CN110982701B - 一株生产微生物油脂的雅致小克银汉霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物制备柴油技术领域，本发明提供了一株雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株XY01075 CGMCC No.18838及其在制备生物柴油中的应用。本发明提供的菌株已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的菌株具有生长迅速、易于培养、生物量高、含油率高和能生产大量的油酸。

Description

一株生产微生物油脂的雅致小克银汉霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物制备柴油技术领域。
背景技术
近年来，微生物由于富含油脂而得到广泛关注。通常研究人员将干菌体的含油率在20％-70％的微生物称为油脂微生物(Wynn et al,2001；Ratledge,2004)。按照该标准，真菌界(Fungi)毛霉门(Mucoromycota)毛霉目(Mucorales)小克银汉霉属(Cunninghamella)的大多数物种都能称之为油脂微生物。该类群生物量较大，能够产生高百分比含量的不饱和脂肪酸，但含油率并不突出。比如，Cunninghamella echinulata的含油率范围在30％-48％(Fakas et al,2008；Alakhras et al,2015)；Cunninghamellablakesleeana通过培养条件(C：N比、培养温度和pH等)的优化，干菌体的含油率也只有41％(Sukrutha et al,2014)。如何实现高含油量的菌株成为目前的技术难点。
发明内容
本发明专利公开了一株雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株XY01075CGMCC No.18838及其在制备生物柴油中的应用。
本发明提供的菌株已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该中心简称为CGMCC，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC No.18838。
本发明提供的菌株具有生长迅速、易于培养、生物量高、含油率高和能生产大量的油酸。
附图说明
图1是Cunninghamella elegans XY01075的孢囊梗，孢囊孢子显微图。
图2是菌株Cunninghamella elegans XY01075脂肪酸成分气相色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.菌种的采集和培养
菌株XY01075分离自土壤样品，采集地点为江苏省镇江市，分离培养基是PDA(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L)，培养温度为25℃。
菌株进行活化之后，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于培养基中，然后在摇床中140rpm，25℃培养5天。培养完成后，真空抽滤发酵液得到鲜菌体，取出100mg鲜菌体采用气相色谱的方法对脂肪酸成分进行鉴定，其余进行烘干处理得到干菌体提取微生物油脂。
2.菌株鉴定：
(1)分子生物学鉴定
分子生物学使用ITS rDNA序列，设计特异性引物如下：
引物1：5'-GGC TTA ATT TGA CTC AAC ACG G-3'；
引物2：5'-GCT ATC CTG AGG GAA ACT TCG-3'。
ITS rDNA分子条形码序列如序列表1所示。
(2)菌株形态：
菌株XY01075属于低等真菌，菌丝无隔多核，孢囊梗单轴或总状分枝，顶端膨大成泡囊，泡囊上通过小梗着生众多圆形小孢子囊，直径在10um左右，孢囊壁持久且遇水不消解，布满碳酸钙小刺，小孢子囊内着生单个孢囊孢子，圆形、椭圆形或卵形，内含物丰富。
(3)菌种鉴定
菌株XY01075的rDNA序列在National Center for Biotechnology Information,U.S.National Library of Medicine(NCBI)数据库中进行BLAST，结果显示其与雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株CBS 773.68的序列最为相似，相似度为99.85％，同时结合显微图片，推测菌株XY010775是雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)。
雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株XY01075已于2019年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该中心简称为CGMCC，该菌株保藏中心登记入册标号为CGMCC No.18838。
3.含油率测定和脂肪酸分析：
菌株活化，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于培养基中，然后在摇床中140r/min，25℃条件下培养5天。培养完成后，真空抽滤得到鲜菌体，取出100mg采用气相色谱的方法对脂肪酸成分进行鉴定，其余进行烘干处理得到干菌体提取微生物油脂。
培养基(Kendrick&Ratledge,1992)的主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/L KH2P04,2.0g/L Na2HP04,1.5g/L MgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/L CaCl2.2H20,8mg/L FeCl3·6H20,1mg/L ZnS04·7H20,0.1mg/L CuSO4·5H20,0.1mg/L CO(NO3)2·6H20and 0.1mg/L MnS04·5H20,pH 6.0，。
微生物油脂的提取：1g干菌体加入6M盐酸5mL，之后沸水浴30min，冷却后加入95％乙醇10mL，之后再加入石油醚和乙醚各5mL，震荡均匀后，5000rpm离心3min，最后蒸发萃取剂得到微生物油脂。
