CN111100474A - 花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 - Google Patents
花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111100474A CN111100474A CN201911251981.6A CN201911251981A CN111100474A CN 111100474 A CN111100474 A CN 111100474A CN 201911251981 A CN201911251981 A CN 201911251981A CN 111100474 A CN111100474 A CN 111100474A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cyanine dye
- reaction
- synthesizing
- salt
- pyrrole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/10—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups
- C09B23/105—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups two >CH- groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及花菁染料的合成制备技术,具体涉及一种对酸碱有显著响应的花菁染料的设计合成,检测了该花菁染料在不同pH的PBS溶液中的吸收光谱和荧光光谱。测试发现在酸性和碱性条件下,该化合物的吸收和荧光光谱发生了明显的变化,适用于对癌细胞的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光染料的合成方法,具体为花菁染料作为酸碱响应的荧光染料的合成及其应用。
背景技术
花菁染料是一种近红外荧光染料,由含两个氮原子的杂环和多甲川链组成,其发射和吸收波长均在600-800nm之间,能有效减少生物样品由于自吸收与自发荧光身所带来的背景干扰。除此之外,花菁染料摩尔消光系数大,荧光量子产率高,水溶性好,生物相容性好,这些优点使它更适合应用在生物环境的分析中。而在生物环境中,pH是一个重要的参数,它的改变与病理学状态息息相关,是某些疾病诊断的一个重要依据(例如,癌细胞一般是酸性环境)。因此,设计一种酸碱响应的花菁染料在医学研究上有重大的意义。
但是,传统花染料通过增加聚甲川链来增加其激发波长和发射波长,容易造成染料的光稳定性降低和光漂白性增加等问题,而功能化花菁染料具有多个修饰位点,可以通过分子设计,合成得到不同官能化的菁染料。但是功能化的菁染料产率低,价格高;尤其是大Stokes位移的不对称结构的花菁染料,合成难度更大,限制了其应用。因此,本发明通过Knoevenagl缩合反应在吡咯的1位和3位连接两个含氮杂环,提供了一种简单高效的花菁染料的合成方法。
发明内容
针对上述问题,本发明的技术方案通过Knoevenagl缩合反应在吡咯的1位和3位连接两个含氮杂环,提供一种花菁染料的合成方法,工艺步骤:
(1)氮气保护下,将N-乙酰甘氨酸溶解在DMF中,在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷,室温下反应0.5-3h,再升温至80-100℃下反应3-5h(优选条件为,在室温下反应时间为1h,再升温至90℃下反应4h),反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中,经中和、萃取柱层析提纯,得到淡黄色固体粉末,即为3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛;所述的N-乙酰甘氨酸、三氯氧磷的摩尔比为1:2.5-5。
(2)将吲哚和碘甲烷溶解在乙腈中,70-90℃下搅拌反应1-3h(优选条件为吲哚和碘甲烷在乙腈中80℃下搅拌反应2h),反应完成后冷至室温,过滤、洗涤,得到淡粉色固体粉末,即为1,2,3,3,-四甲基吲哚盐;吲哚、碘甲烷的摩尔比为1:2-4。
(3)将3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐溶解在无水正丁醇中,在100-140℃下反应4-6h(优选条件为120℃下反应5h),反应结束后旋蒸除去正丁醇,柱层析提纯,得到灰黑色固体粉末,即为花菁染料,3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐的摩尔比为1:1.5-3.5。
上述反应步骤(1)中,DMF要干燥,反应温度不可过高,防止高温下DMF分解。
上述反应步骤(2)中,碘甲烷要过量,取用的时候要小心,如果是夏天泡在冰水中再取,防止温度过高快速挥发。
上述反应步骤(3)中,正丁醇要重蒸除水,反应时可加分水器除水。
本发明合成得到的产品采用磁共振氢谱与碳谱验证了上述产品的结构。同时,本发明将所制备得到的花菁染料作为酸碱响应的荧光试剂上的应用。测试发现,该化合物具有两个荧光通道,分别为875nm-900nm和500nm-650nm,在这两个荧光通道内,都是pH在3到5之间荧光开启响应,而溶酶体的正常pH为4.5-5.5,引起该化合物荧光开启响应,即该化合物可以用于生物体内。
附图说明
