TWI778083B

TWI778083B - 脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑

Info

Publication number: TWI778083B
Application number: TW107120737A
Authority: TW
Inventors: 川原知浩; 田中良紀; 嶋川真木; 大野裕史; 結束貴臣; 中島淳
Original assignee: 日商表飛鳴製藥股份有限公司; 公立大學法人橫濱市立大學
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2022-09-21
Also published as: EP3639833A1; JPWO2018230695A1; JP7016085B2; WO2018230695A1; US20210145897A1; MY201921A; BR112019025948A2; CN111107860A; TW201906619A; US11224622B2; MX2019014955A; EP3639833B1; EP3639833A4

Abstract

本發明以提供脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑為課題。

本發明提供含有柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑。

Description

脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑

本發明係有關含有柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑。

近年來由於飲食生活變豐富，其結果卡路里攝取過剩，同時也因為運動不足，導致代謝症候群(metabolic syndrome)的人急速增加。代謝症候群亦稱為「內臓脂肪症候群」，與脂質代謝異常、糖代謝異常等複數疾病或異常有關連，其結果導致動脈硬化、脂肪肝、高脂血症、肥胖症、高血壓、糖尿病等症狀及疾患之可能性高。

脂肪肝之主要原因為大量喝酒及過營養。未喝酒而呈現肝疾患症狀之非酒精性脂肪性肝疾患(Non-alcoholic fatty liver disease，以下亦稱為NAFLD)由於為良性疾病，病情未進展而被輕忽，導致引起肝炎、肝硬化、肝癌等之例增加，成為不容忽視的疾患。

為了預防或治療該等代謝症候群，至今雖已開發有醫藥品，惟，很多都呈現強的副作用，要繼續使用有問題。

本發明之目的為提供脂肪關連疾患及/或炎症、纖維化的預防或治療劑。

本發明人等為了解決上述課題進行深入研究，結果發現柔嫩梭菌屬之菌具有脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療效果。本發明人等更進行檢討，獲得種種新見解，因而完成本發明。

亦即，本發明係有關以下之發明。

[1]一種脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑，含有柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物。

[2]如上述[1]所述之預防或治療劑，其中，該脂肪關連疾患為代謝症候群關連疾患或非酒精性脂肪性肝疾患(NAFLD)。

[3]如上述[1]或[2]所述之預防或治療劑，其中，該柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌為普拉梭菌ATCC(註冊商標)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)。

[4]一種用於預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症之組成物，係含有上述[1]至[3]項中任一項所述之預防或治療劑。

[5]如上述[4]所述之組成物，其中，該組成物為醫藥品組成物、食品組成物及化粧品組成物中之任一種。

[6]一種柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之使用，係用於製造上述[1]至[5]中任一項所述之預防或治療劑或組成物。

[7]一種普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物。

[8]一種預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症的方法，係包含於人類或人類以外之動物投予柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之步驟。

[8-2]如上述[8]所述之方法，其中，該脂肪關連疾患為代謝症候群關連疾患或非酒精性脂肪性肝疾患(NAFLD)。

[8-3]如上述[8]或[8-2]所述之方法，其中，該柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌為普拉梭菌ATCC(註冊商標)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)。

[9]一種柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之使用，為用於預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症。

[9-2]如上述[9]所述之使用，其中，該脂肪關連疾患為代謝症候群關連疾患或非酒精性脂肪性肝疾患(NAFLD)。

[9-3]如上述[9]或[9-2]所述之使用，其中，該柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌為普拉梭菌ATCC(註冊商標) 27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)。

[10]一種柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之用於預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症之使用。

[10-2]如上述[10]所述之柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之使用，其中，該脂肪關連疾患為代謝症候群關連疾患或非酒精性脂肪性肝疾患(NAFLD)。

[10-3]如上述[10]或[10-2]所述之柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌或其處理物之使用，其中，該柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌為普拉梭菌ATCC(註冊商標)27768(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27768)、普拉梭菌ATCC27766(Faecalibacterium prausnitzii ATCC27766)或普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)。

本發明可提供脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑。

第1圖為表示測定正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物體重變化之結果圖。

第2圖為表示測定正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物攝餌量之結果圖。

第3圖為表示從正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物採取之肝臓重量之測定結果圖。

第4圖為表示從正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物採取之副睪周圍脂肪重量之測定結果圖。

第5圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物之HOMA-IR(恆定模式的評估胰島素阻抗性)之算出結果圖。

第6圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物血漿中總膽固醇量之測定結果圖。

第7圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中總膽固醇量之測定結果圖。

第8圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中三酸甘油酯量之測定結果圖。

第9圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物之ALT值之測定結果圖。

第10圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物之AST值之測定結果圖。

第11圖為表示將正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物之肝臓組織切片以油紅O染色後之樣態圖。

第12圖為表示將正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物之肝臓組織切片以天狼星红染色後之樣態圖。

第13圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中膠原1α1之相對基因表現量之測定結果圖。

第14圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中αSMA之相對基因表現量之測定結果圖。

第15圖為表示測定於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中TNFα之相對基因表現量之測定結果圖。

