CN102131933A - 增加植物的细胞壁沉积和生物质 - Google Patents

Abstract

原位调节编码WALLDOF(其为参与植物细胞壁生物发生的转录因子)的基因的表达使得细胞壁沉积增加和产生更高的植物生物质密度。

Description

增加植物的细胞壁沉积和生物质

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2008年8月22日提交的美国临时申请No.61/091,075的优先权，其全部内容通过引用方式结合在本文中。

技术领域

本发明涉及具有提高的将固定碳包封在存储化合物中的效率的农作物。更具体而言，本发明涉及增加植物的细胞壁沉积和/或生物质(biomass)方法和构建体。

背景技术

多年生农作物(例如甘蔗、柳枝稷、芒属(Miscanthus)和木本物种)是以单糖或纤维素和半纤维素的复合混合物的形式固定的碳的主要来源。这些生物质资源是目前致力于开发不断增长的世界人口所需的能源的若干工业(例如生物能源工业)的主要目标。

生物质资源例如可用于生产可能在不久的将来有可能替代美国目前石油消费的30％的纤维素乙醇。Perlack等人，Biomass as Feedstocks for a Bioenergy and Bioproducts Industry：The Technical Feasibility of a Billion-Ton Annual Supply，ORNL/TM-2005/66(2005)。这些木质纤维原料已被认为可提供优于当前能源的环境优势和经济优势，因为它们要求的农业投入比一年生作物少，且可在农业边际土地(marginal land)上生长。Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：11206-210(2006)。

已经制定了在接下来的十年中由于用于发电、燃料和生物材料生产的林产品、木质残留物和木质能源作物的使用不断增加而对于木材的世界需求预期增长20％的规划。Strauss和Bradshaw，Tree biotechnology in the new millennium：International symposium on ecological and societal aspect of transgenic plantations，Oregon State University(2001)；Mead，Biomass and Bioenergy，28：249-66(2005)。

因此，存在着发展高产树木种植以降低天然森林的压力的需要，首先需要种植树木品种(例如杨树和桉树)的广泛育种提前量。到目前为止这方面仍存在困难，因为树木的长世代时间使得常规的育种成为非常缓慢的过程。遗传工程技术具有极大地缩短树木繁植时间线的潜力，并允许进行更有针对性的育种。

增加对植物的上述地面部分(ground portion)的碳分配的途径将增加生长速率和生物质产量。Ragauskas等人，Science，311：484-89(2006)。在树木中，固定的碳主要是在细胞的次生细胞壁中累积，其是木质的主要成分。次生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。在次生细胞壁的形成过程中，这些细胞壁成分的生物合成是高度协同的，且取决于控制大量单个基因的主调控基因。除了在次生细胞壁生物合成基因研究中的进展以外，对于在木质形成过程中这些基因的协同表达的基础分子机理知之甚少。Zhong等人，Plant Cell，19：2776-92(2006)。

存在几种类型的控制基因表达、蛋白质产生及蛋白质加工和蛋白质活性的调控过程。这些过程中的一种涉及转录因子的活性，该转录因子为能够识别基因启动子中的序列且通过结合这类特殊的序列来调节该基因的转录速率的蛋白质。已经在多种生物体中识别了几种转录因子，且这些转录因子在控制特定生物合成途径中的作用也已被确定。例如，在百日草属植物(Zinnia)(Demura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：15794-99，2002)和鼠耳芥属(Arabidopsis)(Kubo等人，Genes Dev.，19：1855-60，2005)的体外木质部分化过程中或在鼠耳芥属茎和根(Oh等人，J.Exp.Bot.，54：2709-22，2003；Zhao等人，Plant Physiol，138：803-18，2005)和杨树(Hertzberg等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，98：14732-137，2001)的次生生长过程中差异表达的基因的转录谱(profiling)已经导致识别出多样的转录因子家族，其可参与木质部分化或次生生长的调控。类似地，微阵列分析表明182种转录因子在鼠耳芥属开花茎的不同发育阶段中差异地表达。Ehlting等人，Plant J.，42：618-40(2005)。尽管大多数这些木质部或次生生长相关的转录因子的确切功能仍是未知的，但它们提供了用于剖析控制木质部发育的复杂过程(包括分化的开始、细胞延长和次生细胞壁增厚)的分子机理的有用工具。

在这些木质部或次生生长相关的转录因子中包括一组DOF(用于DNA与一指结合(DNA-binding with One Finger))结构域转录因子。DOF蛋白为共有高度保守的N末端DNA结合结构域和用于转录调控的C末端结构域的植物特异性转录因子。Yanagisawa，Trends Plant Sci.，7：555-60(2002)。DNA结合结构域的特征为形成Cys2/Cys2 Zn²⁺指结构的52个氨基酸残基，其识别包含共同核心5′-AAAG-3′的顺式调控元件。Umemura等人，Plant J.，37：741-49(2004)；Yanagisawa & Schmidt，Plant J.，17：209-14(1999)。

DOF蛋白质被认为参与植物专有的生物过程的调控，例如光调节基因的表达、光合碳同化、种子存储蛋白质的累积、萌芽、对植物激素的响应、保卫细胞特异性的基因表达、类黄酮代谢和脂质生物合成。Plesch等人，Plant J.，28：455-64(2001)；Moreno-Risueno等人，Plant J.，51：352-65(2007)；Wang等人，Plant J.，52：716-29(2007)。

在水稻中，用于所有种子优先的转录因子基因的最常见的顺式元件被发现为“AAAG”，其为结合Dof蛋白所需的核心位点，这表明DOF转录因子在控制水稻种子发育的分级调控网络中具有关键的和最值得注意的作用。Duan等人，Plant Mol Biol，57：785-804(2005)。

玉米DOF1在叶、茎和根中表达，且在绿化(greening)和黄化(etiolated)的原生质体中具有不同的反式激活活性。DOF1在光照的叶细胞中被激活，且可参与与光依赖性过程关联的基因的光调节。Yanagisawa和Sheen，Plant Cell，10：75-90(1998)。玉米DOF1已被认为是用于C4光合成的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的调节子，该酶催化C4光合途径中CO₂的初步固定。此外，其提高胞质正磷酸酯二激酶的启动子的转录。这两个酶均参与氨基酸合成和呼吸的CO₂的再捕获。已有人提出，玉米DOF1可能在与碳代谢相关的多个基因的表达中起到更普遍的作用。参见Yanagisawa，Plant J.，21：281-88(2000)。

另一玉米内胚乳特异性的DOF蛋白质(被称为醇溶谷蛋白盒结合因子(PBF))已表明与碱性亮氨酸拉链蛋白质Opaque2(其为已知的醇溶谷蛋白基因的转录激活剂)相互作用(Vicente-Carbajosa等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，94：7685-90，1997)。其他同源蛋白质存在于其他谷类的胚乳中，例如BPBF(大麦PBF)和WPBF(小麦PBF)中，它们两个具有与玉米PBF类似的DNA结合性质。这些发现说明PBF基因功能(作为小粒作物中储存蛋白质基因表达的重要调节子)的进化保守性，且支持其中蛋白质-蛋白质相互作用在DOF功能中是重要的设想。Mena等人，Plant J.，16：53-62(1998)。

在水稻中，存在着DOF家族的一个成员(OSDOF3)，其已证明与糊粉层中的R2R3-类型MYB转录因子相互作用，从而导致编码参与所储存分子的动员的水解酶(α-淀粉酶和β-葡聚糖酶)的多个基因的诱导表达。Washio，Plant Physiol，133：850-63(2003)。这些糊粉细胞中的基因调控处于植物激素的控制下，主要是赤霉素(GA)与脱落酸(ABA)的比例。种子吸胀时观察到的大麦PBF转录物的聚积模式表明：其可被GA上调，且可在萌芽时通过与GARC(GA响应复合物)的嘧啶盒(pyrimidine box)(其为在谷类水解酶基因中识别到的GA诱导所需的保守顺式元件)的相互作用起到转录阻抑物的作用。Mena等人，Plant Physiol.，130：111-19(2002)。

在鼠耳芥属中，存在DOF家族的36个成员，其中的两个-DAG1和DAG2(影响萌芽的Dof(Dof Affecting Germination))-也通过光响应和赤霉素浓度影响萌芽，从而可能对相同的母体基因(maternal gene)发挥相反的调控作用。Gualberti等人，Plant Cell，14：1253-63(2002)。

此外，DOF蛋白质已被描述为控制次级代谢产物的调控网络的部分。在这一点上，OBP2(在鼠耳芥属的叶和其他器官的韧皮部中显著表达的DOF基因)已证明激活CYP83B1的表达，该CYP83B1为参与葡糖异硫氰酸盐(其为起到对抗食草动物和微生物的防御物质的作用的一组次级代谢产物)合成的基因。Skirycz等人，Plant J.，47：10-24(2006)。另一鼠耳芥属DOF基因成员AtDOF4；2被确定为诱导丛生植物表型(bushy plant phenotype)和潜在地参与苯丙素(phenylpropanoid)代谢的调节的基因。

AtDOF4；2的组成型过表达和RNAi介导的沉默(silencing)导致类黄酮生物合成基因表达和在冷和高光条件下类黄酮聚积的交互改变。参见Skirycz等人，New Phytol，175：425-38(2007)。

