JP5671358B2

JP5671358B2 - 便秘改善剤

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Publication number: JP5671358B2
Application number: JP2011020305A
Authority: JP
Inventors: 松本　光晴; 光晴松本
Original assignee: Kyodo Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Kyodo Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2011-02-02
Filing date: 2011-02-02
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2031-02-02
Also published as: JP2012158561A

Description

本願発明は、ビフィドバクテリウム及び／又は乳酸菌を含有する便秘改善剤、及び当該活性化剤を含有する食品又は医薬品等に関する。

便秘症の患者は世界中に多く存在し、その発症原因と症状は様々であるため、治療が非常に困難である。例えば、ガンを患う入院患者において症状が重い例が多くみられる。便秘症の治療には、瀉下作用を有する生薬である大黄が古くから用いられてきた。大黄の瀉下作用は、大黄に含まれる配糖体センノシドが腸内細菌によって分解されて生成するレインアンスロンが大腸の蠕動運動を亢進することに基づいていることが知られている。

センノシドは、レインアンスロンの二量体（セニジン）にグルコースが二分子結合した構造を有している。従って、センノシドからレインアンスロンを生成させるには、センノシドのグルコース部位のβ−グルコシダーゼによる開裂、及び当該開列によって生成されるセニジンのレダクターゼによる開裂、という２つの反応が必要である。このような反応は、腸内においては、複数の腸内細菌の共同作用によって行われるとの報告がある。これを支持する報告として、腸内からビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）SEN株を単離し、当該菌株がセンノシドをセニジンに分解するという報告（非特許文献1）、そしてビフィドバクテリウム・アドレスセンテイス（Bifidobacterium adolescentis）ABS41がセンノシドをセニジンに分解するという報告（特許文献1）が存在する。また、セニジンからレインアンスロンを生成する腸内細菌の存在も報告されている。例えば、腸内の優勢菌であるクロストリジウム・スフェノイデス（Clostridium sphenoides）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、及びペプトストレプトコッカス・インターメディウス（Peptostreptococcus intermedius）等である（非特許文献2）。

特開平7-135965

Akao, T., Che, Q. M., Kobashi, K., Yang, L., Hattori, M. andNamba, T. (1994) Isolation of a human intestinal anaerobe, Bifidobacterium sp. Strain SEN, capable of hydrolyzing sennosides to sennidins. Appl Environ Microbiol, 60, 1041-1043. Hattori, M., Kim, G., Motoike, S., Kobayashi, K. and Namba, T. (1982) Metabolism of sennosides by intestinal flora. Chem Pharm Bull (Tokyo) 30, 1338-1346.

しかし、上記の報告は、全てin vitroの結果に基づいているに過ぎず、in vivoでセンノシドからレインアンスロンを単独で生成する微生物、及びそれによって腸の蠕動運動が活性化されることは知られていない。さらに、腸内細菌の菌叢には個人差があるため、健常人であっても腸内においてセンノシドからレインアンスロンの生成が十分に行われない場合がある。さらに、術後の患者や高齢者は、感染症の予防や治療等の目的で抗生物質を服用していることが多く、抗生物質によって腸内細菌の菌叢がダメージを受けている場合がある。このような場合も、センノシドからレインアンスロンが十分に生成されず、有効な便秘改善効果が得られないと考えられる。

以上の事情に鑑み、本願の発明者は腸内細菌叢に依存しないで、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを生成させる研究に着手した。センノシドからレインアンスロンの生成を単独で行うことができる微生物に注目し、その探索を試みた。鋭意検討の結果、目的の性質を有する乳酸菌及びビフィズス菌を発見し、その単離に成功した。さらに、当該乳酸菌及びビフィズス菌は、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを生成することが示された。かかる知見に基づいて本願発明を完成させた。

本願発明は以下を提供する。
（１）センノシドとの組み合わせにおいて使用する、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを単独で生成するビフィドバクテリウムを含有する便秘改善剤。

（２）ビフィドバクテリウムが、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、（１）に記載の便秘改善剤。

（３）腸内でセンノシドを分解できない対象に投与するための、（１）又は（２）に記載の便秘改善剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の便秘改善剤を含有する食品。

