CN105372236A - 一种高灵敏度检测癌细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高灵敏度检测癌细胞的方法，利用金属有机骨架化合物Fe-MIL-101，结构式为Fe3OF(bdc)3，在酸性和中性（pH？3.0～7.0）条件下具有模拟过氧化物酶的特性，通过叶酸（FA）对其表面进行修饰，得到具有叶酸受体靶向的材料Fe-MIL-101-FA；材料与癌细胞进行孵育，通过材料表面的叶酸识别位于癌细胞表面的叶酸受体，Fe-MIL-101催化过氧化氢氧化底物3,3ˊ,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）发生颜色变化，通过比色法检测和量化癌细胞数量，在具有良好线性条件下对癌细胞的检测限达到50个，并且肉眼可观察到10个癌细胞的颜色反应，据此建立了一种简单、快速、高灵敏度的检测癌细胞的方法。
Description
技术领域
本发明涉及癌细胞的检测方法，尤其涉及一种基于Fe-MIL-101-FA材料制备用于比色方法检测癌细胞。
背景技术
肿瘤的发生严重威胁着人们的生命安全，已成为是一种常见的致死性疾病，其发病率有逐年升高的趋势，癌症的检测已成为全世界研究的热点之一，实现肿瘤准确，灵敏，简便检测对于疾病的治疗具有非常重要的意义。
目前，采取的检测手段多为酶联免疫分析法，该方法通过检测肿瘤细胞标志物间接检测肿瘤细胞，因此灵敏度较低，难以早期发现并防治；研究者还利用细胞计数，聚合酶链式反应，化学发光法，计时电流法以及流式细胞术等方法进行癌细胞检测，但这些方法分析成本高，耗时长，操作繁琐。
近年来以叶酸靶向癌细胞通过材料的过氧化物酶活性催化过氧化氢氧化底物发生颜色变化，通过比色定量检测癌细胞的研究已经开展，Y.Tao利用氧化石墨烯和金纳米簇复合材料（GO-AuNCs）与叶酸共价偶联形成新型检测材料（Adv.Mater.2013,25,2594-2599），利用GO-AuNCs的过氧化物酶活性和叶酸受体靶向性实现癌细胞的检测，最低能检测出1000个乳腺癌（MCF-7）细胞；G.Wang报道壳聚糖修饰的卤化银纳米材料与叶酸偶联（ACSAppl.Mater.Inter.2014,6,6434-6442），在可见光照射下利用过氧化氢氧化TMB底物发生颜色变化，从而达到检测癌细胞的目的，其最低检测1000个MDA-MB-231乳腺癌癌细胞。Y.Song合成出氧化石墨烯偶联叶酸和氯高铁血红素（Chem.Commun.,2011，47,4436-4438），通过比色法检测癌细胞，最低能检测出1000个癌细胞，但此材料含有过氧化物酶（氯高铁血红素）。L.Zhang将铂纳米颗粒负载在氧化石墨烯上（PtNPs/GO），并与叶酸共价偶联，利用PtNPs/GO的过氧化物酶活性以及叶酸对肿瘤细胞的靶向性检测MCF-7乳腺癌细胞（Anal.Chem.,2014,86(5),2711-2718），最低检测限达30个癌细胞。发明专利（CN103913453A）公开了Au@PtPd偶联叶酸靶向叶酸高表达的癌细胞，Au@PtPd纳米材料能催化过氧化氢氧化显色剂发生颜色变化，通过色谱层析，晾干后利用扫描仪扫描，对所呈现颜色进行色度分析，此方法操作比较繁琐，且最低检测200个K562细胞。以上方法都是通过贵金属或合金通共价偶联连接叶酸，利用叶酸对癌细胞的靶向性和材料的过氧化物酶活性产生颜色变化的比色法检测癌细胞。
还有文献报道具有过氧化物酶活性的材料偶联抗体检测癌细胞的方法，例如I.M.Kim将磁性纳米颗粒和贵金属铂与氧化石墨烯偶联（GO_MNP/Pt），磁性纳米颗粒和铂能增强氧化石墨烯的过氧化物酶活性，在材料表面接上抗体HER2，能检测HER2过表达的癌细胞，此材料最低能检测100个乳腺癌（SKBR-3）细胞（Nanoscale2014,6(3),1529-1536）；但此法应用抗体，成本较高，且不易保存。