DOF蛋白质参与苯丙素代谢的调节已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体de-etiolated3(det3)、pom-pom1{pom1)和ectopic lignification1(eli1)中得到证明。这些突变体在通常不会在其中发现木质素的细胞中沉积这些聚合物。微阵列分析表明R2R3-MYB和DOF转录因子家族中特定成员的表达的改变可能造成在这些突变体中异位的木质化表型。Rogers等人，New Phytol.，168：123-40(2005)。

根据Yang等人，Plant Physiol，142：820-30(2006)，在杨树中存在41种DOF基因。这些基因与36种鼠耳芥属的和30种水稻的DOF基因一起进行序列分析揭示了41个保守基序，其中之一为：EILKCPRCDSMNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKTCRRYWTKGGALRNVPVGGGCRKNKR

其被确认为DOF结构域。同上，第824页和表I。使用这些DOF基因的全长蛋白质序列构建的最大可能性系统树还在该树中终端节点中重点显示27对旁系同源基因(paralogous gene)。同上，第825页和图2。

发明内容

基于发明人的发现和关于DOF蛋白质的相关认识，本说明书中特别提供了用于增加细胞壁沉积和/或生物质的方法。本发明的方法包括调节植物细胞中walldof序列的表达，例如通过实现转基因植物中该序列的过表达，从而该植物的特征为生物质密度增加。在优选的实施方式中，转基因植物为包括以下步骤的过程的产物：(a)提供用由walldof DNA序列和与其可操作地连接的在植物细胞中为活性的启动子组成的构建体转化的可再生植物材料；和然后(b)对所述材料或从所述材料再生的植物进行选择，其中至少一个选择标准为相对于非转化状态细胞壁沉积增加或生物质密度增加。示例性的walldof DNA序列为(i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和(ii)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还想到由walldof DNA序列和与其可操作地连接的在植物细胞中为活性的启动子组成的构建体。在所述构建体和上述方法中，启动子可以为例如组织或器官特异性启动子，例如木质部特异性启动子；组织或器官优先的启动子，例如木质部优先的启动子、组成型启动子或诱导型启动子。

基于相同理由，相关方面包括包含在例如组织或器官特异性/优先的启动子、组成型启动子或诱导型启动子的控制下表达的异源walldof DNA序列的转基因植物细胞。还提供了表达walldof DNA序列的转基因植物，从而该植物的特征为相对于非转化状态生物质密度的增加。

附图简述

图1显示walldof基因在不同杨树组织中的差异表达。

图2显示根据公认WALLDOF同源序列的内含子-外显子结构的结构。

图3显示双子叶植物WALLDOF的多重比对，其中保守基序1-7被突出显示。

图4显示单子叶植物WALLDOF的多重比对，其中保守基序1-7被突出显示。

图5在(A)中显示WALLDOF基序的顺序和大小和在(B)中显示WALLDOF基序1-7的氨基酸共有序列。

图6示意性地表示本发明的植物表达质粒(plasmidial)载体pALELLYX-DOF，其包含驱动本发明的美洲黑杨(Populus deltoides)DOF(walldof)核苷酸序列表达的形成层/木质部优先的启动子。

图7显示用甲苯胺蓝染料染色的横断对照植物(A)和转基因事件(B)的木质部的茎截面(基准面)，该转基因事件(B)用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化。

图8显示一个对照植物(A)和一个用本发明的植物表达盒pALELLYX-DOF转化的Populus tremula x Populus alba转基因株系(B)的高倍放大的茎截面(基准面)。使用甲苯胺蓝染料染色的截面显示出与非转化的对照植物相比转基因株系的细胞壁沉积增加。

图9显示4个用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化的转基因株系和3个对照植物的细胞壁面积/细胞(μm²)(三个植物重复的平均值)。星号表示根据Student′s检验相比于非转基因对照植物，壁面积统计学显著增加的转基因株系。

图10显示四个用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化的转基因株系和3个对照植物的细胞壁占据的细胞面积的百分比(三个植物重复的平均值)。星号表示根据Student′s检验相比于非转基因对照植物，具有统计学显著增加的细胞壁/细胞的百分比的转基因株系。

图11显示四个用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化的转基因株系和3个对照植物的表观木质密度(g/cm³)(三个植物重复的平均值)。星号表示根据Student′s检验相比于非转基因对照植物，具有统计学显著增加的木质密度的转基因株系。

图12显示表观木质密度(g/cm³)和细胞壁占据的细胞面积的百分比(％/每细胞)之间的正相关性。

图13显示在四个用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化的转基因株系和3个对照植物的发育木质部中的walldof相对mRNA水平(三个植物重复的平均值)。

图14显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-DOF转化的转基因株系和对照植物之间的植物表型对比。

具体实施方式

本发明人证明，被称为WALLDOF的杨树DOF转录因子在次生细胞壁沉积中起关键作用。因此，在例如杨树木质部特异性启动子控制下的walldof基因的原位(in planta)过表达产生显示出次生细胞壁沉积急剧增加和生物质增加的植物。

尽管发明人不局限于任何特定理论，WALLDOF被认为是次生细胞壁沉积的发育程序的转录开关。因此，本发明涉及用于调节植物中WALLDOF或另一相关转录因子(其遗传构成反映编码这种转录因子的DNA片段的引入(优选亚基因组的(infra-genomic)))的水平的方法和DNA构建体，因而增加植物的细胞壁沉积和/或生物质密度。

在这一点上，术语“表达”表示作为由DNA片段的核苷酸序列编码的蛋白质或与该蛋白质相关的产物(“基因产物”)的产生。“过表达”是指以超过正常(非转基因)生物体中该产物的产生水平的水平在转基因生物体中产生基因产物。在这种意义上，“过表达”不要求该基因产物在非转基因生物体中内源性地表达。例如，过表达可通过基因的脱抑制或抑制性因子的再抑制而发生。

因此，人们可将过表达描述为用于“调节”编码WALLDOF或相关转录因子的DNA的表达的手段(以下进一步讨论)。当涉及功能时，“调节”或“调控”还可具有自调控蛋白的分子生物学中通常使用方式引申的含义；也就是说，与生物过程(例如细胞壁沉积)功能性相关的基因的启动子与调控蛋白质的结合，被认为是通过增加或降低它们各自的表达水平来“调节”那些基因。因此，WALLDOF的原位过表达预计调节控制细胞壁沉积和生物质密度的关键基因，从而它们的表达水平将会增加或降低。

出于本发明的目的，合适的转录因子的类包含不会改变作为该类转录因子特征的调控功能的相对于SEQ ID NO：2的取代、添加和缺失。这样的改变的示例为如下讨论的图5B中所示的那些。

基于相同的理由，存在着一类编码该转录因子的DNA，其可以根据基于聚类或比对标准来归类基因序列的多种算法中的任一种(如Yang等人(2006)。同上，所示)，通过序列对比进行确认和功能性评注。因此，本文包括由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构成的基因的直系同源基因(ortholog)和旁系同源基因(paralog)以及编码如上所述与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列功能性相关的蛋白质序列的其他DNA。

通晓植物分子生物学知识的个人还可以通过包括使用合适的杂交探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选的常规方法识别这样的DNA。具体而言，可以借助(简并(degenerate))寡核苷酸和基于PCR的方法(例如，通过PCR-The Basics 2^nd ed.(Taylor & Francis，2006)；PCR Protocols-Methods In Molecular Biology 2^nd ed.(Humana Press，2003)；Real Time PCR(Bios Advanced Methods)1^st ed.(Taylor & Francis，2006)例举的方法)分离旁系同源和直系同源序列。

因此，短语“walldof DNA序列”是指具有在严格条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交且编码属于如上所述功能类的转录因子(包括包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的任何蛋白质)的核苷酸序列的核酸分子。(本文中的斜体字表示基因，且大写字母表示编码的产物)。Walldof DNA序列的类还包括与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少40％、优选至少60％、特别优选至少80％和尤其优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。与此有关的同一性百分比的确定在下面更详细地讨论。

在一个实施方式中，本发明的构建体包含与组织优先的启动子可操作地连接的walldof DNA序列，该启动子可以是但不限于维管组织优先的启动子、木质部优先的启动子、形成层优先的启动子、茎优先的启动子、木质优先的启动子、茎杆优先的启动子和薄壁细胞优先的启动子。与此相关的合适的启动子的示例为在PCT申请公布WO 2005/096805(其通过引用方式结合在本文中)中公开的木质部优先启动子的组。或者，本发明的DNA构建体包含与组成型启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子、组织或器官优先的启动子或任何其他合适的启动子可操作地连接的walldof DNA序列。

因此，可适当地再生的植物材料(例如愈伤组织)用如上所述的DNA构建体转化，且从转化的植物材料通过常规方式获得作为原代转化体或其后代植物，在该植物中转录因子的水平增加。因此，相对于其中转录因子的水平未通过本文公开的遗传工程方法增加的植物，该植物显示出细胞壁沉积和生物质密度的增加。