（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の便秘改善剤を含有する医薬品。
（６）ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタムLKM10070株（FERM P-21999）。

本願明細書において発見されたLKM10070株及びLKM512株等のビフィドバクテリウムは、腸内において単独でセンノシドからレインアンスロンを生成することができる。このような菌種を有効成分として含有する便秘改善剤は、腸内菌叢に依存しないでセンノシドからレインアンスロンの生成を効率的に行うことができるので、センノシドからレインアンスロンの生成ができない対象に対して効果的に適用することができる。そのような対象の例としては、健常でありながらセンノシドからレインアンスロンを生成できない菌叢を有する対象、及び術後の入院患者や抗生物質の投与などによって腸内菌叢が変化を受けた対象等が挙げられる。

（A）ラクトバチルス(Lactobacillus strains)及び（B）ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium strains)のセンノシドＡ(Sennoside A)及びセンノシドＢ(Sennoside B)の分解活性を示す図である。 LKM512株由来のDNAのRAPD-PCRによるバンドパターンを示す図である。各泳動図の左側レーンは分子量マーカーであり、分子量は上から、2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、及び100 bpである。 LKM10070株由来のDNAのRAPD-PCRによるバンドパターンを示す図である。各泳動図の左側レーンは分子量マーカーであり、分子量は上から、2000、1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、及び100 bpである。 LKM10070株及びLKM512株をセンノシド添加培地中で培養後、その培養液をTLCプレートに展開した結果を示す。腸内におけるセンノシドの分解試験のための投与スケジュールを示す図である。（A）LKM10070株及び（B）LKM512株の投与が、カナマイシン処理したマウスにおけるセンノシドの分解に及ぼす影響を示す図である。Mann-WhitneyのU検定で有意差検定を行った。蠕動運動活性化試験のための投与スケジュールを示す図である。 LKM512株の投与が、カナマイシン処理したマウスの蠕動運動に与える影響を示す図である。（A）は、盲腸への分岐点から活性炭の到達部位までの長さを測定した写真である。１１回の試験の典型例を示す。（B）は、前記１１回の試験で得られた測定値の平均値を示す図である。（Wilcoxonの符号付き順位検定（変法））。

本願発明は、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを単独で生成するビフィドバクテリウムを含有する便秘改善剤を提供する。
本願明細書でいうビフィドバクテリウムは、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを単独で生成することができるものであればよい。本願発明において使用することができるビフィドバクテリウムとしては、例えば、ビフィドバクテリウム・アニマリス・アニマリス（Bifidobacterium animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）等が挙げられるが、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）は除く。これらは、単独又は組み合わせて使用することができる。これらのうち、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス、及びビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタムを好ましく用いることができる。

本願発明のビフィドバクテリウムの一態様として、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティスLKM512株、及びビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタムLKM10070株を挙げることができる。これらは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-21998及びFERM P-21999として寄託されており、入手可能である。

本願発明のビフィドバクテリウムは、有効量で投与されることが好ましい。ここでいう有効量とは、腸内でセンノシドからレインアンスロンを生成するために必要な量をいう。そのような有効量とは、ヒトの体重1 kgあたり、例えば10⁶〜10¹⁰colony-forming unit (cfu)/kg、好ましくは10⁷〜10¹⁰cfu/kg、より好ましくは10⁸〜10⁹cfu/kgである。或いは、ビフィドバクテリウムの有効量は、センノシドの投与量との関係で設定してもよい。例えば、センノシドの投与量1 mgあたりのビフィドバクテリウムの投与量は、10⁶〜10¹⁰cfu/mg、好ましくは10⁶〜10⁹cfu/mg、より好ましくは10⁷〜10⁸cfu/mgである。前記のビフィドバクテリウムの投与量は一回、二回、又は三回以上の投与量としてもよく、或いは一日、二日、又は三日以上の投与量としてもよい。

本願発明の便秘改善剤は、センノシドと組み合わせて用いることが好ましい。ここでいう組み合わせとは、例えば、センノシドを投与した後に便秘改善剤を投与すること、センノシドを投与する前に便秘改善剤を投与すること、センノシドと同時に便秘改善剤を投与すること、及びこれらの組み合わせを意味する。センノシドと同時に投与する場合には、センノシドとビフィドバクテリウムを同一剤中に存在させてもよい。

