CN106841190A - 以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，属于分析化学领域。该方法以TMB为显色剂，在柠檬酸‑Na2HPO4缓冲液中，利用不同浓度Ag+与Hg2+生成Hg‑Ag合金催化H2O2氧化TMB得到不同深度蓝色和吸光度的反应液，实现对Ag+的可视化半定量及定量检测。本发明采用具有大的共轭体系，是良好电子供体的TMB的显色反应对样品溶液中Ag+进行定量或可视化半定量检测，整个过程不需要对样品进行复杂处理，不会对样品造成损伤，所需仪器和操作方法简单，且具有检测灵敏度高、检测限低的优点，能够对样品溶液进行实时检测。

Description

以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法。
背景技术
银作为一种贵金属，因其极好的光学、电学和杀菌特性而被广泛应用于能源、摄影、医药等各个行业，而实际应用中必然会产生含银的废液，这些废液被排放到水体环境中后会对水生生物和人类健康造成潜在的威胁。有报道显示，银虽然是人体所需要的重要微量元素之一，但人体内Ag+过量后会在人大脑、肝脏、肾脏、肺、骨骼等处沉积，从而对身体产生伤害作用，尤其伤害人的眼睛和内脏。因此，开发高效方便的分析方法用于银离子高灵敏度、高选择性检测，具有重要的现实意义。
目前，对痕量Ag+的检测主要依赖于原子吸收光谱（AAS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、X-射线荧光、电化学方法（CV）等。这些方法虽然检测精密度高，但其所用仪器昂贵、运行费用高，对检测条件要求较高，且检测时需进行萃取、浓缩富集或抗干扰等复杂的前处理过程，使得整个检测过程费时、费力，不适用于大规模现场快速检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述检测方法中的技术问题，提供一种成本低廉、操作方便、以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，以实现Ag+的大规模现场快速检测。
本发明检测方法的原理如下：以TMB为显色底物，在柠檬酸-Na2HPO4缓冲液存在的条件下，将Hg2+配成痕定量的溶液加入体系中，由于柠檬酸盐的弱还原性，Hg2+被还原成Hg0，生成包裹柠檬酸盐的Hg NPs；继续往溶液中加入配制好的Ag+溶液，包裹有柠檬酸盐的HgNPs可以将Ag+还原成Ag NPs，生成Hg-Ag 合金；运用Hg-Ag 合金的类过氧化物酶活性催化H2O2与TMB发生反应，当TMB与·OH发生作用时，·OH夺取TMB中的电子，使反应体系由无色变为蓝色，TMB失去一个电子的产物在652 nm处有最大吸收峰出现，从而高灵敏度、高选择性的间接检测Ag+。
本发明以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，以 TMB为显色剂，在柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，利用不同浓度Ag+与Hg2+生成Hg-Ag 合金催化H2O2氧化TMB得到不同深度蓝色和吸光度的反应液，实现对Ag+的可视化半定量及定量检测。
上述检测方法按以下步骤进行：
（1）建立Ag+的可视化半定量或定量检测标准：
利用不同浓度Ag+与Hg2+生成Hg-Ag 合金催化H2O2氧化TMB得到不同深度蓝色的反应液，记录颜色比较图像；采用可见光谱仪扫描反应液500-750nm范围内的吸收光谱，测定不同浓度Ag+在652 nm下的吸光度，得到的吸光度值（A）与银离子浓度（C，μmol/L）之间的线性方程为：A=0.01197C+0.00627，R2=0.9921。
（2）检测样品溶液中的Ag+：
以体积计，取200份柠檬酸-Na2HPO4缓冲液于试管中，分别加入2份Hg2+溶液，2份样品溶液，2份H2O2溶液，最后加入1份TMB，记录反应液的颜色，然后与步骤（1）中颜色比较图像对照，确定Ag+浓度范围；或者得到反应液在652 nm下的吸光度值，根据线性方程得到待测样品溶液中Ag+的浓度。
由于TMB难溶于水，易溶于丙酮、乙醚、DMSO、DMF等有机试剂，出于安全环保、经济实惠的考虑，优选上述步骤（2）中TMB溶液的溶剂为DMF。
通过单因素优化实验，得到反应液的最佳pH值为4，反应温度为22℃，柠檬酸-Na2HPO4缓冲液浓度为0.2 mol/L，Hg2+溶液的浓度为2.5 mmol/L，H2O2溶液的浓度为0.4mol/L，TMB溶液的浓度为0.1 mmol/L。
该方法Ag+检出限为1×10-4μmol/L，线性范围为1×10-3 - 40μmol/L。
本发明采用具有大的共轭体系，是良好电子供体的TMB的显色反应对样品溶液中Ag+进行定量或可视化半定量检测，整个过程不需要对样品进行复杂处理，不会对样品造成损伤，所需仪器和操作方法简单，且具有检测灵敏度高、检出限低的优点，能够对样品溶液进行实时检测。
附图说明
图1为本发明反应液在500-750nm范围内的紫外可见光谱图。
图2为本发明检测方法的反应条件优化结果，其中：（a）为pH值优化结果；（b）为反应温度优化结果；（c）为Hg2+浓度优化结果；（d）为TMB浓度优化结果；（e）为H2O2浓度优化结果；（f）为Ag+浓度优化结果。
图3为本发明Ag+检测方法对16种金属离子的选择性实验结果。
图4为本发明Ag+检测方法对16种金属离子的抗干扰实验结果。
图5为本发明Ag+检测方法的线性图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，现结合附图和具体实施方式对本发明的检测方法和优化过程作进一步说明。
1、反应液的可见吸收光谱
取两只相同的石英比色皿，一只中依次加入柠檬酸- Na2HPO4缓冲液（0.2mol/L，2mL），Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)， Ag+ （2.5×10-4 mol/L，20μL），H2O2 (0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 mmol/L，20μL），另一只中不加Ag+作为对照，采用可见光谱仪扫描二者在500-750nm范围内的吸收光谱，结果如图1所示。
