CN115806679A - 一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法 - Google Patents

一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法 Download PDF

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张灵乐
项婷婷
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周园园
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Abstract

本发明提供了一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法。包括提供一种具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,本发明纳米探针通过共沉淀法合成,包括如下步骤:先取15 mL 6 mg mL‑1金属有机框架材料MIL‑101(Fe)超声分散2h后加入到20mL反应瓶中,将透明质酸与EDC 37℃水浴15min后加入NHS反应15min后,加入MIL‑101(Fe),经40℃搅拌反应4h、10,000 rpm离心30 min后,重悬于去离子水中即可得到MIL‑101(Fe)‑HA溶液。将材料与MGC‑803细胞进行孵育,通过材料表面的透明质酸识别位于MGC‑803细胞表面的CD44受体,MIL‑101(Fe)催化过氧化氢氧化底物3,3ˊ,5,5’‑四甲基联苯胺发生颜色变化,通过比色法检测和量化肿瘤细胞数量,据此建立了一种简单、快速、高灵敏度的检测肿瘤细胞的方法。

Description

一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测 肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域,涉及一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,尤其涉及一种靶向肿瘤细胞、生物相容性较好的基于MIL-101(Fe)-HA材料制备用于比色方法检测肿瘤细胞。
技术背景
癌症已成为人类生存和健康的主要威胁,实现肿瘤准确、灵敏、简便检测对于疾病的治疗具有非常重要的意义。当前采取的检测方法多为酶联免疫法,该方法通过检测肿瘤标志物间接检测肿瘤细胞,因此灵敏性较低,难以早期发现并且防治;还有研究者利用细胞计数、聚合酶链式反应、化学发光法、计时电流法以及流式细胞术等方法进行肿瘤细胞检测,但这些方法分析成本高,耗时长,操作繁琐。近年来,以透明质酸靶向肿瘤细胞通过材料的过氧化物酶活性催化过氧化氢底物发生颜色反应,通过比色定量检测肿瘤细胞的研究已经开展。其中,大多检测肿瘤细胞的材料为贵金属材料、氧化石墨烯和金属的复合材料或是合金材料,除了氧化石墨烯和金纳米簇复合材料在酸性和中性条件下都具有良好的模拟酶活性外,其余材料在中性条件的模拟酶活性均研究较少。
而本发明中的检测肿瘤细胞材料属于金属有机框架材料-MIL-101(Fe),在酸性和中性条件下均具有较高的模拟酶活性,且通过透明质酸修饰后应用于检测肿瘤细胞,在提高材料生物相容性的同时能够特异性识别肿瘤细胞并于正常细胞区分开来。与上述材料相比,本发明制备的MIL-101(Fe)具有高比表面积、水热稳定性高、结构稳定、并在酸性和中性条件下都具有较高过氧化物酶活性的优势。MIL-101(Fe) 表面修饰透明质酸后使纳米颗粒能够靶向肿瘤细胞,利用其过氧化物酶活性靶向肿瘤细胞达到较好的检测效果。
发明内容
本发明目的在于,提供一种具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料。
本发明的再一目的在于,提供上述材料得到的试剂。
本发明的又一目的在于,一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法。
本发明目的通过下述方案实现,一种具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,以MIL-101(Fe)-HA材料,包括下述制备步骤:
(1) 将15 mL 6 mg mL-1 金属有机框架材料MOFs(MIL-101(Fe)) 超声分散得到的MIL-101(Fe) 溶液;
(2)通过酰胺化反应将透明质酸 (HA) 连接到MIL-101(Fe) 合成具有肿瘤细胞靶向性的透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA材料,且透明质酸修饰后,材料生物相容性提高,在酸性和中性条件下同样具有较高的过氧化物酶活性。
所述的透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA材料合成方法,提升了MIL-101(Fe)生物相容性。
优选的,步骤(1)中,超声分散2h。
优选的,步骤(2)中,将透明质酸HA溶于N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC 37℃水浴15min后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS 反应15min,随后加入步骤(1)MIL-101(Fe)溶液,再经40℃搅拌反应4h、10,000rpm离心30min后,最后重悬于去离子水中即可得到MIL-101(Fe)-HA探针溶液。
进一步的,步骤(2)中,透明质酸溶于N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基丁二酰亚胺NHS中,反应孵育时间为60-90 min,优选70 min。
本发明还提供了一种肿瘤检测试剂,包含上述透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA材料。