因此，如上所述，在一个实施方式中，希望提供用例如图6中所示的用于示例性目的的DNA构建体转化的植物。例如，已在其基因组中引入上文所述的DNA构建体的本发明的转化植物以高水平表达包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，造成相对于非转化状态(即当与相同类型或品种的非转化植物相比时)的细胞壁沉积的增加和/或生物质密度的增加。

根据其他实施方式，调节植物中walldof DNA序列的表达引起细胞壁面积/细胞增加和细胞壁面积占整个细胞面积的百分比增加。因为每细胞细胞壁面积和细胞壁面积占整个细胞面积的百分比与生物质密度正相关，因而这样的调节使得生物质密度增加。

根据某些方面，如通过标准组织化学、化学或物理分析所观察和测量的，调节植物细胞(例如被子植物细胞或裸子植物木质管胞)中walldof DNA序列的表达增加细胞壁的沉积。例如，参见A Guide To Wood Microtomy：Making Quality Microslides Of Wood Sections，1^st ed.，Ives，ed.Ives，Suffolk，2001；Plant Microtechnique And Microscopy，Ruzin，ed.Oxford University Press，New York，1999；Characterization Of Lignocellulosic Materials，Hu，ed.Blackwell Publishing，2008；Preparation Of Wood For Chemical Analysis，Tappi T 264cm-97，Tappi Press，Atlanta，1997。

更一般地、本文描述的方法和构建体可用于增加众多植物的生物质密度，其中例如但不限于桉属、杨属、针叶树、柳树、甘蔗、高粱、小麦、玉米、棉花、大豆、苜蓿、蔬菜(包括但不限于西兰花、花菜、甘蓝、萝卜、白菜、洋葱、胡萝卜、黄瓜、辣椒、番茄、茄子、西葫芦、葫芦、南瓜、秋葵、菠菜、干豆、豌豆、韭菜、莴苣、茴香、青刀豆、甜菜等)、甜瓜、西瓜、油菜(油菜籽)、水稻、大麦、花生、木豆(pigeon pea)、小米、葡萄、浆果(包括但不限于蓝莓、黑莓、木霉、桑椹、酸果蔓、波森莓(boisen berry)等)、树果(包括但不限于李子、桃、油桃、杏、猕猴桃、石榴、芒果、无花果、橙、柠檬、酸橙、血橙、柚、苹果、香蕉等)、坚果树(椰子、核桃(英国胡桃和黑胡桃)、美洲山核桃、杏仁、榛子、巴西坚果、山核桃、橡子)、生产油籽的植物(包括但不限于葵花、油菜籽等)、苏丹草、芒草、柳枝稷、象草和狼尾草(fountain grass)等。

使用本文公开的方法和构建体，可对植物进行遗传工程化以增加用于多种应用和工业的生物质，包括但不限于纸浆和纸工业、一般林业、生物质原料、用于生物能源的生物材料、谷物、饮料、糖果、糖和甜味剂；纤维；染料；鞣质；涂料；树脂；乳胶、水凝胶、油漆、油、蜡、香料、花卉和观赏植物、食品色素、调味品、草药、药物、药品、营养品、竹、软木和木材。

因此，取决于特定应用或工业所需的植物和特定生物质，具有增加的生物质或生物质密度的植物可显示一种或多种以下非限制性的表型：增加的高度；叶的重量、大小或数目；苗的长度和厚度；根的长度、厚度和分支；每棵植物的种子产量；开花；组织(包括木质形成组织)中细胞的数目和大小；和植物繁殖器官的发育。

除非特别说明，本文中的所有技术术语为生物化学、分子生物学或农学中常规使用的，且具有它们的常规含义。该含义记录在例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等人，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，New York，1988(定期更新)；Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，5^th ed.，vol.1-2，ed.Ausubel等人，John Wiley & Sons，Inc.，2002；Genome Analysis：A Laboratory Manual，vol.1-2，ed.Green等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997中。

涉及植物生物技术的方法在本文中有所描述，且还详细描述在如下专著中，例如Methods in Plant Molecular Biology：A Laboratory Course Manual，ed.Maliga等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1995。各种使用PCR的技术被描述在，例如Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego，1990及Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer：A Laboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2003中。PCR引物对可通过已知技术(例如使用用于该目的的计算机程序，例如Primer，版本0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)从已知序列获得。核酸的化学合成方法被讨论在，例如Beaucage和Caruthers，Tetra.Letts.22：1859-62(1981)，及Matteucci和Caruthers，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981)中。

限制性内切酶消化、磷酸化、连接和转化根据Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd ed.(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的进行。除非另有说明，用于生长和维持细菌细胞的所有试剂和材料均得自Aldrich Chemicals (Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、Invitrogen(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。

术语“编码”或“译码”是指基因通过转录和翻译机制向细胞提供一系列氨基酸可以由此装配为特定的氨基酸序列从而产生活性酶的信息的过程。由于遗传密码的简并性，DNA序列中的某些碱基变化不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本发明包括基本上不影响编码的蛋白质的功能特性的核苷酸序列的任何修饰。

术语“比对”是指通过纵向对比对齐的多个核苷酸序列或氨基酸序列，从而可以容易地以图形方式鉴定共有(即“相同的”)、“相似的”和/或不同的成分(即核苷酸碱基或氨基酸残基)。此外，术语“比对”包括任意两个或多于两个序列之间的整体和局部比对。特别地，“比对”可用于确定共有(即“相同的”)成分的数目，并因此确定两个或多于两个核苷酸或肽序列之间的“同一性”。“比对”还可用于确定“相似的”成分的数目，并因此确定两个或多于两个核苷酸或肽序列之间的“相似性”。因此，“比对”可用于确定序列之间的“同源性”和识别这些结构域内的“保守结构域”和相关性。序列比对和对于百分序列同一性和/或相似性的评分可使用本领域已知的计算机程序确定，例如GCG Wisconsin version 10.3 Package(可从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，Calif.92121-3752 USA获得)或EmbossWin版本2.10.0(使用程序“针(needle)”)。或者，百分相似性或同一性可特别地通过使用算法(例如FASTA、BLAST等)对数据库进行检索来确定。

术语“同一性”和“相似性”以及“相同的”和“相似的”分辨可通过使用整体和/或局部比对算法对至少两个肽序列或两个核苷酸序列的比对来确定。同一性值为在与至少一个本文提供的序列比对后，在给定序列的相同位置上具有完全相同的核苷酸或氨基酸的位置数目或百分比。类似地，相似性值为在与至少一个本文提供的序列比对后，在给定序列的相同位置上具有相似的核苷酸或氨基酸的位置数目或百分比。因此可以理解，相似的氨基酸为那些具有相似性质的氨基酸，其包括但不限于酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸和非极性氨基酸等。因此还可以理解，“相同的”核苷酸或氨基酸也被认为是“相似的”。因此，当序列在它们整个长度上分别具有至少90％和70％序列同一性时，它们可被称为“基本相同的”或“实质上相似的”。

本文中使用的术语“同源性”是指本文提供的参比序列与新测序的克隆插入物的至少一个片段或其编码的氨基酸序列之间的序列相似性。本发明还包括与本文公开的任何序列同源(即具有显著的序列相似性)的序列。此外，与本文公开的那些序列同源的序列可来自所选择的任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物以及农学上非常重要的植物物种。几种不同的用于识别和定义这些功能同源序列(其可分别被分类为“直系同源序列”和“旁系同源序列”)的方法是已知的。直系同源序列是在不同的物种中具有相似的序列和相似的功能且通过物种形成事件衍生的基因。因为植物具有共同的祖先，所以任何植物物种中的许多基因将具有另一植物物种中相应的直系同源基因。一旦直系同源序列被识别，“直系同源序列”的功能可从参比序列的确认功能中推导出来。旁系同源序列为单一物种内结构相关基因，且通过复制事件衍生，因而相应的编码蛋白质可保留相似的功能。出于此目的，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列构成的基因的合适的旁系同源序列应编码具有相当的转录调控活性的蛋白质。

短语“分离的核酸分子”意图指已从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在DNA构建体中的重组DNA分子在本发明中被认为是分离的。分离的DNA分子的进一步例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或经过纯化(部分或充分纯化)的溶液中的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体外RNA转录物。分离的核酸分子还包括经合成制备的这类分子。

术语“异源核酸”是指已被引入细胞(或细胞祖先)内的核酸，DNA或RNA。这样的异源核酸可以包含作为在其所引入的细胞中天然存在的序列的副本的片段及其碎片。

本发明提供了用于增加细胞壁沉积和植物生物质密度的方法和构建体。作为非限制性的例子，提供了增加杨树的细胞壁沉积和木质密度的例子。木质实质上是来自次生木质部的细胞壁和细胞气隙的基质。Megraw，Wood Quality Factors in Loblolly Pine(Tappi Press，1985)，第88页。在这种意义上，木质密度是通过细胞壁厚度、维管内腔的横截面积和参与通过茎的水输送的维管数目确定的。Roderick和Berry，New Phytol.149：473(2001)；Preston等人，New Phytologist 170：807-18(2006)。已证明在桉属和其他被子植物物种中木质密度与水力传导性和维管的横截面积呈负相关。Thomasa等人，Forest Ecology and Management 193：157-65(2004)；Preston等人，New Phytologist，170：807-18(2006)。其他非限制性的例子包括在多种植物中增加细胞壁沉积和/或生物质，例如用于各种应用(包括，但不限于谷物、饮料、糖果、糖和甜味剂、动物饲料、纤维、染料、鞣质、涂料、树脂、乳胶、水凝胶、油漆、油、蜡、香料、花卉和观赏植物、食品色素、调味料、草药、药物、药品和营养品)的大豆、玉米、小麦、油菜、棉花、黄豆、油菜、苜蓿、甘蔗和水稻。

