BRPI0916953B1 - método para aumentar a deposição na parede celular, densidade de biomassa e/ou teor de celulose, construção, bem como produto de planta processado. - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO PARA AUMENTAR A DEPOSIÇÃO NA PAREDE CELULAR, DENSIDADE DE BIOMASSA E/OU TEOR DE CELULOSE, CONSTRUÇÃO, BEM COMO PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO.

(51) Int.CI.: C12N 15/82 (30) Prioridade Unionista: 22/08/2008 US 61/091,075 (73) Titular(es): FIBRIA CELULOSE S/A (72) Inventor(es): PAULO ARRUDA; ISABEL RODRIGUES GERHARDT (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/02/2011

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA AUMENTAR A DEPOSIÇÃO NA PAREDE CELULAR, DENSIDADE DE BIOMASSA E/OU TEOR DE CELULOSE, CONSTRUÇÃO, BEM COMO PRODUTO DE PLANTA PROCESSADO.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/091.075, depositado em 22 de agosto de 2008, os teores do qual são incorporados aqui pela referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO.

A presente invenção refere-se a colheitas com a eficiência melhorada de empacotamento do carbono fixado em compostos estocáveis. Mais particularmente, a metodologia e os construtos são direcionados ao aumento de deposição sobre a parede celular e/ou de biomassa de plantas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

As colheitas perenes, tais como cana-de-açúcar, switchgrass, Miscanthus e espécies arborizadas, são as principais fontes de carbono fixado na forma de açúcar simples ou de misturas de complexos de celulose e hemicelulose. Estes recursos de biomassa são os objetivos principais de várias indústrias, tais como a indústria de bioenergia, que são atualmente direcionadas ao desenvolvimento dos recursos exigidos pela crescente população mundial.

Os recursos de biomassa são úteis, por exemplo, para a produção de etanol celulósico que pode deslocar potencialmente 30% do atual consumo de petróleo dos USA, num futuro próximo. Perlack et al, BIOMASS AS FEEDSTOCKS FOR A BIOENERGY AND BIOPRODUCTS INDUSTRY: THE TECHNICAL FEASIBILITY OF A BILLION-TON ANNUAL SUPPLY, ORNL/ TM2005/66 (2005). Essas matérias-primas lignocelulósicas foram propostas por oferecerem vantagens ambientais e econômicas sobre os atuais recursos energéticos, porque elas necessitam menos investimentos agrícolas do que as colheitas anuais e podem ser cultivadas em terras agricolamente marginais. Hill etal, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 103: 11206-210 (2006).

As projeções que foram feitas mostram uma demanda mundial

2/48 esperada por madeira aumentada de 20% na próxima década, devido a um uso crescente de produtos florestais, resíduos de madeiras, e colheitas florestais energéticas para a produção de eletricidade, de combustível e para produção de biomassa. Strauss e Bradshaw, TREE BIOTECHNOLOGY IN THE NEW MILLENNIUM: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ECOLOGICAL AND SOCIETAL ASPECT OF TRANSGENIC PLANTATIONS, Universidade Estadual do Oregon (2001); Mead, Biomass and Bioenergy, 28: 249-66 (2005).

Por isso, há uma necessidade para desenvolver plantações de árvore altamente produtivas para reduzir a pressão sobre as florestas naturais, precedidas por avanços sobre a reprodução extensiva das plantações de espécies de árvores tais como o álamo e o eucalipto. Até agora isto foi difícil porque o longo tempo de geração das árvores torna a reprodução convencional um processo muito lento. As técnicas de engenharia genética têm o potencial para encurtar muito a cronologia de reprodução de árvores e permitir a reprodução mais direcionada.

As aproximações para aumentar a alocação de carbono nas porções das plantas acima do solo aumentariam as taxas de crescimento e o rendimento de biomassa. Ragauskas etal, Science, 311: 484-89 (2006). Nas árvores o carbono fixado é acumulado principalmente nas paredes secundárias das células, que são o constituinte principal da madeira. As paredes secundárias são compostas principalmente de celulose, hemiceluloses e lignina. Durante a formação da parede secundária, a biossíntese desses componentes da parede celular é altamente coordenada e depende dos genes mestres reguladores controlando um enorme microarranjo de genes individuais. Apesar dos avanços no estudo dos genes da biossíntese da parede secundária, pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares que são a base da expressão coordenada desses genes durante a formação da madeira. Zhong etal, Plant Cell, 19: 2776-92 (2006).

Há vários tipos de processos reguladores controlando a expressão genética, a produção de proteína, e o processamento da proteína e a atividade da proteína. Um desses tais processos envolve a atividade de fato3/48 res de transcrição, que são proteínas capazes de reconhecer sequências no promotor de genes e, pela ligação nas tais sequências particulares, modulam a taxa de transcrição de tais genes. Vários fatores de transcrição foram identificados em diversos organismos e o seu papel no controle de determinadas vias de biossíntese foi estabelecido. Por exemplo, o perfil transcricional de genes diferencial mente expressados durante a diferenciação in vitro do xilema na zínia (Demura et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 99: 15794-99, 2002) e na Arabidopsis (Kubo et al, Genes Dev., 19: 1855-60, 2005) ou durante o crescimento secundário em troncos e raízes da Arabidopsis (Oh et al, J. Exp. Bot, 54: 2709-22, 2003; Zhao et al, Plant Physiol, 138: 803-18, 2005) e no álamo (Hertzberg et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 98: 14732137, 2001) levou à identificação de diversas famílias de fatores de transcrição, que podem estar envolvidos na regulação da diferenciação do xilema ou no crescimento secundário. Similarmente, a análise por microarranjo mostrou que 182 fatores de transcrição são diferencialmente expressados durante as diferentes etapas de desenvolvimento da inflorescência dos troncos de Arabidopsis. Ehlting et ai. Plant J, 42: 618-40 (2005). Embora as funções exatas da maior parte desses fatores de transcrição associados ao xilema ou ao crescimento secundário sejam desconhecidas, eles fornecem instrumentos úteis para dissecar os mecanismos moleculares controlando o processo complexo do desenvolvimento do xilema, incluindo a iniciação da diferenciação, o alongamento da célula e o engrossamento da parede secundária.

Entre estes os fatores de transcrição associados ao xilema ou ao crescimento secundário está um grupo de DOF (para ligação com DNA com um dedo) de fatores de transcrição de domínio. As proteínas de DOF são fatores de transcrição específicos para a planta que compartilham um domínio de ligação com DNA na terminação N altamente conservada e um domínio na terminação C para a regulação transcricional. Yanagisawa, Trends Plant Sei., 7: 555-60 (2002). Odomíniode ligação com o DNA é caracterizado por 52 resíduos de aminoácido estruturados como um Cys2/Cys2 com dedo de Zn²⁺, que reconhece elementos reguladores cis contendo o núcleo

4/48 comum 5-AAAG-3'. Umemura et al, Plant J, 37: 741-49 (2004); Yanagisawa & Schmidt, Plant J., 17: 209-14 (1999).

Sugeriu-se que as proteínas do DOF participem na regulação de processos biológicos exclusivos para plantas, tais como expressão genética regulada pela luz, assimilação fotossintética de carbono, acúmulo de proteínas para armazenamento da semente, germinação, resposta a fito-hormônios, expressão genética específica para a célula guarda, o metabolismo de flavonoides e a biossíntese de lipídio. Plesch et al, Plant J., 28: 455-64 (2001); Moreno-Risueno et al, Plant J., 51: 352-65 (2007); Wang et al, Plant J., 52: 716-29 (2007).

No arroz o elemento c/s mais apresentado de todos os genes dos fatores transcricionais preferenciais para a semente foi encontrado como sendo 'AAAG', o sítio principal necessário para a ligação de proteínas DOF, sugerindo o papel essencial e mais notável dos fatores de transcrição DOF em redes reguladoras hierárquicas controlando desenvolvimento de semente do arroz. Duan etal, Plant Mol Biol, 57: 785-804 (2005).

