CN103913453A

CN103913453A - 用于叶酸过表达癌细胞快速检测的比色方法

Info

Publication number: CN103913453A
Application number: CN201410124906.4A
Authority: CN
Inventors: 葛慎光; 于京华; 葛磊; 颜梅; 张彦; 黄加栋; 刘伟艳
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: CN103913453B

Abstract

本发明公开了一种叶酸过表达癌细胞快速检测的方法。将金纳米颗粒与不同比例的K₂PtCl₆和H₂PdCl₄混合制备出AuPtPd纳米材料；利用6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇对AuPtPd纳米粒子表面修饰，通过点击化学技术与炔基化的叶酸进行偶合；叶酸受体靶向的AuPtPd纳米材料与癌细胞进行孵育，连接于细胞表面，AuPtPd纳米材料能够催化过氧化氢氧化显色剂发生颜色变化，将其溶液低于色谱纸亲水区，晾干后利用扫描仪对其进行扫描，对所呈现颜色进行色度分析，K562细胞浓度为200-10000cells/mL时，K562细胞与所呈现的色度差展现出良好的线性关系，其线性回归方程为ΔI=38.69+0.075c，相关系数R=0.9931，据此建立了一种操作简便，快速，费用低和无需专业人士即可检测癌细胞。

Description

用于叶酸过表达癌细胞快速检测的比色方法

技术领域

本发明涉及癌细胞的检测方法，具体地说是一种基于AuPtPd纳米材料制备用于比色方法测定癌细胞。

背景技术

肿瘤的发生严重影响着人们的生活质量，危及着人们的生命安全，实现肿瘤细胞及其生理活动的准确、快速、简便检测，对于疾病的确诊与治疗具有非常重要的意义。目前，有关检测方法已有一些报道，但普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵，且要求工作人员有较高的专业技能。因此实现目标物的高灵敏、快速、简单测定癌细胞有着非常重要的意义。目前对细胞检测流式细胞术是一种能够对细胞或亚细胞结构进行快速检测的新型分析和分选技术，其主要特点是检测速度快，并且可进行多参数测量。随着流式细胞术研究的逐步深入和成熟，其应用范围已经从科学研究扩展到临床诊断，在临床医学领域里有着极大的应用潜力。但是，由于其昂贵的分析成本（仪器价格、试剂盒时间消耗等）及对操作人员专业训练的严格要求，这种分析技术只能在条件比较完善的大型实验室或检测不能才能实现。同时，由于这类仪器一般还具有较为庞大的体积，因此也在一定程度上限制了其应用和普及。

细胞检测方法的发展离不开新的材料和技术，没有材料和技术的新突破，就很难有细胞检测方法的研究进展。纳米材料在生物分子检测中的应用一直是生物分析化学领域研究的热点问题之一，利用纳米材料特殊的表面效应、体积效应、量子效应等可以在生物分子检测中明显地提高分析与检测的灵敏度和选择性，因此在生物医学等领域有着非常广阔的应用前景。近年来，利用纳米材料和纳米技术，并将纳米生物传感器与生化检测技术相结合，进行癌症的早期诊断与靶向治疗的研究，是相关生物技术领域中的研究前沿。基于细胞受体的细胞传感器是直接或者间接以细胞表面的受体作为识别元件与待测目标特异性结合，当待测目标与细胞表面受体结合后，细胞内部会发生一系列级联反应，信号转换器会将这些反应装化为可检测的信号，从而达到获取该反应机制的功能性信息的目的。大部分细胞传感器在生物识别的起始阶段都是直接或间接的利用细胞受体，所以，细胞受体对于新型细胞传感系统的开发意义重大。自从发现叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞中高度表达，而在正常细胞高度保守以来，叶酸/叶酸受体介导靶向传递成为该领域研究的热点。一种AuPtPd纳米材料用于催化显色剂显色，实现通过显色对细胞进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶酸过表达癌细胞快速检测的方法，所述的癌细胞的快速检测方法是利用AuPtPd纳米材料催化显色剂显色方法。

所述的癌细胞的快速检测方法检测过程如下：

（1）将金纳米颗粒与不同比例的K₂PtCl₆和H₂PdCl₄混合制备出AuPtPd纳米材料；

（2）利用6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇对AuPtPd纳米粒子表面修饰，通过点击化学技术与炔基化的叶酸进行偶合；