本发明也提供了一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,包括如下步骤:
1)透明质酸受体CD44靶向的MIL-101(Fe)-HA材料与MGC-803细胞进行孵育;
2)离心分离后,加入底物和显色剂于反应溶液中,在有H2O2条件下,MIL-101(Fe)-HA催化过氧化氢氧化底物3,3ˊ,5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 产生颜色变化,通过比色测定对肿瘤细胞进行定量检测。
本发明方法的肿瘤细胞定量检测原理是:将上述纳米探针与MGC-803细胞进行孵育,通过探针表面的透明质酸识别位于肿瘤细胞表面的CD44受体后,实现探针与肿瘤细胞的靶向结合,随后探针内部的MIL-101(Fe) 催化过氧化氢氧化底物TMB发生颜色变化,通过比色法即可实现肿瘤细胞的定量检测。
将材料与MGC-803细胞进行孵育,通过材料表面的透明质酸识别位于MGC-803细胞表面的CD44受体,MIL-101(Fe) 催化过氧化氢氧化底物3,3ˊ,5,5’-四甲基联苯胺发生颜色变化,通过比色法检测和量化肿瘤细胞数量,在具有良好线性条件下对肿瘤细胞的检测限达到50个,并且明显可观察到10个肿瘤细胞的颜色反应,据此建立了一种简单、快速、高灵敏度的检测肿瘤细胞的方法。
在上述方案基础上,醋酸缓冲液 20 mM、pH 2.0~5.0 下的酸性和磷酸缓冲液0.2M、pH 5.8~8.0下的中性条件。
进一步的,透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA探针添加量为5~20 μg,优选为10μg。
优选的,步骤2)中,所述的反应溶液为0.9% NaCl,显色剂为TMB溶液,底物为双氧水,显色剂和底物浓度均为0.2 mM,室温反应400s后于最大吸收波长652nm处读取吸光值。
本发明一种功能化纳米粒子探针的制备及其在肿瘤细胞检测中的应用,仅利用MIL-101(Fe)表面修饰透明质酸后即可使纳米颗粒精准靶向肿瘤细胞,MIL-101(Fe)-HA探针不仅取材方便、操作简化且生物相容性高、适合大规模制备。本发明提供了一种能够准确、灵敏、简便检测肿瘤细胞的方法;解决目前传统肿瘤细胞检测过程中存在的操作步骤繁琐、时间和金钱成本高等的问题;解决检测肿瘤细胞材料合成复杂困难的问题,
利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法为当前传统肿瘤细胞检测过程中存在耗时耗费等问题提供一种新的解决方案,且良好的生物相容性为其在分子影像、生物医药等领域提供了广泛的应用前景。本发明利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,能够特异性识别具有透明质酸受体CD44表达的肿瘤细胞,对于正常细胞无识别作用。相比传统检测,操作简单且耗时短。材料合成简单易行,所制备的材料具有较高的催化活性和生物相容性,肿瘤细胞检测限度比大部分现有方法低,对肿瘤细胞的识别能力更强。
附图说明
图1为本发明MIL-101(Fe) 材料TEM图;
图2为本发明MIL-101(Fe)-HA 材料的紫外光谱图;
图3为本发明比色法检测肿瘤细胞图;
图4为本发明比色法检测不同数量的肿瘤细胞。
具体实施方式
实施例1
一种具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,按下述步骤制备:
(1)取 6mg MIL-101(Fe) 加入到15mL去离子水中超声分散2h后加入到100mL 反应瓶中得到粒径均一、分散性良好的MIL-101(Fe)溶液(如图1);
(2)将透明质酸HA与30mg EDC 加入15mL MES Buffer 中 37℃水浴15min,然后加入15mg NHS 反应15min;再加入MIL-101(Fe)溶液,40℃搅拌反应4h后,10,000rpm离心30min,重悬于去离子水中即可得到MIL-101(Fe)-HA探针溶液,其紫外扫描光谱图见图2。
探针溶液用于肿瘤检测:
(1)上述得到的MIL-101(Fe)-HA材料5μg加入到含肿瘤细胞培养基中(总体积为1mL),在37℃,5% CO2培养箱中,与肿瘤细胞进行孵育,孵育时间为60min, 1,000rpm离心5min,并用磷酸缓冲液PBS(pH7.4)洗三次,以去除未与细胞结合的材料;
(2)加入0.9% NaCl反应液,0.2 mM TMB溶液,0.2 mM双氧水,室温反应400s后于最大吸收波长652nm处读取吸光值。
如图3所示肿瘤细胞会过表达的跨膜糖蛋白CD44,细胞与MIL-101(Fe)-HA孵育后,正常细胞与肿瘤细胞结合材料的能力有区别,加入底物和双氧水后显色的程度有差别,相同数量肿瘤细胞比正常细胞的吸光度值高很多,CD44高表达的肿瘤细胞的吸光度值与正常细胞的吸光度值有显著差异性,说明此法可以识别肿瘤细胞,将正常细胞和肿瘤细胞区别开来。
如图4所示为本发明比色法检测不同数量的肿瘤细胞。细胞数量分别为0,10,50,100,200,500个,与MIL-101(Fe)-HA孵育400s后以TMB为比色底物在652 nm处的紫外吸收强度。随着细胞数目增加,与之结合的MIL-101(Fe)-HA随之增多,溶液的颜色变深,吸光度值增高。细胞数在10-500之间具有相对良好的线性关系,肉眼可观察到10个肿瘤细胞的颜色反应,细胞数在50-500之间具有良好线性关系,最低可检测50个肿瘤细胞。
实施例2
一种功能化纳米粒子探针的制备及其在胃肿瘤细胞检测中的应用,与实施例1不同之处在于,酸性和中性条件分别为醋酸缓冲液 (20 mM, pH 2.0~5.0) 和磷酸缓冲液(0.2M, pH 5.8~8.0)。其他与实施例1相同。
实施例3
一种功能化纳米粒子探针的制备及其在胃肿瘤细胞检测中的应用,与实施例2不同之处在于,所述MIL-101(Fe)-HA探针 20 μg。
实施例4
一种功能化纳米粒子探针的制备及其在胃肿瘤细胞检测中的应用,与实施例3不同之处在于,所述探针与肿瘤细胞进行孵育,孵育时间为90 min。

