保存。按照以往的方法，对于使用苯酚提取法提取的DNA，实施16S rRNA(16S核糖体RNA)的同源性分析，鉴定菌种。另外，分离培养及纯培养的操作均在厌氧培养箱(株式会社HIRASAWA制造)内实施。
[实施例2]细菌(普拉梭菌标准株ATCC27768)的制备
进行普拉梭菌标准株ATCC27768(普拉梭菌ATCC27768)的离心菌体的制备。具体而言，以37℃将普拉梭菌ATCC27768的冷冻保藏菌株静置培养48小时后，以容量比计，以相对于培养菌液成为1/100的比例的方式将菌株接种于胰蛋白胨大豆肉汤B，以37℃静置培养48小时。对得到的培养菌液进行离心分离，利用PBS洗涤2次，进行离心，得到离心菌体。
[实验例A]受试动物及细菌的给药
对于8周龄的C57BL/6J小鼠，在使其摄取20周的高果糖高脂饲料(有时也称为AMLN饲料等；Research Diets,Inc.制造)的同时，以20mg/小鼠的量每天口服给药一次普拉梭菌ATCC27768。将摄取普通饲料(MF饲料，Oriental Yeast Co.,ltd.制造)、未给药普拉梭菌ATCC27768的组作为正常组。将摄取高果糖高脂饲料、未口服给药普拉梭菌ATCC27768的组作为对照组。
[实施例3]对代谢综合征的预防或治疗效果
(体重、摄食量、肝脏重量及附睾周围的脂肪重量的测定)
在试验期间内，根据常规方法，每周进行一次受试动物的体重及摄食量的测定。
在从饲喂AMLN饲料开始20周后，禁食18小时，然后根据常规方法，采集肝脏及附睾周围脂肪，测定各组织重量。
(血液化学分析)
使用葡萄糖含量检测用试剂葡萄糖CII-Test Wako(和光纯药工业株式会社制造)及胰岛素含量检测用试剂超敏小鼠胰岛素测定试剂盒(Morinaga Institute ofBiological Science,Inc.制造)，按照随附的实验方案，测定通过全血采集而得到的血浆中包含的葡萄糖及胰岛素的含量。HOMA-IR使用所述式(1)进行计算。
(结果)
在普拉梭菌ATCC27768给药组中，与对照组相比，体重增加受到显著抑制(图1)。对于摄食量，在普拉梭菌ATCC27768给药组及对照组中未发现差异(图2)。此外，与正常组相比，对照组的肝脏及附睾周围的脂肪重量显著增加(图3及4)。与此相对，在普拉梭菌ATCC27768给药组中，由摄取AMLN饲料造成的肝脏及附睾周围脂肪重量的增加受到了显著抑制(图3及4)。进一步，通过给药普拉梭菌ATCC27768，作为胰岛素抵抗性指标的HOMA-IR得到了显著改善(图5)。此外，与对照组相比，在普拉梭菌ATCC27768给药组中观察到了胰岛素量减少的倾向。
由这些结果可知，普拉梭菌ATCC27768具有抗肥胖效果及糖耐量改善效果。且根据这些结果可知，通过给药普拉梭菌ATCC27768，能够抑制代谢综合征的进展。
[实施例4]对NAFLD的预防或治疗效果
(血液化学分析)
委托SRL,Inc.测定通过全血采集而得到的血浆中包含的总胆固醇量、ALT及AST的值。此外，委托Skylight Biotech,Inc.测定肝脏中的脂质分析中的总胆固醇量及甘油三酯量。
(病理分析)
根据常规方法，将采集自受试动物的肝脏浸渍在10％福尔马林中并固定后，制成石蜡块，并制成石蜡切片。对该石蜡切片使用油红O染色原液(MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD.制造)或天狼星红染色液(Sigma-Aldrich Japan K.K.制造)，按照随附的实验方案，对肝脏的石蜡切片进行染色，对染色后的石蜡切片进行拍照。
(基因表达分析)
使用RNA提取试剂(QIAGEN K.K.制造)，按照随附的实验方案，从采集自受试动物的肝脏中提取总RNA。使用逆转录试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)，按照随附的实验方案，制成cDNA，将制成的cDNA作为模板，进行定量即时PCR。使用实时PCR试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)及实时PCR装置(Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)，按照随附的实验方案进行定量即时PCR。通过定量即时PCR，测定胶原蛋白1α1(Collagen 1α1)、αSMA、TNFα及18S rRNA的基因表达量。作为胶原蛋白1α1、αSMA及TNFα基因的引物以及探针，使用表1所示序列的引物以及探针。使用真核18S rRNA内源性对照(VIC(注册商标)/MGB(商品名称)探针，引物限制)(ABI公司制造，Cat.No:4319413E)测定18SrRNA的基因表达量。计算各基因的表达量相对于18S rRNA的表达量的相对值，从而评价基因表达量。
[表1]
Figure BDA0002311162850000191
(结果)