本願発明において使用するセンノシドは、精製されたものであってもよいし、他の成分と共存した粗精製品であってもよい。センノシドの精製品は、市販品を購入してもよいし、粗精製品から当業者によく知られた方法によって精製してもよい。粗精製品としては、例えば、生薬として知られているセンナ及び大黄等、及び、便秘改善用の医薬品として知られているソルダナ錠（商標）（堀井薬品工業株式会社）、ペンクルシン錠（商標）（東和薬品株式会社）、及びプルゼニド錠（商標）（ノバルティスファーマ株式会社）等が挙げられる。

センノシドは、有効量で投与されることが好ましい。ここでいう有効量とは、腸の蠕動運動を活性化するために必要な量のレインアンスロンの生成が可能となる量をいう。例えば、ヒトの体重1 kgあたりのセンノシドの投与量は、0.1〜0.8 mg/kg、好ましくは0.2〜0.7 mg/kg、より好ましくは0.3〜0.6 mg/kgである。

本願発明の便秘改善剤は、いずれの対象に適用してもよい。本願明細書でいう対象とは、腸を有する動物であればよく、ヒト及びその他の動物を意味する。本願発明の便秘改善剤は、腸内でセンノシドからレインアンスロンを生成できない対象に適用するとより効果的である。そのような対象とは、例えば、健常であるが、センノシドからレインアンスロンを生成できない腸内菌叢を有する対象、及び感染症を予防又は治療するために抗生物質を投与されたことによって腸内菌叢がダメージを受けている対象等が挙げられる。

本願発明の便秘改善剤は、医薬品又は食品（例えば、機能性食品、健康食品、サプリメントなど）として継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒剤（ドライシロップを含む）、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（チュアブル剤などを含む）、散剤（粉末剤）、丸剤などの各種の固形製剤、又は内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液状製剤などの形態で調製することができ、成分の安定性や摂取の簡便さの点からカプセル剤又は錠剤の形態が好ましいが、特に限定されるものではない。

カプセル剤又は錠剤の形態の本願発明の便秘改善剤は、医薬又は食品として許容される公知の添加物を用いて製造することができ、医薬又は食品の分野で採用されている通常の製剤化手法を適用することができる。例えば、錠剤は、各成分を処方に従って添加配合し、粉砕、造粒、乾燥、整粒、及び混合を行い、得られた調製混合物を打錠することによって調製することができる。

製剤化のための添加物としては、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、pH調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤などが挙げられる。また、液剤の形態にする場合は、ペクチン、キサンタンガム、グアガムなどの増粘剤を配合することができる。また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にしたり、ペースト状の膠剤とすることもできる。さらに、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。

本願発明の便秘改善剤は、必要に応じ、従来公知の着色剤、保存剤、香料、風味剤、コーティング剤などの成分を配合して調製することもできる。
また、本願発明の便秘改善剤は、１以上の追加成分を配合して調製してもよい。追加成分の例としては、抗酸化剤、血糖降下剤、抗コレステロール剤、免疫賦活剤、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル分（鉄、亜鉛、マグネシム、ヨード等）、脂肪酸（EPA、DHA等）等を挙げることができる。

本願発明の別の側面では、投与方法に適した形態を有する便秘改善剤を提供する。投与方法としては、例えば、経口投与及び非経口投与が挙げられるが、経口投与が好ましい。本願明細書において「経口投与に適した形態」というときは、例えば、錠剤、ロゼンジ、硬質又は軟質カプセル、水性又は油性懸濁液、乳液、分散性粉末又は顆粒、シロップ又はエリキシルが挙げられる。また「非経口投与に適した形態」とは、直腸投与に適した形態であり、例えば座薬、及び浣腸薬等が挙げられる。