O DOF1 do milho se expressa nas folhas, troncos e raízes e tem atividades de transativação diferentes em protoplastos das folhagens e etiolados. O DOF1 é ativado em células de folha iluminadas e pode estar envolvido na regulação pela luz de genes ligados a processos dependentes da luz. Yanagisawa and Sheen, Plant Cell, 10: 75-90 (1998). Sugeriu-se também que o DOF1 de milho seja um regulador para a C4 fotossintética fosfoenolpiruvato carboxilase, que catalisa a fixação primária de CO₂ na via fotossintética C4. Adicionalmente, ele melhora a transcrição do promotor de uma diquinase de ortofosfato citossólico. Ambas as enzimas estão envolvidas na síntese de aminoácido e na recaptura do CO₂ respirado. Propôs-se que o DOF1 do milho pudesse desempenhar um papel mais geral na expressão de múltiplos genes relacionados ao metabolismo do carbono. Ver Yanagisawa, Plant J, 21: 281-88 (2000).

Mostrou-se que outra proteína DOF do milho específica para o endosperma, denominada fator de ligação caixa da prolamína (PBF), interage com a proteína zíper de leucina básica Opaque2, um ativador transcricio5/48 nal conhecido da expressão genética da prolamina (Vicente-Carbajosa et al, Proc, Natl Acad. Sei USA, 94: 7685-90, 1997). Outras proteínas homólogas existem no endosperma de outros cereais, tais como BPBF (PBF da cevada) e WPBF (PBF do trigo), ambas com as propriedades de ligação com o DNA semelhante ao PBF de milho. Esta observação sugere uma conservação evolutiva da função genética do PBF, como um regulador importante da expressão genética de proteína de armazenamento entre pequenos cereais de grão, e apoia um cenário onde as interações de proteína à proteína são importantes nas funções da DOF. Mena et al, PlantJ., 16: 53-62 (1998).

No arroz há um membro da família DOF (OSDOF3) que foi mostrado por interagir com um fator de transcrição de MYB do tipo R2R3 na camada aleurona, resultando na expressão induzida de diversos genes que codificam enzimas hidrolíticas (α-amilases e β-glucanases) que participam na mobilização de moléculas armazenadas. Washio, Plant Physioi., 133: 850-63 (2003). A regulação genética nestas células de aleurona está sob o controle de fito-hormônios, principalmente a proporção de giberelinas (GA) para o ácido abscísico (ABA). O modelo de acúmulo observado do PBF da cevada transcrito durante a inibição de semente sugeriu que ele pode ser suprarregulado pela GA e funcione como um repressor transcricional sobre a germinação através da interação com a caixa de pirimidina do GARC (complexo responsivo GA), um elemento c/s conservado necessário para a indução da GA identificado em genes de hidrolase de cereais. Mena et al, Plant PhysioL, 130: 111-19(2002).

Na Arabidopsis há 36 membros da família do DOF, dois dos quais, DAG1 e DAG2 (Dof Afetando a Germinação), também afetam a germinação de semente por resposta à luz e a concentração de giberelina, possivelmente desempenhando papéis reguladores nos mesmos genes maternos. Gualbeiti et ai, Plant Cell, 14: 1253-63 (2002).

Adicionalmente, as proteínas do DOF foram descritas como parte de uma rede reguladora controlando metabólitos secundários. Neste sentido, ο OBP2, um gene DOF proeminentemente expressado na floema de folhas e em outros órgãos da Arabidopsis, foi mostrado como ativando a ex6/48 pressão da CYP83B1, um gene que participa na síntese de glicosinolatos, um grupo de metabólitos secundários que funcionam como substâncias de defesa contra herbívoros e micro-organismos. Skirycz et al. Planta J., 47: 10-24 (2006). Outro membro genético do DOF da Arabidopsis, AtDOF4;2, foi identificado como um gene que induz um fenótipo espesso de planta e potencialmente está envolvido na regulação do metabolismo da fenilpropanoide.

A sobre-expressão constitutiva e o silenciamento do AtDOF4;2 mediado pelo RNAi causam alterações recíprocas na expressão de genes da biossíntese de flavonoides e no acúmulo de flavonoides sob condições de frio e luz intensa. Ver Skirycz et al, New Phytol, 175: 425-38 (2007).

A participação de proteínas DOF na regulação do metabolismo de fenilpropanoide também foi mostrada em mutantes de-etiolados3 (det3), pom-pom1 (pom1) e na lignificação ectópical (elH) da Arabidopsis thaliana. Estes mutantes depositam a lignina em células onde este polímero não seria normalmente encontrado. A análise por microarranjo sugere que as modificações na expressão de membros específicos do R2R3-MYB e das famílias do fator de transcrição DOF possam contribuir para os fenótipos de lignificações ectópicas nestes mutantes. Rogers et al., New Phytol., 168: 123-40 (2005).

No álamo há 41 genes DOF, de acordo com Yang et al., Plant Physiol., 142: 820-30 (2006). Uma análise de sequência desses genes junto com 36 genes da Arabadopsis e 30 genes de DOF do arroz revelou 41 motivos conservados, dos quais um: EILKCPRCDSMNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKTC RRYWTKGGALRNVPVGGGCRKNKR,foi identificado como o domínio DOF. Id., página 824 e Tabela 1. Uma árvore filogenética de verossimilhança máxima, construída usando sequências de proteína de comprimento total desses genes DOF, também destacou 27 pares de genes de parálogo nos nodos terminais da árvore. Id., a página 825 e a figura 2. SUMÁRIO DA INVENÇÃO.

Baseado nas descobertas dos inventores e discernimentos relacionados sobre proteínas DOF, fornecidas na presente descrição é, entre outras coisas, uma metodologia de aumento de deposição sobre a parede

7/48 celular e/ou aumento de biomassa. O método da invenção compreende a expressão de modulação de uma sequência waildofem uma célula de planta, por exemplo, efetuando a sobre-expressão de tal sequência em uma planta transgênica, de tal modo que a planta é caracterizada por uma densidade de biomassa aumentada. Em uma modalidade preferida, a planta transgênica é o produto de um processo compreendendo: (a) fornecimento de material de planta regenerável que é transformado com um construto compreendido de uma sequência iva//do/DNA e, operavelmente ligado à mesma, um promotor que é ativo em células de planta; e depois (b) submissão do material ou plantas regeneradas do material a uma seleção para a qual pelo menos um critério de seleção é a deposição na parede celular aumentada ou a densidade de biomassa aumentada, em relação a um estado não transformado. Ilustrativo da sequência iva//clo/DNA são (i) a sequência de nucleotídeo exibida na SEQ ID N°: 1 e (ii) a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido exibida na SEQ ID N°: 2.

Também contemplado é um construto compreendido de uma sequência wa//do/DNA e, operavelmente ligado ao mesmo, um promotor que é ativo em células de planta. Tanto no construto como no método supracitado, o promotor pode ser, por exemplo, um promotor específico para o órgão ou tecido, tal como um promotor específico para o xilema; um promotor preferido para tecido ou órgão, tal como um promotor preferido para o xilema, um promotor constitutivo, ou um promotor induzível.

Justamente por isso, os aspectos relacionados incluem uma célula de planta transgênica compreendendo uma sequência iva//do/DNA heteróloga que é expressada sob o controle, por exemplo, de um promotor preferido/específico, promotor constitutivo, ou promotor induzível para um tecido ou órgão. Também é fornecida uma planta transgênica expressando uma sequência tva//cfo/DNA de tal modo que a planta é caracterizada pela densidade de biomassa aumentada, em relação um estado não transformado. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra a expressão diferencial do gene waildofem diferentes tecidos de álamo.

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A figura 2 mostra a estrutura quanto à estrutura de éxon do íntron de homólogos WALLDOF putativos.

A figura 3 mostra múltiplos alinhamentos de dicotiledôneos WALLDOFs nos quais os motivos conservados de 1 a 7 são destacados.

A figura 4 mostra múltiplos alinhamentos de monocotilédones WALLDOFs (nos quais os motivos conservados de 1 a 7 são destacados).

A figura 5 mostra em (A) a ordem e o tamanho de motivos WALLDOF e em (B) a sequência de consenso de aminoácido de motivos WALLDOF de 1 a 7.

A figura 6 esquematicamente ilustra o vetor plasmídio pALELL YX-DOF de expressão da planta da invenção compreendendo um promotor preferido de câmbio/xilema que dirige a expressão da sequência de nucleotídeo de um Populus deitoides DOF (walldof) da invenção.

