CN110918123A - 一种带有自身终止作用的过氧化物酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种带有自身终止作用的过氧化物酶，所述过氧化物酶包含Zn4O(NH2BDC)3微晶IRMOF3和叶酸，两者通过酰胺化反应即可得到过氧化物酶。本发明过氧化物酶经过简单的叶酸修饰得到，文献报道4mM H2O2浓度会使HRP催化的TMB蓝色产物颜色逐渐变浅，而本发明中H2O2浓度为0.04mol/L仍然可以得到437nm处的黄色产物，与试剂盒酸终止后的效果相当。

Description

一种带有自身终止作用的过氧化物酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种带有自身终止作用的过氧化物酶及其制备方法和应用。
背景技术
目前，金属有机框架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)的研究已引起科研人员的关注，不仅因为其非线性光学、气体存储、发光、磁性、药物传递以及催化方面的性能，也因为其结构。许多化学官能团与MOFs组装的条件不相容，不能通过传统的合成路线共价连接在MOFs腔内。例如，具有游离羧基或吡啶的MOFs仍然很少，因为该部分通常用作MOFs框架的关键配位元素。而具有游离羧基/氨基的MOFs材料对研究者具有极大的吸引力，它们可以通过广泛的反应进一步修饰，以提供带有不同官能团的新MOFs。MOFs在催化领域的研究多关注缩合反应的催化，模拟过氧化物酶方面研究较少。以辣根过氧化物酶(HRP)为催化剂，经典的四甲基联苯胺(TMB)底物可以被H2O2氧化获得蓝色产物。
迄今为止在科学和专利文献中公开的过氧化物酶抑制剂多为氨基酸、H2O2，终止剂多为酸，而对过氧化物酶自身的终止效果未见报道。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种带有自身终止作用的过氧化物酶及其制备方法和应用，该过氧化物酶能够用于替代HRP，催化剂活性高、使用条件不苛刻。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种带有自身终止作用的过氧化物酶，所述过氧化物酶包含Zn4O(NH2BDC)3微晶IRMOF3和叶酸，两者通过酰胺化反应即可得到过氧化物酶。
如上所述的带有自身终止作用的过氧化物酶在四甲基联苯胺和H2O2的催化反应中代替HRP方面中的应用。
如上所述的带有自身终止作用的过氧化物酶的制备方法，步骤如下：
将叶酸加入到MES buffer中，叶酸的终浓度为2mg/mL，MES buffer的浓度为0.1mol/L且pH＝6，将加有叶酸的MES buffer用终浓度为38.4mg/mL的EDC·HCl活化15min，然后加入终浓度为23mg/mL的NHS，100W超声活化60min，得活化过的叶酸溶液；
准确称量IRMOF3微晶，随后向其中加入上述活化过的叶酸溶液，IRMOF3微晶：活化过的叶酸溶液的比例g：mL为0.01：2，100W超声30min后，30℃摇床反应过夜，5000-8000rpm离心5分钟，80℃真空干燥，得到IRMOF3-FA固体，即得带有自身终止作用的过氧化物酶。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明过氧化物酶经过简单的叶酸修饰得到，文献报道4mM H2O2浓度会使HRP催化的TMB蓝色产物颜色逐渐变浅，而本发明中H2O2浓度为0.04mol/L仍然可以得到437nm处的黄色产物，与试剂盒酸终止后的效果相当。
2、本发明的过氧化物酶能够用于替代HRP，与现有技术相比，催化剂活性高、使用条件不苛刻。
3、本发明过氧化物酶能够应用在四甲基联苯胺和H2O2的催化反应中代替HRP方面中，酶反应通常用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，而本发明过氧化物酶不需要使用终止剂。
附图说明
图1为本发明中IRMOF3-FA的紫外可见光谱图；
图2为本发明中IR谱：IRMOF3(上线)，IRMOF3-FA(下线)；
图3为本发明中IRMOF3-FA催化TMB与H2O2的反应图(H2O2浓度范围：20-100μL)；
图4为本发明中TMB终止反应产物颜色图；
图5为本发明中IRMOF3-FA@PEG-GOD-25mg-100mgX1000的GOD装载效果图；