核苷酸和多肽序列

Walldof DNA序列例如但不限于SEQ ID NO：1所示的序列和具有一个或多个缺失的、取代的、插入的或添加的碱基的由SEQ ID NO：1变体构成的核酸分子，该变体编码以如上文所述的WALLDOF活性为特征的多肽。

“变体”为与特定基因或蛋白质的标准的或给定的核苷酸或氨基酸序列偏离的核苷酸或氨基酸序列。术语“同型体”、“同种型”和“类似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。由一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代改变的氨基酸序列或核苷酸序列的改变可以被认为是“变体”序列。变体可具有“保守性”的改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如使用异亮氨酸替换亮氨酸。变体可具有“非保守性”的改变，例如使用色氨酸替换甘氨酸。同功的小变异还可包括氨基酸缺失或插入或两者。确定哪个氨基酸残基可以取代、插入或缺失的指导可通过使用公知的计算机程序(例如Vector NTI Suite(InforMax，MD))确定。“变体”还指“改组的基因”，如在例如几个转让给Maxygen，Inc.(Redwood City，CA)的专利中所描述的，例如美国专利No.6,251,674和No.6,500,639。因此，“变体”可从根据美国专利No.6,132,970中公开的方法和原理修饰的序列和需要的多核苷酸的变体获得，该专利通过引用并入本申请中。

示例性的WALLDOF多肽序列包括但不限于SEQ ID NO：2所示的序列及具有一个或多个取代的、缺失的、插入的或添加的氨基酸但仍保持WALLDOF活性的多肽序列。WALLDOF序列包括具有如图5所示的至少1个氨基酸共有基序、优选至少2个氨基酸共有基序、更优选至少3个氨基酸共有基序、更优选至少4个氨基酸共有基序、更优选至少5个氨基酸基序、最优选至少6个氨基酸共有基序和最优选7个氨基酸共有基序的多肽序列。本文还包括一个或多个由如图5所示的至少1个氨基酸共有基序、优选至少2个氨基酸共有基序、更优选至少3个氨基酸共有基序、更优选至少4个氨基酸共有基序、更优选至少5个氨基酸基序、最优选至少6个氨基酸共有基序和最优选7个氨基酸共有基序形成的WALLDOF保守结构域。

此外，可以存在多种形式的WALLDOF，这可能是由于基因产物的翻译后修饰或相应walldof基因的多种形式造成的。具有这样的修饰和编码WALLDOF转录因子的序列也包括在此。

在本文中，“保守结构域”或“保守区域”是在某些多核苷酸或多肽序列中高度保守的区域，即其中在显著不同序列之间存在相对高的序列相似性程度。这些术语还指由多核苷酸序列编码的多肽序列的结构域，其形成随进化相对保守的三维结构和功能性单元。短语“保守结构域”或“保守区域”还包括完整的、局部的和半独立的单元，其通常是稳定的和独立折叠的，通过包装由多核苷酸序列编码的“氨基酸共有基序”形成。

短语“氨基酸共有基序”是指在多肽间基本保守的多肽序列的部分或子序列。

序列分析

“变体”序列的类中包括与参比walldof DNA序列杂交的序列。出于此目的，当两个序列在杂交溶液(6X SSC、0.5％SDS、5X Denhardt′s溶液和100μg非特异性载体DNA)中形成双链复合物时，该两个序列杂交。参见Ausubel等人，同上，2.9节，增刊27(1994)。序列可在“中等严格性”下杂交，其被定义为在60℃温度下、在6X SSC、0.5％SDS、5X Denhardt′s溶液和100μg非特异性载体DNA的杂交溶液中。对于“高严格性”杂交，温度升至68℃。在中等严格性杂交反应后，核苷酸在室温下在2X SSC加0.05％SDS的溶液中洗涤5次，随后用0.1X SSC加0.1％SDS在60℃洗涤1小时。对于高严格性，洗涤温度上升至68℃。本领域普通技术人员可容易地通过在杂交反应和洗涤过程中改变温度、在杂交反应和洗涤过程中改变盐浓度等选择这样的条件。出于本发明的目的，杂交的核苷酸为那些使用1ng具有10,000cpm/ng比放射性的放射性标记探针检测的核苷酸，其中该杂交的核苷酸在-70℃下暴露在X射线薄膜不超过72小时后可清晰观察到。

本发明包括与SEQ ID NO：1所示的核酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的这样的核酸分子。优选的为与SEQ ID NO：1所示的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸分子。两个核酸序列之间的差异可在参比核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任何地方出现，且独立散置在参比序列中或参比序列内的一个或多个相邻组中的核苷酸之间。

事实上，当提到任何特定的核酸分子与参比核苷酸序列是否至少95％、96％、97％、98％或99％相同时，其暗示在这两个分子之间使用本领域已知的算法进行比较，且可使用公众可得的计算机程序(例如BLASTN算法)常规地确定。参见Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。

核酸构建体

一方面，SEQ ID NO：1所示的序列被引入适于导入植物或细胞中的核酸构建体。因此，这样的核酸构建体可用于调节植物或植物细胞中walldof基因的表达。调节植物或植物细胞中walldof基因的表达是通过实现组织优先的表达的启动子(例如上文引入的PCT公布WO 2005/096805中所描述的启动子)引入核酸构建体中实现的。其他组织优先的或组成型启动子可被整合入DNA构建体中。

细胞壁沉积和植物生物质密度可通过引入本文所述的核酸构建体而改变。本发明还提供了含有这样的构建体的植物细胞，由此获得的具有改变的walldof基因表达的植物和该植物的后代。

作为编码WALLDOF的核酸序列的来源，可以使用合适的cDNA或基因组DNA或合成的多核苷酸。用于分离合适的walldof DNA序列的方法已被描述，同上。因而可以获得编码完整或基本完整的转录因子的序列。合适长度的该DNA序列可通过限制性内切酶的方式切割使用。当使用基因组DNA作为用于转录的部分碱基序列的来源时，有可能使用内含子或外显子区域或两者的组合。

为了获得适于改变植物细胞中walldof基因表达的构建体，可以使用转录因子cDNA中发现的cDNA序列或植物染色体中发现的基因序列。重组核酸构建体可使用标准技术制备。例如，用于转录的核酸序列可通过用限制性内切酶处理含所述序列的载体以切割出适当的片段来获得。用于转录的核酸序列还可通过退火和连接合成的寡核苷酸或通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用合成的寡核苷酸来产生以给出各末端的合适的限制性位点。然后将核酸序列克隆到包含合适的调控元件(例如上游启动子和下游终止子序列)的载体中。

本发明的一个重要方面为核酸构建体的用途，在该核酸构建体中，WALLDOF编码序列与一个或多个在某些细胞类型、器官或组织中驱动WALLDOF编码序列表达但不会不适当地影响正常发育或植物生理机能的调控序列可操作地连接。

“启动子”是指转录起点上游的DNA区域，其参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录。“组成型启动子”为在植物的整个生命期中和在大多数环境条件下为活性的启动子。组织特异性的、组织优先的、器官特异性的、器官优先的、细胞类型特异性的和诱导型启动子组成“非组成型启动子”类别。“可操作地连接”是指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，“可操作地连接”是指被连接的核酸序列为邻接的。

可用于表达被引入细胞的核酸序列内以增加walldof基因表达的启动子可为组成型启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)，或组织特异性的、组织优先的、器官特异性的、器官优先的、细胞类型特异性的、诱导型启动子或任何其他合适的启动子。例如，通过使用维管系统特异性的、木质部特异性的或木质部优先的启动子，人们可以特别地在许多组织(例如维管组织，特别是木质部)中改变WALLDOF活性。使用组成型启动子通常会在植物所有部分中影响酶水平和功能，但使用组织优先的启动子允许将改变的基因表达靶向于特定的植物部分，从而导致更可控的表型。

因此，使用在细胞壁生物发生过程中驱动表达的启动子可被认为是方便的，从而WALLDOF转录因子将仅在需要其作用的器官或组织或细胞类型中被调节。如本文所使用的，“木质部优先的启动子”是指本文公开的核酸分子在木质部中比在任何其他植物组织中活性更高。可使用的木质部优先的启动子包括但不限于木质部优先的香豆酸-4-羟化酶(C4H)基因启动子、木质部优先的微管蛋白(TUB)基因启动子和木质部优先的脂质转移蛋白(LTP)基因启动子。其他合适的木质部优先的启动子公开在WO 2005/096805中，同上。

构建体还可包含位于本文公开的核酸分子下游的终止序列，从而终止mRNA的转录，以及添加的多聚A序列。这样的终止子的例子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子和胭脂氨酸合酶基因(NOS)终止子。该构建体还可包含增强子、起始密码子、剪接信号序列和靶向序列。

构建体可任选地包含选择标志物，通过该选择标志物可以在培养中鉴别出转化的细胞。标记物可以与异源核酸分子(即与启动子可操作地连接的基因)关联。如本文所使用的，术语“标志物”是指编码允许对包含该标志物的植物或细胞进行选择或筛选的性状或表型的基因。在植物中，例如，标志物基因可编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或转染的细胞中选择出转化的细胞。

合适的选择标志物的例子包括但不限于腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素β磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦和草丁膦抗性和氨基-糖苷3′-O-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。这些标志物可以包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。该构建体也可以含有选择标志物基因Bar，其赋予对除草剂草胺膦(phosphinothricin)类似物如草丁膦铵的抗性。Thompson等，EMBO J.6：2519-23(1987)。其它合适的选择标志物也是已知的。

也可以使用可视标志物，例如绿色荧光蛋白(GFP)。基于细胞分裂的控制来鉴别或选择转化的植物的方法也已描述。参见WO 2000/052168和WO 2001/059086。

也可以包含细菌或病毒来源的复制序列，以允许构建体克隆到细菌或噬菌体宿主中。优选地，使用具有广泛宿主范围的原核生物复制起点。可以包含用于细菌的选择标记物，以允许选择带有所需构建体的细菌细胞。合适的原核生物选择标志物也包括对抗生素如卡那霉素或四环素的抗性。

本领域中已知的，构建体中也可以存在编码另外的功能的其它核酸序列。例如，当土壤杆菌是宿主时，可以包含T-DNA序列，以利于后续转移和整合到植物染色体中。

用于遗传工程的植物

本发明详细描述了植物的遗传操作，该操作通过调节编码WALLDOF的多核苷酸序列增加细胞壁沉积和/或生物质密度。

在这一点中，植物包括但不限于桉属、杨属、针叶树、柳树、甘蔗、高粱、小麦、玉米、棉花、大豆、苜蓿、蔬菜(包括但不限于西兰花、花菜、甘蓝、萝卜、白菜、洋葱、胡萝卜、黄瓜、辣椒、番茄、茄子、西葫芦、葫芦、南瓜、秋葵、菠菜、干豆、豌豆、韭菜、莴苣、茴香、青刀豆、甜菜等)、甜瓜、西瓜、油菜(油菜籽)、水稻、大麦、花生、木豆、小米、葡萄、浆果(包括但不限于蓝莓、黑莓、木霉、桑椹、酸果蔓、波森莓等)、树果(包括但不限于李子、桃、油桃、杏、猕猴桃、石榴、芒果、无花果、橙、柠檬、酸橙、血橙、柚、苹果、香蕉等)、坚果树(椰子、核桃(英国胡桃和黑胡桃)、美洲山核桃、杏仁、榛子、巴西坚果、山核桃、橡子)、产生油籽的植物(包括但不限于葵花、油菜籽等)、苏丹草、芒草、柳枝稷、象草和狼尾草等。但是，该列表决不是限制性的，因为其他类型的植物是本领域普通技术人员所知的，且可用于增加细胞沉积和生物质。

本发明可特别用于对用于多种工业和应用中的植物进行工程化，该多种工业和应用包括但不限于：纸浆和纸工业及生物能源工业、一般林业、生物质原料、用于生物能源的生物材料、谷物、饮料、糖果、糖和甜味剂；纤维；染料；鞣质；涂料；树脂；乳胶、水凝胶、油漆、油、蜡、香料、花卉和观赏植物、食品色素、调味料、草药、药物、药品、营养品、竹、软木和木材。

遗传操作包括任何用于将合适引入宿主生物体或另外地改变生物体的遗传表达的方法。例如，当植物用增加基因(例如walldof)的表达并因此增加细胞壁沉积和生物质密度的多核苷酸序列转化时，该植物被遗传修饰。相反，未用多核苷酸序列转化的植物是对照植物，且被称为“未转化的”植物。

在某些实施方式中，选择带有引入其基因组中的walldof基因的DNA构建的遗传修饰的植物。例如，如此转化的转基因杨树植物与未转化的杨树植物通过以下事实区分：转化的转基因杨树植物除了包含在未转化的杨树植物中天然存在的如SEQ ID NO：1所示的核酸组拷贝以外，还包含至少一个稳定整合到其基因组中的该核酸分子的拷贝。

术语“植物”包括全植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、分化的或未分化的植物细胞及其后代。植物材料包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、苗、茎、果实、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可使用的植物类别通常广至适用于遗传工程技术的高等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)及裸子植物。该术语还指任何可进行遗传操作的纤维素植物材料，包括但不限于分化的或未分化的植物细胞、原生质体、全植物、植物组织或植物器官，或植物的任何成分，例如叶、茎、根、芽、块茎、果实、根茎等。本文使用的“繁殖体”包括具有能够产生新植物的能力的结构，例如种子、孢子或在与母体分离的情况下能够独立生长的植物体的部分。

在本文中，术语“生物能源”是指从有机物质产生的可用的可再生能源，即将有机物质的复杂碳水化合物转化为能量。有机物质可直接作为燃料使用、燃烧以产生电力、加工成液体和气体或作为加工和转化的残余物。

术语“生物质”是指任何在可再生或重复的基础上获得的有机物质，包括农业(即食品和纤维)作物和树木、木材和木材残留物、植物(包括养殖植物)、草和其他残留物质。生物质通常以可持续的方式通过光合作用从水、无机营养物质和二氧化碳产生。

生物质或生物质密度中的增加可通过至少一种植物表型的增加看出，该植物表型包括但不限于：高度；叶的重量、大小或数目；苗的长度和厚度；根的长度、厚度和分支；每棵植物的种子产量；开花；组织(包括木质形成组织)中细胞的数目和大小；和植物繁殖器官的发育。

用于遗传修饰的示例性方法

多核苷酸序列(例如walldof DNA序列)可通过本领域已知的各种方式稳定地整合入植物基因组中。单子叶和双子叶的被子植物或裸子植物的细胞可被转化。例如参见Klein等人，Biotechnology 4：583-590(1993)；Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-1199(1993)；Bent等人，Mol.Gen.Genet.204：383-396(1986)；Paszowski等人，EMBO J.3：22717-2722(1984)；Sagi等人，Plant Cell Rep.13：2615-286(1994)。例如，可以按照Nagel等人，Microbiol Lett 67：325(1990)所述使用土壤杆菌属的种如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)。此外，植物可通过根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)或中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)的转化进行转化。Broothaerts等人，Nature 433：629-633(2005)。

另外的用于遗传修饰植物或细胞的方法包括但不限于：电穿孔、粒子枪轰击(Klein等人，(1987)Nature.327：70-73)、磷酸钙沉淀和聚乙二醇融合、转移到萌芽的花粉粒中、直接转化(Lorz等人，Mol.Genet.199：179-182(1985))，及其它本领域已知的方法。如果使用选择标志物如卡那霉素抗性，则更易于确定哪些细胞被成功转化。标志物可以包含在被特定重组酶如cre或flp识别的重组位点对内，以利于在选择后除去该标志物。参见美国申请公布No.2004/0143874。

出于本文的目的，与启动子可操作地连接的walldof DNA序列可被引入植物或细胞中。例如，示例性的构建体可包含与木质部优先的启动子可操作地连接的walldof序列。

植物转化

本发明包括植物的遗传操作，特别是如上所述的植物或可用于任何如上所述的工业或应用的任何植物，以增加细胞壁沉积和/或生物质密度。

术语“转基因植物”是指包含本身也出现在另一生物体或物种中或相对于宿主密码子选择由另一生物体或物种优化的核酸序列的植物。单子叶和双子叶的被子植物或裸子植物的细胞可通过本领域已知的各种方式被转化。例如参见Klein等人，Biotechnology 4：583-90(1993)；Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-99(1993)；Bent等人，Mol Gen.Genet.204：383-96(1986)；Paszowski等人，EMBO J.3：2717-22(1984)；Sagi等人，Plant Cell Rep.13：262-66(1994)。例如，可以按照Nagel等人，Microbiol Lett 67：325(1990)所述使用土壤杆菌属的种如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)。此外，植物可通过根瘤菌属、中华根瘤菌属或中慢生根瘤菌属的转化进行转化。Broothaerts等人，Nature 433：629-633(2005)。同时，短语“转基因植物”是指已整合了DNA序列(包括但不限于正常情况下不存在于宿主植物基因组中的基因、正常情况下不转录为RNA或翻译为蛋白质(“表达的”)的DNA序列，或其他任何希望引入非转化的植物中的基因或DNA序列，例如正常情况下可能存在于非转化的植物中但是希望进行基因工程化或希望改变其表达的基因)的植物。“转基因植物”的类别包括原代转化体和例如，通过标准基因渐渗或另一种育种程序而在其谱系中包括转化体的植物。

例如，土壤杆菌可使用植物表达载体通过例如电穿孔转化，之后土壤杆菌介导表达载体向植物细胞的导入。用于实现这一过程的另外的方法包括但不限于电穿孔、粒子枪轰击、磷酸钙沉淀和聚乙二醇融合、转移到萌芽的花粉粒中、直接转化(Lorz等人，Mol.Genet.199：179-182(1985))，及其它已知的方法。如果使用选择标志物如卡那霉素抗性，则更易于确定哪些细胞被成功转化。标地物基因可以包含在被特定重组酶如cre或flp识别的重组位点对内，以利于在选择后除去该标志物。参见美国申请公布No.2004/0143874。