A figura 7 mostra seções transversais do tronco (nível base) do xilema de uma planta de controle (A) e uma linhagem transgênica (B) transformada com o vetor plasmídio de expressão da planta pALELL YX-DOF da invenção corada com a tintura toluidina azul.

A figura 8 mostra um alto aumento de seções transversais do tronco (nível baseado) de uma planta de controle (A) e uma linhagem transgênica (B) de Populus tremula x Populus alba transformadas com o cassete de expressão de planta pALELL YX-DOF da invenção. As seções coradas com a tintura azul de toluidina mostram a deposição na parede celular aumentada das linhagens transgênicas comparando com plantas de controle não transformadas.

A figura 9 mostra a área da parede por célula (pm²) de quatro linhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmídio de expressão da planta pALELL YX-DOF da invenção e três plantas de controle (média de três plantas em replicata). O asterisco denota linhagens transgênicas possuindo a área da parede aumentada estatisticamente significativa sobre as plantas de controle não transgênicas de acordo com o teste / de Student.

A figura 10 mostra a percentagem da área de célula ocupada pela parede de quatro linhagens transgênicas transformadas com o vetor

9/48 plasmídio pALELLYX-DOF de expressão da planta da invenção e três plantas de controle (média de três plantas em replicata). O asterisco denota linhagens transgênicas possuindo percentagem da parede celular aumentada estatisticamente significativa por célula sobre as plantas de controle não transgênicas de acordo com o teste t de Student.

A figura 11 mostra a densidade aparente da madeira (g/cm³) de quatro linhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmídio pALELLYX-DOF de expressão da planta da invenção e três plantas de controle (média de três plantas em replicata). O asterisco denota linhagens transgênicas possuindo aumento na densidade de madeira estatisticamente significativa sobre as plantas de controle não transgênicas de acordo com o teste t de Student.

A figura 12 mostra as correlações positivas entre a densidade aparente da madeira (g/cm³) e a percentagem da área da célula (% / por célula) ocupado pela parede.

A figura 13 mostra os níveis de mRNA relativos ao walldof r\o xilema que se desenvolve de quatro linhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmídio pALELLYX-DOF de expressão da planta da invenção e três plantas de controle (média de três plantas em replicata).

A figura 14 mostra comparações de fenótipo de planta entre linhagens transgênicas transformadas com o vetor plasmídio pALELL YXDOF de expressão da planta da invenção e das plantas de controle. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

Os presentes inventores demonstraram que um fator de transcrição de DOF do álamo, chamado WALLDOF, desempenha um papel essencial na deposição na parede celular secundária. Assim, na sobre-expressão da planta de um gene walldof sob o controle, por exemplo, de um álamo promotor específico para o xilema, resulta em plantas que expõem um aumento dramático em deposição na parede secundária e biomassa aumentada.

Embora os inventores não estejam ligados a nenhuma determinada teoria, entende-se que a WALLDOF funciona como um comutador

10/48 transcricional para o programa de desenvolvimento da deposição na parede secundária. Consequentemente, a presente invenção se refere à metodologia e a construtos de DNA para modular o nível de WALLDOF ou um outro, fator de transcrição relacionado em uma planta, o constituinte genético do qual reflete uma introdução, preferivelmente infragenômica, de um segmento de DNA que codifica tal fator de transcrição, por meio disso aumentando a deposição na parede celular e/ou a densidade de biomassa da planta.

Neste sentido, o termo expressão denota a produção de um produto que é ou isto está relacionado a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de um segmento de DNA (produto genético). A sobre-expressão se refere à produção em um organismo transgênico de um produto genético a um nível que excede o nível de produção daquele produto em um organismo normal (não transgênico). Neste sentido, a sobre-expressão não necessita da expressão endógena do produto genético no organismo não transgênico. Por exemplo, a sobre-expressão pode ocorrer por de repressão de um gene ou repressão de um fator inibitório.

Por isso, cada um pode falar da sobre-expressão como um meio para modular a expressão de um DNA que codifica para WALLDOF ou um fator de transcrição relacionado (ver a discussão adicional abaixo). Como uma função do contexto, modulando ou modulam também pode mandar desenhar uma conotação do uso comum na biologia molecular de proteínas reguladoras; isto é, diz-se que a ligação por uma proteína reguladora de promotores de genes que estão relacionados funcionalmente a um processo biológico, tal como deposição na parede celular, module aqueles genes aumentando ou reduzindo os seus respectivos níveis de expressão. Consequentemente, na sobre-expressão de WALLDOF na planta, seria esperado por modular genes-chave controlando a deposição na parede celular e a densidade da biomassa, de tal modo que os seus níveis de expressão seriam aumentados ou reduzidos.

Para objetivos atuais, a classe de fatores de transcrição convenientes acomoda substituições, adições, e eliminações em relação à SEQ ID N°: 2 que não alteram a função reguladora que caracteriza a classe. Uma

11/48 ilustração de tais modificações são aquelas mostradas na figura 5B presente, discutida abaixo.

Justamente por isso, é compreendida uma classe de DNAs, que codificam para tal fator de transcrição, que pode ser identificado e funcionalmente anotado pela comparação de sequência, segundo algum de diversos algoritmos disponíveis para agrupar sequências genéticas com base em critérios de alinhamento ou aglomeração, como ilustrado por Yang et al. (2006), infra. Assim, a presente divulgação abrange ortólogos e parálogos de um gene compreendido da sequência de nucleotídeo enunciada na SEQ ID N°: 1, bem como outros DNAs que codificam para uma sequência de proteína que está funcionalmente relacionada, como descrito acima, à sequência de aminoácido enunciada na SEQ ID N°: 2.

Um indivíduo informado em biologia molecular de planta também pode identificar tais DNAs via a metodologia convencional que envolve a avaliação de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas com sondas de hibridização convenientes. Particularmente, as sequências de parálogo e ortólogo podem ser isoladas com a ajuda de oligonucleotídeos (degenerados) e métodos baseados em PCR exemplificados, por exemplo, por PCR - THE BASICS (Taylor & Francis, 2006); 2^a edição; PCR PROTOCOLS - METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Humana Press, 2003); REAL TIME PCR (Bios ADVANCED METHODS) 1^a edição (Taylor & Francis, 2006).

Consequentemente, a frase sequência wa//do/DNA denota uma molécula de ácido nucléico com uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estritas com a sequência enunciada na SEQ ID N°: 1 e isto codifica um fator de transcrição que pertence à classe funcional, descrita acima, inclusivamente de qualquer proteína compreendendo as sequências de aminoácido enunciadas em SEQ ID N°: 2. (A italicização na presente descrição denota um gene, e capitalização um produto codificado.) A categoria de sequências wa/Wo/DNA também inclui sequências com pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 60%, especialmente preferivelmente pelo menos 80% e particularmente preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou identidade de 99% com a sequência de

12/48 nucleotídeo mostrada em SEQ ID N°: 1. A determinação da identidade de percentagem neste sentido é discutida no maior detalhe abaixo.

Em uma modalidade, um construto inventivo compreende uma sequência walldofDNA operavelmente ligada a um promotor preferido ao tecido, que pode ser mas não é limitado a um vascular - promotor preferido, promotor preferido do xilema, promotor preferido ao ramo, tronco - promotor preferido, um promotor preferido à madeira, um promotor preferido ao talo, e uma parênquima promotor preferido à célula. Ilustrativo de promotores convenientes neste sentido é o conjunto do promotor preferido do xilema divulgado no pedido de PCT publicado WO 2005/096805, que é incorporado aqui pela referência. Alternativamente, o construto de DNA da invenção compreende uma sequência wa//cfc> (DNA operavelmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor específico para tecido ou órgão, um promotor preferido para tecido ou órgão, ou qualquer outro promotor conveniente.

Consequentemente, apropriadamente o material de planta de regenerável, tal como calo, é transformado com um construto de DNA como descrito acima, e do material de planta transformado uma planta é obtida da maneira convencional, como uma eleição prévia transformante ou progênie da mesma, na qual o nível do fator de transcrição da planta é aumentado. Por conseguinte, a planta expõe um aumento de deposição na parede celular e na densidade de biomassa, em relação uma planta na qual o nível do fator de transcrição não é aumentado pela metodologia de engenharia genética divulgada aqui.