本願発明の便秘改善剤が効果を発揮するためには、ビフィドバクテリウムが生きた状態で腸に到達し、センノシドからレインアンスロンが生成される必要がある。例えば、便秘改善剤を経口投与する場合、胃を通過することになるので、胃内環境からビフィドバクテリウムを保護することが好ましい。このような観点から、本願発明の便秘改善剤は腸溶コーティングされていることが好ましい。そのような便秘改善剤の形態としては、顆粒剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、及びマイクロカプセル剤等が挙げられる。例えば、本願発明に係るビフィドバクテリウムをカプセルに封入することによってカプセル剤を調製してもよい。カプセル剤は、使用目的に応じて大きさや材質を任意に調節することができる。例えば、カプセル剤を食品等に混合して使用する場合には、食品本来の食感にできるだけ影響を与えないために小さなカプセル剤を使用してもよい。そのような場合、例えば、直径１ mm以下のマイクロカプセルを使用することが挙げられる。一方、カプセル剤をサプリメントとして使用する場合には、サプリメントとして採用される一般的な大きさにしてもよい。さらに、ビフィドバクテリウム以外の成分をカプセル剤に封入してもよい。その他の成分としては、例えば、センノシド、又は本願発明の効果を維持、増強、及び／又は補完する作用を有する成分が挙げられる。

一方、本願発明のビフィドバクテリウムLKM512は、胃内環境に対して耐性を有するため、上記のような顆粒剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、及びマイクロカプセル剤等で保護しなくても生きた状態で腸に到達し、便秘改善効果を十分に発揮することができる。

本願発明の便秘改善剤は、例えば、以下のような用途に適している。例えば、飲料、発酵食品、菓子類、パン類、スープ類等の各種食品又はその添加成分として；又はドッグフード、キャットフードなどの各種ペットフード又はその添加成分として使用することができる。これらの食品の製造方法は、本願発明の効果を損なわないものであれば特に限定されず、各用途で当業者に使用されている方法に従えばよい。本願発明の便秘改善剤を適用できる食品は、例えば、対象が日常的に摂取する食品だけでなく、特定保健用食品、栄養機能食品、特別用途食品等の機能性食品にも適用できる。本願発明の便秘改善剤が適用可能な食品の具体例としては、牛乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、プリン、アイスクリーム、フルーツジュース、緑茶、紅茶、烏龍茶、コーヒー、サプリメント、及び豆乳等が挙げられる。固形食品に本願発明の便秘改善剤を加える場合には、例えば顆粒剤、及び粉剤等の形態で加えることが好ましい。また、飲料、ペースト状食品に便秘改善剤を加える場合には、例えばマイクロカプセルの形態で加えることが好ましい。

さらに、本願発明の便秘改善剤は、例えば、便秘症状の治療、予防、軽減等に使用するための医薬に適用することができる。

本願発明の理解をより容易にするために、以下に具体例を示すが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。
［試験例1］センノシド分解活性を有する菌のスクリーニング
（１−１）乳酸菌の培養と試験サンプルの調製
協同乳業株式会社が所有する乳酸菌89株を試験に供した。これらの菌株は、様々な発酵乳及びヒトの糞便より分離され、純粋培養した後に保存されたものである。

前培養として、乳酸菌をLactobacilli MRS培地（Becton Deckinson）又はGYP寒天培地（ペプトン5.0 g、酵母エキス10.0 g、ブドウ糖10.0 g、酢酸ナトリウム3水和物2.0 g、寒天15.0 g、Salts溶液5 ml、Tween 80（2.5 mg/ml）10 ml、Salts溶液（1 ml分）、硫酸マグネシウム7水和物40 mg、硫酸マンガン4水和物2 mg、硫酸鉄（II）7水和物2 mg、塩化ナトリウム2 mg）に接種し、37℃で72時間、嫌気培養することによりコロニーを形成させた。

前記コロニーの1つを白金耳で掻き取り、滅菌フィルターを通過させたセンノシドA（和光純薬工業株式会社）及びセンノシドB（和光純薬工業株式会社）をそれぞれ50μg/mlで含有するLactobacilli MRS培地又は寒天を含有しないGYP培地に接種し、37℃で48時間、嫌気培養を行った。培養後の培養液を遠心分離にかけ、上清をフィルター（0.45μm、水係）でろ過することによってろ液を得た。当該ろ液を分析に使用するまで-20℃で保存した。

