CN110951634A - 大黄鱼il-4/13a基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用 - Google Patents

大黄鱼il-4/13a基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大黄鱼IL‑4/13A基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明成功构建高效表达大黄鱼IL‑4/13A基因的毕赤酵母工程菌，该工程菌于2019年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019598。该工程菌高效表达的大黄鱼IL‑4/13A重组蛋白作为免疫佐剂能够有效促进大黄鱼特异性抗体的产生。

Description

大黄鱼IL-4/13A基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大黄鱼IL-4/13A基因在毕赤酵母中表达产物的制备方法及其应用。
背景技术
白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）和IL-13属于I型细胞因子，分子量一般为12-20 kD (Luzina, I.G., A.D. Keegan, N.M. Heller, G.A. Rook, T. Shea-Donohue,and S.P. Atamas. 2012. Regulation of inflammation by interleukin-4: a reviewof "alternatives". Journal of leukocyte biology 92: 753-764.)，是一种多功能的细胞因子，几乎对所有从造血干细胞（hematopoietic stem cell）分化而来的免疫细胞都有作用，主要功能体现在以下三个方面：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过上调表达B细胞表面的MHC II型分子、CD23和IL-4受体（IL-4R），诱导B细胞增殖和特异性抗体产生，介导体液免疫应答 (Nelms, K.,A.D. Keegan, J. Zamorano, J.J. Ryan, and W.E. Paul. 1999. The IL-4 receptor:signaling mechanisms and biologic functions. Annual review of immunology 17:701-738.)；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
诱导前体细胞分化成Th2效应细胞，促进Th2细胞发育而抑制Th1细胞活性(Luzina, I.G., A.D. Keegan, N.M. Heller, G.A. Rook, T. Shea-Donohue, and S.P.Atamas. 2012. Regulation of inflammation by interleukin-4: a review of "alternatives". Journal of leukocyte biology 92: 753-764.)；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
通过抑制巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等的表达和增加TGF-β、VEGF和EGF等生长因子的产生，诱导巨噬细胞向M2型活化 (Zhu, L.Y., P.P. Pan, W. Fang, J.Z. Shao, and L.X.Xiang. 2012. Essential role of IL-4 and IL-4Ralpha interaction in adaptiveimmunity of zebrafish: insight into the origin of Th2-like regulatorymechanism in ancient vertebrates. Journal of immunology 188: 5571-5584.)。
鱼类IL-4/13与哺乳动物IL-4和IL-13氨基酸序列的同源性非常低，近年来通常采用共线性分析的方法寻找。首个鱼类IL-4报道于2007年，位于绿河豚（Tetraodon nigroviridis）基因组上临近RAD50的位置，与哺乳动物IL-4相比氨基酸序列同源性只有11-16% (Li, J.H., J.Z. Shao, L.X. Xiang, and Y. Wen. 2007. Cloning,characterization and expression analysis of pufferfish interleukin-4 cDNA:the first evidence of Th2-type cytokine in fish. Molecular immunology 44:2078-2086)；后来又在斑马鱼（Danio rerio）基因组上临近KIF3A位置，发现了两个IL-4基因，定位在不同的染色体上，分别命名为IL-4/13A和IL-4/13B，并且斑马鱼IL-4（IL-4/13A）已经证实能够与IL-4Rα特异性结合、促进B细胞增殖及增加特异性IgM产生 ，这些结果表明鱼类可能存在与哺乳动物类似的Th2免疫反应。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌。
本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母表达产物及其制备方法。
本发明的目的之三在于提供大黄鱼IL-4/13A重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体产生方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌的分类命名为：毕赤酵母（Pichia pastoris） SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A， 于2019年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019598，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
一种上述高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼IL-4/13A重组蛋白，所述大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的分子量为25kDa(糖基化后)。该重组蛋白作为免疫佐剂与细菌亚单位疫苗配合使用，显著增加大黄鱼特异性抗体的产生。
一种高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）克隆大黄鱼IL-4/13A基因全长cDNA序列，采用PCR技术扩增出编码第21位至第148位氨基酸的大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达的成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
（2）将步骤（1）得到的大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段克隆到毕赤酵母真核表达载体pPICZαA上，经博来霉素筛选及测序鉴定后，得到含大黄鱼IL-4/13A基因片段的重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A；