第16圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物肝臓中IL-6之相對基因表現量之測定結果圖。

第17圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群試驗動物血漿中內毒素量之測定結果圖。

第18圖為表示於正常群、對照群、F.prausnitzii ATCC27768投予群或F.prausnitzii TY-2投予群試驗動物之肝臓纖維化狀態圖。

[柔嫩梭菌屬之菌]

於本發明使用之柔嫩梭菌屬之菌並無特別限制，可為例如普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)等。普拉梭菌可列舉例如普拉梭菌ATCC27768、普拉梭菌ATCC27766、普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)等。另，於本發明使用之柔嫩梭菌屬之菌，例如形態的特徴(例如菌落之形狀、細胞之形等)、生理、生化學性狀(例如糖之同化性、生育溫度、理想pH等)、化學分類學的性狀(菌體脂肪酸組成等)等性狀與已知之柔嫩梭菌屬之菌比較，可為與其性狀比較結果為基礎，鑑定為相同或實質上為相同之菌，亦可為與以16S rRNA基因之鹼基序列分析為基礎，鑑定為相同或實質上為相同之菌。

[柔嫩梭菌屬之菌之取得方法及培養方法]

柔嫩梭菌屬之菌之取得方法並無特別限制，可依照例如公知或本體公知之方法，例如從人類或非人類動物之糞便等取得之方法(可參照例如本專利申請說明書之實施例1)，可為從自然界或生體內取得之方法，可為從ATCC等機關等購入之方法，亦可為取得市售品之方法等。

又，普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)為了進行根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之國際寄存，已於2018年6月11日由日本獨立行政法人製品評估技術基盤機構(National Institute of Technology and Evaluation)生物技術中心專利微生物寄託中心(NPMD)(地址：郵遞區號292-0818日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8 122 室)受領。

該菌雖可由向上述寄存中心申請取得，惟，例如也可將形態的特徴(例如菌落之形狀、細胞之形等)、生理、生化學性狀(例如糖之同化性、生育溫度、理想pH等)、化學分類學的性狀(菌體脂肪酸組成等)等之性狀與普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)之菌比較，可為與其性狀比較結果為基礎，鑑定為相同或實質上為相同之菌，亦可為與以16S rRNA基因之鹼基序列分析為基礎，鑑定為相同或實質上為相同之菌。

於本發明，柔嫩梭菌屬之菌之培養方法可為例如於市售之培養基中添加菌，在培養箱內培養等公知或本身公知之方法。

[菌或其處理物]

本發明之柔嫩梭菌屬之菌(如上所述，包含普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)等。以下亦相同)較好為生菌，惟，亦可使用菌的處理物。菌的處理物係指於柔嫩梭菌屬之菌中加入任何處理者，該處理並無特別限制。該處理物具體而言可列舉該菌體藉由超音波等之破碎液、該菌體之培養液或培養上清液、將該等藉由過濾或離心分離等固液分離方法進行分離之固體殘渣等。又，該處理物可為將細胞壁藉由酵素或機械方法除去之處理液、藉由進行三氯乙酸處理或鹽析處理等所獲得之蛋白質複合體(蛋白質、脂蛋白質、糖蛋白質等)或肽複合體(肽、糖肽等)等之菌體內成分，亦可為菌分泌至細胞膜外等之菌體外成分等。另，該等之濃縮物、該等之稀釋物或該等之乾燥物等亦包含於該處理物。又，對於該菌體藉由超音波等之破碎液、該細胞之培養液或培養上清液等另進行例如由各種層析分離等之處理者亦包含於本發明之該處理物中。本發明之柔嫩梭菌屬之菌之生菌體或死菌體亦包含於本發明之該處理物中。上述死菌體可藉由例如酵素處理、施加約100℃的熱之加熱處理、藉由抗生物質等藥物處理、藉由福馬林等化學物質處理、藉由γ線等放射線處理等獲得。

於本發明使用之菌可為乾燥物(菌體乾燥物)，作為菌體乾燥物較好為單微米之菌體乾燥物。菌體乾燥物通常係指經乾燥之各個菌體或經乾燥之菌體之集合物。又，單微米係指將小數第1位四捨五入，為1至10μm。本發明中使用之柔嫩梭菌屬之菌若使用單微米之菌體乾燥物，則由於提昇製劑中之生菌率，脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療效果變高。

對於菌體乾燥物之較佳製造方法加以說明。將上述菌體分散於溶劑，作成菌體液。溶劑可使用於該業界使用之公知之溶劑，較好為水。再者，根據所期望，可加入乙醇。藉由加入乙醇，最初乙醇為氣化，接著水為氣化，變成可階段性乾燥。另，菌體液亦可為懸濁液。溶劑可為與上述者相同。於懸濁時，懸濁劑可使用例如海藻酸鈉等。

又，上述菌體液另可以通常之調配比例添加保護劑、賦形劑、結合劑、崩解劑或靜電防止劑等該業界通常使用之添加劑。

上述菌體液為了製造菌體乾燥物，可藉由噴霧乾燥裝置進行乾燥操作。噴霧乾燥裝置較好為具備可形成單微米噴霧液滴之微粒化裝置之噴霧乾燥裝置。若作成粒徑非常小之噴霧液滴，則每個噴霧液滴單位質量之表面積變大，由於與乾燥溫風之接觸可效率佳的進行，生產性提昇。