图1为实施例1所得到的花菁染料的核磁共振氢谱图。
图2为实施例1得到的花菁染料在DMSO溶液中的吸收和荧光图,a为吸收光谱图,b为荧光光谱图,测试浓度为10-5mol/L,激发波长为630nm。
图3为实施例1得到的花菁染料在不同pH下PBS溶液中的吸收。
图4为实施例1得到的花菁染料在470nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性,其中,a为荧光光谱图,b为570nm处的荧光强度随pH的变化曲线。
图5为实施例1得到的花菁染料在590nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性,其中,a为荧光光谱图,b为893nm处的荧光强度随pH的变化曲线。
图6为不同浓度的花菁染料在人体乳腺癌细胞MCF-7的毒性。
具体实施方式
实施例1
一种花菁染料的合成方法,步骤如下:
Step1:氮气保护下,将N-乙酰甘氨酸(8.54mmol,1g)溶解在10mLDMF中,在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷(31.3mmol,2.92mL),室温反应1h,再90℃反应4小时。反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中,加碳酸钠中和,乙酸乙酯萃取。柱层析提纯(EA:PE=2:1),得到中间体3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛,产率69%。
Step2:将吲哚(2.871g,0.018mol)和碘甲烷(7.69g,0.054mol)溶解在20mL乙腈中,80℃下搅拌2h。冷至室温后过滤,并用冷的乙醚洗涤。得到1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化物,产率60%。
Step3:将化合物双醛(0.026mol,0.5g)和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐(0.055mol,1.65g)溶解在15mL无水正丁醇中,在120℃下反应5h。反应结束后旋蒸除去正丁醇,柱层析提纯(CH2Cl2:CH3OH=20:1),得到灰黑色固体粉末,即为花菁染料,产率90%。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.32(s,1H),8.02–7.84(m,2H),7.84–7.70(m,4H),7.53(t,J=19.7,14.9,7.4Hz,4H),7.37(s,1H),7.11(d,J=14.9Hz,1H),3.91(d,J=11.7Hz,6H),1.75(t,J=11.9Hz,12H).
实施例2
氮气保护下,将3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛(0.05g,2.6mmol)和1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化物(0.165g,5.5mmol)和醋酸钠(0.067g,8.1mmol)加入反应瓶中,加入2mL乙酸酐,80℃下反应30min,反应结束后旋蒸除去溶剂,柱层析提纯。得到花菁染料,产率50%。
实施例3
将3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛(0.05g,2.6mmol)和1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化物(0.165g,5.5mmol)溶解在5mL乙醇中,回流5h。反应结束后旋蒸除去溶剂,柱层析提纯(DCM:CH3OH=100:1)。产率55%。
实施例4
取花菁染料0.0023g溶于3mL DMSO中,配成10-3M溶液,再用移液枪取出50μL于5mLDMSO中,配成10-5M溶液,分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测试该花菁染料在DMSO中的吸收光谱和荧光光谱。然后,用PBS缓冲液配置不同浓度的pH,再用移液枪取出50μL10-3M的花菁溶液于5mL不同pH的PBS缓冲液中,配成10-5M溶液,分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测试该花菁染料在不同pH的PBS缓冲液中的吸收光谱和荧光光谱。
实施例5
将花菁染料配成不同浓度放置于MCF-7细胞中,12h后观察细胞存活率。
从图2可以看出在DMSO的稀溶液中,该化合物的吸收和发射分别在625和690nm处。
从图3可以看出,该染料在酸性环境下,最大吸收波长位于470nm处,而在中性及碱性环境下,其最大吸收波长位于590nm处,表明该化合物可能存在两条荧光通道。
从图3可以看出,目标化合物在470nm和590nm两种激发波长下的荧光光谱,在470nm激发下,580nm处有明显的发射峰,且在酸性条件下荧光较强,而在中性和碱性条件下荧光较弱。相同的,在590nm激发下,在890nm处有明显的发射峰,在pH=4时荧光最强。
从图4可以看出,(a)和(b)是化合物(10-5M)在470nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性。在强酸性条件下,荧光较强,随着酸性的减弱,在pH从3-5之间,荧光强度显著下降,在中性和碱性条件下,荧光强度几乎为0.