Como discutido acima, assim, em uma modalidade é desejável fornecer uma planta transformada com um construto de DNA representado, com objetivo ilustrativo, na figura 6. Por exemplo, uma planta transformada da invenção, possuindo incorporado no seu genoma o construto de DNA descrito acima, expressa um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido enunciada na SEQ ID N°: 2 em altos níveis, resultando em deposição aumentada na parede celular e/ou densidade aumentada de biomassa, em relação um estado não transformado (isto é, comparando com

13/48 uma planta não transformada do mesmo tipo ou variedade).

De acordo com outras modalidades, a modulação da expressão de uma sequência wa//do/DNA em uma planta causa um aumento na área da parede por célula e na percentagem da área da parede sobre a área de célula total. Como área da parede por célula e a percentagem da área da parede sobre a área de célula total é positivamente correlacionada com a densidade da biomassa, tal modulação resulta na densidade de biomassa aumentada.

Segundo certos aspectos, a modulação da expressão de uma sequência wa//do/DNA em uma célula de planta, tais como uma célula de planta angiosperma ou gimnosperma xylary tracheid, aumenta a deposição na parede celular, como visualizado e medido pelas análises padrão histoquímica, química e física. Por exemplo, ver A GUIDE TO WOOD MICROTOMY: MAKING QUALITY MiCROSLiDES OF WOOD SECTIONS, 1° editor, Ives, editor. Ives, Suffolk, 2001; PLANT MICROTECHNIQUE AND MICROSCOPY, Ruzin, editor universidade de Oxford Press, Nova Iorque, 1999; CHARACTERIZATION OF LIGNOCELLULOSIC MATERIALS, Hu, editor Blackwell Publishing, 2008; PREPARATION OF WOOD FOR CHEMICAL ANALYSIS, Tappi T 264 cm-97, Tappi Press, Atlanta, 1997.

Mais geralmente, a metodologia e os construtos descritos aqui podem ser implementados para aumentar a densidade de biomassa em uma ampla faixa de variedade de plantas, tal como mas não limitada ao eucalipto ssp, álamo ssp, coníferas, salgueiro, cana-de-açúcar, sorgo, trigo, milho, algodão, feijão-soja, alfafa, verduras (incluindo mas não limitados a brócolis, couve-flor, repolho, rabanete, repolho chinês, cebola, cenoura, pepino, pimentão, tomate, berinjela, abobrinha, cabaças, abóbora, quiabo, espinafre, feijão seco, ervilha, alho-porro, alface, funcho, feijão de jardim, beterrabas de açúcar, etc.), melões, melancias, canola (colza), arroz, cevada, amendoim, ervilha de pombo, painço, uva, bagas (incluindo mas não limitado a mirtilo, amora-preta, framboesa, amora, oxicoco, amora, etc.). Frutos de árvores (incluindo mas não limitado a ameixa, pêssego, nectarina, damasco, quiwi, romã, manga, figo, laranja, limão, visco, laranja vermelha, toranja, maçã,

14/48 banana, e assim por diante), árvores produtoras de castanhas (coco, noz (inglesa e preto), nogueira-pecã, amêndoa, avelã, castanha do Pará, noz de nogueira norte-americana, bolota), plantas de produção oleaginosas (incluindo mas não limitado a girassol, colza, etc.) grama de Sudão, Miscanthus, switchgrass, grama de elefante, e grama de fonte, entre outros.

Usando as metodologias e construtos divulgados aqui, uma planta pode ser geneticamente projetada para aumentar a biomassa para várias aplicações e indústrias, incluindo, mas não limitada a polpa e indústria de papel, silvicultura geral, matéria-prima de biomassa, biomateriais de bioenergia, cereais, bebidas, confeitarias, açúcar e adoçantes; fibras; tinturas; tanino; pinturas; resinas; látices, hidrogéis, pinturas, óleos, ceras, perfumes, florais e ornamentais, coloração de alimentos, temperos, ervas medicinais, produtos farmacêuticos, nutracêuticos, bambu, cortiça, e madeira.

Assim, dependendo da planta e a determinada biomassa necessária para uma dada aplicação ou indústria, uma planta com biomassa aumentada ou densidade de biomassa aumentada pode expor um ou vários dos seguintes fenótipos não restritivos, altura aumentada; peso, tamanho ou números de folhas; comprimento e espessura de tiras; comprimento, espessura e ramificação de raízes; produção de semente por planta; florescência; números e tamanhos de células nos tecidos, incluindo tecidos que formam a madeira; e desenvolvimento de órgãos reprodutores da planta.

Todos os termos técnicos na presente descrição são de uso comum em bioquímica, biologia molecular ou agricultura e têm a sua significação convencional, a menos que seja indicado de outra maneira. Tal significação é relembrada, por exemplo, em; MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3^a edição, volume 1-3, editores Sambrook e Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, editores Ausubel et al, Greene Publishing Associates and Wiley-InterSc/ênce, Nova Iorque, 1988 (com atualizações periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5^a edição, volumes 1-2, editores Ausubel et ai,

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John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-2, editores Green et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1997.

As metodologias que envolvem técnicas de biologia de planta são descritas aqui e também são descritas detalhadamente em tratados, tais como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, editores Maliga et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1995. Várias técnicas que usam PCR são descritas, por exemplo, em Innis et al, PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, São Diego, 1990 Dieffenbach e Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2003. Os pares de iniciadores de PCR podem ser derivados de sequências conhecidas por técnicas conhecidas, tais como programas de computador com uso destinado a esse objetivo, por exemplo, Primer, Versão 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Massachusetts. Os métodos da síntese química de ácidos nucleicos são discutidos, por exemplo, em Beaucage e Caruthers, Tetra. Lett. 22: 1859-62 (1981), e Matteucci e Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981).

As digestões das enzimas de restrição, as fosforilações, as ligações e as transformações foram feitas como descrito em Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^a edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. A menos que de outra maneira não especificada,todos os reagentes e os materiais usados para o crescimento e a manutenção de células bacterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wisconsin), DIFCO Laboratories (Detroit, Michigan), Invitrogen (Gaithersburg, Maryland), ou Sigma Chemical Company (Sant Louis, Missouri).

Os termos codificando e codificação referem-se ao processo pelo qual um gene, através dos mecanismos de transcrição e tradução, fornece a informação a uma célula da qual uma série de aminoácidos pode ser montada em uma sequência de aminoácido específica para produzir uma

16/48 proteína ativa. Por causa da degeneração do código genético, certas modificações baseadas na sequência de DNA não modificam a sequência de aminoácido de uma proteína. Consequentemente, a presente divulgação abrange qualquer modificação a uma sequência de nucleotídeo que não afete substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína codificada.

O termo alinhamento se refere aqui a diversos nucleotídeo ou sequências de aminoácido alinhadas pela comparação longitudinal para que os componentes, isto é, bases de nucleotídeo ou resíduos de aminoácidos, em comum (idênticos), semelhantes e/ou diferentes possam ser prontamente e graficamente identificados. Adicionalmente, o termo alinhamento inclui alinhamentos globais e locais entre quaisquer duas ou mais sequências. Entre outras aplicações, alinhamento pode ser usado para determinar os números de componentes em comum (idênticos) e por isso a identidade entre dois ou mais nucleotídeo ou sequências de peptídeo. O alinhamento também pode ser usado para determinar os números de componentes semelhantes e por isso similaridade entre dois ou mais nucleotídeo ou sequências de peptídeo. Assim, o alinhamento pode ser usado para determinar a homologia entre sequências e identificar domínios conservados e relacionados dentro desses domínios. Alinhamentos de sequência e grande número de identidade de percentagem de sequência e/ou similaridade podem ser determinados pelo uso de programas de computador conhecidos na técnica, tais como GCG Wisconsin versão 10.3 Package, disponível pela Accelrys Inc, 9685 Scranton Road, São Diego, Califórnia 92121-3752 EUA, ou EmbossWin versão 2.10.0 (usando o programa agulha). Alternativamente, a similaridade percentual ou identidade pode ser determinada procurando contra bancos de dados, usando algoritmos, tais como FASTA, BLAST, entre qualquer outro.