不含标志物基因的转基因植物可使用包含编码标志物的核酸的第二质粒产生，该第二质粒明显不同于包含walldof DNA序列的第一质粒。该第一和第二质粒或其部分被引入同一植物细胞中，从而选择标志物基因被瞬时表达，转化的植物细胞被识别，且获得其中walldof DNA序列被稳定地整合到基因组中而选择标志物基因未被稳定整合的转化植物。参见美国申请公布No.2003/0221213。当可通过各种方法(包括但不限于PCR和DNA测序)分析植物时，也可产生不具有选择标志物的转基因植物。

上述土壤杆菌的转化方法已知可用于转化双子叶植物。另外，de la Pena等人，Nature 325：274-76(1987)，Rhodes等人，Science 240：204-07(1988)和Shimamato等人，Nature 328：274-76(1989)公开了使用土壤杆菌转化谷类单子叶植物的方法。另外参见Bechtold等人，Methods Mol Biol 82：259-66(1998)，其证明了用于土壤杆菌介导的转化中的真空渗入。

植物细胞可用本发明公开的核酸构建体转化而无需使用选择性或可视标志物，且转基因生物体可通过检测被引入的构建体的存在来识别。特定细胞中蛋白质、多肽或核酸分子的存在可被测量，以确定例如细胞是否已被成功转化或转染。例如且作为本领域的常规手段，被引入的构建体的存在可通过PCR或其他合适的用于检测特定核酸或多肽序列的方法来检测。此外，通过与在相似条件下培养的未转化的细胞的生长速率或形态特征相比，转化的细胞可通过辨别转化的细胞的生长速率或形态特征中的差异来确认。参见WO 2004/076625。

从转化的细胞或培养物再生转基因植物的方法根据植物物种而不同，但是基于已知的方法。例如，用于再生转基因烟草(Nicotiana)和桉属植物的方法是众所周知的。

遗传修饰的植物的选择和分析

选择相对于同一物种的非转基因植物具有调节的walldof基因表达的遗传修饰植物。此外，本发明的遗传修饰的植物的各种不同实施方式可具有增加的细胞壁沉积和生物质密度。例如，本发明的转基因植物可具有包括以下特征的表型：(1)通过组织化学分析可观察到和可测量到的增加的细胞壁沉积，(2)改变的细胞壁面积和细胞壁面积占总细胞面积的百分比，从而由于细胞壁面积和细胞壁面积的百分比与生物质密度正相关，生物质密度因此增加。

短语“调节的表达”是指调节包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的WALLDOF转录因子的水平，调节的水平为比内源性调控多肽水平高10-50％，优选比内源性调控多肽水平高30-80％，最优选比内源性调控多肽水平高50-150％，最优选比内源性调控多肽水平高70-200％，最优选比内源性调控多肽水平高100-300％。还提供了具有该表达盒的植物、植物细胞和植物部分。

短语“细胞壁沉积”是指通过结构性或非结构性分子的沉积来构建和生物合成植物细胞壁。更具体而言，沉积用于细胞壁生物合成的分子包括纤维素、半纤维素、果胶多糖、蛋白质、木质素、软木脂、蜡和角质，但不仅仅限于这些。短语“细胞壁沉积”还指任何植物细胞、组织或器官的初生和次生细胞壁合成，该植物细胞、组织或器官包括但不限于：木质部、韧皮部、薄壁组织、分生组织及形成层、根、茎、叶、种子、花蕾等。

短语“增加的细胞壁沉积”是指细胞壁厚度的量的增加，从而相比于非转化的植物的细胞壁面积和细胞壁面积占总细胞面积的百分比，细胞壁面积和细胞壁面积占总细胞面积的百分比可以增加至少10-50％，优选至少30-80％，最优选至少50-150％，最优选至少70-200％，最优选至少100-300％。

短语“增加的生物质密度”是指相对于非转化的同一的种植物的生物质密度的量的增加。相比于非转化的植物的生物质密度，本文提供的工程化植物的生物质密度可增加至少10-50％，优选至少30-80％，最优选至少50-150％，最优选至少70-200％，最优选至少100-300％。

定量细胞壁沉积增加的方法

本文提供的遗传修饰的植物的特征可以是增加的细胞壁沉积。这是通过调节walldof基因的表达实现的。调节植物或植物细胞中walldof基因的表达可通过向核酸构建体中引入启动子(如上文所述的显示组织优先的表达的启动子)来实现。另一实施方式是产生表达WALLDOF蛋白质的转基因植物，优选在不同启动子(如其他组织特异性启动子或组成型启动子)的控制下进行。增加的细胞壁沉积是通过在合适的时间和位置表达合适量的WALLDOF蛋白质实现的。这种精确调节可通过确定最合适的启动子和通过选择显示所需表达水平的转基因“事件”来完成。

表达所需水平的WALLDOF蛋白质的转化植物是通过以下方式选择的：例如通过分析拷贝数(Southern印迹分析)、mRNA转录水平(例如使用特异性walldof DNA序列引物对或侧翼引物的RT-PCR)，或通过分析各种不同组织中WALLDOF蛋白质的存在和水平(例如SDS-PAGE；ELISA分析等)。选择高或中等WALLDOF表达的事件用于进一步测试，直到获得具有稳定整合的walldof DNA构建体的高表现水平原种(elite)事件。

全植物、种子、细胞、组织以及任何上述转化的植物的后代(例如F1杂交代、F2种子/植物等)均包含在本发明中，且可通过DNA中转基因的存在被确认，该DNA中转基因的存在是通过例如使用全基因组DNA作为模板和使用walldof特异性PCR引物对进行PCR分析所确定的。

也可研发“事件特异性的”PCR诊断方法，其中PCR引物是基于在插入的嵌合基因侧翼的植物DNA，参见美国专利No.6,563,026。类似地，可以研发事件特异性AFLP指纹或RFLP指纹，它们识别转基因植物或从该转基因植物衍生的任何植物、种子、组织或细胞。

可以理解，本文提供的转基因植物优选不显示不需要的表型，例如产率的降低、对疾病(特别对死养生物(necrotroph))易感性增加或不想要的结构改变(矮化、畸形)等，且如果这些表型可在原代转化体中观察到的话，则这些表型可通过育种和选择方法(杂交/回交/自交等)除去。本文描述的任何转基因植物对于转基因可以是纯合的或杂合的。

增加的细胞壁沉积可通过分析生物材料(例如木材木质部)的组织学切片确定。一般而言，该分析在可被横切为例如10μm厚，用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下观察的茎中进行。可以使用ImageTools软件进行每个细胞的细胞壁面积的测量。

用于定量生物质密度增加的方法

细胞壁沉积的增加造成表观生物质密度的增加。生物质密度可通过任何合适的方法确定。例如，存在X射线方法学，包括将茎切成1mm厚的圆片，并对该圆片进行X射线衍射。对从该茎圆片获得的放射照片使用如例如Mothe等人，Ann.For.Sci.，55：301-13(1998)所述的数字成像软件进行扫描和测量。

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在此提供了用于获得表达walldof基因的转基因植物的方法和用于评估基因的表型效应的方法的具体例子。它们意图是示例性的而非限制性的。

实施例1.杨树中walldof基因的识别

为了研发制备本发明的DNA构建体的方法，我们首先搜索了在杨树木质部中优先表达的转录因子。

在来自GenBank中可获的黑杨属(Populus sp.)的超过400,000EST的集合中搜索表达基因的组织特异性模式。出于该目的，从不同的杨树组织产生的cDNA文库被分组为以下典型组织：悬浮细胞、芽尖、茎皮、形成层、种子、木质、花蕾、叶和根。在通过CAP3程序(Huang和Madan，Genome Res.，9：868-877，1999)产生的簇集合中搜索那些由来自代表杨树形成层和木质组织的文库的至少90％EST读数构成的簇。此外，搜索那些由至少3个来自形成层和木质组织的EST读数且优选少于2个来自其他文库的读数构成的簇。

然后使用Blast-X算法、使用截止e值＜＝1e^-5(Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402，1997)，将所选的簇与来自拟南芥转录因子的专门数据库的序列进行比对，该数据库由从鼠耳芥属基因调控子信息服务器(AGRIS)AtTFDB数据库获得的序列组成。将结果储存在黑杨属转录因子的局部数据库中，并通过基于互联网的界面浏览，以过滤掉那些特别或优选在黑杨属的形成层和/或木质组织中表达的基因的特异性转录因子序列。

在以形成层和/或木质优先的方式表达的一组转录因子中，发现了一个具有形成层优先的表达谱的代表DOF转录因子家族成员的簇(图1)。代表该DOF转录因子的EST包含768bp的开放阅读框，其与毛果杨(Populus trichocarpa)基因模型estExt_fgenesh4_pg.C_LG_XV0093的开放阅读框99％相同。由于其与细胞壁的沉积相关，我们将其称为WALLDOF(细胞壁相关的DOF结构域蛋白质(wall-associated DOF domain protein))。