与对照组相比，普拉梭菌ATCC27768给药组的血浆中的总胆固醇量、肝脏中的总胆固醇量及甘油三酯量显著减少(图6、7及8)。进一步，由于给药普拉梭菌ATCC27768，作为肝功能指标的ALT值及AST值得到显著改善(图9及10)。此外，普拉梭菌ATCC27768的给药使肝脏中的肥大化的脂肪滴及箭头所示的胶原纤维显著减少(图11及12)。此外，普拉梭菌ATCC27768的给药使作为肝脏纤维化因素的胶原蛋白1α1及表示与纤维化相关的肝星状细胞活性的αSMA的基因相对表达量显著减少(图13及14)。
由这些结果确认到，普拉梭菌ATCC27768具有对脂肪肝和/或肝脏的纤维化的抑制效果。此外，由于具有肝功能的改善效果，因此确认到通过给药普拉梭菌ATCC27768，能够抑制NAFLD症状的形成。
[实施例5]对炎症的预防或治疗效果
(血液化学分析)
与实施例3中记载的血液化学分析相同，为了测定通过全血采集而得到的血浆中包含的内毒素量，使用测定试剂内毒素检测-LAL显色试剂盒(LAL Chromogenic EndpointAssay)(Hycult Biotech Inc.制造)，测定内毒素的含量。
(基因表达分析)
与实施例4中记载的基因表达分析相同，使用定量即时PCR，测定IL-6及18S rRNA的基因表达量。作为IL-6基因的引物及探针，使用表2所示序列的引物及探针。通过与实施例4中记载的18S rRNA基因表达量测定方法相同的方法，测定18S rRNA的基因表达量。计算IL-6基因的表达量相对于18S rRNA的表达量的相对值，从而评价基因表达量。
[表2]
Figure BDA0002311162850000201
(结果)
与对照组相比，在普拉梭菌ATCC27768给药组中，作为炎性细胞因子的TNFα及IL-6的基因相对表达量显著减少(图15及16)。此外，通过给药普拉梭菌ATCC27768，与正常组及对照组的血浆内毒素量相比，诱导肠道至全身的炎症反应的血浆内毒素量显著减少(图17)。由这些结果可知，普拉梭菌ATCC27768具有抗炎症效果。
[实施例6]细菌(普拉梭菌标准株ATCC27768及普拉梭菌TY-2株)的制备
进行普拉梭菌标准株ATCC27768(普拉梭菌ATCC27768)及普拉梭菌TY-2株(普拉梭菌TY-2)(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)的离心菌体的制备。具体而言，将普拉梭菌ATCC27768或普拉梭菌TY-2的冷冻保藏菌株在37℃下静置培养48小时后，以容量比计，以相对于培养菌液成为1/100的比例的方式将菌株接种于胰蛋白胨大豆肉汤B，在37℃下静置培养48小时。对得到的培养菌液进行离心分离，用PBS洗涤2次，进行离心，得到离心菌体。
[实施例7]死菌体的制成
对普拉梭菌标准株ATCC27768(普拉梭菌ATCC27768)或普拉梭菌TY-2株(普拉梭菌TY-2)(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)的离心菌体照射30kGy的γ射线约190分钟，制成死菌体。委托Koga ISOTOPE,Ltd.进行照射。
[实验例B]受试动物及细菌的给药
对于8周龄的C57BL/6J小鼠，在使其摄取20周的高果糖高脂饲料(有时也称为AMLN饲料等；Research Diets,Inc.制造)的同时，以20mg/小鼠的量每天口服给药一次未照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、未照射γ射线普拉梭菌TY-2或照射γ射线普拉梭菌TY-2。将摄取普通饲料(MF饲料，Oriental Yeast Co.,ltd.制造)、未给药普拉梭菌ATCC27768及普拉梭菌TY-2的组作为正常组。将摄取高果糖高脂饲料、未口服给药普拉梭菌ATCC27768及普拉梭菌TY-2的组作为对照组。
[实施例8]对肝脏纤维化的抑制效果
(病理分析)
根据常规方法，将采集自受试动物的肝脏浸渍在10％福尔马林中并固定后，制成石蜡块，并制成石蜡切片。对该石蜡切片使用天狼星红染色液(Sigma-Aldrich Japan K.K.制造)，按照随附的实验方案，对肝脏的石蜡切片进行染色，对染色后的石蜡切片进行拍照。
(结果)
未照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、未照射γ射线普拉梭菌TY-2或照射γ射线普拉梭菌TY-2的给药均使肝脏中的箭头所示的胶原纤维显著减少(图18)。
由上述结果确认到，未照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、照射γ射线普拉梭菌ATCC27768、未照射γ射线普拉梭菌TY-2株或照射γ射线普拉梭菌TY-2株具有对肝脏纤维化的抑制效果。即，确认到粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌的活菌体及死菌体具有对肝脏纤维化的抑制效果。
工业实用性
本发明能够预防或治疗肥胖相关疾病和/或炎症，因此在代谢综合征等的预防或治疗方面是有用的。
SEQUENCE LISTING
<110> 表飞鸣制药株式会社
公立大学法人横滨市立大学