（１−２）ビフィドバクテリウムの培養と試験サンプルの調製
協同乳業株式会社が所有する、ビフィドバクテリウム47株を試験に供した。これらの菌株は、様々な発酵乳及びヒトの糞便より分離され、純粋培養した後に保存されたものである。

前培養として、ビフィドバクテリウムをBL寒天培地（日水製薬株式会社）に接種し、37℃で48時間嫌気培養することによってコロニーを形成させた。
前記コロニー1つを白金耳で掻き取り、滅菌フィルターを通過させたセンノシドA及びセンノシドBをそれぞれ50μg/mlで含有するLactobacilli MRS培地に接種し、37℃で48時間、嫌気培養を行った。培養後の培養液を遠心分離にかけ、上清をフィルター（0.45μm、水係）でろ過することによってろ液を得た。当該ろ液を分析に使用するまで-20℃で保存した。

（１−３）センノシド分解活性の評価
上記（１−１）及び（１−２）で調製した培養ろ液をHPLCに供し、センノシドA及びBのピーク面積を測定した。当該ピーク面積に基づいて、培養前のセンノシドの含有量に対する培養ろ液中のセンノシドの含有量の比を算出し、センノシドの分解活性を評価した。HPLCの分析条件を以下に示す。

HPLC： Waters Allianceシステム（Waters 2696）；
検出器： UV（Waters 2487 Dual Absorbance Detector（340 nm））；
カラム： Intersil（商標）ODS-3カラム（250×3 mm、粒径4μm、GLサイエンス株式会社）；
カラム温度： 50℃；
流速： 0.8 ml/min；
注入量： 0.1 ml；
溶出条件： 14 v/v%アセトニトリルを含有する0.05 Mリン酸水溶液を用いた。分析中、アセトニトリルの濃度を次のように変化させた：
0~10分： 14 v/v%
10~28分： 14 → 35 v/v%
28~29分： 35 → 80 v/v%
29~34分：80 v/v%
10分間平衡化。

（１−４）結果
培養前後の培地中のセンノシド含量の変化を図１に示す。乳酸菌を対象とするスクリーニングでは、89株中5株、具体的には菌株番号K21、K23、K50、K77、及び2024において、培養液中のセンノシドの比率が80％以下に低下した（図1A）。一方、ビフィドバクテリウムを対象とするスクリーニングでは、47株中21株、具体的には菌株番号LKM10001、LKM10006、LKM10007、LKM10020、LKM10022、LKM10029、LKM10031、LKM10033、LKM10038、LKM10041、LKM10042、LKM10046~10048、LKM10050、LKM00230、LKM512、M5、M8、JCM1194、及びJCM1217において、センノシドの分解率が20％以上であることが示された（図1B）。特に、菌株番号LKM10033、LKM10038、LKM10042、及びM8においては、培養前後のセンノシドの比率が0.6以下、即ち70％以上の分解率を示した。

乳酸菌に比して、ビフィドバクテリウムにおいてセンノシドの分解能が高い菌株が多く発見された。これらのうち、LKM512及びM8(LKM10070株と命名)を以下の試験に使用した。
［試験例2］センノシド分解菌の特性解析
試験例1において単離されたLKM512株及びLKM10070株の特性を解析した。その結果を以下に示す。

（１）LKM512株
１．グラム陽性、偏性嫌気性菌、芽胞形成なし。
２．形態：菌体の一部あるいは両端が膨らみ、ボーリングのピン状のものが多くみられる（血液添加ＢＬ寒天培地）。
３．コロニー：正円、表面、周縁とも平滑、乳白色。(血液添加BL寒天培地)
４．アピ50 CHによる糖分解パターン（表1）

５．RAPD-PCRパターン
DNA抽出：Proteinase Kを用いて菌体を破壊し、TE飽和フェノールとエタノール沈殿を用いる一般的に知られている方法によりDNAを抽出・精製した。

反応液組成：反応液25μlあたり菌体DNA 約0.1μg、20 pmolesプライマー、0.6 U Prime STAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ株式会社)、250μM dNTP 2μl、5×Buffer 5μl。