实施例2.在杨树和其他植物中walldof同源序列的识别

根据植物种系发生的研究，WALLDOF是由Ptr_DOF40、Ptr_DOF02、PTR_DOF06、Ptr_DOF15、Ptr_DOF25、Os02g45200(NCBIID：Os02g0673700)、Os04g47990(NCBI ID：Os04g0567800)、Os02g15350(NCBI ID：Os02g0252400)、AT2G46590、AT3G61850、AT4G24060、AT1G64620和AT4G00940构成的簇或分化枝的部分。Yang等人.，Plant Physiol，142：820-30(2006)。

通过序列相似性分析，经BLAST搜索确定，例如其他植物的其他序列被识别：2个来自葡萄基因组(葡萄(Vitis vinifera)-Phtozome/JGI ID GSVIVT00037222001和GSVIVT00006675001)，两个来自大豆基因组(大豆(Glycine max)-GenBank标注ID DOF21-gi|112363396|gb|ABI16022.1|-和DOF28-gi|112363398|gb|ABI16023.1|)。在其他草类中，2个推定的高粱DOF基因(JGI ID Sb04g032040.1和Sb06g025680.1)与WALLDOF类似。有可能在玉米基因组的目前集合(Tigr AZM5-http://maize.tigr.Org/release5.0/azm5.shtml)中识别到2个相似的DOF：DOF1来自重叠群(contig)AZM5_18231和DOF2来自重叠群AZM5_4711。

除了序列和植物种系发生的相似性以外，上述walldof相似的基因共有相似的内含子-外显子结构及共同的保守蛋白质结构域。图2显示内含子-外显子结构(编码区域内)方面的相似性。相似的walldof基因显示出由除Ptr_DOF06、Ptr_DOF25 AT4G00940和Os02g15350以外的2个外显子组成。

为了分析与上述WALLDOF相似的成员相关的假定基序，我们已经分别分析了双子叶植物和单子叶植物的比对。图3显示双子叶植物之间的相似性，图4显示单子叶植物之间的相似性。当一起分析时，从两个比对组得出图5中所述的基序。这表明，来自不同物种的假定的WALLDOF相似的成员(它们由如上文所定义的“旁系同源”基因编码)在它们的蛋白质序列中共有这些共同基序。

实施例3.来自美洲黑杨的walldof的分离和克隆

(a)来自美洲黑杨形成层/木质部的mRNA的制备和cDNA的合成：

从一年生美洲黑杨的茎切片上除去树皮。将包含形成层、木质部和木髓的茎的内部部分切成小片，冻在液氮中，并使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取方法进行RNA的提取。参见Aldrich和Cullis，Plant Mol.Biol.Report.，11：128-41(1993)。使用总RNA作为模板来合成cDNA。通过RT-PCR、使用Superscript II反转录酶(Invitrogen)和寡聚(dT)引物来产生cDNA的第一条链。双链cDNA是通过后续的聚合酶反应、使用如下所述的基因特异性引物获得的。

(b)PCR引物和RT-PCR反应的设计：

合成基于毛果杨基因模型estExt_fgenesh4_pg.C_LG_XV0093的寡聚物作为PCR的引物，包括在第一个ATG密码子附近或在编码多肽的主ORF的终止密码子附近的区域，以扩增主ORF的整个编码区域。引物的序列为：

DOFNCO(SEQ.ID.NO：3)

5′-ATCCATGGATACTTCTACTCAGTGGCCACAGG-3′

DOFXBA(SEQ.ID.NO：4)

5′-ACTCTAGATTACCATGATCCACCACCTAACATTC-3′

在(a)中获得cDNA库被用作使用SEQ.ID.NO：3和4的引物的PCR反应中的模板。PCR包括以下40个循环：94℃1分钟，51℃1分钟和72℃2分钟，接下来是72℃延长7分钟的额外步骤。PCR产物通过在1.0％琼脂糖上进行凝胶电泳分离，然后使用溴化乙锭染色电泳的凝胶，并用UV透照仪(transilluminator)检测扩增的带。检测到的扩增带被确认，并且用刀片切下琼脂糖凝胶。将凝胶片转移到1.5mL微型管中，并使用GFX PCR清洁和凝胶带纯化试剂盒(Amersham)来分离和纯化DNA片段。将回收的DNA片段亚克隆到市售的克隆载体中，转化到大肠杆菌中，然后用于制备质粒DNA，其然后再通过标准方案使用双脱氧法进行测序。参见Messing，Methods in Enzymol，101：20-78(1983)。得到的核苷酸序列(如SEQ.ID.NO：1所示)编码在此确认为具有SEQ.ID.NO：2的WALLDOF多肽。

实施例4.欧洲山杨×银白杨(P.tremula x P.alba)杂交体的土壤杆菌介导的转化

将从美洲黑杨分离的和在实施例2中获得的核酸分子克隆到木质部优先的香豆酸-4-羟化酶(C4H)基因启动子下游的表达载体中，如WO 2005/096805所述(图6)。产生的表达构建体在大肠杆菌中扩增，然后被转化到根癌土壤杆菌LBA4404菌株中。

野生型白杨杂种(欧洲山杨×银白杨)用携带在实施例3中获得的构建体的根癌土壤杆菌转化。来自体外微体繁殖(micropropagate)的叶柄和运输茎(intermodal stem)段被用作外植体。在包含100mg/L卡那霉素的再生培养基中选择转化的苗，并允许该苗在Murashige和Skoog培养基中生根。然后将选择的植物转移到土壤中，并在温室中生长。

转基因事件通过PCR确认。基因构建体被整合在转基因植物的基因组中是通过对选择标志物基因(卡那霉素)和walldof基因的PCR分析确认的。

实施例5.walldof的过表达增加转基因杨树中的细胞壁沉积

对用实施例3中获得的构建体转化的两个月龄的杨树茎的较低部分进行木质部的组织学分析。使用配备有钢刀的显微镜薄片切片机(LEICA RM2255)从野生型和转基因株系横切(10μm厚)的茎切片。将该切片进行甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下观察。

图7显示非转化的植物(A)和用在实施例2中获得构建体转化的转基因事件(B)的横跨从木髓到形成层的木质部的茎切片。有可能看到，当与非转化的植物相比时，转基因事件中细胞壁的厚度显著增加。这清楚地证明了在转化的事件中由调节的walldof表达导致的细胞壁沉积的显著增强。另外在转化的事件中，细胞的内腔宽度显著降低。图8表示与非转化的植物相比，与图6中所示的同一转化事件的茎切片的较高放大图。可以清楚观察到由于细胞壁厚度的增加导致的腔宽度的显著降低。

细胞壁面积的测量值表明，在转化的事件的重复中细胞壁显著变厚。事件A.4.2、B.3.1和B.4.1表现出与非转化的植物相比，每细胞的细胞壁面积分别增加255％、77％和55％(图9)。

与非转化的对照植物的占总细胞面积27％相比，在转化的植物中细胞壁面积占总细胞面积的百分比显著增加，在38％-82％之间变化(图10)。

实施例6.walldof的过表达增加了杨树中的表观木质密度

细胞壁沉积的增加造成转化植物的表观木质密度增加。为了确定表观木质密度，使用双面锯从茎下部切割样品(1mm厚)。使用预先调整(时间：5分钟；能量：16Kv；强度：3mA)的Hewlett Pakard Faxitron(型号43805N)以12％的水分含量(MC)对薄条板进行X光照射。使用正常程序显影膜(Kodak，Diagnostic Film X-Omat XK1，24X18cm)。将转化的和未转化的植物的放射照片使用256灰度级以1,000dpi分辨率进行扫描。X射线微密度的测量(X射线密度测定法)是通过CERD软件在该数字图像上进行的。Mothe等人，Ann.For.Sci，55：301-13(1998)。如Walker和Doob，Wood Fiber Sci.，20：35-43(1998)所述的，用于密度测定分布的方法被用于确定平均表观木质密度。

与非转化的植物相比，事件A.4.2、B.3.1和B.4.1分别显示84％、38％和32％的表观木质密度的增加(图11)。杨树被认为是木质密度为大约300-400g/cm³的软木质植物。与未转化的植物中大约0.42g/cm³的木质密度相比，本发明的转化的事件在事件B.3.1和B.4.1中显示出为约0.66g/cm³的木质密度和在事件A.4.2中显示出为约0.82g/cm³的木质密度(图11)。增加的细胞壁沉积是导致该木质密度结果的主要原因，因为这两种属性之间的相关性显示为0.97(图12)。