图6为本发明中IRMOF3@HOOC-PEG-GOD-25mg-100mgX5000的GOD装载效果图；
图7为本发明中高浓度糖、IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD、TMB共存体系的UV-vis光谱图；
图8为本发明中低浓度糖、IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD、TMB共存体系的UV-vis光谱图；
图9为本发明中高浓度糖、IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD、TMB、HRP共存体系的UV-vis光谱图；
图10为本发明中低浓度糖、IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD、TMB、HRP共存体系的UV-vis光谱图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种带有自身终止作用的过氧化物酶，所述过氧化物酶包含Zn4O(NH2BDC)3微晶IRMOF3和叶酸，两者通过酰胺化反应即可得到过氧化物酶。
如上所述的带有自身终止作用的过氧化物酶在四甲基联苯胺和H2O2的催化反应中代替HRP方面中的应用。
如上所述的带有自身终止作用的过氧化物酶的制备方法，步骤如下：
将叶酸加入到MES buffer中，叶酸的终浓度为2mg/mL，MES buffer的浓度为0.1mol/L且pH＝6，将加有叶酸的MES buffer用终浓度为38.4mg/mL的EDC·HCl活化15min，然后加入终浓度为23mg/mL的NHS，100W超声活化60min，得活化过的叶酸溶液；
准确称量IRMOF3微晶，随后向其中加入上述活化过的叶酸溶液，IRMOF3微晶：活化过的叶酸溶液的比例g：mL为0.01：2，100W超声30min后，30℃摇床反应过夜，5000-8000rpm离心5分钟，80℃真空干燥，得到IRMOF3-FA固体，即得带有自身终止作用的过氧化物酶。
本发明过氧化物酶能够用于四甲基联苯胺(TMB)和H2O2的催化反应，代替HRP。酶反应通常用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，而本发明不需要使用终止剂。
本发明的相关制备如下：
(1)IRMOF3-FA制备
将2mg/mL叶酸的MES buffer用38.4mg/mL(1.536g)的EDC·HCl活化15min,然后加入23mg/mL NHS超声活化60min(0.92g)。准备10mL离心管，每管加入0.02g IRMOF3微晶，随后加入4mL上述活化过的叶酸溶液，超声30min后，30℃摇床反应过夜，离心，80℃真空干燥得到IRMOF3-FA固体。
(2)TMB的氧化反应
将大约120μL的TMB(0.2mmol/L，在DMSO中)，120μL的IRMOF3-FA样品(1mg/mL)加入到装有2.7mL乙酸钠-乙酸缓冲液(pH3.6)的离心管中，然后加入60μL H2O2(0.04mol/L)。设置5个H2O2浓度梯度，补乙酸钠-乙酸缓冲液至3mL，反应在50℃下进行20min。通过UV-vis分光光度计在437nm检测黄绿色产物。
(3)IRMOF3-FA的GOD装载
CM-PEG(0.5g,0.1mmol)溶于2.5mL MES buffer(0.1mol/L,pH＝6)，加入EDC·HCl(0.0383g,0.2mmol)超声活化30min，再向其中加入NHS(0.023g,0.2mmol)再活化30min，摇床140rpm过夜活化，向活化后的溶液加入10mg葡萄糖氧化酶(GOD)，摇床过夜。得到PEG-GOD样品。
准备3个10mL离心管，分别加入20mg的IRMOF3-FA，再分别加入PEG-GOD 100mg，50mg，25mg(以PEG质量计算)，0.5mL，0.25mL，0.125mL补MES buffer至3mL，摇床3天。离心取上清，荧光检测。样品标记为IRMOF3-FA@PEG-GOD。
CM-PEG-CM(0.2g，0.1mmol)溶于2.5mL MES buffer(0.1mol/L,pH＝6)，后续实验步骤同CM-PEG。得到HOOC-PEG-GOD样品。经IRMOF3-FA装载得到IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD。
(4)IRMOF3-FA淬灭GOD实验
