CN110954622A - 一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法 - Google Patents

一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定旋覆花中1,3‑二咖啡酰奎宁酸含量的方法，属于中药有效成分含量检测技术领域。通过加热回流提取旋覆花中有效成分1,3‑二咖啡酰奎宁酸，以作为供试品溶液，再与对照品溶液均经高效液相色谱仪进行测定，可实现对旋覆花中有效成分1,3‑二咖啡酰奎宁酸的定性和定量检测，且本检测限可达0.23μg/ml；本方法具有操作简便、稳定性高、重复性好、专属性强等特性，为后续旋覆花中1,3‑二咖啡酰奎宁酸的定性定量的研究，以及产品质量控制、评价指标建立等提供可靠的检测方法。

Description

一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法
技术领域
本发明是一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，具体涉及一种采用高效液相色谱法测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，属于中药有效成分含量检测技术领域。
背景技术
咖啡酰奎宁酸类化合物，是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯键连接而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、杜仲、百花刺参、旋覆花、山银花等中药植物中。具有抗氧化、抗炎、抗菌抗病毒、细胞保护、免疫调节、抗高血糖高血脂和抗癌等药理活性。以旋覆花为例，旋覆花为菊科植物旋覆花或欧亚旋覆花的干燥头状花序，主要用于治疗风寒咳嗽，痰饮蓄结，胸膈痞满，喘咳痰多，呕吐噫气，心下痞硬等病症，具有降气，消痰，行水，止呕的功效。
近年来，随着对旋覆花中咖啡酰奎宁酸类化合物药理活性的深入研究，人们发现，旋覆花中所含的咖啡酰奎宁酸类化合物具有多方面的生物活性，以专利号为CN201110112717.1，发明名称为咖啡酰奎宁酸类化合物的专利文献为例，其中提到，咖啡酰奎宁酸类化合物的用途一方面是作为流感病毒RNA 聚合酶抑制剂和预防的应用，另一方面是其在制备预防和/或治疗与流感病毒RNA 聚合酶相关疾病的药物的应用，特别是在制备抗流感药物中的应用和在制备抗禽流感病毒(H5N1) 的药物中的应用。由此可见旋覆花中咖啡酰奎宁酸类化合物在抗流感药物开发过程中具有巨大的潜在价值。我们知道，旋覆花中含有多种咖啡酰奎宁酸类化合物，开发和挖掘旋覆花中不同咖啡酰奎宁酸类化合物的药效和作用，将作为当前旋覆花新药开发的一个切入点。王彩芳等在“HPLC法测定线叶旋覆花中1,5-二咖啡奎宁酸含量”（药物研究，2008年9月5卷第25期，32-33）中建立了以高效液相色谱法测定线叶旋覆花中有效成分1,5-二咖啡奎宁酸含量的方法，1,5-二咖啡奎宁酸具有保护肝细胞、抗肝损伤、抗肝纤维化等方面的显著作用，为旋覆花的生产开发和质量控制提供科学依据。
1,3-二咖啡酰奎宁酸具有增强胆汁降低脂肪，肝脏解毒，预防脂肪肝；能有效抑制LDL胆固醇氧化，降低胆固醇；有护肝作用，能修复受损肝细胞等作用，常应用于减肥降脂配方，护肝及解酒药中使用。已有研究表明，1,3-二咖啡酰奎宁酸是旋覆花的主要成分，但目前却鲜有关于旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸的含量检测、分离纯化的研究报道。2015版《中国药典》中也未记载有关于旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸的鉴定和含量测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，采用加热回流方式提取旋覆花中有效成分，以作为供试品溶液，再与对照品溶液均经高效液相色谱仪进行测定，可实现对旋覆花中有效成分1,3-二咖啡酰奎宁酸的定性（鉴别）和定量（含量）检测，且本检测限可达0.23μg/mL；本方法具有操作简便、稳定性高、重复性好、专属性强等特性，为后续旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸的定性定量的研究，以及产品质量控制、评价指标建立等提供可靠的检测方法。
本发明通过下述技术方案实现：一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，包括以下步骤：
A．称取1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，采用30%甲醇为溶剂，以浓度梯度配制至少五份对照品溶液；
B．将经步骤A配制的至少五份对照品溶液分别进样于高效液相色谱仪中，经测定，得各对照品溶液对应的色谱图；
C．以各对照品溶液的浓度为横坐标，对应色谱图中1,3-二咖啡酰奎宁酸色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；
D．称取待测定的旋覆花供试品，置于圆底烧瓶中，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5～2.5 h，放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液过滤，以滤液作为供试品溶液；
E．将步骤D所得的供试品溶液进样于高效液相色谱仪中，再以与步骤B一致的条件进行测定，得供试品溶液的色谱图；
F．将供试品溶液色谱峰的峰面积带入步骤C中所得的线性回归方程中，得待测定的旋覆花供试品中的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量。
所述步骤A中，依次按0.0508mg/ml、0.1058mg/ml、0.1678mg/ml、0.3087 mg/ml、0.4786mg/ml的浓度梯度配置对照品溶液。采用该浓度梯度，具有较高的测定准确性。
所述步骤D中，供试品溶液的制备方法包括：称取旋覆花供试品，干燥，粉粹为50～80目的旋覆花粉末，置于圆底烧瓶中，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5～2.5 h，放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液过滤，以滤液作为供试品溶液。
所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的色谱柱填料为C18，柱长为250mm，内径为4.6mm，滤膜孔径为5μm。