（3）将重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A线性化后，经电击法转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168感受态细胞，经酵母重组子的 PCR 分析后，获得含有大黄鱼IL-4/13A基因片段的阳性重组子毕赤酵母工程菌Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A；
（4）将上述阳性重组子的毕赤酵母工程菌接到酵母培养基1中，30 °C ,220 rpm 震荡培养；待OD600 至 2.0 ，将上述菌液倒入离心管，4 °C ，6000 g 离心 7 min，去上清，用酵母培养基2重悬，30 °C,220 rpm 震荡培养，每隔 24 h 添加1%甲醇诱导4天，使其达到最高表达量，同时使用 SDS-PAGE 检测其表达情况；
（5）将步骤（4）诱导表达好的菌液于4 °C，12000 g 离心 10 min，取上清，加入终浓度0.2 M NaCl和终浓度10 mM咪唑，4 °C 静置过夜；将静置过夜的上清 12000 g，4 °C 离心10 min，再使用0.45 μm 的滤膜过滤；将过滤后的上清液缓慢滴入含有 1 mL Ni2+介质的层析柱，流速为 3~4 mL/min；用酵母杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10 mL；再用酵母蛋白洗脱液洗脱，直至洗净目的蛋白；SDS-PAGE 分析收集的各组分。
上述步骤（4）中所述酵母培养基1配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/L磷酸钾缓冲液(PH6.0)、 1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基（YNB）；酵母培养基2配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/L磷酸钾缓冲液(PH6.0)、1%甲醇、1.34% YNB和0.00004%生物素。
上述步骤（5）中所述酵母杂蛋白洗涤液的配方为： 20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、20 mM咪唑， pH=7.4；所述酵母蛋白洗脱液的配方为：20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、750 mM咪唑，pH=7.4。
一种大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母表达产物大黄鱼IL-4/13A重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体产生方面的应用。
大黄鱼IL-4/13A重组蛋白作为免疫佐剂应用于促进大黄鱼特异性抗体的产生，包括以下步骤：根据 GenBank 中溶藻弧菌 DLD 基因的序列信息（AGK62253.1），从大黄鱼的溶藻弧菌中扩增获得溶藻弧菌 DLD 基因，并使其在大肠杆菌中重组表达 DLD 蛋白，以获得的重组 DLD 蛋白作为抗原用于特异性抗体产量分析实验。
具体实验过程如下： 试验组选择10ug的重组IL-4/13A蛋白与100 μg重组 DLD蛋白混合腹腔注射大黄鱼（体重：50 g-70g ），1 周后以相同剂量加强免疫一次；对照组的大黄鱼采用同样方式注射10 μg BSA蛋白和重组DLD 蛋白；免疫 28、35和42 天后收集大黄鱼外周血血清，采用 ELISA 方法分析大黄鱼血清中 anti-DLD IgM的产量。
使用10ug的重组IL-4/13A蛋白腹腔注射大黄鱼（体重：50 g-70g ），48h后收集大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血，用梯度密度离心法分离白细胞，使用大黄鱼IgM的单克隆抗体结合流式细胞仪分析淋巴细胞中B细胞的比例，对照组的大黄鱼采用同样方式注射10 μgBSA蛋白。
本发明的优点在于：本发明成功构建了高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌，该工程菌表达的大黄鱼IL-4/13A基因重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体中具有重要作用，能显著促进大黄鱼血清中anti-DLD IgM的产量的增加。
附图说明
图1 为大黄鱼IL-4/13A基因全长cDNA序列的扩增以及菌落PCR电泳图。在图1.A中，M为标准蛋白分子量Marker；1泳道为从文库种扩增得到的大黄鱼IL-4/13A基因，约447个核苷酸。
图2 为纯化的大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的SDS-PAGE鉴定。在图2中M为预染蛋白分子量 Marker；1泳道为含有pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌培养液上清；2泳道为毕赤酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A培养液上清；3泳道为纯化的IL-4/13A重组蛋白。
图3 为大黄鱼血清中anti-DLD IgM产量分析图。大黄鱼IL-4/13A重组蛋白与弧菌亚单位疫苗共同免疫的大黄鱼后，不同时间点大黄鱼血清中anti-DLD IgM的产量分析图，4W： 第4周，5W： 第5周，6W： 第6周；* P<0.01，** P<0.05；以相同浓度的牛血清白蛋白刺激为对照组。
图4为大黄鱼IL-4/13A重组蛋白腹腔注射48h小时后，大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血白细胞中IgM+B细胞增殖的分析图。A、B和C分别为头肾、脾脏和外周血中IgM+B细胞增增殖的流式示意图；D为大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血白细胞中IgM+B细胞增殖的点状图；HKLs:头肾白细胞，SLs:脾脏白细胞，PBLs:外周血白细胞；* P<0.01, ** P<0.05。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1 大黄鱼IL-4/13A基因cDNA的获得
通过对大黄鱼脾脏转录组文库分析，发现了大黄鱼IL-4/13A cDNA 序列，经PCR扩增,获得了大黄鱼IL-4/13A的全长cDNA, 该序列全长447个核苷酸（如SEQ ID NO.1所示），编码一个由148个氨基酸组成的蛋白质（如SEQ ID NO.2所示）。
所述大黄鱼IL-4/13A基因cDNA及其推断的氨基酸序列如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中，灰色高亮表示起始密码子和终止密码子。单下划线表示信号肽。保守的半胱氨酸用方框表示。 N-糖基化位点用双下划线表示。
实施例2 含大黄鱼IL-4/13A成熟肽序列重组表达载体pPICZα-IL-4/13A的构建