Os termos identidade e similaridade, bem como idêntico e semelhante, respectivamente, podem ser determinados pelo alinhamento de pelo menos dois peptídeos ou duas sequências de nucleotídeo, via um global e/ou um algoritmo de alinhamento local. Os valores de identidade são os números ou os valores de porcento das posições que, após alinhamento

17/48 com pelo menos uma das sequências fornecidas aqui, têm exataménte os mesmos nucleotídeos ou aminoácidos nas mesmas posições em uma sequência dada. Os valores de similaridade são os números ou os valores de porcento das posições que, após alinhamento com pelo menos uma das sequências fornecidas aqui, têm nucleotídeos semelhantes ou aminoácidos nas mesmas posições em uma sequência dada. Por isso, entende-se que os aminoácidos semelhantes são aqueles com as propriedades semelhantes, que inclui mas não é limitado a aminoácidos acidíferos, aminoácidos básicos, aminoácidos aromáticos, aminoácidos de alifático, aminoácidos polares e aminoácidos não polares, entre outras propriedades. Também, por isso, se entende que os nucleotídeos idênticos ou os aminoácidos se consideram semelhantes, também. Assim, as sequências podem ser referidas como substancialmente idênticas ou essencialmente semelhante quando eles compartilham pelo menos 90% e 70% da identidade de sequência sobre o seu comprimento inteiro, respectivamente.

O termo homologia, como usado na presente descrição, se refere à similaridade de sequência entre uma sequência de referência fornecida aqui e pelo menos um fragmento de uma inserção de clone recentemente sequenciada ou a sua sequência de aminoácido codificada. As sequências que são homólogas, isto é, que compartilham a similaridade de sequência significativa, a qualquer sequência (s) divulgada aqui também são contempladas. Além disso, as sequências que são homólogas àqueles divulgados aqui podem ser derivadas de qualquer planta da escolha, incluindo monocotilédones e dicotilédones, e particularmente espécies de planta agricolamente importantes. Vários métodos diferentes são conhecidos por identificar e definir estas sequências funcionalmente homólogas, que podem ser classificadas como ortólogos e parálogos, respectivamente. Os ortólogos são genes, em espécies diferentes, que têm uma sequência semelhante e função semelhante e isto é derivado via um evento de especiação. Já que as plantas têm ancestrais comuns, muitos genes em qualquer espécie de planta terão um gene ortólogo correspondente em outras espécies de planta. Uma vez que uma sequência ortóloga foi identificada, a função do ortólogo pode

18/48 ser deduzida da função identificada da sequência de referência. Os parálogos são genes estruturalmente relacionados dentro de uma espécie única e são derivados por um evento de duplicação, pelo qual as respectivas proteínas codificadas podem conservar funções semelhantes. Para objetivos atuais, um parálogo conveniente de um gene compreendido da sequência de nucleotídeo enunciada na SEQ ID N°: 1 deve codificar para uma proteína com a atividade reguladora transcricional comparável.

Pela frase molécula de ácido nucleico isolada tem o significado de uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, as moléculas de DNA recombinante contidas em um construto de DNA são consideradas isoladas com os objetivos da presente invenção. Os exemplos adicionais de moléculas de DNA isoladas incluem as moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA que são purificadas, parcialmente ou substancialmente, na solução. As moléculas de RNA isoladas incluem in vitro as cópias de RNA das moléculas de DNA da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico isoladas também incluem tais moléculas produzidas sinteticamente.

A frase ácido nucleico heterólogo se refere a um ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi introduzido em uma célula (ou o antepassado da célula). Tal ácido nucleico heterólogo pode compreender segmentos que são uma cópia de uma sequência que é naturalmente encontrada na célula na qual foi introduzido, ou fragmentos do mesmo.

A presente divulgação fornece metodologia e construtos para aumento de deposição sobre a parede celular e densidade de biomassa de planta. Como um exemplo não restritivo, de aumento de deposição sobre a parede celular e densidade de madeira no álamo é fornecido. A madeira é essencialmente uma matriz de paredes de célula e espaços aéreos celulares do xilema secundário. Megraw, WOOD QUALITY FACTORS IN LOBLOLLY PINE (Tappi Press, 1985), página 88. Neste sentido, a densidade de madeira é determinada pela espessura da parede celular, a área de seção reta do lúmen dos vasos, e o número dos vasos envolvidos no transporte de água

19/48 através do tronco. Roderick e Baga, New Phytoi. 149: 473 (2001); Preston et al, New Phytologisi 170: 807-18 (2006). Foi mostrado no Eucalipto e outras espécies angiospermas que a densidade de madeira negativamente correlaciona com a condutividade hidráulica e a área de seção reta dos vasos. Thomasa et al, Forest Ecology and Management 193: 157-65 (2004); Preston et al, New Phytologist, 170: 807-18 (2006). Outros exemplos não restritivos incluem o aumento de deposição sobre a parede celular e/ou a biomassa em várias plantas, tais como feijão-soja, milho, trigo, canola, algodão, soja, canola, alfafa, cana-de-açúcar, e arroz, para uma variedade de aplicações incluindo, mas não limitados a cereais; bebidas; confeitarias; açúcar e adoçantes; forragem; fibras; tinturas; tanino; pinturas; resinas; látices; hidrogéis; pinturas; óleos; ceras; perfumes; floral e ornamental; corantes alimentícios; temperos; ervas; medicinal; produtos farmacêuticos; e nutracêuticos. Nucleotídeo e Sequências de Polipeptídeo.

As sequências de WalldofDNA são ilustradas por mas não limitadas à sequência enunciada na SEQ ID N°: 1, bem como por moléculas de ácido nucléico compreendendo variantes da SEQ ID N°: 1, com uma ou várias bases eliminadas, substituídas, inseridas, ou acrescentadas, cujas variantes codificam para polipeptídeos caracterizados pela atividade WALLDOF, como descrito acima.

Uma variante é um nucleotídeo ou sequência de aminoácido que se desvia do padrão, ou dado, nucleotídeo ou sequência de aminoácido de um determinado gene ou proteína. Os termos isoforma, isotipo, e análogo também se referem a formas de variantes de um nucleotídeo ou uma sequência de aminoácido. Uma sequência de aminoácido que é alterada pela adição, remoção, ou substituição de um ou vários aminoácidos, ou uma modificação na sequência de nucleotídeo pode ser considerada uma sequência de variantes. A variante pode ter modificações conservativas, em que um aminoácido substituído tem as propriedades estruturais ou químicas semelhantes, por exemplo, a substituição da leucina com a isoleucina. Uma variante pode ter modificações não conservativas, por exemplo, a substituição de uma glicina com um triptofano. As variações menores análo20/48 gas também podem incluir eliminações ou inserções de aminoácido, ou ambos. A orientação na determinação que os resíduos de aminoácido podem ser substituídos, inseridos, ou eliminados pode ser encontrada no uso de programas de computador bem conhecidos, tais como Vetor Suite da NTI (InforMax, Maryland). A variante também pode referir-se a um gene misto como descrito, por exemplo, em várias Patentes destinadas à Maxygen, Inc (Redwood City, Califórnia), tal como as Patentes U.S. N°s 6.251.674 e 6.500.639. Consequentemente, uma variante pode ser projetada de variantes de sequências de polinucleotídeos desejados que são modificados de acordo com os métodos e a base lógica divulgada na Patente U.S. N° 6.132.970, que é incorporada aqui pela referência.

As sequências de polipeptídeo WALLDOF exemplares incluem, mas não estão limitadas à sequência enunciada na SEQ ID N°: 2, bem como sequências de polipeptídeo possuindo um ou vários aminoácidos substituídos, eliminados, inseridos, ou acrescentados ainda retendo a atividade de WALLDOF. As sequências de WALLDOF incluem sequências de polipeptídeo possuindo pelo menos um motivo de consenso de aminoácido, preferivelmente pelo menos dois motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos três motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos quatro motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos cinco motivos de consenso de aminoácido, bem mais preferivelmente pelo menos seis motivos de consenso de aminoácido e bem mais preferivelmente os sete motivos de consenso de aminoácido como descrito na figura 5. A presente divulgação também abrange domínios conservados de um ou vários WALLDOF formados por pelo menos um motivo de consenso de aminoácido, preferivelmente pelo menos dois motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos três motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos quatro motivos de consenso de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos cinco motivos de consenso de aminoácido, bem mais preferivelmente pelo menos seis motivos de consenso de aminoácido e bem mais preferivelmente os sete motivos de consenso de aminoácido como descrito na figura 5.