所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的检测波长为320nm。
所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的色谱柱温度为15～40℃。
所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的流动相为乙腈与0.2%磷酸溶液。
T(min) 0 12 30 31 41 42 54
乙腈（%） 5～15 10～20 27～37 60～95 60～95 5～15 5～15
0.2%磷酸（%） 95～85 90～80 73～63 40～5 40～5 95～85 95～85
所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的流动相的流速为0.5～1.5 ml/min。
所述步骤B和E中，对照品溶液和供试品溶液的进样量相同，进样量均为5～20μl。
本发明所用的旋覆花供试品为旋覆花药材，市场可以直接购买获得。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明采用高效液相色谱法，以1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品进行定位，对旋覆花中的1,3-二咖啡酰奎宁酸进行定性定量检测，测量方法操作简单，专属性、定量限、检测限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性、耐用性等方面均能得到有效保障，RSD均小于2.0%，实际检测效果良好。
（2）本发明实用性强，在实际测量过程中，其检测限可达0.23μg/ml，既可以判断旋覆花药材真伪，又可以判断旋覆花药材质量的优劣，检测过程简单、快捷。
（3）本发明以旋覆花药材的提取液为供试品溶液，以1,3-二咖啡酰奎宁酸30%甲醇溶液为对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，在该测定方法中，具有供试品溶液制备简单，设备要求较低，实验操作安全，稳定性高，重复性好，专属性强，以及操作简便等优点。
附图说明
图1为本发明实施例中使用的供试品YYC18032701的紫外图。
图2为本发明实施例中使用的供试品YYC18032702的紫外图。
图3为本发明实施例中使用的供试品YYC18032705的紫外图。
图4为本发明实施例中使用的1,3-二咖啡酰奎宁酸的紫外图。
图5为本发明中实施例1的标准曲线图。
图6为本发明中实施例7的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
供试品来源：以成都荷花池中药市场三个批次的旋覆花药材为供试品，批号分别为YYC18032701、YYC18032702及YYC18032705；
对照品来源：以1,3-二咖啡酰奎宁酸（由成都普思生物科技股份有限公司生产，产品批号为PS011116，纯度99.36%）作为对照品；
所涉及试剂：甲醇、乙腈、磷酸、超纯水（超纯水主要用于配制流动相0.2%磷酸水溶液和30%甲醇）；
所涉及仪器：梅特勒SQP十万分之一电子天平、中佳HC-2062离心机、Waters 2695-2996及Agilent 1100。
图1至图4分别为供试品（YYC18032701、YYC18032702及YYC18032705）和1,3-二咖啡酰奎宁酸的紫外图。
实施例1：
一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，使用高效液相色谱仪测定红花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸的含量，具体步骤如下：
A．称取1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，以30%甲醇为溶剂，配制成浓度分别为0.0508mg/mL、0.1058mg/mL、0.1678mg/mL、0.3087 mg/mL及0.4786mg/mL的五份对照品溶液；
B．将经步骤A所得的五份对照品溶液分别以10μL的进样量进样于高效液相色谱仪中，得各对照品溶液对应的色谱图，高效液相色谱仪内的条件为：
色谱柱：C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，滤膜孔径为5μm；
色谱柱柱温：35℃；
流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液，两者体积比为:
Figure DEST_PATH_IMAGE001
流速：1.0 ml/min。
检测波长：320 nm；
C．以各对照品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中1,3-二咖啡酰奎宁酸色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=23223170.6564x+8818.2362，R2=0.9999）（如图5所示），同时，可知：1,3-二咖啡酰奎宁酸含量在0.0508～0.4786mg/mL范围内具有良好的线性关系；
D．称取待批号为YYC18032705的旋覆花供试品1.0g，干燥，粉粹为60目的旋覆花粉末，加入适量30%甲醇，称定，加热回流2.0h。放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液，使用0.35μm 的微孔滤膜过滤，以续滤液作为供试溶液，再将所得的供试品溶液进样于高效液相色谱仪中，再以与步骤B一致的条件进行测定，得供试品溶液的色谱图，将其中1,3-二咖啡酰奎宁酸峰的峰面积带入步骤C所得线性回归方程中，得待测定供试品中的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量为0.217%。
同时，得出：以信噪比为3时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为检测限，即浓度为0.23μg/mL；以信噪比为10时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为定量限，即浓度为0.89μg/mL。
实施例2：
一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，使用高效液相色谱仪测定红花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸的含量，具体步骤如下：