此處之單微米液滴係指噴霧液滴之粒徑將小數第1位四捨五入，為1至10μm者。

噴霧乾燥裝置可列舉微粒化裝置為例如旋轉式霧化器(旋轉圓盤)、加壓噴嘴或利用壓縮氣體之力之雙流體噴嘴或4流體噴嘴之噴霧乾燥裝置。

噴霧乾燥裝置只要可形成單微米噴霧液滴，可為上述形式中之任一種噴霧乾燥裝置，惟，較好使用具有4流體噴嘴之噴霧乾燥裝置。

具有4流體噴嘴之噴霧乾燥裝置，由於作為4流體噴嘴之構造為將氣體流路及液體流路作為1系統，將該等於2系統噴嘴邊緣以對稱設置，於噴嘴邊緣構成成為流體流動面之斜面。

又，可為面對噴嘴邊緣先端之衝突焦點，從兩邊將壓縮氣體與液體集合成一點之外部混合方式之裝置。只要是該方式，噴嘴不會阻塞，可長時間噴霧。

壓縮氣體可使用例如空氣、二氧化碳、氮氣或氬氣等惰性氣體等。尤其是於將容易被氧化者等進行噴霧乾燥時較好使用二氧化碳、氮氣或氬氣等惰性氣體。

壓縮氣體之壓力通常為約1至15kg重/cm²，較好為約3至8kg重/cm²。

於噴嘴中之氣體量，每個噴嘴邊緣1mm通常為約1至100L/分，較好為約10至20L/分。

通常，之後於乾燥室，將乾燥溫風接觸該噴霧液滴，將水分蒸發，獲得菌體乾燥物。

乾燥室入口之溫度通常為約2至400℃，較好為約5至250℃，更好為約5至150℃。入口溫度即使為約200至400℃高溫，藉由因水分蒸發之氣化熱，乾燥室內之溫度不會達到該高溫，又，藉由縮短乾燥室內之滯留時間，可抑制生菌某一程度的死亡或損傷。

出口溫度通常為約0至120℃，較好為約5至90℃，更好為約5至70℃。

如上所述，藉由將菌體乾燥物之粒徑變小，有可提供生菌率上昇、生菌率多之製劑之利點。

亦即，為了獲得單微米之菌體乾燥物，較好為將單微米之噴霧液滴進行噴霧。噴霧液滴之粒徑若變小，則由於噴霧液滴之每單位質量之表面積變大，與乾燥溫風之接觸可效率佳的進行，可極力抑制因乾燥溫風之熱引起之菌體死亡或損傷。其結果可獲得生菌率上昇、生菌數多之菌體乾燥物。

[劑]

本發明之劑含有柔嫩梭菌屬之菌或其處理物。因此，該等劑可用於預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症。

脂肪關連疾患可為例如脂肪關連之疾患，亦可為脂肪關連之疾患附隨之發症等疾患等。脂肪關連之疾患可列舉例如以脂肪為起因、惡化或發症之疾患等。以脂肪為起因、惡化或發症之疾患可列舉例如代謝症候群、非酒精性脂肪性肝疾患(NAFLD)(包含非酒精性脂肪肝炎(NASH))、高脂血症等。代謝症候群表示複數疾病或異常重疊之狀態，複數疾病或異常包含例如肥胖症(例如脂質代謝異常、脂肪肝等)、糖代謝異常、胰島素阻抗性異常、狹心症或心肌梗塞等心疾患或動脈硬化性疾患(例如腦梗塞、閉塞性動脈硬化症等)等。脂肪關連之疾患附隨發症等之疾患可列舉例如肝硬化、肝癌等。

炎症並無特別限制，例如可為突發性炎症，亦可為持續性炎症等。又，炎症部位可為全身，亦可為局部。炎症之原因並無特別限制，例如可為藉由外因之炎症，亦可為藉由內因之炎症。外因可列舉例如物理性因子(例如機械性刺激、熱、紫外線等)、化學性因子(例如強酸、強鹼、有害藥品等)、生物學性因子(例如細菌、病毒、寄生蟲等)等。內因可列舉例如過敏、自體免疫異常(例如異位性皮膚炎、風濕性關節炎等)、炎症物質之產生(例如內毒素)、臓器之機能異常、壓力(例如腱鞘炎、變形性關節症)等。炎症之程度並無特別限制，可列舉例如輕度至重度之炎症。

本發明之劑所發揮預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症的效果，可藉由公知或本體公知之方法確認。例如體重的測定、或肝臓之脂肪量或副睪周圍之脂肪量等以CT掃描等分析，於體重或脂肪量少或減少之情況，可確認發揮預防或改善肥胖之效果。又，例如將肝臓組織之一部分進行病理分析，確認脂肪滴、纖維化之狀態，於脂肪滴、纖維化之狀態少或減少之情況，可確認發揮脂肪肝及/或肝臓纖維化的預防或治療效果。又，例如藉由使用定量性即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)等分析參予肝細胞纖維化之基因表現，於該基因表現低或減少之情況，可確認發揮肝臓纖維化的預防或治療效果。例如於定量性即時聚合酶鏈鎖反應可使用藉由螢光色素標識之TaqMan探針或分子信號(molecular beacon)等。TaqMan探針或分子信號為將螢光色素或淬滅體結合於具有與藉由PCR擴增之區域內部序列相同性之寡核苷酸之探針，可共存於PCR反應使用。又，例如測定血漿中含有之總膽固醇量、ALT、AST值，於該等量或值少或減少之情況，可確認發揮肝機能的維持或改善效果。又，例如從血漿中含有之葡萄糖及胰島素量，使用下述式(1)，算出HOMA-IR，於該值減少之情況，可確認發揮改善耐糖能力效果。