从图5可以看出,(a)和(b)是化合物(10-5M)在590nm处激发的荧光对PBS溶液的pH依赖性。在pH为4和8时,荧光强度较高,而在其他条件下,荧光强度较低,表明有两个荧光通道。
从图6可以看出,当花菁染料的溶度浓度小于等于2.5μM时,花菁染料在人体乳腺癌细胞放置12小时后的细胞存活率大于80%,表明基本没有毒性。进一步说明了本发明所制得的花菁染料可以用于生物体内。
Claims (9)
1.一种花菁染料的合成方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)氮气保护下,将N-乙酰甘氨酸溶解在DMF中,在冰盐浴下缓慢滴加三氯氧磷,室温下反应0.5-3h,再升温至80-100℃下反应3-5h,反应结束后将反应液缓慢倒入冰水中,经中和、萃取柱层析提纯,得到淡黄色固体粉末,即为3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛;
(2)将吲哚和碘甲烷溶解在乙腈中,70-90℃下搅拌反应1-3h,反应完成后冷至室温,过滤、洗涤,得到淡粉色固体粉末,即为1,2,3,3,-四甲基吲哚盐;
(3)将3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐溶解在无水正丁醇中,在100-140℃下反应4-6h,反应结束后旋蒸除去正丁醇,柱层析提纯,得到灰黑色固体粉末,即为花菁染料,反应式如下:
2.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(1)中N-乙酰甘氨酸、三氯氧磷的摩尔比为1:2.5-5。
3.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(1)中室温下反应时间为1h,再升温至90℃下反应4h。
4.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(2)中吲哚、碘甲烷的摩尔比为1:2-4。
5.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(2)中吲哚和碘甲烷在乙腈中80℃下搅拌反应2h。
6.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(3)中3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐的摩尔比为1:1.5-3.5。
7.根据权利要求1所述的花菁染料的合成方法,其特征在于,步骤(3)中3,5-二氯-1H-吡咯-2,4-二甲醛和1,2,3,3,-四甲基吲哚盐在无水正丁醇中,在120℃下反应5h。
8.根据权利要求1-7任一项所制备得到的花菁染料作为酸碱响应的荧光试剂上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的花菁染料作为荧光试剂在检测pH为3-5的溶液上的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911251981.6A CN111100474B (zh) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911251981.6A CN111100474B (zh) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111100474A true CN111100474A (zh) | 2020-05-05 |
CN111100474B CN111100474B (zh) | 2021-03-23 |
Family
ID=70423228
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911251981.6A Active CN111100474B (zh) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111100474B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113583013A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-02 | 南通大学 | 一种pH敏感的比率型半花菁-罗丹明染料及其制备方法 |
CN113736282A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-12-03 | 三峡大学 | 一种吲哚半花菁结构光致变色染料合成及其应用 |
CN115584142A (zh) * | 2022-09-09 | 2023-01-10 | 三峡大学 | 一种红色发光环状结构花菁染料及其合成方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009005871A2 (en) * | 2007-04-10 | 2009-01-08 | Montana State University | Novel optical labeling molecules in proteomics and other biological analyses |
CN108658838A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-10-16 | 北京化工大学 | 一种基于七甲川吲哚菁的甲醛荧光探针及其制备方法和使用方法 |
CN109651835A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-19 | 云南师范大学 | 一种ir780酮式菁染料分子及其制备方法与晶体结构 |
CN110387137A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-29 | 三峡大学 | 一种吲哚半花菁结构的水溶性染料及其合成方法 |
-
2019
- 2019-12-09 CN CN201911251981.6A patent/CN111100474B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009005871A2 (en) * | 2007-04-10 | 2009-01-08 | Montana State University | Novel optical labeling molecules in proteomics and other biological analyses |