（3）叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd纳米材料与癌细胞进行孵育，离心分离；

（4）取（3）悬浮液与显色剂混合，加入显色剂溶液底物；

（5）比较（4）得到溶液颜色，将其溶液滴在色谱纸亲水区（样品区）上，晾干，扫描仪扫描对其色度分析。

所述的癌细胞的快速检测方法具体检测步骤如下：

（1）所述AuPtPd纳米材料制备方法，量取80mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90℃，加入0.8mL 1%的HAuCl₄，加热至96℃并保持一分钟，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15min，自然冷至室温；秤取0.048g K₂PtCl₆于50 mL水中，0.035 g PdCl₂溶于2 mL 0.2 mol/L的盐酸并加水稀释至100 mL；取5 mL金纳米溶液与40 μL 2mmol/L K₂PtCl₆和40 μL 2mmol/L H₂PdCl₄溶液混合，加入10倍量的抗坏血酸，剧烈震荡，溶液颜色由棕色变为灰色。

（2）所述的对AuPtPd纳米材料表面进行叶酸功能化具体方法，6-巯基-己醇，叠氮-11-烷基-硫醇和AuPtPd按照物质的量比为20:10:1混合，所得溶液在25℃下放置72小时，采用分子量30 kDa 的半透膜进行透析30min，AuPtPd纳米材料表面形成6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇包覆物（A）；1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸（B）；把A物质和B物质按照物质的量之比为1:10混合，加入CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10h，得到叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd材料。

（3）所述叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd材料与肿瘤细胞进行孵育，孵育时间30 min，在转速1000rpm离心5 min。

（4）所述显色剂TMB溶液底物为H₂O₂，取1 mL（3）悬浮液与显色剂100 μL 0.1 mmol/L TMB和100 μL 0.1 mmol/L H₂O₂混合，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液1 mL，静置10 min，溶液颜色变蓝。

（5）所述色谱纸亲水区，利用蜡打印技术在色谱纸纸上打印圆形图案，直径5 mm，将打印蜡的图案放在恒温150℃下2min，未打印蜡的地方为亲水区，在亲水区滴加50μL（4）得到的溶液，在室温下放置，晾干，扫描仪扫描对亲水区域色度进行分析，定量测定细胞数量。

本发明所述显色剂为邻苯二胺（OPD），2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）。

本发明的有益效果：

本发明所述一种叶酸受体靶向的AuPtPd纳米粒子能够特异性识别表面有高水平叶酸受体表达的细胞，能够催化过氧化氢氧化显色剂发生颜色变化，用于癌细胞的检测。

（1）叶酸可以与癌细胞表面的叶酸受体特异性的结合，因此该方法大大提高了选择性。

（2）AuPtPd纳米粒子具有非常高的稳定性，在生理环境下能够稳定存在。

（3）叶酸通过“点击化学”反应可以与AuPtPd纳米粒子形成共价键，连接牢固，叶酸受体靶向的AuPtPd纳米粒子具有很好的生物相容性。

（4）AuPtPd具有高的催化活性，对催化过氧化氢氧化显色剂效果显著。

（5）由于所用的叶酸分子小，有利于聚集于细胞的表面；具有良好的叶酸受体靶向性，AuPtPd催化显色剂颜色发生明显变化，可以实现对癌细胞的检测。

附图说明

图1为AuPtPd纳米粒子透射电镜图。

图2为AuPtPd纳米粒子扫描电镜图（内插能级谱图）。

具体实施方式

实施例1用于K 562肿瘤细胞的快速检测方法

1 叶酸/AuPtPd纳米材料的制备

（1）量取80mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90℃，加入0.8mL 1%的HAuCl₄，加热至96℃并保持一分钟，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15min，自然冷至室温；秤取0.048 g K₂PtCl₆于50 mL水中，0.035 g PdCl₂溶于2 mL 0.2 mol/L的盐酸并加水稀释至100 mL；取5 mL金纳米溶液与40 μL 2mmol/L K₂PtCl₆和40 μL 2mmol/L H₂PdCl₄溶液混合，加入10倍量的抗坏血酸，剧烈震荡，溶液颜色由棕变为灰色。

（2）6-巯基-己醇，叠氮-11-烷基-硫醇和AuPtPd按照物质的量比为20:10:1混合，所得溶液在25℃下放置72小时，采用分子量30 kDa 的半透膜进行透析30min，在AuPtPd纳米材料表面形成6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇包覆物（A）；1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸（B）；把A物质和B物质按照物质的量之比为1:10混合，加入CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10 h，得到叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd材料。

2 K562细胞的培养

RPMI-1640培养液：称取 RPMI-1640 粉 10.4 g，溶于三蒸水1000 mL，加入 2 g NaHCO₃，调节 pH 值至7.4，用 0.22 μm 的微孔滤膜正压过滤除菌，用之前加入10 %胎牛血清(FBS)，青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL，1 mmol/L L-谷氨酰胺，4 ℃保存备用。