[數1]HOMA-IR=絕食時血漿胰島素(μu/mL)×絕食時血漿葡萄糖(mg/dL)/405..(1)

又，例如測定血漿中含有之內毒素量，於血液中之內毒素量少或減少之情況，可確認發揮炎症的預防或治療效果。又，例如分析血漿中含有之炎症性細胞激素等之基因表現，於該炎症性細胞激素等之基因表現少或減少之情況，可確認發揮炎症的預防或治療效果。

於本發明，「預防」其程度並無特別限制，包含阻止發症、抑制進行等。又，於「治療」亦包含改善等，其改善程度並無特別限制，亦包含疾病緩解、痊癒等。

本發明之劑只要含有柔嫩梭菌屬之菌或其處理物即可，亦可對應劑型、投予形態、所期望之藥效等適當的含有其他成分。其他成分可列舉其他藥理活性成分、載體、添加劑(例如防腐劑、界面活性劑、安定劑、等張化劑、pH調整劑等)等。其他成分可單獨或將2種以上組合。

[劑之投予方法、劑型等]

本發明之劑之投予形態(或劑型)只要可預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症即可，並無特別限制，例如可為經口或非經口投予(劑)等。

經口劑可列舉例如將本發明之劑與藥學上容許之載體混合之錠劑(例如糖衣錠等)、丸劑、膠囊劑、散劑、包覆錠劑、顆粒劑、口含劑等固體劑；水劑、懸濁劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等液劑；膠狀製劑等半固體製劑等。非經口劑可列舉例如注射劑(例如皮下注射劑、靜脈內注射劑、肌肉內注射劑、腹腔內注射劑、點滴劑等)、栓劑(例如直腸栓劑、陰道栓劑等)、外用劑(例如經皮製劑、軟膏劑、經鼻投予製劑等)等。

本發明之劑之形狀並無特別限制，可列舉例如液體狀、流動狀、凝膠狀、半固體狀、固體狀等。又，亦包含於用時藉由調製，成為液體狀、流動狀、凝膠狀、半固體狀、固體狀等者。

[劑之投予量]

本發明之劑中含有之菌或其處理物之含量並無特別限制，例如對於劑之全量，換算為菌之乾燥質量可為約0.0001質量%至約50質量%左右、約0.001質量%至約30質量%左右、約0.01質量%至約10質量%左右等，對於劑之全量，換算為菌之處理物之乾燥質量可為約0.0001質量%至約50質量%左右、約0.001質量%至約30質量%左右、約0.01質量%至約10質量%左右等。

本發明之劑之投予量可對應劑型、投予途徑、投予對象、年齡、體重、投予間隔等適當選擇。於經口投予時，劑之投予量亦根據投予對象(例如成人)、投予間隔(例如1日投予1次)等，例如換算為本發明之菌之乾燥質量可為約0.0001mg至約100g、約0.001mg至約50g、約0.01mg至約20g、約0.1mg至約5g等，換算為本發明之菌之處理物之乾燥質量可為約0.0001mg至約100g、約0.001mg至約50g、約0.01mg至約20g、約0.1mg至約5g等。例如於本發明之劑含有生菌之情況，生菌之菌數通常為約1至10¹²個/大人/次，較好為10¹至10¹¹個/大人/次，更好為10²至10¹⁰個/大人/次。此處，製劑中生菌數之測定依菌體而異，例如藉由後述之使用添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養基可容易的測定。於非經口投予之情況之劑之投予量亦根據投予對象(例如成人)、投予間隔(例如1日投予1次)等，換算為本發明之菌之乾燥質量可為例如約0.0001mg至約100g、約0.001mg至約50g、約0.01mg至約20g、約0.1mg至約5g等，換算為本發明之菌之處理物之乾燥質量可為例如約0.0001mg至約100g、約0.001mg至約50g、約0.01mg至約20g、約0.1mg至約5g等。

又，投予間隔亦對應劑型、投予對象等適當選擇，例如可為1日約1至3次，亦可為數個月約1至3次。

投予次數亦可對應劑型、投予對象等適當選擇，例如可1次投予，亦可於某一間隔持續投予等。

本發明之劑構成各種態樣之劑(組成物、醫藥組成物、食品組成物、化粧品組成物)。因此，於本發明亦包含含有上述劑之組成物。

[醫藥品(醫藥品組成物)]