<120> 脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂
<130> KHP192117457.7
<150> JP 2017-118686
<151> 2017-06-16
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 探针
<400> 1
cccgccgatg tcgctatcca gct 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
gaccgatgga ttcccgttcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggacattagg cgcaggaagg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 探针
<400> 4
cccagagtgg agaagcccag ccagt 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
acccttcagc gttcagcctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
cacacatagc tggagcagcg 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 探针
<400> 7
aggggccacc acgctcttct gtctac 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
gcctatgtct cagcctcttc tc 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 9
aggccatttg ggaacttctc atc 23
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 探针
<400> 10
acaatcagaa ttgccattgc acaactcttt 30
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 11
gttctctggg aaatcgtgga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 12
ttctgcaagt gcatcatcgt 20

Claims (10)

1.一种脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其含有粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物。
2.根据权利要求1所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其中，脂肪相关疾病为代谢综合征相关疾病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂，其中，粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌为普拉梭菌ATCC27768(Faecalibacterium prausnitziiATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)。
4.一种用于预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症的组合物，其含有权利要求1～3中任一项所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其为药物组合物、食品组合物及化妆品组合物中的任意一种。
6.粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物在制备权利要求1～5中任一项所述的脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗剂或者组合物中的应用。
7.一种普拉梭菌TY-2(国际保藏机构登记号NITE ABP-02743)或其处理物。
8.脂肪相关疾病和/或炎症的预防或治疗方法，其特征在于，所述方法包括对人或除人以外的动物给药粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物的工序。
9.粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物在预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症中的应用。
10.一种粪杆菌(Faecalibacterium)属的细菌或其处理物，其用于预防或治疗脂肪相关疾病和/或炎症。
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