使用プライマー（表2）

反応条件：98℃, 5分; 40℃, 5分; 72℃, 5分を4サイクル→98℃, 5分; 40℃, 1分; 72℃, 2分を30サイクル。
電気泳動：PCR産物10μlを2%アガロースゲル及び0.5μg/mlエチジウムブロミド入り1×TBEバッファーにて泳動し、UV照射下でバンドを確認した。分子量マーカーは100 bp ladderを用いた。

プライマーM13では、300 bp、400 bp、500 bp付近に明瞭なバンドが検出された。プライマーXD9では、200 bpと400 bp付近に明瞭なバンドが、750 bpと1200 bp付近に弱いバンドが検出される。プライマー102では、200 bp付近に明瞭なバンドが、450 bp付近に弱いバンドが検出される。プライマー127では、350−400 bp付近に明瞭なバンドが検出される（図2）。

（２）LKM10070株
１．グラム陽性、偏性嫌気性菌、芽胞形成なし。
２．形態：湾曲した桿菌。ブーメラン型や菌体の一部が膨らむものも多い（血液添加BL寒天培地）。
３．コロニー：正円、表面、周縁とも平滑、レンガ色。（血液添加BL寒天培地）
４．アピ50 CHによる糖分解パターン（表1）
５．RAPD-PCRパターン
DNAの抽出及びPCR反応は、上記（１）５に記載の方法に従って行った。

プライマーM13では、250−350 bp付近に明瞭なバンドが検出される。プライマーXD9では、350 bpに明瞭なバンドが、150−250 bpと400−700 bp付近に弱いバンドが検出される。プライマー102では、200 bp付近にバンドが検出される。プライマー127では、200 bpと300 bp付近にバンドが検出される（図3）。

［試験例3］培養ろ液中のレインアンスロンの検出
LKM10070株及びLKM512株をそれぞれLactobicilli MRS培地に接種し、37℃で35時間、嫌気条件下で培養した。培養液を遠心分離し、上清をフィルター（0.45μm、水系）でろ過し、ろ液を得た。Hattoriら（Chem Pharm Bull (Tokyo) 30, 1338-1346）の方法に従って、前記ろ液にアドメチン誘導化処理を施した。薄層クロマトグラフィーの条件は、Zwaving（Pharmacology 20 Suppl I, 65-75）の方法に従った。アドメチン誘導化処理液5μlをSilica-gel 60（メルク）にスポットし、n-プロパノール：酢酸エチル：水＝4：4：3で40分間展開した後、スポットの移動度（Rf）を求めた。

培養液の一部を薄層クロマトグラフィーに供した結果を図4に示す。LKM512株及びLKM10070株の培養液いずれにおいても、Rf値が0.68の位置にスポットが確認された。この値は上記Zwavingらの報告におけるRf値0.64とほぼ同じであることから、レインアンスロンに相当すると考えられる。このことから、上記菌株は、単独でセンノシドからレインアンスロンを生成することが示唆された。

［試験例4］腸内におけるセンノシドの分解
LKM512株及びLKM10070株による、in vivoにおけるセンノシドの分解能を検討した。
Crj：CD-1（ICR）マウス（日本クレア株式会社）を兄妹交配させ、得られた仔マウスを当研究室で同条件にて飼育することによって、遺伝的差異及び腸内細菌叢の差異を極力少なくしたマウス（12〜15週齢）を作製し、試験に使用した。温度を25℃、湿度を50％に制御し、かつ12時間のサイクルで明暗が切り替わる実験室内でマウスを飼育した。飼料CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）及び水道水は自由摂食とした。

実験スケジュールを図5に示す。試験開始の24時間前（図5における「-24」）、及び試験開始時（図5における「0」）に、カナマイシン硫酸塩（和光純薬工業株式会社）を75 mg/マウスの濃度でマウスに経口投与した。試験開始1.5時間後（図5中の「1.5」）にLKM512株及びLKM10070株を含有する10ｍＭリン酸緩衝液（PBS）0.4 mlをマウスに経口投与した（5×10⁸〜1×10⁹cfu/マウスに相当）。対照マウスにはPBS 0.4 mlを経口投与した。その1.5時間後（図5中の「3」）、1％炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解されたセンノシドAを0.75 mg/マウスとなるように経口投与した。その後8時間の間に排泄される糞便を2時間ごとに回収し、分析するまで-20℃で凍結保存した。