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Adicionalmente, múltiplas formas de WALLDOF podem existir, que pode ser devido à modificação pós-translacional de um produto genético, ou a múltiplas formas dos respectivos genes walldof. As sequências que têm tais modificações e aquele código de um fator de transcrição WALLDOF também estão incluídas.

Na presente descrição, um domínio conservado ou região conservada é uma região que é altamente conservada entre certo polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeo, isto é, onde há um grau relativamente alto da similaridade de sequência entre as sequências distintas. Também, estes termos se referem a domínios de sequências de polipeptídeo, que são codificadas por sequências de polinucleotídeo, que formam estruturas tridimensionais e unidades funcionais relativamente conservadas ao longo da evolução. As frases domínio conservado ou região conservada também abrangem unidades compactas, locais, e semiautônomas, muitas vezes estáveis e independentemente dobradas, formadas pelas embalagens de motivos de consenso de aminoácido codificados por sequências de polinucleotídeo.

A frase motivo de consenso de aminoácido se refere à porção ou à subsequência de uma sequência de polipeptídeo que é substancialmente conservada entre polipeptídeos.

Análise de Sequência

Incluído na categoria de sequências de variantes são sequências que hibridizam a uma referência vva//do/DNA na sequência. Para objetivos atuais, duas sequências hibridizam quando elas formam um complexo de fita dupla em uma solução de hibridização de 6X SSC, SDS de 0,5%, 5X de solução de Denhardt e 100pg de transportador de DNA não específico. Ver Ausubel et al., supra, na seção 2.9, suplemento 27 (1994). As sequências podem hibridizar em severidade moderada, que é definido como uma temperatura de 60°C em uma solução de hibridização de 6X SSC, SDS de 0,5%, 5X a solução de Denhardt e 100pg de transportador não específico DNA. Para a hibridização de alta severidade, a temperatura é aumentada a 68°C. Depois da reação de hibridização de severidade moderada, os núcleo22/48 tídeos são lavados em uma solução de 2X SSC mais SDS de 0,05% de cinco vezes na temperatura ambiente, com subsequente lavagem com 0,1 X SSC mais SDS de 0,1% a 60°C durante 1 hora. Para a alta severidade, a temperatura de lavagem é aumentada a 68°C. Uma pessoa normalmente versada na técnica pode selecionar prontamente tais condições variando a temperatura durante a reação de hibridização e o processo de lavagem, a concentração de sal durante a reação de hibridização e o processo de lavagem, e assim por diante. Para objetivos atuais, os nucleotídeos hibridizados são aqueles que são detectados usando 1 ng de uma sonda radiomarcada possuindo uma radioatividade específica de 10.000 cpm/ng, onde os nucleotídeos hibridizados estão claramente visíveis seguindo exposição ao filme de raio x em -70°C durante não mais do que 72 horas.

A presente divulgação abarca tais moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas a uma sequência de ácido nucléico descrita em SEQ ID N°: 1. Preferido são moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à sequência de ácido nucléico mostrada em SEQ ID N°: 1. As diferenças entre duas sequências de ácido nucléico podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de nucleotídeo de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, entremeadas individualmente entre nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou vários grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Como uma matéria prática, afirmando se alguma determinada molécula de ácido nucléico é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo de referência implica uma comparação feita entre duas moléculas, o uso de algoritmos conhecidos na técnica e pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador publicamente disponíveis, tais como o algoritmo BLASTN. Ver Altschul et aí., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).

Construtos de Ácido Nucléico

Em um aspecto, a sequência enunciada na SEQ ID N°: 1 é in23/48 corporada em um construto de ácido nucléico que é conveniente para a introdução em uma planta ou uma célula. Assim, tal construto de ácido nucléico pode ser usado para modular a expressão genética walldof em uma célula de planta ou planta. A modulação walldof da expressão genética em uma célula de planta ou planta é atingida incorporando-se um promotor no construto de ácido nucléico, tal como aqueles descritos no pedido de PCT WO 2005/096805, incorporado acima, que efetuam uma expressão preferida ao tecido. Outro tecido - os promotores preferidos ou constitutivos podem estar integrados em um construto de DNA.

A deposição na parede celular e a densidade de biomassa de planta podem ser modificadas introduzindo um construto de ácido nucléico como descrito aqui. Também fornecidas são células de planta contendo tais construtos; o derivado de plantas de possuindo a expressão genética walldof modificada e a progênie de tais plantas.

Como uma fonte da sequência de ácido nucléico que codifica WALLDOF, um cDNA conveniente ou DNA genômico ou o polinucleotídeo sintético pode ser usado. Os métodos do isolamento de sequências walldofBNA convenientes são descritos, supra. A codificação de sequências do total, ou substancialmente total, do fator de transcrição assim pode ser obtida. Os comprimentos convenientes desta sequência de DNA podem ser desligados para o uso por meio de enzimas de restrição. Ao uso de DNA genômico como a fonte de uma sequência baseada parcial da transcrição, é possível uso de regiões de íntron ou éxon ou uma combinação de ambos.

Para obter construtos convenientes para modificar a expressão do gene walldof em células de planta, a sequência de cDNA como encontrado no fator de transcrição de cDNA ou a sequência genética como encontrado no cromossomo da planta pode ser usada. Os construtos de ácido nucleico recombinante podem ser feitos com o uso de técnicas padrão. Por exemplo, a sequência de ácido nucléico para transcrição pode ser obtida tratando um vetor contendo a dita sequência com enzimas de restrição para recortar o segmento apropriado. A sequência de ácido nucléico da transcrição também pode ser gerada recozendo e ligando oligonucleotídeos sintéti24/48 cos ou ao uso de oligonucleotídeos sintéticos em uma reação de cadeia de polimerase (PCR) para dar sítios de restrição convenientes em cada extremidade. A sequência de ácido nucléico então é clonada em um vetor contendo elementos reguladores convenientes, tal como promotor a montante e sequências de terminador a jusante.

Um aspecto importante da presente divulgação é o uso de construtos de ácido nucléico em que uma sequência de codificação WALLDOF é operavelmente ligada a uma ou várias sequências reguladoras, que dirigem a expressão da sequência de codificação WALLDOF em certos tipos de célula, órgãos, ou tecidos sem afetar indevidamente o desenvolvimento normal ou a fisiologia de planta.

O promotor conota uma região de DNA a montante da partida da transcrição que é envolta no reconhecimento e de ligação da polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor constitutivo é aquele que é ativo em todas as partes da vida da planta e sob a maior parte de condições ambientais. Específico para o tecido, preferido ao tecido, específico para o órgão, preferido ao órgão, específico ao tipo de célula, e promotores induzíveis constituem a classe de não promotores constitutivos. Operavelmente ligado se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, onde a sequência de promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Em geral, operavelmente ligado significa que as sequências de ácido nucléico que são ligadas são contíguas.

Promotores úteis para a expressão de uma sequência de ácido nucléico introduzida em uma célula para aumentar a expressão do gene waiIdof podem ser constitutivos, tais como o vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) promotor 35S, ou específico para o tecido, preferido ao tecido, específico para o órgão, preferido ao órgão, específico ao tipo de célula, promotores induzíveis, ou qualquer outro promotor (s) conveniente. Por exemplo, ao uso de promotores específicos para o sistema, específicos para o xilema, ou preferidos ao xilema vasculares, cada um pode modificar a atividade WALLDOF especificamente em muitos tecidos, tais como tecidos vas25/48 culares, especialmente xilema. O uso de um promotor constitutivo em geral afeta níveis de enzima e funções em todas as partes da planta, enquanto o uso de um promotor preferido ao tecido permite visar da expressão genética modificada a partes de planta específicas, levando a uns fenótipos mais controláveis.