从液氮中取出冻存管后立即置于 38 ℃恒温水浴中解冻，取出冻存管，用 75 %酒精清洁管口，将冻存细胞转移到大玻璃培养瓶，加入 20 mL 新鲜培养液培养，复苏次日更换培养液。K562细胞在含有 10 %灭活胎牛血清(FBS)、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL的 RPMI-1640 培养液中，于 37 ℃、5 % CO₂、水饱和湿度条件下培养。

3 K562细胞的测定

（1）取20 μL叶酸/AuPtPd纳米材料与100个/mL，1000个/mL，2000个/mL，5000个/mL，10000个/mL和15000个/mL的K 562细胞孵育30 min，在转速为1000 rpm离心5 min，得到细胞表面结合叶酸/AuPtPd的悬浮液。

（2）取1 mL（1）悬浮液与显色剂100 μL 0.1 mmol/L TMB和100 μL 0.1 mmol/L H₂O₂混合，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液1 mL，静置10 min，溶液颜色变蓝。

（3）用Adobe illustrator CS4设计图案，利用蜡打印技术通过打印机在1级色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150℃下2min，在设计的纸上图案区作为疏水区，未打印蜡的地方亲水区作为工作区（样品区），样品区直径5 mm，在亲水区滴加50μL（3）得到的溶液，在室温下放置，晾干。

（4）将步骤（3）得到的带有颜色的色谱纸放在扫描仪上对样品区进行色度处理，随着K 562细胞浓度的增加，表明结合在细胞表面的叶酸受体靶向的AuPtPd就越多，催化过氧化氢氧化TMB变色越大，色度差值（ΔI）值也随之变大。K562细胞浓度为200-10000 cells/mL时，K 562细胞与所呈现的色度差展现出良好的线性关系，其线性回归方程为ΔI=38.69+0.075c，相关系数R=0.9931。因此，基于叶酸受体靶向的AuPtPd用于检测肿瘤细胞的检测限为80个/mL，这种方法实现了操作简便，快速，费用低和无需专业人士即可检测叶酸受体过表达的细胞。

Claims

1.一种用于叶酸过表达的癌细胞的快速检测方法，其特征是包括以下步骤：

（4）取（3）悬浮液与显色剂混合，加入显色剂溶液底物；

2.根据权利要求1在步骤（1）中，所述AuPtPd纳米材料制备方法，量取80mL去离子水于三口烧瓶中，加热至90℃，加入0.8mL 1%的HAuCl₄，加热至96℃并保持一分钟，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15min，自然冷至室温，秤取0.048g K₂PtCl₆于50 mL水中，0.035 g PdCl₂溶于2 mL 0.2 mol/L的盐酸并加水稀释至100 mL，取5 mL金纳米溶液与40 μL 2mmol/L K₂PtCl₆和40 μL 2mmol/L H₂PdCl₄溶液混合，加入10倍量的抗坏血酸，剧烈震荡，溶液颜色由棕色变为灰色。

3.根据权利要求1在步骤（2）中，所述的对AuPtPd纳米材料表面进行叶酸功能化具体方法，6-巯基-己醇，叠氮-11-烷基-硫醇和AuPtPd按照物质的量比为20:10:1混合，所得溶液在25℃下放置72小时，采用分子量30 kDa 的半透膜进行透析30min，AuPtPd纳米材料表面形成6-巯基-己醇和叠氮-11-烷基-硫醇包覆物（A）；1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸（B）；把A物质和B物质按照物质的量之比为1:10混合，加入CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L，放置10h，得到叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd材料。

4.根据权利要求1在步骤（3）中，所述叶酸受体靶向的叶酸/AuPtPd材料与肿瘤细胞进行孵育，孵育时间30 min，在转速1000rpm离心5 min。

5.根据权利要求1在步骤（4）中，所述显色剂TMB溶液底物为H₂O₂，取1 mL（3）悬浮液与显色剂100 μL 0.1 mmol/L TMB和100 μL 0.1 mmol/L H₂O₂混合，加入pH 6.5的磷酸缓冲溶液1 mL，静置10 min，溶液颜色变蓝。

6.根据权利要求1在步骤（5）中，所述色谱纸亲水区，利用蜡打印技术在色谱纸纸上打印圆形图案，直径5 mm，将打印蜡的图案放在恒温150℃下2min，未打印蜡的地方为亲水区，在亲水区滴加50μL（4）得到的溶液，在室温下放置，晾干，扫描仪扫描对亲水区域色度进行分析，定量测定细胞数量。

7.根据权利要求1所述本发明所述显色剂为邻苯二胺（OPD），2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）。