A．称取1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，以30%甲醇为溶剂，配制成浓度分别为0.0508mg/mL、0.1058mg/mL、0.1678mg/mL、0.3087 mg/mL及0.4786mg/mL的五份对照品溶液；
B．将经步骤A所得的五份对照品溶液分别以5μL的进样量进样于高效液相色谱仪中，得各对照品溶液对应的色谱图，高效液相色谱仪内的条件为：
色谱柱：C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，滤膜孔径为5μm；
色谱柱柱温：15℃；
流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液，两者体积比为:
Figure 757031DEST_PATH_IMAGE002
流速：0.5 ml/min。
检测波长：320 nm；
C．以各对照品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中1,3-二咖啡酰奎宁酸色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=23223170.6564x+8818.2362，R2=0.9999），同时，可知：1,3-二咖啡酰奎宁酸含量在0.0508～0.4786mg/mL范围内具有良好的线性关系；
D．称取待批号为YYC18032705的旋覆花供试品1.5g，干燥，粉粹为50目的旋覆花粉末，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5h。放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液，使用0.22μm 的微孔滤膜过滤，以续滤液作为供试溶液，再将所得的供试品溶液进样于高效液相色谱仪中，再以与步骤B一致的条件进行测定，得供试品溶液的色谱图，将其中1,3-二咖啡酰奎宁酸峰的峰面积带入步骤C所得线性回归方程中，得待测定供试品中的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量为0.217%。
同时，得出：以信噪比为3时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为检测限，即浓度为0.23μg/mL；以信噪比为10时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为定量限，即浓度为0.89μg/mL。
实施例3：
一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，使用高效液相色谱仪测定红花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸的含量，具体步骤如下：
A．称取1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，以30%甲醇为溶剂，配制成浓度分别为0.0508mg/mL、0.1058mg/mL、0.1678mg/mL、0.3087 mg/mL及0.4786mg/mL的五份对照品溶液；
B．将经步骤A所得的五份对照品溶液分别以20μL的进样量进样于高效液相色谱仪中，得各对照品溶液对应的色谱图，高效液相色谱仪内的条件为：
色谱柱：C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，滤膜孔径为5μm；
色谱柱柱温：40℃；
流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液，两者体积比为:
Figure DEST_PATH_IMAGE003
流速：1.5 ml/min。
检测波长：320 nm；
C．以各对照品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中1,3-二咖啡酰奎宁酸色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=23223170.6564x+8818.2362，R2=0.9999），同时，可知：1,3-二咖啡酰奎宁酸含量在0.0508～0.4786mg/mL范围内具有良好的线性关系；
D．称取待批号为YYC18032705的旋覆花供试品1.2g，干燥，粉粹为80目的旋覆花粉末，加入适量30%甲醇，称定，加热回流2.5h。放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液，使用0.45μm 的微孔滤膜过滤，以续滤液作为供试溶液，再将所得的供试品溶液进样于高效液相色谱仪中，再以与步骤B一致的条件进行测定，得供试品溶液的色谱图，将其中1,3-二咖啡酰奎宁酸峰的峰面积带入步骤C所得线性回归方程中，得待测定供试品中的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量为0.217%。
同时，得出：以信噪比为3时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为检测限，即浓度为0.23μg/mL；以信噪比为10时，所对应的1,3-二咖啡酰奎宁酸浓度为定量限，即浓度为0.89μg/mL。
实施例4：
本实施例对批号为YYC18032705批次的旋覆花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定，并平行进样六次，其余以与实施例1相同的处理方法，结果见表1所示：
表1 本测定含量方法的精密度
Figure 611854DEST_PATH_IMAGE004
由表1得知：本测定含量方法的相对标准偏差RSD为0.685%，试验方法精密度符合要求。
实施例5：
本实施例对批号为YYC18032705批次的旋覆花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定，并平行处理六份供试品溶液，分别进样一次，其余以与实施例1相同的处理方法，结果见表2所示：
表2 本测定含量方法的重复性
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表2得知：本测定含量方法的相对标准偏差RSD为0.612 %，试验方法重复性符合要求。
实施例6：