CN108658838A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-10-16 | 北京化工大学 | 一种基于七甲川吲哚菁的甲醛荧光探针及其制备方法和使用方法 |
CN109651835A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-19 | 云南师范大学 | 一种ir780酮式菁染料分子及其制备方法与晶体结构 |
CN110387137A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-29 | 三峡大学 | 一种吲哚半花菁结构的水溶性染料及其合成方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RAMU MEESALA等: ""Synthesis of new heteroaryldi(diindolyl)methanes:Colorimetric detection of DNA by di(diindolylmethyl)carbazoles"", 《J.CHEM.SCI.》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113583013A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-02 | 南通大学 | 一种pH敏感的比率型半花菁-罗丹明染料及其制备方法 |
CN113583013B (zh) * | 2021-08-31 | 2022-05-17 | 南通大学 | 一种pH敏感的比率型半花菁-罗丹明染料及其制备方法 |
CN113736282A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-12-03 | 三峡大学 | 一种吲哚半花菁结构光致变色染料合成及其应用 |
CN113736282B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-08-01 | 三峡大学 | 一种吲哚半花菁结构光致变色染料合成及其应用 |
CN115584142A (zh) * | 2022-09-09 | 2023-01-10 | 三峡大学 | 一种红色发光环状结构花菁染料及其合成方法 |
CN115584142B (zh) * | 2022-09-09 | 2023-07-11 | 三峡大学 | 一种红色发光环状结构花菁染料及其合成方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111100474B (zh) | 2021-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111100474B (zh) | 花菁染料的合成方法及作为酸碱响应的荧光试剂上的应用 | |
CN102127088B (zh) | 一种萘酰亚胺修饰的罗丹明类衍生物nrc及其制备和应用 | |
CN113135969B (zh) | 一种以壳聚糖为骨架检测pH的双光子荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN106432348A (zh) | 一种基于铕配合物的可见光可激发的比率荧光温敏探针及其制备方法和应用 | |
CN105111415B (zh) | 一种侧链含萘基团的聚噻吩衍生物及其制备方法和应用 | |
CN114315691B (zh) | 一种用于识别铜离子的非对称方酸菁比色探针及其应用 | |
CN110818732B (zh) | 基于bodipy的高效实时生物硫醇荧光检测探针 | |
CN113831339B (zh) | 一种苝酰亚胺衍生物荧光探针、制备方法及其应用 | |
CN109608382B (zh) | 一种检测氰根离子和次氯酸的荧光探针及其制备和应用 | |
CN108250211B (zh) | 一种用于检测Zn2+的荧光探针及其制备方法 | |
CN102516229B (zh) | 检测组氨酸的荧光探针及其前驱体和它们的制备方法 | |
CN105602551B (zh) | 一种以萘酰亚胺为核的近红外荧光传感分子 | |
CN111116564B (zh) | 检测次氯酸根离子的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用 | |
CN110357896B (zh) | 一类化合物及制备与其在检测二价铜离子和强酸pH中的应用 | |
CN109608495B (zh) | 一种检测hno的化合物及其制备方法和应用 | |
CN114133387B (zh) | 具有粘度传感性质的可靶向多种细胞器的荧光探针 | |
CN110642772A (zh) | 检测硝基还原酶的近红外比率荧光探针及制备方法和应用 | |
CN112898963B (zh) | 一种检测粘度的荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN106518870B (zh) | 以萘酰亚胺为核的比色‑荧光探针及其制备方法和应用 | |
CN113979984B (zh) | 一种水溶性黄酮类铝离子荧光探针的制备方法及其应用 | |
CN104387790A (zh) | 一种含噻吩基团的苯并吲哚盐染料及其制备方法和用途 | |
CN113354584A (zh) | 一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用 | |
CN107286926A (zh) | 基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用 | |
CN106432236B (zh) | 以萘酰亚胺为核的双通道铜离子探针及其制备方法和应用 | |
CN103539792A (zh) | 一种氰基取代的不对称菁类化合物,其制备方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |