CN110904081A - 一种內切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种内切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用。其中编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明首次从黑莓基因组中克隆得到一种内切葡聚糖酶RuEG6的编码基因RuEG6，并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，将本发明的RuEG6基因导入植物细胞，可获得纤维素含量降低的转基因植株。

Description

一种內切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种利用黑莓内切葡聚糖酶编码基因降低植物纤维素含量的方法。
背景技术
植物在不同的生长期其细胞壁中的纤维素含量不同，不同植物细胞壁的纤维素含量也不同，而不同植物也要求一定合适的纤维素含量。一方面，纤维素在维持植物细胞的结构和强度上具有重要作用，而纤维素含量较高又对实际生产利用带来一定局限性。
如：烟叶纤维素的存在一定程度上影响了烟叶的内在品质，需要合理改善纤维素含量(蒲俊和刘彦岭，2019)。纤维素含量高的牧草适口性和可消化性较差。玉米饲料粗纤维含量高，适口性差，改善其适口性是开发其作为饲料资源的关键环节(王燕等，2016)。甜玉米果皮纤维素含量高严重影响其果皮柔嫩度(赵捷等，2018)，柑橘果肉“不化渣”也是因果肉中含高含量的纤维素导致口感粗糙(辜青青等，2016)。
因此，降低纤维素含量是提高多种植物利用率的关键措施，近年来迫切需要寻找一种有效降低纤维素含量的有效方法。纤维素酶是能够降解代谢多种多聚糖底物生成葡萄糖的一类细胞壁降解酶，植物中主要类型为内切葡聚糖酶(endo-1,4-D-glucanase,EG，也称为Cellulase,EC 3.2.1.4)(Fischer&Bennett,1991)。纤维素酶可以降解纤维素、部分降解半纤维素以及木糖苷(半纤维素多糖)的β-1,4-葡聚糖键(Vicente et al.,2007)。纤维素酶主要广泛存在于成熟的多汁柔软浆果果实中(Huber,1983)。
目前纤维素降解多使用微生物制剂和添加纤维素酶的方法，但这需筛选适宜的降解菌菌株，也仍存在纤维素酶降解能力低、活性不稳定、产酶成本高、作用pH范围狭窄等问题，使得降解效果也有限。采用传统的杂交育种技术或人工定向选择方法改良植物的纤维素含量需要的时间长，见效慢。
通过生物技术方法实现快速改良纤维素含量成为一种可能，但目前尚未见将果实软化关键纤维素酶基因应用于降低植物纤维素含量的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种经过量表达转化能够有效降低植物纤维素含量的生物技术方法。
为了实现上述目的，本发明提供了编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
本发明还提供了一种内切葡聚糖酶RuEG6，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
以及包括编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA的表达载体。
特别的，上述表达载体优选将具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA利用酶切连接技术插入植物表达载体pGLN得到的植物过量表达载体pGLN-RuEG6。上下游引物所用酶切位点可以是多种酶切位点引物的组合，利用在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因)或抗生素标记物(卡那霉素标记物)的抗性基因对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选。
本发明还提供了了利用上述表达载体pGLN-RuEG6制备工程菌的方法，通过将所述表达载体pGLN-RuEG6转入根癌农杆菌EHA105，即得所述工程菌。
本发明还提供了用于扩增上述cDNA的引物，其正向引物为5’-ATGGAGAAATTTGTGAGACTCG-3’,反向引物为5’-TGAGTGCTTGTGCTTTCCTTTA-3’。
本发明还提供了上述cDNA在降低植物纤维素含量上的应用。
以及上述内切葡聚糖酶RuEG6在降低植物纤维素含量上的应用。
将携带有编码RuEG6的cDNA的植物表达载体通过Ri质粒、Ti质粒、植物病毒载体、显微注射、直接DNA转化、农杆菌介导、电导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
有益效果：
本发明首次从黑莓基因组中克隆得到一种黑莓内切葡聚糖酶RuEG6的编码基因RuEG6，并验证了该基因的功能。利用植物表达载体，将本发明的RuEG6基因导入植物细胞，可获得纤维素含量降低的转基因植株。过量表达本发明RuEG6基因的烟草，其纤维素和半纤维素含量显著降低，说明RuEG6基因在降低植物纤维素含量方面起着重要作用。本发明的RuEG6对培育纤维素和半纤维素含量高的植物类型具有重要意义。
附图说明
图1为pGLN的质粒图谱；
图2为RuEG6转基因烟草正义载体GUS染色鉴定图；
图3为RuEG6转基因烟草正义载体RT-PCR鉴定电泳图；
图中，泳道1：DL 2000分子量标准；泳道2：以非转化烟草对照Wt为模板(阴性对照)；泳道3-13：转正义载体各转基因烟草植株cDNA为模板扩增图；