（1） 大黄鱼IL-4/13A成熟肽片段的PCR扩增：合成正向引物IL-4/13A-F: GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAAAATCCTCTTCATCAACAG 和反向引物IL-4/13A-R:CTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCATGTCTTTG GAAGCCCC；以大黄鱼IL-4/13A基因cDNA为模板扩增出编码第21位至第148位氨基酸的大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达的成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。使用全式金公司的TransStart® FastPfu Fly DNAPolymerase按照说明书进行PCR扩增，PCR体系为：
5×TransStart® FastPfu Fly DNA Polymerase 缓冲液 10 μL
dNTP 4 μL
正向引物(10 μM) 1 μL
反向引物(10 μM) 1 μL
cDNA模板(100 ng/μL) 1 μL
TransStart® FastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL
双蒸水补至50 μL。
PCR程序如下：
1.94℃ 2 分钟
2.94℃ 30秒
3.58℃ 30秒
4.72℃ 30秒，返回第2步，35个循环
5.72℃ 10分钟
6.4℃保存。
PCR扩增产物用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件：电压120伏，1电泳时间15分钟。使用凝胶成像仪观察，可见一条与预期相符的核苷酸条带，然后用Omega公司胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
（2）酶切和连接反应：酵母真核表达载体pPICZαA经EcoR I和Xho I酶切3 h后进行同源重组连接，使用全式金公司 pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，连接体系如下：
2x pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly 5 μL
PCR扩增产物 4 μL
酶切后的载体pPICZαA 1μL
反应条件：50℃反应15分钟。
（4）连接产物转化Novogen公司大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性克隆，扩大培养后，使用Omega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒，并测序验证，从而获得了含大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段的重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A。
实施例3 毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A工程菌的构建
将含有大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段的重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A经线性化后，用电击转化法转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，将转化后的菌液分别涂布于含250µg/ mL、500µg/ mL和1mg/ mL 博来霉素的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，30℃ 静置培养2-4天，长出单菌落，经菌落PCR后得到含有大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因的毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A工程菌。
培养基配方：
酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基：2%蛋白胨、1 %酵母抽提物、2%葡萄糖和1.5%琼脂粉。
实施例4大黄鱼IL-4/13A基因在毕赤酵母中表达及其表达产物纯化
1. 大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
将实施例3获得的毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A工程菌接到酵母培养基1中，30 °C ,220 rpm 震荡培养。待OD600 至 2.0 ，将上述菌液倒入 离心管，4°C ，6000 g 离心 7 min，去上清，用 酵母培养基2重悬，30 °C 震荡培养。 每隔 24 h 添加1%甲醇诱导4天，使其达到最高表达量，同时使用 SDS-PAGE 检测其表达情况。
酵母培养基1配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/L磷酸钾缓冲液(PH6.0)、 1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基（YNB）。
酵母培养基2配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/L磷酸钾缓冲液(PH6.0)、1%甲醇、1.34% YNB和0.00004%生物素。
2. 亲和层析法纯化大黄鱼IL-4/13A重组蛋白
将上述诱导表达好的菌液于4 °C， 12000 g 离心 10 min，取上清，加入 NaCl (终浓度 0.2 M)和咪唑(终浓度10 mM)，4 °C 静置过夜。将静置过夜的上清 12000 g，4 °C 离心10 min，再使用0.45 μm 的滤膜过滤。将过滤后的上清液缓慢滴入含有 1 mL Ni2+介质的层析柱，流速为 3~4 mL/min；用酵母杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10 mL。再用酵母蛋白洗脱液洗脱，直至洗净目的蛋白。SDS-PAGE 分析收集的各组分。
所述酵母杂蛋白洗涤液的配方为： 20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、20 mM咪唑， pH=7.4。
所述酵母蛋白洗脱液的配方为：20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、750 mM咪唑，pH=7.4。
3. 大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的透析
纯化后大黄鱼IL-4/13A重组蛋白用缓冲液透析三次，4℃ , 12000r / min离心30min去除沉淀，取少量进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示得到了纯度较高的大黄鱼IL-4/13A重组蛋白，保存于-70℃备用；
透析缓冲液配方：0.27 g/L NaH2PO4、1.42 g/L Na2HPO4、8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl,pH 7.3, 10%甘油。
实施例5 大黄鱼IL-4/13A重组蛋白对特异性抗体产生的作用
本实验室现有保藏分离于患病大黄鱼的溶藻弧菌，根据 GenBank 中溶藻弧菌 DLD 基因的序列信息（AGK62253.1），从大黄鱼的溶藻弧菌中扩增获得溶藻弧菌 DLD基因，使其在大肠杆菌中重组表达，以重组DLD蛋白作为抗原用于特异性抗体产量分析实验。