本發明亦可於含有本發明之劑之醫藥品中使用。

本發明之醫藥品之製造方法只要可將本發明之劑含於原料中製造者即可，並無特別限制，可依照以往公知或本體公知之方法製造。

本發明之醫藥品之投予形態(或劑型)只要可預防或治療脂肪關連疾患及/或炎症者即可，並無特別限制，例如可為經口或非經口投予(劑)等。

本發明之醫藥品之形狀並無特別限制，可列舉例如液體狀、流動狀、凝膠狀、半固體狀、固體狀等。又，亦包含於用時藉由調製，成為液體狀、流動狀、凝膠狀、半固體狀、固體狀等者。

本發明之醫藥品中含有之菌或其處理物之含量並無特別限制，例如對於醫藥品全量，換算為菌之乾燥質量可為約0.0001質量%至約50質量%左右、約0.001質量%至約30質量%左右、約0.01質量%至約10質量%左右等，對於醫藥品全量，換算為菌之處理物之乾燥質量可為約0.0001質量%至約50質量%左右、約0.001質量%至約30質量%左右、約0.01質量%至約10質量%左右等。

本發明醫藥品之投予量可對應劑型、投予途徑、投予對象、年齡、體重、投予間隔等適當選擇。於經口投予時醫藥品之投予量亦根據投予對象(例如成人)、投予間隔(例如每1日投予1次)等，例如換算為本發明之菌之乾燥質量可為約0.0001mg至約10g、約0.001mg至約5g、約0.01mg至約1g、約0.1mg至約500mg等，換算為本發明之菌之處理物之乾燥質量可為約0.0001mg至約10g、約0.001mg至約5g、約0.01mg至約1g、約0.1mg至約500mg等。於非經口投予時醫藥品之投予量亦根據投予對象(例如成人)、投予間隔(例如每1日投予1次)等，換算為本發明之菌之乾燥質量例如可為約0.0001mg至約10g、約0.001mg至約5g、約0.01mg至約1g、約0.1mg至約500mg等，換算為本發明之菌之處理物之乾燥質量例如可為約0.0001mg至約10g、約0.001mg至約5g、約0.01mg至約1g、約0.1mg至約500mg等。

又，投予間隔亦可對應劑型、投予對象等適當選擇，例如可為1日約1至3次，亦可為數個月約1至3次。

本發明之醫藥品於任何劑型，除了本發明之劑之外亦可含有藥學上容許之基材或載體(例如水性溶劑、固體載體、多元醇、植物油、油性基劑等)、藥學上容許之添加劑(例如界面活性劑、香料或清涼化劑、防腐劑、殺菌劑或抗菌劑、pH調節劑、等張化劑、螯合劑、緩衝劑、安定化劑、抗氧化劑、黏稠化劑等)、本發明之劑以外之其他生理活性成分(例如維生素類、胺基酸類、糖類、高分子化合物等)或藥理活性成分(例如抗菌藥成分、殺菌藥成分等)等。

[食品(食品組成物)]

本發明之劑亦可於食品之領域使用。亦即，本發明之劑亦可為食品用添加劑等。該等食品用添加劑係構成食品。因此，本發明亦包含含有上述劑之食品(食品組成物)。

食品可列舉例如營養補助食品、平衡營養食品、健康食品、營養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、患者用食品等飲食品。該等食品之製造方法只要可獲得脂肪關連疾患及/或炎症的預防或改善效果者即可，並無特別限制。該食品之較佳具體例可例示具有粉末、顆粒、膠囊、錠劑等形態之補充物。又，於上述形態以外，作為該食品亦可列舉優格、起司等發酵食品(乳製品)、膠、糖果、軟糖、打錠糖果、甜餅乾、蛋糕、巧克力、冰淇淋、果凍、慕絲、布丁、餅乾、玉米片、咀嚼片、薄餅、煎餅等點心類；碳酸飲料、清涼飲料、乳飲料、咖啡飲料、紅茶飲料、果汁飲料、營養飲料、酒精飲料、礦泉水等飲料類；粉末果汁，粉末湯等粉末飲料；沙拉用醬料、醬料等調味料；麵包類；麵類；魚板等魚漿製品；拌飯料等。又，除了經口攝取用之形態以外亦可為經管攝取用(流動食等)之形態。

劑於本發明食品中劑的含有比率可根據對象者之年齡、性別、健康狀態、其他條件等適當選擇，可對應適用量或食品之形態等適當調節。又，為了藉由本發明之劑更有效的表現改善或預防效果，亦可提供作為含有多數劑之食品。

本發明食品之製造方法只要是含有本發明之劑作為原料之方法即可，並無特限制，可使用以往公知或本身公知之方法。本發明之劑可於本發明之食品之製造過程中藉由常法添加或調配。

本發明食品中含有之劑之配合量並無特別制，可根據食品之種類或成分等適當變更。

於本發明食品之攝取，本發明之劑之攝取量並無特別限制，可根據使用對象、年齡、性別、食品種類、成分等適當變更。

[化粧品(化粧品組成物)]