Claims (8)

1.一种具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,其特征在于:为MIL-101(Fe)-HA材料,包括下述制备步骤:
(1) 将15 mL 6 mg mL-1 金属有机框架材料MOFs(MIL-101(Fe)) 超声分散得到后的MIL-101(Fe) 溶液;
(2)通过酰胺化反应将透明质酸 (HA) 连接到MIL-101(Fe) 合成具有肿瘤细胞靶向性的透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA材料。
2.根据权利要求1具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,其特征在于:步骤(1)中,超声分散2h后加入到20mL 反应瓶中。
3.根据权利要求1具有肿瘤细胞靶向性的金属有机框架材料,其特征在于:步骤(2)中,将透明质酸HA溶于N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC 37℃水浴15min后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS 反应15min,随后加入步骤(1)MIL-101(Fe)溶液,再经40℃搅拌反应4h、10,000rpm离心30min后,最后重悬于去离子水中即可得到MIL-101(Fe)-HA探针溶液。
4.一种肿瘤检测试剂,其特征在于,包含权利要求1或2所述的材料。
5.一种利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)透明质酸受体CD44靶向的MIL-101(Fe)-HA材料与MGC-803细胞进行孵育;
(2)离心分离后,加入底物和显色剂于反应溶液中,在有H2O2条件下,MIL-101(Fe)-HA催化过氧化氢氧化底物3,3ˊ,5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 产生颜色变化,通过比色测定对肿瘤细胞进行定量检测。
6.根据权利要求4所述利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,其特征在于,醋酸缓冲液 20 mM、pH 2.0~5.0 下的酸性和磷酸缓冲液0.2M、pH5.8~8.0下的中性条件。
7.根据权利要求4所述利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,其特征在于,透明质酸受体靶向的MIL-101(Fe)-HA探针添加量为5~20 μg。
8.根据权利要求4所述利用MOFs材料的模拟过氧化物酶活性在中性条件下检测肿瘤细胞的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的反应溶液为0.9% NaCl,显色剂为TMB溶液,底物为双氧水,显色剂和底物浓度均为0.2 mM,室温反应400s后于最大吸收波长652nm处读取吸光值。
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