CN110987579A - 一种快速从微量血液中富集纯化维生素d的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，包括具体制备步骤：S1：取血清样本10μL,加入10μL100％甲醇及1％三氟乙酸，涡旋混匀；S2：12000g离心1分钟；S3：取上清5μL，加入到SPE小柱中；S4：5000g离心1分钟；S5：换管，加入10μL5％氨水及80％乙腈；S6：5000g离心1分钟，收集液体，氮气吹干，需1分钟。因为血清中维生素D得到充分富集，因此极大提高检测灵敏度，所需的血清量为原方法的1/20，仅需微量样品，因此可用于末梢取血(无需静脉抽血)；极大缩短了样品制备时间，从原先的20min缩短到4min；原方案中需使用大量甲醇、正己烷，新方案中每个样本使用的甲醇体积为原来的1/20，无需使用正己烷，极大降低毒性有机溶剂的使用剂量。

Description

一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法
技术领域
本发明涉及一种方法，特别涉及一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法。
背景技术
维生素D是一簇类固醇脂溶性激素，共有5种化合物，其中与健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3。维生素D能够帮助身体吸收钙和磷，调节人体免疫功能，减少有害炎症反应。因此，准确测定维生素D体内含量非常重要。用质谱检测方法进行维生素D的检测具有重复性好，准确率高的特点，目前已经开始取代传统的以免疫为主的检测方法。而在质谱检测中，样本的制备环节十分重要，决定了结果的准确性。
目前，样本制备环节方法如下：
1.取血清样本200μL,加入200μL100％甲醇及0.1％甲酸，涡旋混匀。
2.12000g离心5分钟。
3.取上清200μL，加入400μL正己烷，涡旋混匀。
4.12000g离心5分钟。
5.取上清300μL，氮气吹干，需10分钟。
此方法主要问题是有毒有害的有机溶剂用量较大，对操作人员存在潜在的危害，且处理时间较长，一个样本需处理超过20分钟，不利于大量样本的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，以解决上述背景技术中提出的维生素D样本的制备有毒有害的有机溶剂用量较大，对操作人员存在潜在的危害，且处理时间较长，一个样本需处理超过20分钟，不利于大量样本的制备的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，包括具体制备步骤：
S1：取血清样本10μL,加入10μL100％甲醇及1％三氟乙酸，涡旋混匀；
S2：12000g离心1分钟；
S3：取上清5μL，加入到SPE小柱中；
S4：5000g离心1分钟；
S5：换管，加入10μL5％氨水及80％乙腈；
S6：5000g离心1分钟，收集液体，氮气吹干，需1分钟。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S1中进行涡旋混匀时，需要依次将10μL100％甲醇和1％三氟乙酸放入血清样本中，待其中一种添加剂混合均匀时，在加入第二种，避免在同时加入10μL100％甲醇和1％三氟乙酸时，使得10μL100％甲醇和1％三氟乙酸相互发生反应，对样本造成破坏。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S3中加入SPE小柱中，需要对SPE小柱进行活化，同时选择合适大小的SPE小柱。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S5中加入10μL5％氨水及80％乙腈时，需要分开加入两种添加剂，待其中一个混合均匀再加入另一个，避免10μL5％氨水及80％乙腈相互反应，破坏样本。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S6中氮气吹干时，需要调节合适的温度压力及吹干时间。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，因为血清中维生素D得到充分富集，因此极大提高检测灵敏度，所需的血清量为原方法的1/20，仅需微量样品，因此可用于末梢取血(无需静脉抽血)；
2、本发明一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，极大缩短了样品制备时间，从原先的20min缩短到4min；
3、本发明一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，原方案中需使用大量甲醇、正己烷，新方案中每个样本使用的甲醇体积为原来的1/20，无需使用正己烷，极大降低毒性有机溶剂的使用剂量。
附图说明
图1为原方法测定维生素D2含量示意图；
图2为本发明测定维生素D2含量示意图；
图3为原方法测定维生素D3含量示意图；
图4为本发明测定维生素D3含量示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供了一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法的技术方案：
实施例一(原方法)：
S1：取血清样本10μL,加入10μL100％甲醇及1％三氟乙酸，涡旋混匀；
S2：12000g离心1分钟；
S3：取上清5μL，加入到SPE小柱中；
S4：5000g离心1分钟；
S5：换管，加入10μL5％氨水及80％乙腈；
S6：5000g离心1分钟，收集液体，氮气吹干，需1分钟。
实施例二：
在实施例一(原方法)的基础上，新方法为：
S1：取血清样本10μL,加入10μL100％甲醇及1％三氟乙酸，涡旋混匀；
S2：12000g离心1分钟；
S3：取上清5μL，加入到SPE小柱中；
S4：5000g离心1分钟；
S5：换管，加入10μL5％氨水及80％乙腈；
S6：5000g离心1分钟，收集液体，氮气吹干，需1分钟。
原方法(图1)与新方法(图2)测定维生素D2含量结果对比：由结果可知原方法最终从50μL血清中富集纯化出的维生素D2与新方法中最终从2.5μL中血清中富集纯化出的维生素D2的质量比为2:1,即纯化的富集效率新方法是原方法的10倍；
原方法(图3)与新方法(图4)测定维生素D3含量结果对比：由结果可知原方法最终从50μL血清中富集纯化出的维生素D3与新方法中最终从2.5μL中血清中富集纯化出的维生素D3的质量比为5:1,即纯化的富集效率新方法是原方法的4倍。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，包括具体制备步骤，其特征在于：
S1：取血清样本10μL,加入10μL100％甲醇及1％三氟乙酸，涡旋混匀；
S2：12000g离心1分钟；
S3：取上清5μL，加入到SPE小柱中；
S4：5000g离心1分钟；
S5：换管，加入10μL5％氨水及80％乙腈；
S6：5000g离心1分钟，收集液体，氮气吹干，需1分钟。
2.根据权利要求1所述的一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，其特征在于：所述S1中进行涡旋混匀时，需要依次将10μL100％甲醇和1％三氟乙酸放入血清样本中，待其中一种添加剂混合均匀时，在加入第二种。
3.根据权利要求1所述的一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，其特征在于：所述S3中加入SPE小柱中，需要对SPE小柱进行活化，同时选择合适大小的SPE小柱。
4.根据权利要求1所述的一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，其特征在于：所述S5中加入10μL5％氨水及80％乙腈时，需要分开加入两种添加剂，待其中一个混合均匀再加入另一个。
5.根据权利要求1所述的一种快速从微量血液中富集纯化维生素D的方法，其特征在于：所述S6中氮气吹干时，需要调节合适的温度压力及吹干时间。
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