具体实验过程如下：试验组选择10ug的重组IL-4/13A蛋白与100 μg重组 DLD蛋白混合腹腔注射大黄鱼（体重：50 g-70g ），1 周后以相同剂量加强免疫一次；对照组的大黄鱼采用同样方式注射10 μg BSA蛋白和重组DLD 蛋白；免疫 28、35和42 天后收集大黄鱼外周血血清，采用 ELISA 方法分析大黄鱼血清中 anti-DLD IgM的产量。图3结果表明，免疫10 ug大黄鱼IL-4/13A重组蛋白DLD第5周后，大黄鱼血清中anti-DLD IgM的的效价提高了2.6倍。
使用10ug的重组IL-4/13A蛋白腹腔注射大黄鱼（体重：50 g-70g ），48h后收集大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血，用梯度密度离心法分离白细胞，使用大黄鱼IgM的单克隆抗体结合流式细胞仪分析淋巴细胞中B细胞的比例，对照组的大黄鱼采用同样方式注射10 μgBSA蛋白。图4结果表明，大黄鱼IL-4/13A重组蛋白可以显著促进大黄鱼IgM+B细胞的增殖，最高可促进50%的比例。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 大黄鱼IL-4/13A基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 447
<212> DNA
<213> SEQ ID NO. 1
<400> 1
atgatgatgc ttctgcttgt atccactctg gtactgctgg tcaatccggc tctgaccaat 60
cctcttcatc aacagaaatc cccaaataac ctgaaccata tatttgacct ggctgagaat 120
tacaataaat ctctcgctca ggctttcttt gtggaggatg tgtcacatct ggctgaaggc 180
aaaaacaaat gcgatgataa gttcttctgc aaagtgcatg atatcctgaa caagttcgga 240
aaaaagcaca atatcattga caaaaagaag gaggaggggc ttgtgaggaa cctggaggca 300
tacgtcgatg gcagaaatat taactgtaca gagctgctga aggacatggt gccttcaaga 360
gaggaaagac caatacccgt actcatagga cacctcatgc gttgtatcca gaacaggaac 420
ttaaatgggg cttccaaaga catgtga 447
<210> 2
<211> 148
<212> PRT
<213> SEQ ID NO. 2
<400> 2
Met Met Met Leu Leu Leu Val Ser Thr Leu Val Leu Leu Val Asn Pro
1 5 10 15
Ala Leu Thr Asn Pro Leu His Gln Gln Lys Ser Pro Asn Asn Leu Asn
20 25 30
His Ile Phe Asp Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Leu Ala Gln Ala
35 40 45
Phe Phe Val Glu Asp Val Ser His Leu Ala Glu Gly Lys Asn Lys Cys
50 55 60
Asp Asp Lys Phe Phe Cys Lys Val His Asp Ile Leu Asn Lys Phe Gly
65 70 75 80
Lys Lys His Asn Ile Ile Asp Lys Lys Lys Glu Glu Gly Leu Val Arg
85 90 95
Asn Leu Glu Ala Tyr Val Asp Gly Arg Asn Ile Asn Cys Thr Glu Leu
100 105 110
Leu Lys Asp Met Val Pro Ser Arg Glu Glu Arg Pro Ile Pro Val Leu
115 120 125
Ile Gly His Leu Met Arg Cys Ile Gln Asn Arg Asn Leu Asn Gly Ala
130 135 140
Ser Lys Asp Met
145
<210> 3
<211> 387
<212> DNA
<213> SEQ ID NO. 3
<400> 3
cctcttcatc aacagaaatc cccaaataac ctgaaccata tatttgacct ggctgagaat 60
tacaataaat ctctcgctca ggctttcttt gtggaggatg tgtcacatct ggctgaaggc 120
aaaaacaaat gcgatgataa gttcttctgc aaagtgcatg atatcctgaa caagttcgga 180
aaaaagcaca atatcattga caaaaagaag gaggaggggc ttgtgaggaa cctggaggca 240
tacgtcgatg gcagaaatat taactgtaca gagctgctga aggacatggt gccttcaaga 300
gaggaaagac caatacccgt actcatagga cacctcatgc gttgtatcca gaacaggaac 360
ttaaatgggg cttccaaaga catgtga 387
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> SEQ ID NO. 4
<400> 4
Pro Leu His Gln Gln Lys Ser Pro Asn Asn Leu Asn His Ile Phe Asp
1 5 10 15
Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Leu Ala Gln Ala Phe Phe Val Glu
20 25 30
Asp Val Ser His Leu Ala Glu Gly Lys Asn Lys Cys Asp Asp Lys Phe
35 40 45
Phe Cys Lys Val His Asp Ile Leu Asn Lys Phe Gly Lys Lys His Asn
50 55 60
Ile Ile Asp Lys Lys Lys Glu Glu Gly Leu Val Arg Asn Leu Glu Ala
65 70 75 80
Tyr Val Asp Gly Arg Asn Ile Asn Cys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Met
85 90 95
Val Pro Ser Arg Glu Glu Arg Pro Ile Pro Val Leu Ile Gly His Leu
100 105 110
Met Arg Cys Ile Gln Asn Arg Asn Leu Asn Gly Ala Ser Lys Asp Met
115 120 125
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> IL-4/13A-F
<400> 5
gagaaaagag aggctgaagc tgaaaatcct cttcatcaac ag 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> IL-4/13A-R
<400> 6
ctcttctgag atgagttttt gttccatgtc tttggaagcc cc 42