又，本發明之劑可於化粧品領域使用。本發明之劑由於具有抗炎症效果，含有本發明之劑之本發明化粧品可預防或治療皮膚之炎症等。

作為本發明之化粧品，只要含有本發明之劑即可，並無特別限制，於藥用化粧品等藥事法之定義，亦包含分類為醫藥部外品者。

本發明化粧品之形狀、形態、用途、使用方法等並無特別限制，可根據使用對象、年齡、性別等適當選擇。

本發明化粧品之製造方法只要是使用本發明之劑作為成分之方法即可，並無特別限制，可使用以往公知或本身公知之方法。又，本發明之化粧品為了發揮本發明之效果，本發明之劑可調配於化粧品通常可使用之基材或載體及必要時之添加劑(例如抗氧化劑、界面活性劑、增黏劑、保存劑、pH調整劑、防腐劑、著色劑、香料等)或其他有效成分(例如保濕成分、抗炎症成分、抗菌或殺菌成分、維生素類、細胞賦活化成分、血行促進成分、角質軟化成分、美白成分、收斂成分等)。

上述之本發明化粧品、食品及醫藥品通常可藉由常法收容於容器或袋等中。容器或袋等只要可作為化粧品、食品及醫藥品之容器使用者即可，並無特別限制，對應本發明之劑、化粧品、食品及醫藥品之形態、形狀、劑型，可適當選擇以往公知或本身公知者使用。

為本發明對象之動物只要是人類、非人類動物中之任何一種即可，並無特別限制，可列舉例如哺乳動物。哺乳動物可列舉例如人類、猴子、猩猩、黑猩猩、大猩猩等靈長類，小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等嚙齒類或兔子等實驗動物，牛、馬、豬、羊、山羊等家畜，狗、猫等寵物，鷄、鴨子、鵝等鳥類等。哺乳動物較好為靈長類(人類等)或寵物，更好為人類、狗或猫，最好為人類。

[實施例]

以下，藉由實施例詳細說明本發明，惟，該等實施例為本發明之一例，本發明之技術範圍不只限於該等例。

[稀釋液、添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養基及添加5%羊脫纖維血液之添加胰蛋白酶大豆湯之調製]

依照日本藥典外醫藥品規格「雙歧桿菌」項記載之方法，以如下之操作調製稀釋液。將磷酸一氫鈉酐：6.0g、磷酸二氫鉀：4.5g、聚山梨醇酯80：0.5g、L-鹽酸半胱胺酸：0.5g、瓊脂：1.0g於精製水1000mL中混合，使用高壓蒸氣滅菌器於121℃加熱滅菌15分鐘，調整pH值為6.8至7.0。

將添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養基以如下之操作調製之。將胰蛋白酶大豆瓊脂培養基(Difco公司製造)40.0g溶解於蒸餾水950mL後於121℃加熱滅菌15分鐘。將羊脫纖維血液(日本Biotest研究所製造)50mL添加於在約47℃冷卻之胰蛋白酶大豆瓊脂培養基中後適量添加於滅菌盤，調製添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養基(亦稱為瓊脂平板培養基A等)。

以如下之操作調製添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆湯。將胰蛋白酶大豆湯(和光純藥工業(股)公司製造)30.0g溶解於蒸餾水950mL後於121℃加熱滅菌15分鐘。將羊脫纖維血液50mL添加於在約47℃冷卻之胰蛋白酶大豆湯(和光純藥或日本Biotest)，調製添加5%羊脫纖維血液之胰蛋白酶大豆湯(亦稱為胰蛋白酶大豆湯B等)。

將此處調製者於以下之實施例使用。

[實施例1]柔嫩梭菌屬之菌之分離

於上述稀釋液900μL中加入人類糞便試料100mg，使用渦旋混合器使均質混合。另，使用上述稀釋液，調製每10倍階段稀釋者之後使用康拉迪(Conradi)棒於瓊脂平板培養基A中各塗抹100μL，塗抹後之瓊脂平板培養基A使用厭氧菌培養裝置(HiRASAWA(股)公司製造)，迅速地於厭氧條件下，於37℃分離培養48至96小時。培養後使用牙籤及環圈將出現於瓊脂平板培養基A上之菌落以畫線塗抹於新的瓊脂平板培養基A中後迅速地於厭氧條件下，於37℃純培養48至96小時。再次重複進行相同之純培養處理後刮取出現之菌落，懸濁於20%甘油與等量液體培養基之混合液，於-80℃保存。依照以往之方法，對於使用苯酚萃取法萃取之DNA實施16S rRNA(16S核糖體RNA)之同源性分析，鑑定菌種。又，分離培養及純培養之作業全都於厭氧性室(HiRASAWA(股)公司製造)內實施。

[實施例2]菌(柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)標準株ATCC27768)之調製

進行調製柔嫩梭菌標準株ATCC27768(F.prausnitzii ATCC27768)之離心菌體。具體而言，為將F.prausnitzii ATCC27768之凍結保存菌株於37℃靜置培養48小時後接種於胰蛋白酶大豆湯B中，使以容量比對於培養菌液100為1之比例，於37℃靜置培養48小時。將獲得之培養菌液離心分離，以PBS洗淨2次、離心之，獲得離心菌體。

[實驗例A]試驗動物及菌之投予

對於8週齡之C57BL/6J小鼠攝取高果糖高脂肪飼料(亦稱為AMLN飼料等；Research Diets公司製造)20週，同時每日一次將F.prausnitzii ATCC27768以20mg/小鼠之量經口投予。將攝取通常之飼料(MF飼料、東方(Oriental)酵母工業公司製造)，未投予F.prausnitzii ATCC27768之群作為正常群。將攝取高果糖高脂肪飼料，未經口投予F.prausnitzii ATCC27768之群作為對照群。