从图1中可以看出，依序添加Ag+的反应液在652nm处出现最大吸收峰，而未添加Ag+的对照反应液在500-750nm范围内没有紫外吸收，因此，本发明以652nm作为Ag+定量检测的最大吸收波长。
2、本发明检测方法反应条件的优化：
（1）pH值的优化：配制pH分别为2.44、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，浓度为0.2 mol/L的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液，依次加入Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)，Ag+（1.0×10-5 mol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 mmol//L，20μL）。用不同pH值的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液调节反应液的酸碱度，在35℃的恒温条件下，测定反应液652nm处的吸光度随pH值的变化，结果如图2（a）所示，图2（a）显示pH值为4时反应液吸光度最大，故选择最佳pH值为4。
（2）反应温度的优化：于2mL、 pH值为4的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液中，依次加入Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)，Ag+（1.0×10-5 mol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1mmol/L，20μL），于12-62℃（12℃,22℃,32℃,42℃,52℃,62℃）的温度下测定反应液652nm处的吸光度结果如图2（b）所示，图2（b）显示温度为22℃时反应液吸光度最大，故选择最佳温度为22℃。
（3）Hg2+浓度的优化：在pH值为4、温度为22℃的条件下，于2mL浓度为0.2 mol/L的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液中依次加入20μL不同浓度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 μmol/L）的Hg2+，Ag+（1.0×10-5 mol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 mM，20μL），测定反应液652nm处的吸光度结果如图2（c）所示，图2（c）显示Hg2+浓度为2.5 mmol/L时反应液吸光度最大，故选择最佳Hg2+浓度为2.5 mmol/L。
（4）TMB浓度的优化：在pH值为4、温度为22℃的条件下，于2mL浓度为0.2 mol/L的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液中依次加入Hg2+(2.5 mM，20μL)，Ag+（1.0×10-5 mol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和20μL不同浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mmol/L）的TMB，测定反应液652nm处的吸光度结果如图2（d）所示，图2（d）显示TMB浓度为0.1 mmol/L时反应液吸光度最大，故选择最佳TMB浓度为0.1 mmol/L。
（5）H2O2浓度的优化：在pH值为4、温度为22 ℃的条件下，于2mL浓度为0.2 mol/L的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液中依次加入Hg2+(2.5 mM，20μL)，Ag+（1.0×10-5 mol/L，20μL），20μL不同浓度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mol/L）的H2O2和TMB（0.1 mmol/L，20μL），测定反应液652nm处的吸光度结果如图2（e）所示，图2（e）显示H2O2浓度为0.4 mol/L时反应液吸光度最大，故选择最佳H2O2浓度为0.4 mol/L。
（6）Ag+浓度的优化：在pH为值4、温度为22℃的条件下，于2mL浓度为0.2mol/L的柠檬酸- Na2HPO4缓冲液中依次加入Hg2+(2.5 mM，20μL)，20μL不同浓度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 μmol/L）的Ag+，H2O2(0.4 M，20μL)和TMB（0.1 mM，20μL），测定反应液652nm处的吸光度结果如图2（f）所示，图2（f）显示Ag+浓度为4.0 μmol/L时反应液吸光度最大，故选择最佳Ag+浓度为4.0μmol/L。
综上，本发明检测方法的最佳反应条件为：反应液的pH值为4，反应温度为22℃，柠檬酸-Na2HPO4缓冲液浓度为0.2 mol/L，Hg2+溶液浓度为2.5mmol/L，H2O2溶液浓度为0.4mol/L，TMB溶液浓度为0.1mmol/L。
实际检测过程中由于含Ag+的待测样品来源不一，成分复杂，因此，为了验证本发明方法对含Ag+样品溶液的普适性，下面进行Ag+的选择性实验和抗干扰实验。
3、选择性实验