图4为转RuEG6烟草株系正义载体的叶片半纤维素含量(A)、纤维素含量(B)、干物质质量(C)；
图5为转RuEG6烟草株系正义载体的叶片半纤维素含量降低植株(A)、叶片纤维素含量降低植株(B)生长表现；
图4、5中，Wt为野生型非转化株，eg6z-1～eg6z-11为转正义载体的阳性转化株；
图6为对照株(A，C)叶片表面形态、叶片横断面微形态和RuEG6转化株系eg6z-5(B，D)的微形态比较。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1黑莓RuEG6基因的克隆
黑莓RuEG6及其编码基因RuEG6的cDNA克隆与鉴定。黑莓品种‘Boysen’,材料种植于江苏省中科院植物研究所溧水白马科学基地，常规田间管理。
根据黑莓‘Boysen’茎尖转录组测序序列比对以及与NCBI数据库中已克隆的内切葡聚糖酶EG基因序列进行比对，利用生物信息学的方法进行分析，设计RuEG6基因开放阅读框(ORF)正向和反向引物，应用RT-PCR方法，以黑莓成熟果实的cDNA为模板进行克隆RuEG6的开放阅读框，具体方法如下：
RuEG6基因ORF正向引物:5’-ATGGAGAAATTTGTGAGACTCG-3’
RuEG6基因ORF反向引物:5’-TGAGTGCTTGTGCTTTCCTTTA-3’；
取黑莓新鲜成熟果实，置于液氮中研碎，RNA提取依据北京百泰克公司植物通用RNA提取试剂盒(RP3301)进行。cDNA第一链合成依据百泰克反转录试剂盒(PR6601)，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，用上述引物对进行PCR扩增反应。20μl PCR反应体系为：1μlcDNA第一链(0.5μg)、1.6μl引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，10μM)、2μl 10×PCR缓冲液、1.6μl Mg2+、1.6μl dNTP和0.5U LA Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl。反应在ABI Veriti PCR仪上进行，其程序为94℃变性3min；再94℃30sec，52℃40sec，72℃2min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物回收后经连接pMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析结果表明PCR产物具有序列表中SEQ IDNO.1的核苷酸序列，命名为RuEG6。
实施例2转RuEG6基因烟草的获得
分别设计带有酶切位点‘KpnI’和‘EcoRI’(Takara)正义载体的上下游引物，RuEG6ZF：CGGggtaccATGGAGAAATTTGTGAGACTCG，RuEG6ZR：CCGgaattcTTACGCTAATGAGTAGCTCGAG；重新扩增上述黑莓果实cDNA，PCR体系和反应程序均同上述，RuEG6的cDNA克隆和鉴定均与上述相同。利用限制性内切酶‘KpnI’和‘EcoRI’进行RuEG6 PCR产物的酶切，将RuEG6正向插入到表达载体pGLN(图1)中，转化大肠杆菌DH5α，转化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得到pGLN-RuEG6植物表达载体。用冻融法分别将pGLN-RuEG6正义载体质粒转入根癌农杆菌菌株EHA105(Biovector Co.,LTD)中。pGLN-RuEG6正义载体分别通过农杆菌EHA105介导转化烟草。利用Gus染色方法初步鉴定转化植株，进而提取转基因烟草的cDNA作为模板，以未转化烟草为对照，设计正义载体引物进行RT-PCR初步鉴定阳性转基因烟草，方法如下：
A：切下转基因烟草植株幼叶少许，放入干净离心管中，以未转化株为对照，将配制好的Gus染液50μl加入离心管中，打开管盖抽真空10min，37℃培养过夜。倒掉染液，向离心管中加入75％50μl，根据脱色情况再更换乙醇漂洗至液体清澈(对照呈白色)，拍照记录结果。Gus染色鉴定结果见图2。
B：对Gus染色呈阳性的转化株提取RNA,反转录后进行RT-PCR，设计目的基因内部上下游引物5’-CTCCGACTATCTTACATCTG-3’和5’-AGTTGTTACCTTCTGTGCTA-3’进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为：2×Super-Taq mix(10μL)，上、下游引物(10pmol)各0.8μL，模板1μL(大约含0.05μg),加ddH2O 7.4μL。其程序为94℃变性3min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。进一步鉴定的呈阳性的转基因苗扩增结果见图3。
实施例3RuEG6基因的功能鉴定
测定阳性转RuEG6基因正义载体烟草株系叶片的半纤维素含量、纤维素含量和新鲜叶片干物质质量(图4)，发现11株转正义载体的阳性转化株中，与野生型烟草相比，有6株表现为半纤维素含量下降(图4A)，8株表现为纤维素含量下降(图4B),8株表现为叶片干物质质量下降(图4C)。对植株开花前停止营养生长时的株高进行测定，发现与野生型烟草相比，半纤维素含量下降的6株转RuEG6基因烟草株系中有3株表现矮化，2株表现为略低于对照(图5A)，纤维素含量下降的8株转RuEG6基因烟草株系有6株株高明显低于对照株(图5B)。转化株eg6z-5矮化最为明显，进一步对其由上而下第5片展开叶片表面和横截面微形态与野生型烟草Wt相同叶位叶片进行观察比较，发现eg6z-5叶片表面表皮细胞的饱满度明显低于野生型(图6A)，细胞呈明显皱缩和塌陷(图6B)，eg6z-5叶片横截面(图6D)与野生型(图6C)相比，表皮细胞、栅栏组织细胞皱缩细胞壁变薄，使得转化株eg6z-5叶片变薄。