Assim, ele pode ser encontrado conveniente para usar um promotor que dirige a expressão durante a biogênese da parede celular, pelo qual o fator de transcrição WALLDOF só seria modulado no órgão (s) ou tecido (s) ou tipo (s) de célula nos quais a sua ação é necessária. Como uso aqui, O promotor preferido do xilema subentende que as moléculas de ácido nucleico divulgadas aqui são mais ativas no xilema do que em qualquer outro tecido de planta. Os promotores preferidos ao xilema que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, o cumarato-4-hidroxilase prferido ao xilema (C4H) promotor genético, a tubulina preferida ao xilema (TUB) promotor genético, e a proteína de transferência de lipídio preferida ao xilema (LTP) promotor genético. Outros promotores preferidos ao xilema convenientes são divulgados na WO 2005/096805, supra.

Um construto também pode conter sequências de terminação, que são posicionadas a jusante das moléculas de ácido nucleico divulgadas aqui, de tal modo que a transcrição de mRNA é terminada, e sequências de po!i-A acrescentadas. Um exemplo de tais terminadores são o vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) 35S terminador e o gene de sintetase de nopalina (TNOS) terminador. O construto também pode conter melhoradores, códons de iniciação, entrançando sequências de sinal, e visando sequências.

Um construto pode conter opcionalmente um marcador de seleção pelo qual as células transformadas podem ser identificadas na cultura. O marcador pode ser associado com a molécula de ácido nucleico heteróloga, isto é, o operavelmente genético ligado a um promotor. Como usado aqui, o termo marcador se refere a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a avaliação para, uma planta ou célula contendo o marcador. Em plantas, por exemplo, o gene de marcador pode codificar a resistência de herbicida ou o antibiótico. Isto permite a seleção de células

26/48 transformadas entre células que não são transformadas ou transfectadas.

Os exemplos de marcadores selecionáveis convenientes incluem sem restrição o desaminase de adenosina, o redutase de di-hidrofolato, higromicina-p-fosfotransferase, o quinase de timidina, o fosforribosil transferase de xantina-guanina, o glifosato e a resistência de glifosinato, e o glicosídeo da amina 3’-O-fosfotranserase (canamicina, neomicina e resistência G418). Estes marcadores podem incluir a resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, e gentamicina. O construto também pode conter a Barra genética de marcador selecionável, que confere a resistência a análogos de fosfinotricina de herbicida como glifosinato de amônio. Thompson et al, EMBOJ. 9: 2519-23 (1987). Outros marcadores de seleção convenientes são conhecidos também.

Os marcadores visíveis, tais como proteína florescente verde (GFP) podem ser usados. Os métodos para identificar ou selecionar plantas transformadas baseadas no controle da divisão de célula também foram descritos. Ver WO 2000/052168 e WO 2001/059086.

As sequências de réplica, de origem bacteriana ou viral, também podem ser incluídas para permitir ao construto ser clonado em um hospedeiro bacteriano ou hospedeiro de fago. Preferivelmente, uma ampla faixa de variação de hospedeiro de origem procariótica para réplica é usada. Um marcador selecionável de bactérias pode ser incluído para permitir a seleção de células bacterianas que carregam o construto desejado. Os marcadores selecionáveis procarióticos convenientes também incluem a resistência a antibióticos, tais como canamicina ou tetraciclina.

Outras sequências de ácido nucléico que codificam funções adicionais também podem estar presentes no construto, como é conhecido na técnica. Por exemplo, quando Agrobacteríum é o hospedeiro, sequências de T-DNA podem ser incluídas para facilitar a transferência subsequente para a incorporação em cromossomos de planta.

Plantas de Engenharia Genética

A presente divulgação implica a manipulação genética de plantas de aumento de deposição sobre a parede celular e/ou densidade de bi27/48 omassa, via a modulação uma sequência de polinucleotídeo que codifica WALLDOF.

Neste sentido as plantas incluem sem restrição o Eucalipto ssp, Álamo ssp, coníferas, salgueiro, cana-de-açúcar, sorgo, trigo, milho, algodão, feijão-soja, alfafa, verduras (incluindo mas não limitadas a brócolis, couve-flor, repolho, rabanete, repolho chinês, cebola, cenoura, pepino, pimentão, tomate, berinjela, abobrinha, cabaços, abóbora, quiabo, espinafre, feijão seco, ervilha, alho-porro, alface, funcho, feijão de jardim, beterrabas de açúcar, etc.), melões, melancias, canola (colza), arroz, cevada, amendoim, ervilha de pombo, painço, uva, bagas (incluindo mas não limitadas a azul, preto, framboesa, amora, oxicoco, amora, etc.). Frutos de árvores (incluindo mas não limitado a ameixa, pêssego, nectarina, damasco, quiwi, romã, manga, figo, laranja, limão, visco, laranja vermelha, toranja, maçã, banana, e assim por diante), árvores de castanhas (coco, noz (inglês e preto), nogueirapecã, amêndoa, avelã, castanha do Pará, noz de nogueira norte-americana, bolota), plantas de produção oleaginosas (incluindo mas não limitado a girassol, colza, etc.) grama de Sudão, Miscanthus, switchgrass, grama de elefante, e grama de fonte, entre outros. Contudo, a lista não é sob nenhum modo limitante, já que outros tipos de plantas serão conhecidos àqueles versados na técnica e podem ser usados para aumentar a deposição de célula e a biomassa.

A presente invenção é determinada como sendo útil para projetar plantas de várias indústrias e aplicações incluindo mas não limitado a para a polpa e indústria de papel e a indústria de bioenergia, silvicultura geral, matéria - prima de biomassa, biomateriais de bioenergia, cereais, bebidas, confeitarias, açúcar e adoçantes; fibras; tinturas; tanino; pinturas; resinas; látices, hidrogéis, pinturas, óleos, ceras, perfumes, florais e ornamentais, corantes alimentícios, temperos, ervas, medicinais, produtos farmacêuticos, nutracêuticos, bambu, cortiça, e madeira.

Geneticamente a manipulação abrange qualquer metodologia para introduzir um ácido nucléico em um organismo hospedeiro ou de outra maneira modificar a expressão genética do organismo. Por exemplo, uma

28/48 planta é geneticamente modificada quando é transformada com uma sequência de polinucleotídeo que aumenta a expressão de um gene, tal como walldof, e por meio disso aumenta a deposição na parede celular e a densidade de biomassa. Ao contrário uma planta que não é transformada com uma sequência de polinucleotídeo é uma planta de controle e menciona-se como uma planta não transformada.

Em certas modalidades, as plantas geneticamente modificadas são selecionadas que têm o construto de DNA que incorpora o gene walldof em seu genoma. Como um exemplo, uma planta de álamo transgênica assim transformada é distinguida de uma planta de álamo não transformada pelo fato que elas compreendem pelo menos uma cópia do conjunto de molécula de ácido nucléico para em SEQ ID N°: 1 de maneira estável integrado no seu genoma além de cópias de tal molécula que ocorrem naturalmente na planta de álamo não transformada.

A planta é um termo que abrange plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo folhas, troncos, raízes, etc.), sementes, células de planta diferenciadas ou não diferenciadas, e progênie da mesma. O material de planta inclui, sem restrição, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calo, folhas, raízes, tiros, troncos, fruto, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. A classe de plantas que podem ser usadas é geralmente tão larga como a classe de plantas mais altas acessíveis a técnicas de engenharia genética, incluindo angiospermas, tanto plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas, bem como gimnospermas. O termo também denota qualquer material de planta de celulósico que pode ser geneticamente manipulado, incluindo mas não limitado a células de planta diferenciadas ou não diferenciadas, protoplastos, plantas inteiras, tecidos de planta, ou órgãos de planta, ou qualquer componente de uma planta, tais como uma folha, tronco, raiz, botão, tubérculo, fruto, rizoma, ou o parecido. Como usado aqui, o propágulo inclui uma estrutura com a capacidade de dar a origem a uma nova planta, por exemplo uma semente, um esporo, ou uma parte do corpo vegetativo capaz de crescimento independente se separado do pai.