本实施例对批号为YYC18032705批次的旋覆花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定，其中，将供试品进行加热回流提取，得供试品溶液，并分别在0h、2h、4h、6h及8h后进样测定，其余以与实施例1相同的处理方法，结果见表3所示：
表3 本测定含量方法的溶液稳定性
Figure 391591DEST_PATH_IMAGE006
由表3可知：本测定含量方法的相对标准偏差RSD为0.850%，试验方法中溶液稳定性符合要求。
实施例7：
本实施例对批号为YYC18032705批次的旋覆花药材中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定，其中，A．采用两台不同的高效液相色谱仪，型号分别为Agilent 1100和Waters 2695-2996，其余以与实施例1相同的处理方法，结果见表4所示：
表4 本测定含量方法的耐用性（采用同一根色谱柱的两台不同型号高效液相色谱仪）
Figure DEST_PATH_IMAGE007
B．采用三根不同的色谱柱，型号分别为Phenomenex Luma C18 （4.6*250mm*5um）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus（4.6*250mm*5um）及Ultimate® XB-C18（4.6*250mm*5um），其余以与实施例1相同的处理方法，结果见表5所示：
表5 本测定含量方法的耐用性（同一台高效液相色谱仪采用三根不同型号的色谱柱）
Figure 973751DEST_PATH_IMAGE008
由表4-5可知：本测定含量方法的相对标准偏差RSD均低于2.0%，该测定方法耐用性符合要求。
实施例8：
在对旋覆花药材内的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量进行测定过程中，本实施例对1,3-二咖啡酰奎宁酸进行加标回收，以确保该方法测定的结果与真实值或参考值一致。步骤包括：
称取1,3-二咖啡酰奎宁酸2.170mg为对照品，并置于10mL容量瓶中，加入30%甲醇，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为2.170mg/mL对照品溶液。
称取已知含量的旋覆花YYC18032705药材粉末1.0g为供试品，平行六份，并分别加入所得对照品溶液1mL，置于圆底烧瓶中，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5～2.5 h。放冷后，以水补齐重量，摇匀后取提取液过滤，以滤液作为供试溶液，注入高效液相色谱仪中，其余以与实施例1相同的处理方法，测定，计算回收率，结果见表6所示：
表6 本测定含量方法的准确度
Figure DEST_PATH_IMAGE009
由表6可知：本测定含量方法中1,3-二咖啡酰奎宁酸回收率在98.49～100.09%，表明有很好的测定准确度。
实验例9：
从三个批次中分别称取旋覆花供试品，按实施例1中步骤D制备供试品溶液，得供试品溶液；然后，取浓度为0.182 mg/ml的1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得色谱图（如图6所示），用色谱峰的峰面积外标一点法计算1,3-二咖啡酰奎宁酸含量，结果见表7所示：
表7
Figure 725807DEST_PATH_IMAGE010
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A．称取1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，采用30%甲醇为溶剂，以浓度梯度配制至少五份对照品溶液；
B．将经步骤A配制的至少五份对照品溶液分别进样于高效液相色谱仪中，经测定，得各对照品溶液对应的色谱图；
C．以各对照品溶液的浓度为横坐标，对应色谱图中1,3-二咖啡酰奎宁酸色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；
D．称取待测定的旋覆花供试品，置于圆底烧瓶中，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5～2.5 h，放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液过滤，以滤液作为供试品溶液；
E．将步骤D所得的供试品溶液进样于高效液相色谱仪中，再以与步骤B一致的条件进行测定，得供试品溶液的色谱图；
F．将供试品溶液色谱峰的峰面积带入步骤C中所得的线性回归方程中，得待测定的旋覆花供试品中的1,3-二咖啡酰奎宁酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤A中，依次按0.0508mg/ml、0.1058mg/ml、0.1678mg/ml、0.3087 mg/ml、0.4786mg/ml的浓度梯度配置对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤D中，供试品溶液的制备方法包括：称取旋覆花供试品，干燥，粉粹为50～80目的旋覆花粉末，置于圆底烧瓶中，加入适量30%甲醇，称定，加热回流0.5～2.5 h，放冷后，以30%甲醇补齐重量，摇匀后取提取液过滤，以滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的色谱柱填料为C18，柱长为250mm，内径为4.6mm，滤膜孔径为5μm。
5.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的检测波长为320nm。
6.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的色谱柱温度为15～40℃。
7.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的流动相为乙腈与0.2%磷酸溶液。
8.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，高效液相色谱仪的流动相的流速为0.5～1.5 ml/min。
9.根据权利要求1所述的一种测定旋覆花中1,3-二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于：所述步骤B和E中，对照品溶液和供试品溶液的进样量相同，进样量均为5～20μl。
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