结果可见：转RuEG6基因的正义载体转化植株，11株阳性植株中分别有6株和8株表现为半纤维素和纤维素含量低于对照非转化株，说明转基因株系与对照非转化烟草相比半纤维素和纤维素含量变化明显，过量表达RuEG6基因能降低转基因烟草的半纤维素和纤维素含量，因而在降低植物纤维素含量中具有较好的应用潜力。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种内切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2430
<212> DNA
<213> 黑莓（Rubus L.）
<400> 1
cctcgtcgta ttgactgcaa tcgcgtgtcg cccttatgga gaaatttgtg agactcgttt 60
ccatggctcc tctgtttctg cttctttgct ttcctttggc tttggctggt catgactaca 120
gccaagctct gagcaagagc attctcttct ttgaagctca gagatctggt gtccttcccc 180
ataaccagag ggtctcttgg agatccaact ctggcttgta cgatggcaag gccagtgggg 240
tggatctggt tgggggttac tacgatgcag gggacaatgt gaaatttggg cttcccatgg 300
cattcactgt tacaatgatg tcctggagta taatagagta cggaaagcaa atggcttcaa 360
gcggtgaact tgggcacgcc atggaagctg tcaagtgggg cactgactac ttcattaaag 420
ctcacccaga acccaatgtt ctctatggag aggtcggaga tgggaacagc gaccactact 480
gctggcagag gccggaggac atgaccacgg accgccgggc ttacaagatc agcccgagca 540
atcccgggtc ggatctcgcc ggagaaactg ccgccgccat ggccgctgcc tccattgtat 600
tccgccgctc caacccggcc tattcccgtg agctcttaca gcatgcttac cagctgttcg 660
attttgcaga caagtacagg ggcaaatatg acagcagcat tacagttgcc caaaagtact 720
accgctccat cagtggctac aatgatgagt tgctttgggc tgcggcttgg ttgtatcagg 780
cttccaataa ccagtactat ttgaactacc ttgctaacaa tggtgactcc atgggtggaa 840
ctggttgggg catgacagag tttggttggg atgtcaagta ttctggtgtt cagacccttg 900
ttgccaagtt cttaatgcaa ggcaaagctg gtcagcatgc tgcagttttt gagaagtact 960
cggtgaaagc ggagtacttc atgtgttcat gcctcggaaa gggcagccgc aatgtgcaga 1020
agactcctgg tggcctcatt ttccggcaga ggtggaacaa catgcagttt gtgacaagtg 1080
cctccttctt ggccaccgtc tactccgact atcttacatc tgctggaaaa acattgaagt 1140
gtgcttctgg caatgtggca ccttccgagc ttctatcctt tgcaaaatct caggtggact 1200
acattcttgg agacaatcca agagccacta gttacatggt tggctatgga aacaactatc 1260
ctcaacaagt tcaccacagg ggttcctcaa ttgtttccat taagaaggat tcttcatttg 1320
tgagctgcag gggaggttat gctacttggt ttagccggaa ggctagtgac ccaaatctcc 1380
ttaccggtgc cattgttggt ggacccgatg catatgacaa ctttgctgat caaagagaca 1440
actatgagca gactgaacct gctacctaca acaatgctcc tcttctcggt atattggctc 1500
gtttaggagg cggtcatggc ggttataacc agctcctacc agttgttaca acccagccaa 1560
aacaagctcc acagcctaaa ctcaccccag ttgctccagc ttcatcttct ggcccaattg 1620
caatagcaca gaaggtaaca acttcatggg tttccaaggg agtaacttac tacagatatt 1680