Claims (6)

1.一种高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述毕赤酵母工程菌，其分类命名为毕赤酵母（Pichia pastoris ）SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A，于2019年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019598，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种如权利要求1所述的高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼IL-4/13A重组蛋白。
3.如权利要求2所述的高效表达大黄鱼IL-4/13A基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼IL-4/13A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）克隆大黄鱼IL-4/13A基因全长cDNA序列，采用PCR技术扩增出编码第21位至第148位氨基酸的大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）将步骤1）得到的大黄鱼IL-4/13A成熟肽基因片段克隆到毕赤酵母真核表达载体pPICZαA上，经博来霉素筛选及测序鉴定后，得到含大黄鱼IL-4/13A基因片段的重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A；
（3）将重组表达载体pPICZαA-IL-4/13A线性化后，经电击法转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168感受态细胞，经酵母重组子的 PCR 分析后，获得含有大黄鱼IL-4/13A基因成熟肽片段的阳性重组子毕赤酵母工程菌Pichia pastoris SMD1168/pPICZαA-IL-4/13A；
（4）将上述阳性重组子的毕赤酵母工程菌接到酵母培养基1中，30 °C ,220 rpm 震荡培养；待OD600 至 2.0 ，将上述菌液倒入离心管，4 °C ，6000 g 离心 7 min，去上清，用酵母培养基2重悬，30 °C,220 rpm 震荡培养，每隔 24 h 添加1%甲醇诱导4天，使其达到最高表达量，同时使用 SDS-PAGE 检测其表达情况；
（5）将步骤（4）诱导表达好的菌液于4 °C，12000 g 离心 10 min，取上清，加入终浓度0.2 M NaCl和终浓度10 mM咪唑，4 °C 静置过夜；将静置过夜的上清 12000 g，4 °C 离心10 min，再使用0.45 μm 的滤膜过滤；将过滤后的上清液缓慢滴入含有 1 mL Ni2+介质的层析柱，流速为 3~4 mL/min；用酵母杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10 mL；再用酵母蛋白洗脱液洗脱，直至洗净目的蛋白；SDS-PAGE 分析收集的各组分。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述酵母培养基1配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、pH6.0 0.1mol/L磷酸钾缓冲液、1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基YNB；酵母培养基2配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、pH6.0 0.1mol/L磷酸钾缓冲液、1%甲醇、1.34% YNB和0.00004%生物素。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述酵母杂蛋白洗涤液的配方为：20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、20 mM咪唑， pH=7.4；所述酵母蛋白洗脱液的配方为：20 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、750 mM咪唑，pH=7.4。
6.如权利要求2所述的大黄鱼IL-4/13A重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体产生方面的应用。
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Application publication date: 20200403

Assignee: Fuzhou Elite Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: FUJIAN AGRICULTURE AND FORESTRY University

Contract record no.: X2023350000299

Denomination of invention: Preparation of Pichia pastoris expression product of IL-4/13A gene from Larimichthys crocea and its application

Granted publication date: 20220111

License type: Common License

Record date: 20230710