以上这些文献和专利中的检测癌细胞的材料为贵金属材料、氧化石墨烯和金属的复合材料或是合金材料，除了氧化石墨烯和金纳米簇复合材料（GO-AuNCs）在酸性条件和中性条件下都具有良好的模拟酶活性外，其余材料在中性条件下的模拟酶活性均未研究过。而本专利中的检测癌细胞的材料属于金属有机骨架化合物（即MOFs材料），在酸性和中性条件下具有较高的模拟酶活性，且通过叶酸表面修饰后应用于检测癌细胞，能特异性识别癌细胞并与正常细胞区分开来。与上述材料相比，MOFs材料具有高比表面积、水热稳定性高、结构稳定，并且在酸性和中性条件下都具有较高过氧化物酶活性的优势。
研究表明，MOFs材料具有模拟过氧化物酶的活性。英文文章“MIL-53(Fe):AMetal–OrganicFrameworkwithIntrinsicPeroxidase-LikeCatalyticActivityforColorimetricBiosensing”，该文章研究了MIL-53(Fe)材料的过氧化物酶活性并用于双氧水的检测，具有良好的检测效果。另一篇英文文章“Ananosizedmetal–organicframeworkofFe-MIL-88NH2asanovelperoxidasemimicusedforcolorimetricdetectionofglucose”，研究了Fe-MIL-88NH2的过氧化物酶活性并应用于葡萄糖的检测。英文文章“Metal–OrganicFramework-DerivedCopperNanoparticle@CarbonNanocompositesasPeroxidaseMimicsforColorimetricSensingofAscorbicAcid”，该文章研究了Cu纳米粒子分散在碳基质上并通过一步合成法合成Cu基金属有机骨架化合物，该材料具有模拟过氧化物酶的活性并用于抗坏血酸的检测。另一篇英文文章“Water-stablemetal–organicframeworkswithintrinsicperoxidase-likecatalyticactivityasacolorimetricbiosensingplatform”，报道了两种铁基金属有机骨架化合物MIL-68和MIL-100具有过氧化物酶活性，并将其用于双氧水和抗坏血酸的检测，达到良好的检测效果。还有“Zirconium-MetalloporphyrinPCN-222:MesoporousMetal–OrganicFrameworkswithUltrahighStabilityasBiomimeticCatalysts”文章报道具有卟啉Fe(Ⅲ)中心的的MOF材料PCN-222(Fe)也具有过氧化物酶活性。
到目前为止，MOFs材料多用于双氧水、葡萄糖和抗坏血酸在酸性条件下的检测，尚未有MOFs材料用于癌细胞检测的文章或专利，本专利成功的将MOFs材料创新性的用于体外癌细胞检测。该检测癌细胞的方法具有材料用量小、简单、安全、灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能准确、灵敏度高、简便易行的检测癌细胞的方法，最低能检出50个癌细胞，且材料的合成简单。
本发明材料合成及检测过程如下：
(1)称取一定量的叶酸溶于50mMMES(pH6.0)缓冲液，缓冲液中叶酸的质量分数为10～25%避光搅拌过夜，加入Fe-MIL-101，缓冲溶液中Fe-MIL-101的质量分数为20～50%，室温搅拌24小时，离心，沉淀用超纯水洗八次去除未吸附的叶酸，制备出Fe-MIL-101-FA材料；
(2)叶酸受体靶向的Fe-MIL-101-FA材料10～30μg加入到含癌细胞的培养基中，其终浓度为（10～30μgmL-1），在37℃，5%CO2培养箱中，与癌细胞进行孵育，孵育时间为60-90分钟，离心（2000rpm，5分钟），并用磷酸盐缓冲液洗三次，以去除未与细胞结合的材料；
(3)加入0.2mMTMB和0.2mMH2O2于0.9%NaCl中，与细胞结合的材料催化过氧化氢氧化TMB发生颜色变化，颜色深浅与细胞的数量呈正相关，室温放置400s，于最大吸收波长652nm处读取吸光度值，根据吸光度与线性关系求出细胞数。