等比稀释D(+)-无水葡萄糖，浓度依次为1.6×10-3mol/L、8×10-4mol/L、4×10- 4mol/L、2×10-4mol/L、1×10-4mol/L、5×10-5mol/L。
将IRMOF3-FA@PEG-GOD或IRMOF3-FA@HOOC-PEG-GOD材料和MES 1:10混合，取360μL分别与6个等比稀释后的不同浓度的D(+)-无水葡萄糖40μL混合，在37℃的条件下反应30min。将反应后6个不同浓度的产物取出100μL，加入2.78mL的乙酸钠-乙酸buffer和120μLTMB(0.2mmol/L,DMSO)，放入6个标记好的10mL离心管中，超声反应30min；为使效果明显，将37℃反应30min的产物分别加入HRP(辣根过氧化物酶)20μL(1mg/mL)，对应的乙酸钠-乙酸buffer为2.76mL。之后将离心管放入离心机中离心，检测上清。
1、IRMOF3-FA产物的表征
a、紫外可见光谱
说明IRMOF3-FA样品在TMB氧化反应所需的pH3.6 buffer中400nm以下有紫外吸收。如图1所示。
b、IR光谱
谱图说明与IRMOF3相比，IRMOF3-FA样品修饰是成功的。1690cm-1和1600cm-1均出现峰值，说明酰胺化成功。如图2所示。
2、IRMOF3-FA对TMB的氧化反应
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)具有高度的敏感性，又无致癌性，但常规应用H2SO4终止反应，颜色会由蓝变黄。本发明结果表明IRMOF3-FA能催化H2O2和TMB之间的反应，乙酸钠-乙酸buffer即为酸性条件下，在波长437nm处检测到黄绿色产物如图3和图4所示。
3、IRMOF3-FA的GOD装载效果
利用荧光分光光度计，激发波长λex＝332nm，狭缝宽10nm，进行测定，结果见图5、图6。图5三条线分别为IRMOF3-FA:PEG-GOD＝20mg:25mg、IRMOF3-FA:PEG-GOD＝20mg:50mg、IRMOF3-FA:PEG-GOD＝20mg:100mg各自稀释1000倍后的荧光测定结果，说明IRMOF3-FA:PEG-GOD＝20mg:100mg上清浓度最低，装载效果最好。图6三条线分别为IRMOF3-FA:HOOC-PEG-GOD＝20mg:25mg、IRMOF3-FA:HOOC-PEG-GOD＝20mg:50mg、IRMOF3-FA:HOOC-PEG-GOD＝20mg:100mg各自稀释5000倍后的荧光测定结果，说明IRMOF3-FA:HOOC-PEG-GOD＝20mg:50mg上清浓度最低，装载效果最好。
4、IRMOF3-FA淬灭GOD实验
利用UV-vis分光光度计未在437nm和652nm检测到产物，结果如图7、图8、图9、图10。结果表明叶酸修饰的IRMOF3产物未能催化低浓度糖、高浓度糖产生H2O2，HOOC-PEG-GOD失去活性。通过观察图7与图9、图8与图10，表明后加入的HRP也不能催化此反应。而PEG-GOD与HOOC-PEG-GOD得到的图谱一样，PEG-GOD也失去活性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (3)

1.一种带有自身终止作用的过氧化物酶，其特征在于：所述过氧化物酶包含Zn4O(NH2BDC)3微晶IRMOF3和叶酸，两者通过酰胺化反应即可得到过氧化物酶。
2.如权利要求1所述的带有自身终止作用的过氧化物酶在四甲基联苯胺和H2O2的催化反应中代替HRP方面中的应用。
3.如权利要求1所述的带有自身终止作用的过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：
将叶酸加入到MES buffer中，叶酸的终浓度为2mg/mL，MES buffer的浓度为0.1mol/L且pH＝6，将加有叶酸的MES buffer用终浓度为38.4mg/mL的EDC·HCl活化15min，然后加入终浓度为23mg/mL的NHS，100W超声活化60min，得活化过的叶酸溶液；
准确称量IRMOF3微晶，随后向其中加入上述活化过的叶酸溶液，IRMOF3微晶：活化过的叶酸溶液的比例g：mL为0.01：2，100W超声30min后，30℃摇床反应过夜，5000-8000rpm离心5分钟，80℃真空干燥，得到IRMOF3-FA固体，即得带有自身终止作用的过氧化物酶。
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