CN111024832A - 多糖结合疫苗中残余氰基硼氢化钠的离子色谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

氰基硼氢化钠（NaCNBH3）能够还原多糖经高碘酸钠氧化形成的醛基与蛋白的氨基形成C=N双键，促进糖与蛋白的结合，从而被用于多糖结合疫苗的制备工艺中；本发明提供一种多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的离子色谱‑脉冲安培检测方法，包括步骤：用NaCNBH3标准品配制对照品溶液；将待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；供试品溶液和对照品溶液NaCNBH3分别上样于离子色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；根据对照品溶液NaCNBH3浓度及其色谱峰面积，供试品溶液NaCNBH3色谱峰面积，采用外标法计算试样中NaCNBH3的浓度。本发明方法简单、操作方便、精确度高，可准确、快速实现多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的有效监控。

Description

多糖结合疫苗中残余氰基硼氢化钠的离子色谱检测方法
技术领域
本发明属于测试分析领域，具体为一种利用离子色谱-脉冲安培测定NaCNBH3的方法。
背景技术
多糖结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，抗原类型从胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，能激发2岁以下儿童、老年人和免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆，诱导产生的保护性抗体主要为IgG抗体，比多糖疫苗诱导产生的IgM更有效，且能维持较长时间，具有多糖疫苗不可比拟的优势。在多糖结合疫苗的制备工艺中，荚膜多糖经高碘酸钠氧化形成的醛基与蛋白的氨基形成C=N双键，在催化剂氰基硼氢化钠的条件下，C=N双键被还原成稳定单键，从而促进了结合反应的右移。因此，氰基硼氢化钠（NaCNBH3）被广泛的应用在多糖结合疫苗的制造领域。由于该物质含有氰基，具有一定的毒性，故需要对结合疫苗中残余NaCNBH3进行有效监控，准确测定多糖结合原液疫苗中NaCNBH3的残留量对疫苗产品质量控制具有重要意义。
目前，国内采用紫外可见分光光度法（UV）和酶标法，来测定花粉蛋白注射液NaCNBH3的含量，此法反应时间长（5h），条件复杂，灵敏度低，且目前国内无相关文献报道多糖结合疫苗中NaCNBH3残留量的测定方法，因此如何对多糖结合疫苗中痕量NaCNBH3残留进行准确测定仍是一个技术难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱-脉冲安培的检测方法。通过该方法，可准确、快速实现多糖结合疫苗中0.05umol残余NaCNBH3的有效监控。
本发明所述的多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱-脉冲安培测定方法，包括如下步骤：
(1)用NaCNBH3标准品配制不同浓度的对照品溶液；
(2)待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
(3)供试品溶液和对照品溶液NaCNBH3分别上样于离子色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；
(4)以对照NaCNBH3溶液的系列浓度对其相应的色谱峰面积作直线回归，然后将供试品溶液的NaCNBH3色谱峰面积代入直线回归方程，求出其相应浓度。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的多糖结合疫苗中残余NaCNBH3的离子色谱-脉冲安培检测方法，在试样处理中，用30KD的超滤管4000g离心20分钟排除了细菌多糖对NaCNBH3测定的干扰，试样中NaCNBH3能得到良好分离和准确定量。两组加标样品中NaCNBH3的回收率分别为94.1%~101.6%。本发明方法简单、操作方便、精确度高，为试样中NaCNBH3的测定提供了良好的条件，可以用于流脑、HIB及肺炎等多种多糖结合疫苗中NaCNBH3残余的测定。
附图说明
图1为专属性测定结果；
图2为线性测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应用来限制本发明的范围。
实施例1
b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液中NaCNBH3残余的测定：
1. 精密制取0.5umol/L、 1.0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/LNaCNBH3标准溶液
2 . b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液用30KD的超滤管4000g离心20分钟, 收取滤过液，稀释10倍后用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