本发明的有益效果：1、能够特异性识别具有叶酸受体表达的癌细胞，对于正常细胞（如小鼠胚胎成纤细胞BABL-3T3）无识别作用。2、检测操作简单，耗时短。3、材料合成简单易行。4、所得的材料具有较高的催化活性，最低能检测50个癌细胞，癌细胞检测限比大部分现有的方法低，对癌细胞的识别能力更强。
附图说明
图1为本发明Fe-MIL-101材料XRD图。
图2为本发明Fe-MIL-101材料N2吸附脱附以及孔径分布图。
图3为本发明Fe-MIL-101材料Fe-MIL-101-FA的红外光谱图。
图4为本发明比色法检测不同种类癌细胞。大部分癌细胞都具有叶酸受体，包括卵巢癌、子宫内膜癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌脑和神经内分泌癌等等，而正常细胞没有叶酸受体，所以细胞与Fe-MIL-101-FA孵育后，不同细胞结合材料的能力有区别，加入底物和双氧水后显色的程度就有差别，相同数量的癌细胞比正常细胞的吸光度值高很多，叶酸高表达的癌细胞的吸光度值与正常细胞的吸光度值有显著差异性，说明此法可以识别癌细胞，将正常细胞与癌细胞区别开来。
图5为本发明比色法检测不同数量的Hela细胞。Hela细胞数分别为0，10，50，100，200，500个，与Fe-MIL-101-FA孵育400s后以TMB为比色底物在652nm处的紫外吸收强度。随着细胞数目增加，与之相结合的Fe-MIL-101-FA随之增多，溶液的颜色变深，吸光度值增高。细胞数在10-500之间具有相对良好的线性关系（R2=0.936），肉眼可观察到10个癌细胞的颜色反应，细胞数在50-500之间具有良好线性关系（R2=0.987），最低可检测50个癌细胞。
Claims (5)
1.本发明提供一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测癌细胞的方法，其特征包括以下步骤：
（1）MOFs材料为Fe-MIL-101，在酸性和中性（pH3.0～7.0）条件下具有模拟过氧化物酶活性；
（2）MOFs材料为Fe-MIL-101，通过表面吸附叶酸（FA）合成具有癌细胞靶向性的叶酸表面修饰MOFs材料（Fe-MIL-101-FA），且通过叶酸修饰后，在酸性和中性条件下同样具有较高的过氧化物酶活性；
（3）叶酸受体靶向的Fe-MIL-101-FA材料与癌细胞进行孵育，离心分离，加入底物和显色剂与反应溶液中，Fe-MIL-101-FA催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）产生颜色变化，通过比色测定对癌细胞进行定量检测。
2.根据权利要求1在步骤（1）中，所述在酸性和中性条件分别是醋酸缓冲液（20mM，pH2.0～5.0）和硼酸缓冲液（20mM，pH6.0～9.0）。
3.根据权利要求1在步骤（2）中，所述Fe-MIL-101-FA材料的合成方法，叶酸溶于50mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES，pH6.0)缓冲液，缓冲液中叶酸的质量分数为10～25%避光搅拌过夜，加入Fe-MIL-101，缓冲溶液中Fe-MIL-101的质量分数为20～50%，室温搅拌24小时，离心，沉淀用超纯水洗八次去除未吸附的叶酸，得到叶酸修饰的Fe-MIL-101材料。
4.根据权利要求1在步骤（3）中，所述叶酸受体靶向的Fe-MIL-101-FA材料5～20μg加入到含癌细胞培养基中（总体积为1mL），在37℃，5%CO2培养箱中，与癌细胞进行孵育，孵育时间为60-90分钟，在转速为2000rpm离心5分钟，并用磷酸盐缓冲液PBS（pH7.4）洗三次，以去除未与细胞结合的材料。
5.根据权利要求1在步骤（3）中，所述反应溶液为0.9%NaCl，显色剂为TMB溶液，底物为双氧水，显色剂和底物浓度均为0.2mM，室温反应400s后于最大吸收波长652nm处读取吸光度值。
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