ccacaactgt gaccaacaac tctggcaaga agattaaaaa cctcaagctg gcaatatcta 1740
aactttacgg tcctctttgg ggtcttacaa agaccggtga ttcctatgtt ttcccagctt 1800
ggctcaactc tttacctgcg ggaaagagcc tcgagtttgt ctacatccat tctgcttctg 1860
cagcaaatgt cttggtctcg agctactcat tagcgtaata aaggaaagca caagcactca 1920
ttgaagcaaa ggggagaggt tcacacagtt tctgggatgg taatataaga attgtgcagt 1980
tatacagaaa tgcagtccag aaaggtcctt ttttttcttt ttctttcgaa tattacttcc 2040
ttatgatgat tgggatctgc ttaggctttt tagacgaagt taggtcgaaa aataagtttc 2100
aagaattgga gaagaaagga gtgaagagac ggtttaaaag gtgtgctcat cctctttcac 2160
ctccgcttca gtaagttata tagttaggtt tgaaagaaag agagtgagag taacagttaa 2220
agttcaagtg tgagaggttg gggggtaaaa agtgacttct caacctattt caagaagtct 2280
tgtttctttg tacttcaaac tttcaaagca gcttcgtatg tctttcttta gtttttgtgt 2340
tgtgaatctt gtgatgttgt aagctatgca acaatattta taagtcgttt gaatggaata 2400
tagttcgtgc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2430
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种内切葡聚糖酶RuEG6及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 2
<211> 620
<212> PRT
<213> 黑莓（Rubus L.）
<400> 2
Met Glu Lys Phe Val Arg Leu Val Ser Met Ala Pro Leu Phe Leu Leu
1 5 10 15
Leu Cys Phe Pro Leu Ala Leu Ala Gly His Asp Tyr Ser Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Lys Ser Ile Leu Phe Phe Glu Ala Gln Arg Ser Gly Val Leu Pro
35 40 45
His Asn Gln Arg Val Ser Trp Arg Ser Asn Ser Gly Leu Tyr Asp Gly
50 55 60
Lys Ala Ser Gly Val Asp Leu Val Gly Gly Tyr Tyr Asp Ala Gly Asp
65 70 75 80
Asn Val Lys Phe Gly Leu Pro Met Ala Phe Thr Val Thr Met Met Ser
85 90 95
Trp Ser Ile Ile Glu Tyr Gly Lys Gln Met Ala Ser Ser Gly Glu Leu
100 105 110
Gly His Ala Met Glu Ala Val Lys Trp Gly Thr Asp Tyr Phe Ile Lys
115 120 125
Ala His Pro Glu Pro Asn Val Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Gly Asn
130 135 140
Ser Asp His Tyr Cys Trp Gln Arg Pro Glu Asp Met Thr Thr Asp Arg
145 150 155 160
Arg Ala Tyr Lys Ile Ser Pro Ser Asn Pro Gly Ser Asp Leu Ala Gly
165 170 175
Glu Thr Ala Ala Ala Met Ala Ala Ala Ser Ile Val Phe Arg Arg Ser
180 185 190
Asn Pro Ala Tyr Ser Arg Glu Leu Leu Gln His Ala Tyr Gln Leu Phe
195 200 205
Asp Phe Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Lys Tyr Asp Ser Ser Ile Thr Val
210 215 220
Ala Gln Lys Tyr Tyr Arg Ser Ile Ser Gly Tyr Asn Asp Glu Leu Leu
225 230 235 240
Trp Ala Ala Ala Trp Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr Leu
245 250 255
Asn Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Asp Ser Met Gly Gly Thr Gly Trp Gly
260 265 270
Met Thr Glu Phe Gly Trp Asp Val Lys Tyr Ser Gly Val Gln Thr Leu
275 280 285
Val Ala Lys Phe Leu Met Gln Gly Lys Ala Gly Gln His Ala Ala Val
290 295 300
Phe Glu Lys Tyr Ser Val Lys Ala Glu Tyr Phe Met Cys Ser Cys Leu
305 310 315 320
Gly Lys Gly Ser Arg Asn Val Gln Lys Thr Pro Gly Gly Leu Ile Phe
325 330 335
Arg Gln Arg Trp Asn Asn Met Gln Phe Val Thr Ser Ala Ser Phe Leu
340 345 350
Ala Thr Val Tyr Ser Asp Tyr Leu Thr Ser Ala Gly Lys Thr Leu Lys
355 360 365
Cys Ala Ser Gly Asn Val Ala Pro Ser Glu Leu Leu Ser Phe Ala Lys
370 375 380
Ser Gln Val Asp Tyr Ile Leu Gly Asp Asn Pro Arg Ala Thr Ser Tyr
385 390 395 400
Met Val Gly Tyr Gly Asn Asn Tyr Pro Gln Gln Val His His Arg Gly
405 410 415
Ser Ser Ile Val Ser Ile Lys Lys Asp Ser Ser Phe Val Ser Cys Arg
420 425 430
Gly Gly Tyr Ala Thr Trp Phe Ser Arg Lys Ala Ser Asp Pro Asn Leu
435 440 445
Leu Thr Gly Ala Ile Val Gly Gly Pro Asp Ala Tyr Asp Asn Phe Ala
450 455 460
Asp Gln Arg Asp Asn Tyr Glu Gln Thr Glu Pro Ala Thr Tyr Asn Asn
465 470 475 480
Ala Pro Leu Leu Gly Ile Leu Ala Arg Leu Gly Gly Gly His Gly Gly
485 490 495
Tyr Asn Gln Leu Leu Pro Val Val Thr Thr Gln Pro Lys Gln Ala Pro
500 505 510
Gln Pro Lys Leu Thr Pro Val Ala Pro Ala Ser Ser Ser Gly Pro Ile
515 520 525
Ala Ile Ala Gln Lys Val Thr Thr Ser Trp Val Ser Lys Gly Val Thr
530 535 540
Tyr Tyr Arg Tyr Ser Thr Thr Val Thr Asn Asn Ser Gly Lys Lys Ile
545 550 555 560
Lys Asn Leu Lys Leu Ala Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Pro Leu Trp Gly
565 570 575
Leu Thr Lys Thr Gly Asp Ser Tyr Val Phe Pro Ala Trp Leu Asn Ser
580 585 590
Leu Pro Ala Gly Lys Ser Leu Glu Phe Val Tyr Ile His Ser Ala Ser
595 600 605
Ala Ala Asn Val Leu Val Ser Ser Tyr Ser Leu Ala
610 615 620

Claims (9)

1.编码内切葡聚糖酶RuEG6的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.内切葡聚糖酶RuEG6，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
3.包括权利要求1的cDNA的表达载体。
4.包括权利要求1的cDNA的表达载体pGLN-RuEG6。
5.根据权利要求4所述表达载体pGLN-RuEG6制备工程菌的方法，其特征在于：将所述表达载体pGLN-RuEG6转入根癌农杆菌EHA105，获得所述工程菌。
6.扩增权利要求1所述cDNA的引物，其特征在于：所述正向引物为5’-ATGGAGAAATTTGTGAGACTCG-3’,反向引物为5’-TGAGTGCTTGTGCTTTCCTTTA-3’。
7.权利要求1所述cDNA在降低植物纤维素含量上的应用。
8.根据权利要求7所述的cDNA在降低植物纤维素含量上的应用，其特征在于：将携带有所述cDNA的植物表达载体通过生物学方法转化待降低纤维素含量的植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
9.权利要求2所述内切葡聚糖酶RuEG6在降低植物纤维素含量上的应用。
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