分别制备2 mmol/L的Na+，K+， Mg2+，Ca2+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Hg2+，Zn2+，Pb2+，Cd2+，Cu2+，Fe2+，Al3+，Cr3+，Fe3+离子溶液；在石英比色皿中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（25 mmol/L，2mL），接着依次加入Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)，20μL（1.0×10-3 mol/L）上述金属离子，Ag+（4.0μmol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 m mol/L，20μL），反应5 min后分别测定反应液652nm处的吸光度如图3所示。从图3中可以看出，本发明方法对Ag+具有很好的选择性。
4、抗干扰实验
分别制备与选择性实验中相同的16种金属离子溶液，在石英比色皿中依次加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（25 mmol/L，2 mL），接着依次加入Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)，20μL 干扰离子中的一种或者20μL 干扰离子中的一种和Ag+（4.0μmol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 mM，20μL），反应5 min后分别测定反应液652nm处的吸光度如图4所示。从图4中可以看出，未加Ag+时反应液在652nm处有较弱的吸收，而加入Ag+后反应液在652nm处具有很强的吸收，表明采用本发明方法检测Ag+时对其他16种金属离子具有很好的抗干扰性。
5、本发明的具体检测过程：
（1）建立Ag+的可视化半定量或定量检测标准：
在石英比色皿中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（25 mmol/L，2 mL），接着依次加入Hg2+(1×10-4 mol/L，20μL)， Ag+（1×10-3，2,5,7,10,13,15,17,20,23,25,28,30,35,37和40 μmol/L，20μL），H2O2(0.1 mol/L，20μL)和TMB（1 m mol/L，20μL），分别记录颜色比较图像，并测定反应液652nm处的吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，银离子浓度（C，μmol/L）为横坐标得到线性回归方程如图5所示，线性方程为：A=0.01197C+0.00627，R2=0.9921，线性范围为：1×10-3 - 40μmol/L。
在最佳实验条件下，以未加入Ag+的反应液为空白溶液，按上述实验方法平行测定16组空白溶液在652 nm下的吸光度值，按3б/k计算（б为16次空白溶液的标准偏差，k为线性方程的斜率）得本发明方法检测限为1×10-4μmol/L。
（2）检测样品溶液中的Ag+：
按照（1）中方法对3个含Ag+样品溶液进行检测，记录反应液颜色，然后与（1）中颜色比较图像对照，确定Ag+浓度范围，从而对含Ag+样品溶液进行可视化半定量检测；若想进一步实现定量检测，则测定3个含Ag+样品溶液在652 nm下的吸光度值分别为0.128，0.251和0.457，根据线性方程A=0.01197C+0.00627得到待测样品溶液中Ag+的浓度分别为10 μmol/L，20 μmol/L和37 μmol/L 。
另外，若样品溶液的浓度超出本发明方法的检测范围，可对样品溶液进行一定程度的稀释后进行检测，然后根据稀释倍数反推出样品溶液中Ag+的浓度。

Claims (6)

1.以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于，以 TMB为显色剂，在柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，利用不同浓度Ag+与Hg2+生成Hg-Ag 合金催化H2O2氧化TMB得到不同深度蓝色和吸光度的反应液，实现对Ag+的可视化半定量及定量检测。
2.根据权利要求1所述的以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于，按以下步骤进行检测：
（1）建立Ag+的可视化半定量或定量检测标准：
利用不同浓度Ag+与Hg2+生成Hg-Ag 合金催化H2O2氧化TMB得到不同深度蓝色的反应液，记录颜色比较图像；采用可见光谱仪扫描反应液500-750nm范围内的吸收光谱，通过测定不同浓度Ag+在652 nm下的吸光度，得到的吸光度值（A）与银离子浓度（C，μmol/L）之间的线性方程为：A=0.01197C+0.00627，R2=0.9921；
（2）检测样品溶液中的Ag+：
以体积计，取200份柠檬酸-Na2HPO4缓冲液于试管中，分别加入2份Hg2+溶液，2份样品溶液，2份H2O2溶液，最后加入1份TMB溶液，记录反应液的颜色，然后与步骤（1）中颜色比较图像对照，确定Ag+浓度范围；或者得到反应液在652 nm下的吸光度值，根据线性方程得到待测样品溶液中的Ag+的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于：所述反应液的pH值为4，反应温度为22℃。
4.根据权利要求2所述的以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述TMB溶液的溶剂为DMF。
5.根据权利要求2所述的以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于：所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液浓度为0.2 mol/L，Hg2+溶液的浓度为2.5mmol/L，H2O2溶液的浓度为0.4mol/L，TMB溶液的浓度为0.1mmol/L。
6.根据权利要求1或2所述的以TMB为显色剂的Ag+可视化检测方法，其特征在于：该方法Ag+的检出限为1×10-4μmol/L，线性范围为1×10-3 - 40μmol/L。
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