[實施例3]對於代謝症候群之預防或治療效果 (測定體重、攝餌量、肝臓重量及副睪周圍之脂肪重量)

於試驗期間依照常法，於一週間進行測定試驗動物之體重及攝餌量一次。

從開始AMLN飼料給餌至20週時於禁食18小時後依照常法採取肝臓及副睪周圍脂肪，測定各組織重量。

(血液化學分析)

使用葡萄糖量測定用試藥葡萄糖CII-test wako(和光純藥工業公司製造)及胰島素量測定用試藥超高感度小鼠胰島素測定套組(森永生科學研究所公司製造)，依照所附的計畫書測定藉由全採血獲得之血漿中含有之葡萄糖及胰島素之含量。使用上述式(1)算出HOMA-IR。

(結果)

於F.prausnitzii ATCC27768投予群，與對照群比較，顯著地抑制體重增加(第1圖)。對於攝餌量，於F.prausnitzii ATCC27768投予群及對照群未觀察到有不同(第2圖)。又，對照群與正常群比較，肝臓及副睪周圍之脂肪重量顯著地增加(第3圖及第4圖)。對於該等，於F.prausnitzii ATCC27768投予群，顯著地抑制藉由攝取AMLN飼料，肝臓及副睪周圍脂肪重量之增加(第3圖及第4圖)。另，藉由投予F.prausnitzii ATCC27768，顯著地改善為胰島素阻抗性指標之HOMA-IR(第5圖)。又，與對照群比較，於F.prausnitzii ATCC27768投予群看到胰島素量有減少之傾向。

藉由該等結果明瞭F.prausnitzii ATCC27768具有抗肥胖效果及改善耐糖能力之效果。藉由該等結果明瞭藉由投予F.prausnitzii ATCC27768，可抑制代謝症候群之進行。

[實施例4]對於NAFLD之預防或治療效果 (血液化學分析)

委託SRL(股)公司測定藉由全採血獲得之血漿中含有之總膽固醇量、ALT及AST值。又，委託Skylight生物科技(股)公司測定於肝臓中脂質分析之總膽固醇量及三酸甘油酯量。

(病理分析)

從試驗動物採取之肝臓依照常法，以10%福馬林浸水固定後製作石蠟塊，製作石蠟切片。對於該石蠟切片使用油紅O染色原液(武藤化學公司製造)或天狼星红染色液(西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich Corporation)公司製造)，依照所附的計畫書將肝臓之石蠟切片染色，照像攝影染色後之石蠟切片。

(基因表現分析)

從試驗動物採取之肝臓使用RNA萃取試藥(Qiagen公司製造)依照所附的計畫書萃取全RNA。使用反轉錄試藥(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司製造)，依照所附的計畫書製作cDNA，將製作之cDNA作為模板，進行定量性即時聚合酶鏈鎖反應。定量性即時聚合酶鏈鎖反應為使用即時聚合酶鏈鎖反應試藥(賽默飛世爾科技公司製造)及即時聚合酶鏈鎖反應裝置(賽默飛世爾科技公司製造)，依照所附的計畫書進行。藉由定量性即時聚合酶鏈鎖反應，測定膠原1α1(Collagen1α1)、αSMA、TNFα及18S rRNA之基因表現量。對於膠原1α1、αSMA及TNFα基因之引子及探針，使用表1所示之序列者。使用真核18S rRNA內部對照(VIC(註冊商標)/MGB(商品名)probe、primer limited)(ABI公司製造、目錄編號：4319413E)測定18S rRNA之基因表現量。基因表現量為對於各基因之表現量，算出對於18S rRNA表現量之相對值進行評估。

(結果)

F.prausnitzii ATCC27768投予群與對照群比較，血漿中之總膽固醇量及肝臓中之總膽固醇量及三酸甘油酯量顯著地減少(第6圖、第7圖及第8圖)。另，藉由投予F.prausnitzii ATCC27768，為肝機能標識之ALT值及AST值顯著地改善(第9圖及第10圖)。又，投予F.prausnitzii ATCC27768，肝臓中經肥大化之脂肪滴及箭頭表示之膠原纖維明顯地減少(第11圖及第12圖)。又，投予F.prausnitzii ATCC27768，顯示肝臓纖維化因子之膠原1α1及參予纖維化之肝星細胞活性之αSMA之相對基因表現量顯著地減少(第13圖及第14圖)。

藉由該等結果，確認F.prausnitzii ATCC27768對於脂肪肝及/或肝臓纖維化具有抑制效果。又，由於具有肝機能之改善效果，藉由投予F.prausnitzii ATCC27768，確認可抑制NAFLD症狀之形成。

[實施例5]對於炎症之預防或治療效果 (血液化學分析)

與實施例3記載之血液化學分析相同，為了測定藉由全採血獲得之血漿中含有之內毒素量，使用測定試藥LAL終點顯色分析(HyCult生物科技公司製造)，測定內毒素之含量。

(基因表現分析)