3. 标准溶液、供试品溶液分别按照色谱条件进行上样检测；
色谱条件的设定：
3.1流动相：50mmol/L NaOH溶液；
3.2 色谱柱：AG11–HC,AS11–HC柱，购自thermo公司；
3.3 检测器：脉冲安培检测器，参比电极为氯化银，检测波形“银电极，S-2,CN-”；
3.4 检测方法：色谱峰面积外标定量法；
3.5 进样体积：25μl，
3.6 色谱柱温度：30℃；
3.7 流速：1ml/min。
4. 结果
Figure RE-973797DEST_PATH_IMAGE001
根据测定值，计算曲线方程：Y=0.037X+0.0035
其中Y为峰面积，X为浓度；
供试品中氰基硼氢化钠峰面积为0.042，计算供试品中氰基硼氢化钠浓度为10.4umol/L
10.4umol/L远远小于标准0.05mmol/L
本发明方法的方法学验证：
专属性验证：
由于在制备结合物过程中主要涉及以下化学物质，因此在进行方法专属性研究时分别用10μmol/L浓度的NaCNBH3标准品、水空白、10mg/L 碳酸氢钠、10mg/L碳酸钠、10mg/L磷酸氢二钠、10mg/L磷酸二氢钠、按照实施例1中的方法进行检测，测试结果见附图1：
10μmol/L浓度的NaCNBH3在3.93min明显单峰（见图1），而碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠在此位置未出现任何吸收峰，因此说明该方法对NaCNBH3进行检测专属性良好。
检测限、定量限验证：
分别配制0.01umol/L、0.05umol/L、0.25umol/L低浓度的NaCNBH3标准样品，按照实施例1中方法进行进样检测，结果如表1所示：
Figure RE-422096DEST_PATH_IMAGE002
当NaCNBH3浓度为0.01umol/L时S/N=4.7，满足信噪比至少为3:1，初步确定0.01umol/L为NaCNBH3检测的检测限；当NaCNBH3浓度为0.05umol/L时，信噪比约为14.2:1，确定0.05umol/L为NaCNBH3检测的定量限。
线性验证：
分别配制0.5umol/L、 1.0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/L5个浓度的NaCNBH3对照品溶液，按照实施例1中方法进行进样检测，实验结果如表1所示：各个样品在3.93分左右均出现洗脱峰，线性回归方程为Y=0.037X+0.0035，R=0.9999（n=5），线性成立。
精密度验证：
取b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液试样，按照实施例1的方法平行测定测定6次NaCNBH3的含量，计算精密度。测试结果如下表3所示：
Figure RE-405095DEST_PATH_IMAGE003
相对标准偏差为1.13%，说明精密度良好。
回收率测定：
在b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液样品中分别添加10 umol/L和20umol/L的NaCNBH3标准品各三份，按照实施例1的方法测定试样中NaCNBH3的含量。测定量与加入量相比为NaCNBH3的回收率。测定结果如下表4所示：
Figure RE-206829DEST_PATH_IMAGE004
两组加标样品回收率均在94.1%~101.6%之间，测定结果显示了该方法用于测定多糖结合物中NaCNBH3P残留量具有良好的准确度。

Claims (7)

1.多糖结合疫苗中残余NaCNBH3离子色谱测定方法，其特征在于包括如下步骤：
用NaCNBH3配制对照品溶液；
待检样品用超滤离心管进行离心,收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
供试品溶液和对照品溶液NaCNBH3分别上样于离子色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；
根据对照品溶液NaCNBH3浓度及其色谱峰面积，供试品溶液NaCNBH3色谱峰面积，采用外标法计算试样中NaCNBH3的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的待检样品为多糖结合物原液。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的超滤离心管为3KD-30KD。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的离子色谱柱为AG11–HC,AS11–HC柱。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的洗脱的流动相为50mmol/L NaOH溶液。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的上样体积为25μl。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(3)中所述的记录色谱图是在脉冲安培检测器，参比电极为氯化银，检测波形“银电极，S-2,CN-”下的色谱图。
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