气相色谱样品制备：称取100mg菌体，置于5mL的螺口玻璃管中。向样品管中加入1mL试剂I(皂化试剂Saponification Reagent：150mL去离子水、150mL甲醇、45g NaOH)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出观察试管是否漏气，如有漏气，将样品冷却到室温，转移到新的试管，重新沸水浴5min测试，如无漏气现象，将试管震荡5–10s，继续沸水浴25min，取出试管，用流水冲洗试管壁使其冷却。将冷却的试管打开，加入2mL试剂II(甲基化试剂MethylationReagent：325mL 6mol·L-1HCl、275mL甲醇)，拧紧盖子，震荡5–10s,迅速放入设定为80℃的水浴锅中加热10min，取出试管用流水快速冷却至室温。向冷却后的试管中加入1.25mL试剂III(萃取试剂Extraction Solvent：200mL甲基叔丁基醚(MTBE)、200mL正己烷)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃10min，用干净的巴斯德吸管将每个试管中的下层水相丢弃。向样品中加入3mL试剂IV(洗涤试剂Base Wash：10.8g NaOH、900mL去离子水)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃5min，用干净的巴斯德吸管收集上层有机相的2/3[若液面浑浊，可向试管中加几滴试剂V(饱和NaCl溶液：40g NaCl、100mL去离子水)，减少乳化现象]，装入干净的气相色谱瓶，用于气相检测。
脂肪酸成分分析：气相色谱系统采用美国安捷伦7890A型(AgilentChromatograph:GC)，包括全自动进样装置、石英毛细管柱(HP-ULTRA 2，25.0m×200μm×0.33μm)及氢火焰离子化检测器。按以下色谱条件平行分析脂肪酸甲酯混合物标样(美国MIDI公司)和待检样本。二阶程序升高柱温，初始温度170℃，5℃·min-1升至260℃，然后40℃·min-1升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃，检测器温度300℃，载气为氢气(2mL·min-1)，尾吹气为氮气(30mL·min-1)，柱前压10psi，进样量1μL，进样分流比100:l。使用林营志等人编写的PLFAsEco程序(Lin et al,2009)，将Sherlock MIS 6.2检测出的原始单个菌株脂肪酸数据提取并转换成以菌株为样本、脂肪酸为指标的数据矩阵Excel文件，对各属脂肪酸组成进行分析，其生物量为14.69g/L，油脂量为7.74g/L，含油率为52.68％，油酸含量占总脂肪酸的39.16％。
Figure BDA0002291963320000061
注：NA表示未检测到。
4由微生物油脂制备生物柴油
使用甲醇作为溶剂，氢氧化钠(NaOH)用作微生物油酯交换反应的催化剂。将NaOH按4g/L的比例加入到甲醇中，剧烈搅拌混合物直到NaOH完全溶解在甲醇中，然后在提取的微生物油脂中加入NaOH-甲醇溶液(W/V＝1:20),50℃下保持10h。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株生产微生物油脂的雅致小克银汉霉菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctgtagtg actgcggagg tcattactta ttcggtcatt ggtttttatt caaaaacctt 60
tggctttaaa tcatccacag tgtgggaaat gtcttctaac gcttgtgcct ggttcagtct 120
agtgctgcca cttgagttta ctcttgggtc aagggacctt tgggtagttt gttcattcgt 180
gaacaacctc ttgtaacggg gataagatta attttattat actaaatttt actgaactga 240
tagaccataa atctatggtt gttttttatt ataaacaaaa aaacaacttt cagcaatgga 300
tctctcggct ttcgtatcga tgaagaacgc agcaaatcgc gatatgtaat gtgatctgcc 360
tatagtgaat catcaaatct ttgaacgcat cttgcacctt atggtattcc ataaggtacg 420
tctgtttcag taccactagt aaatctcccc tccaccttgg tggtttaaaa ggaagagata 480
aattattact ggttctggtg attcttgatt tattaagaat tactctcgac ctaaatataa 540
ggctcgactt ttttattaga tctcgcatct ggtaaaacct agtcggcttt aataggattt 600
atttcttatt aggtttatag ccatcatttt acttttaaat cttggcctga aatcagatgg 660
gactacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa aagaaaataa caatgattcc 720
cctagtaacg gcgagtgaag agggaaaagc tcaaagttgg aacctggtgg gcatagctca 780
cccggattgt aaactaaagt ttttgagtcg tttagtcagc caggtaaata agtcctctgg 840
aaaggggcga catagagggt gaaatccccg tctttggcct gagttttg 888

Claims (2)

1.一株雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株，其特征在于，所述菌株为雅致小克银汉霉XY01075，其保藏编号为CGMCC No.18838。
2.权利要求1所述菌株在制备生物柴油中的应用。
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