與實施例4記載之基因表現分析相同，使用定量性即時聚合酶鏈鎖反應測定IL-6及18S rRNA之基因表現量。對於IL-6基因之引子及探針，使用表2表示之序列者。18S rRNA之基因表現量根據與實施例4記載之18S rRNA基因表現量測定方法相同之方法進行測定。基因表現量為對於IL-6基因之表現量，算出對於18S rRNA表現量之相對值進行評估。

(結果)

於F.prausnitzii ATCC27768投予群，與對照群比較，為炎症性細胞激素之TNFα及IL-6之相對基因表現量顯著地減少(第15圖及第16圖)。又，從腸管引起全身炎症反應之血漿內毒素量藉由投予F.prausnitzii ATCC27768，比正常群及對照群之血漿內毒素量更顯著地減少(第17圖)。從該等結果明瞭，F.prausnitzii ATCC27768具有抗炎症效果。

[實施例6]菌(柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)標準株ATCC27768及Faecalibacterium．prausnitzii TY-2株)之調製

進行調製柔嫩梭菌標準株ATCC27768(F.prausnitzii ATCC27768)及柔嫩梭菌TY-2株(F.prausnitzii TY-2)(寄存編號NITE BP-02743)之離心菌體。具體而言為將F.prausnitzii ATCC27768或F.prausnitzii TY-2之凍結保存菌株於37℃靜置培養48小時後接種於胰蛋白酶大豆湯B中，使以容量比對於培養菌液100為1之比例，於37℃靜置培養48小時。將獲得之培養菌液離心分離，以PBS洗淨2次，離心之，獲得離心菌體。

[實施例7]製作死菌體

於柔嫩梭菌標準株ATCC27768(F.prausnitzii ATCC27768)柔嫩梭菌TY-2株(F.prausnitzii TY-2)(寄存編號NITE BP-02743)之離心菌體以30kGy之γ線照射約190分鐘，製作死菌體。委託Koga-Isotope(股)公司照射。

[實驗例B]試驗動物及菌之投予

對於8週齡之C57BL/6J小鼠攝取高果糖高脂肪飼料(亦稱為AMLN飼料等；Research Diets公司製造)20週，同時每日一次將γ線未照射F.prausnitzii ATCC27768，γ線照射F.prausnitzii ATCC27768，γ線未照射F.prausnitzii TY-2或γ線照射F.prausnitzii TY-2經口投予20mg/小鼠之量。將攝取通常之飼料(MF飼料、東方(Oriental)酵母工業公司製造)，未投予F.prausnitzii ATCC27768及F.prausnitzii TY-2之群作為正常群。將攝取高果糖高脂肪飼料，未經口投予F.prausnitzii ATCC27768及F.prausnitzii TY-2之群作為對照群。

[實施例8]對於肝臓纖維化之抑制效果 (病理分析)

從試驗動物採取之肝臓依照常法，以10%福馬林浸水固定後製作石蠟塊，製作石蠟切片。對於該石蠟切片使用天狼星红染色液(西格瑪奧德里奇公司製造)，依照所附的計畫書將肝臓之石蠟切片染色，照像攝影染色後之石蠟切片。

(結果)

投予γ線未照射F.prausnitzii ATCC27768、γ線照射F.prausnitzii ATCC27768，γ線未照射F.prausnitzii TY-2或γ線照射F.prausnitzii TY-2，任何一種肝臓中箭頭表示之膠原纖維明顯減少(第18圖)。

藉由該等結果確認γ線未照射F.prausnitzii ATCC27768，γ線照射F.prausnitzii ATCC27768，γ線未照射F.prausnitzii TY-2株或γ線照射F.prausnitzii TY-2株對於肝臓之纖維化具有抑制效果。亦即，柔嫩梭菌(Faecalibacterium)屬之菌之生菌體及死菌體確認對於肝臓之纖維化具有抑制效果。

[產業上之利用可能性]

本發明由於可預防或治療肥胖關連疾患及/或炎症，因此可用於預防或治療代謝症候群等。

<110> 日商表飛鳴製藥股份有限公司(BIOFERMIN PHARMACEUTICAL CO.,LTD.) 公立大學法人橫濱市立大學(PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION YOKOHAMA CITY UNIVERSITY)

<120> 脂肪關連疾患及/或炎症的預防或治療劑

<130> B02F6249

<140> TW 107120737

<141> 2018-06-15

<150> JP 2017-118686

<151> 2017-06-16

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<170> PatentIn version 3.1

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Claims

一種普拉梭菌TY-2(Faecalibacterium prausnitzii TY-2)(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物的用途，係用於製造預防或治療肝臟纖維化的藥物，其中，該處理物為破碎液、培養液、培養上清液、固體殘渣、離心菌體或死菌體之任一者。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該處理物為離心菌體或死菌體。
一種普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物，其中，該處理物為破碎液、培養液、培養上清液、固體殘渣、離心菌體或死菌體之任一者。
一種醫藥品組成物，其包含申請專利範圍第3項所述之普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物。
一種食品組成物，其包含申請專利範圍第3項所述之普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物。
一種化粧品組成物，其包含申請專利範圍第3項所述之普拉梭菌TY-2(寄存編號NITE BP-02743)或其處理物。