糞便中のセンノシドAはメタノールを用いて抽出した。マウスの糞便に70 v/v％メタノール5 mlを添加し、30分間振とうした。3000 rpmで10分間遠心分離を行い、上清を回収し、残渣に70 v/v%メタノール4 mlを添加して30分間振とう後、3000 rpmで10分間遠心分離を行い、上清を回収した。上清を一つに合わせ、70 v/v%メタノールで液量を12 mlに調整した。フィルター（0.45μm、水系）でろ過した後、試験例1に示した条件に設定されたHPLCを用いて糞便中のセンノシドを検出・定量した。

結果を図6に示す。カナマイシンを投与したマウス（Control）から回収した糞便中のセンノシドの含量は、カナマイシンを投与しないマウス（Blank）に比べて著しく高いことが示された（図6A及びB）。一方、LKM10070株を投与されたマウスにおいては、糞便中のセンノシドの含量が、Controlに比べて著しく低いこと、そしてその含量は、Blankに匹敵することが示された（図６A）。LKM512株でも同様の傾向が示された（図6B）。

また、LKM512株及びLKM10070株を投与されたマウスの糞便は、軟便であった。
これらの結果を鑑みると、カナマイシンによって腸内菌が死滅して菌数の激減、及び菌叢バランスの激変が起こり、センノシドの分解効率が低下した結果として、カナマイシン処理したマウスの糞便中のセンノシド含量が増加したことが考えられる。一方、LKM512株及びLKM10070株を投与されたマウスにおいては、LKM512株及びLKM10070株が腸内でセンノシドを分解した結果として、糞便中のセンノシド含量が著しく低下し、かつ糞便を促進したものと考えられる。

［試験例6］蠕動運動の活性化試験
試験例5と同様のマウス10匹を使用した。実験スケジュールを図7に示す。試験開始の24時間前（図7における「-24」）、及び試験開始時（図7における「0」）に、カナマイシン硫酸塩（Sigma）を75 mg/マウスの濃度でマウスに経口投与した。試験開始1.5時間後（図7中の「1.5」）にLKM512株を含有する10 mMリン酸緩衝液（PBS）0.4 mlをマウスに経口投与した（5×10⁸〜1×10⁹cfu/マウスに相当）。対照マウスにはPBS 0.4 mlを経口投与した。その1.5時間後（図7中の「3」）、1 w/v％炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解されたセンノシドAを0.75 mg/マウスとなるように経口投与した。その4時間後（図7中の「7」）に5 w/v%の活性炭を懸濁した10 w/v%アラビアゴム溶液0.4 mlを経口投与した。その1.6時間後（図7中の「8.6」）、マウスをエーテル麻酔して安楽死させた。直ちに開腹して腸管を摘出した。盲腸への分岐点を基点（0）として、活性炭の先端までの距離を測定した。その際、結腸方向をプラス、回腸方向をマイナスとした。実験の正確性を確保するため、LKM512株を投与したマウスと対照マウスの１ペアごとに試験を行った。この試験を11回繰り返した。

代表的な結果を図8Aに示す。LKM512株を投与したマウスの腸管においては、対照マウスの腸管に比べて、活性炭の粉末が肛門側へ移動していることが示された。平均移動距離を測定した結果（図8B）も、有意差（P < 0.05）が認められ、蠕動運動が活発化したことが確認された。

Claims

センノシドとの組み合わせにおいて使用する便秘改善剤であって、腸内においてセンノシドからレインアンスロンを単独で生成するビフィドバクテリウムを含有し、ここで、当該ビフィドバクテリウムはビフィドバクテリウム・アニマリス・アニマリス（Bifidobacterium animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、及びこれらの組合せからなる群から選択される、前記便秘改善剤。
ビフィドバクテリウムが、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の便秘改善剤。
腸内でセンノシドを分解できない対象に投与するための、請求項１又は２に記載の便秘改善剤。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の便秘改善剤を含有する食品。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の便秘改善剤を含有する医薬品。
ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum） LKM10070株（FERM P-21999）。