实施例7.提高细胞壁沉积与提高walldof表达相关

为了确定walldof转录物的丰度和将walldof表达的水平与观察到的表型的强度相关联，我们使用从未转化的杨树和4个如上所述分析的转化事件的发育木质部中分离的RNA进行了定量的逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)。使用研钵和杵将液氮冷冻的组织碾磨成粉末，并使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取方法分离总RNA(Aldrich和Cullis，Plant Mol.Biol.Report.，11：128-141，1993)。总RNA用DNaseI(Promega)处理，且cDNA第一链使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)利用1μg总RNA合成。十分之一的cDNA与500nM浓度的基因特异性引物和SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)组合使用。PCR在ABI Prism 7000Sequence Detection System(Applied Biosystems)上进行。为了扩增walldof转录物，使用寡核苷酸引物walldof Fwd (5′-TGCAAGAATTCAAGCCATC-3′)和WALLDOF Rev(5′-GCAGCAGGTTCCAAGTAATG-3′)。被用作参比基因以使模板量标准化的毛果杨肌动蛋白基因序列(estext_genewise1_Vl.C_1850029)使用以下寡核苷酸引物ACTINFwd(5′-GCTGTCCTTTCCCTGTATGC-3′)和ACTIN Rev(5′-ACGACCAGCAAGATCCAAAC-3′)进行扩增。扩增如此进行：50℃2分钟、95℃10分钟，以及45个循环的95℃15秒和60℃1分钟。扩增反应的特异性通过分析解离曲线来评估。walldof和ACTIN的扩增产物的量之间的比例使用2^-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen，Methods，25：402-408，2001)计算。walldof转录物的水平相对于ACTIN的转录物水平计算为从用作生物重复的3个独立样品获得的值的平均。

呈现出细胞壁沉积和表观木质密度的增加的转基因事件与非转化的植物相比在茎中具有更高的walldof基因表达水平。walldof基因的表达水平越高，与细胞壁沉积和木质密度相关的表型越强。

事件A.4.2显示出最高的表观木质密度和细胞壁沉积，与非转化的植物相比walldof基因的表达水平显示出14倍的增长。具有相似的木质密度和细胞壁沉积增加的事件B.3.1和B.4.1也显示出相对于对照植物的walldof基因表达水平的相似的增加(分别为6和7倍的增加)，如图13所示。

实施例8.转化的和未转化的植物中生长速率相似

如植物生长速率所示，用于增加细胞壁沉积和木质密度的碳分配没有干扰植物的生长和发育(图14)。在温室中生长两个月后，转化的植物的生长效率以与对照植物相同的生长速率生长。

实施例9.walldof的过表达增加纤维素含量

为了分析walldof的过表达是否改变木质组成，使用Wiley碾磨机将温室生长的植物茎材料磨碎以通过40-60目的网筛，然后用乙酮进行索氏(soxhlet)抽提5小时。无抽提物的材料用于所有后续分析。使用改良的克拉松(Klason)法确定木质素含量，其中根据Coleman等人，Plant Biotechnol.J.，4：87-101(2006)所述的，经过提取的磨碎茎组织(0.3g)使用3ml的72％H₂SO₄进行处理。称量干燥坩埚以通过重量分析确定克拉松木质素(酸不溶性木质素)。还通过在205nm处的吸收值来分析滤液中的酸可溶性木质素。水解产物中的碳水化合物浓度通过使用配备有离子交换PA1(Dionex)柱、带有金电极的脉冲电流检测器和Spectra AS 3500自动注射器(Spectra-Physics)的高效液相色谱(HPLC)(DX-500；Dionex)来确定。每项实验重复进行两次。各个无抽提物样品的S/G比例的确定是通过硝基苯氧化获得的。Methods in Lignin Chemistry，eds.Lin和Vance，Springer Verlag，Berlin，1992。参见表2。

WALLDOF过表达的植物显示出纤维素高达12％的增加和半纤维素碳水化合物的总体降低。如表1所示，半纤维素含量的降低主要是由甘露糖(在事件A.4.2中低至野生型含量的42％)和阿拉伯糖(在事件A.4.2中低至野生型含量的72％)的降低导致。

表1.对照和转基因杨树中茎木质的碳水化合物组成(干木质重量的％)

平均值和标准误(括号中)报告为n个独立株系的重复分析。

野生型，n＝3；转基因株系，n＝2。

碳水化合物的数据是通过ANOVA分析。与野生型显著不同的值以粗体表示(Tukey检验；P＜0.05)。

表2.对照和转基因杨树中茎木质的木质素含量和组成

木质素(％干木质重量)

木质素单体(μmol/g克拉松木质素)

平均值和标准误(括号中)报告为n个独立株系的重复分析。

野生型，n＝3；转基因株系，n＝2。

数据通过ANOVA进行分析。与野生型显著不同的值以粗体表示(Tukey检验；P＜0.05)。

实施例10.Walldof影响参与氮和碳水化合物代谢中的基因的表达

为了识别直接或间接由walldof转录因子控制的候选目标基因，进行了微阵列分析以对比过表达walldof的株系A.4.2和野生型植物。

收获野生型的3个生物重复的茎和转基因株系A.4.2的3个生物重复的茎，立即冷冻在液氮中，并维持在-80℃下用于RNA提取。对于RNA的分离，剥去茎的皮，并用刀片刮去发育的木质部。在液氮下将木质部碾磨成细粉，并使用如Chang等人，Plant Mol.Biol.Rep.11：4(1993)所述的方法从各个样品中提取总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪确定RNA质量。对于各个样品，10μg总RNA被反向转录、标记并根据制造商的方案(Affymetrix)与杨树基因组阵列(Poplar Genome Array)进行杂交。该杨树基因组阵列包括61，251个探针组，代表了超过56,055个转录物(Affymetrix)。

使用如Gautier等人，Bioinformatics 20：307-315(2004)描述的利用Affy包的R语言的BioConductor套装进行GeneChip数据分析。使用Robust Multichip Average分析进行背景校正、归一化和表达值的汇总。通过Affy Mas5calls功能指定当前呼叫(call)探针组。从分析中除去所有样品中缺乏信号或具有边缘信号的任何基因。转基因植物和野生型之间的对比是使用Limma包进行的。Smith，Stat.Appl.Genet.Mol.Biol，3：3(2004)。差异表达的基因使用假发现率(false discovery rate)校正的t检验确认。Benjamini和Hochberg，J.R.Stat.Soc.Ser.B 57：289-300(1995)。校正的P值阈值设置为0.05。

使用Affymetrix Genechip Poplar Genome Array的walldof事件的木质部转录组(transcriptome)分析识别了差异表达的825个基因，包括参与氮和碳水化合物代谢、细胞壁合成和修饰以及苯丙素代谢的一组基因。

在氮代谢中，微阵列数据确认了谷氨酸脱氢酶基因GDH1和GDH2表达水平的下调。此外，GS2(叶绿体谷氨酰胺合成酶同工型)的转录物水平在walldof过表达的杨树中提高。由于PAL反应所释放的铵被谷氨酰胺合成酶再次同化，因此这一增加在转化体中是可预期的。

此外，四种编码参与淀粉降解的酶的基因(即α-淀粉酶样基因[AMY3]、两个α-葡聚糖磷酸化酶基因和α-葡聚糖二激酶[SEX1])的转录物水平在walldof过表达的株系中增加，而ADP葡萄糖焦磷酸酶大亚基[AGP2和AGP3]的转录物水平降低。这些数据表明淀粉的降解增加。我们已经分析了转基因植物中的总淀粉(表3)，且我们已经在转基因植物中观察到淀粉含量高达32％的下降。

与细胞壁的组织相关，9个假定的阿拉伯半乳聚糖蛋白质(AGP)的转录物水平发生改变。其中7个下调，而两个升高。

在木质素形成过程中其表达水平通常升高的4个基因的转录物水平在walldof过表达的株系中增加：4个编码漆酶的基因。总之，转录组分析揭示了在细胞壁成分(木质素、碳水化合物和蛋白质)的代谢及氮和碳的代谢中的差异。

表3.对照和转基因杨树中茎木质的淀粉含量。

株系	总淀粉(％)
		A.4.2	5.02
B.4.2	5.70
		野生型	6.66

Claims (14)

1.一种用于增加细胞壁沉积和生物质密度中至少一种的方法，包括调节植物细胞中walldof DNA序列的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节包括在转基因植物中实现所述序列的过表达，从而所述植物的特征为生物质密度的增加。

3.根据权利要求3所述的方法，其中所述转基因植物为包括以下步骤的过程的产物：

(a)提供用由walldof DNA序列和与其可操作地连接的在植物细胞中为活性的启动子组成的构建体转化的可再生植物材料；和然后

(b)对所述材料或由所述材料再生的植物进行选择，其中至少一个选择标准为相对于非转化状态细胞壁沉积增加或生物质密度增加。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述启动子为木质部优先的启动子。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述启动子为组成型启动子。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述walldof序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述walldof序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

8.一种由walldof DNA序列和与其可操作地连接的在植物细胞中为活性的启动子组成的构建体。

9.一种转基因植物细胞，其包含在木质部优先的启动子或组成型启动子的控制下表达的异源walldof DNA序列。

10.一种转基因植物，其表达walldof DNA序列从而所述植物的特征在于相对于非转化状态其生物质密度增加。

11.一种用于增加纤维素含量的方法，包括调节植物细胞中walldof DNA序列的表达。

12.一种加工的植物产品，其含有可检测量的包含在异源启动子控制下的walldof序列的重组多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的加工的植物产品，其中所述产品包括饲料、粗粉、细粉、提取物、果肉或匀浆，其中所述饲料、粗粉、细粉、提取物、果肉或匀浆从至少一个植物部分获得。

14.根据权利要求13所述的加工的植物产品，其中所述植物部分为茎、叶、根、花、形成层、木质、块茎或种子。

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