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Na presente descrição, o termo bioenergia denota a energia útil, renovável produzida da matéria orgânica, a conversão de carboidratos complexos da matéria orgânica na energia. A matéria orgânica pode ser usada diretamente como um combustível, queimado como deve produzir a eletricidade, processada em líquidos e gases, ou ser um resíduo de processamento e conversão.

O termo biomassa significa qualquer matéria orgânica que está disponível em uma base renovável ou que ocorre, incluindo agrícola (isto é alimento e fibra) colheitas e árvores, madeira e resíduos de madeira, plantas (incluindo plantas aquáticas), gramas e outros materiais de resíduo. A biomassa é geralmente produzida em uma maneira sustentável de água, nutrientes minerais e gás carbônico pela fotossíntese.

Um aumento em biomassa ou densidade de biomassa pode ser visto por um aumento em pelo menos um do incluindo de fenótipo de planta mas não limitado à altura; peso, tamanho ou números de folhas; comprimento e espessura de tiros; comprimento, espessura e ramificação de raízes; produção de semente por planta; florescência; números e tamanhos de células em tecidos, incluindo tecidos que formam a madeira; e desenvolvimento de planta de órgãos reprodutivos.

Métodos Ilustrativos de Modificação Genética

Uma sequência de polinucleotídeo, tal como uma sequência waiIdofDNA, pode ser de maneira estável integrada em um genoma de planta de vários modos conhecidos à técnica. Tanto a angiosperma monocotiledônea como dicotiledônea ou as células de planta de gimnosperma podem ser transformadas. Por exemplo, ver Klein et al, Bíotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al, C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al, Mol. Gen. Genet 204:383-396 (1986); Paszowski et al, EMBO J. 3: 21 \1 - 2122 (1984); Sagi et al, Plant Ceil Rep. 13: 26 15-286 (1994). Espécies de Agrobacterium, tais como A. tumefaciens e A. rhizogenes podem ser usadas, por exemplo, de acordo com Nagel et al, Microbiol LettQ7: 325 (1990). Adicionalmente, plantas podem ser transformadas por Rhizobium, Sinorhizobium ou transformação Mesorhizobium. Broothaerts et al, Nature 433:629-633

30/43 (2005).

Os métodos adicionais para geneticamente modificar uma planta ou célula incluem, mas não são limitados a, eletroporação, bombardeio de arma de partícula (Klein et al. (1987) Nature. 327:70 - 73), precipitação de fosfato de cálcio, e fusão de polietileno glicol, transferência em grãos de pólen germinantes, transformação direta (Lorz et al, Mol. Ginet. 199: 179-182 (1985)), e outros métodos conhecidos à técnica. Se um marcador de seleção, tal como resistência de canamicina, for empregado, ele facilita determinar que células foram com sucesso transformadas. Genes de marcador podem ser incluídos dentro de pares de sítios de recombinação reconhecidos por recombinases específicas tal como antes ou flp para facilitar a remoção do marcador após seleção. Ver o Pedido Publicado dos U.S. N° 2004/0143874.

Com os objetivos desta descrição, uma sequência wa//do/D NA operavelmente ligada a um promotor pode ser apresentada em uma planta ou célula. Por exemplo, um construto ilustrativo pode compreender uma sequência walldof operavelmente ligada a um promotor preferido do xilema. Transformação da Planta

A presente divulgação compreende a manipulação genética de plantas, especialmente as plantas mencionadas supra ou qualquer planta útil para qualquer indústria ou a aplicação descrita supra, para aumentar a deposição na parede celular e/ou a densidade de biomassa.

A frase planta transgênica se refere a uma planta compreendendo uma sequência de ácido nucléico que está presente também por si em outro organismo ou espécies ou isto é otimizado, uso de códon em relação ao hospedeiro, de outro organismo ou espécies. Tanto angíosperma monocotiledônea como dicotiledônea ou células de planta de gimnosperma podem ser transformados de vários modos conhecidos à técnica. Por exemplo, ver Klein et al, Biotechnology 4: 583-90 (1993); Bechtold et al, C. R. Acad. Sei. Paris 316: 1194-99 (1993); Bent et al, Mol. Gen. Genet. 204: 383-96 (1986); Paszowski etal, EMBO J. 3: 2717-22 (1984); Sagi et al, Plant Cell Rep. 13: 262-66 (1994). Espécies de Agrobacterium, tais como A. tumefaciens e A. rhizogenes podem ser usadas de acordo com Nagel et al, Mi31/48 crobiol Lett 67: 325 (1990), por exemplo. Adicionalmente, plantas podem ser transformadas por Rhizobium, Sinorhizobium ou transformação Mesorhizobium. Broothaerts et al, Nature 433: 629-33 (2005). Também, a frase planta transgênica se refere a uma planta que incorporou uma sequência de DNA, incluindo mas não limitado a genes que estão presentes não normalmente em um genoma de planta hospedeira, as sequências de DNA não normalmente transcritas em RNA ou traduzidas para uma proteína (expressado), ou qualquer outro gene ou sequências de DNA que cada um deseja introduzir na planta não transformada, tal como genes que normalmente podem ser apresentados na planta não transformada mas que cada um deseja ao engenheiro geneticamente ou ter alterado a expressão. A categoria de “planta transgênica inclui tanto uma eleição prévia transformante como uma planta que inclui um transformante na sua linhagem, por exemplo, por meio do introgressão padrão ou outro procedimento de procriação.

Por exemplo, Agrobacterium pode ser transformado com um vetor de expressão de planta via a eletroporação, por exemplo, após que o Agrobacterium medeia a introdução do vetor de expressão em umas células de planta. Os métodos adicionais para realizar isto incluem mas não são limitados a eletroporação, bombardeio de arma de partícula, precipitação de fosfato de cálcio, e fusão de polietileno glicol, transferência em grãos de pólen germinantes, transformação direta, Lorz et al, Mol. Genet. 199: 179-82 (1985), e outras técnicas conhecidas. Se um marcador de seleção, tal como resistência de canamicina, for empregado, ele facilita determinar que células foram com sucesso transformadas. Genes de marcador podem ser incluídos dentro de pares de sítios de recombinação reconhecidos por recombinases específicas, tal como antes ou flp, para facilitar a remoção do marcador após seleção. Ver o Pedido Publicado U.S. N° 2004/0143874.

As plantas transgênicas sem genes de marcador podem ser produzidas com o uso de um segundo plasmídio compreendendo um ácido nucleico que codifica o marcador, distinto de um primeiro plasmídio compreendendo uma sequência walldofDNA. Os primeiros e segundos plasmídios ou as porções do mesmo são introduzidos na mesma célula de planta, de tal

32/48 modo que o gene de marcador selecionável que é transitoriamente expressado, as células de planta transformadas são identificadas, e as plantas transformadas são obtidas no qual a sequência Wa//do/DNA está de maneira estável integrada no genoma e o gene de marcador selecionável não está de maneira estável integrado. Ver o Pedido Publicado U.S. N° 2003/0221213. As plantas transgênicas também podem ser produzidas sem marcadores selecionáveis, já que as plantas podem ser analisadas por vários métodos que incluem sem restrição sequenciamento de DNA e PCR.

Os métodos de transformação Agrobacterium discutidos acima são conhecidos por serem úteis para transformar dicotiolédones. Adicionalmente, de La Pena et ai, Nature 325: 274-76 (1987), Rhodes et al, Science 240: 204-07 (1988), e Shimamato et al, Nature 328: 274-76 (1989), documentam uma metodologia para usar Agrobacterium para transformar monocotilédones de cereal. Também, ver Bechtold et al, Methods Mol Biol. 82: 259-66 (1998), ilustrando a transformação Agrobacterium mediada por infiltração a vácuo.

Células de planta podem ser transformadas com um construto de ácido nucléico divulgado aqui sem o uso de um marcador selecionável ou visível e organismos transgênicos podem ser identificados detectando a presença do construto introduzido. A presença de uma proteína, polipeptídeo, ou molécula de ácido nucléico em uma determinada célula pode ser medida para determinar se, por exemplo, uma célula foi com sucesso transformada ou transfectada. Por exemplo, e como rotina na técnica, a presença do construto introduzido pode ser detectada por PCR ou outros métodos convenientes para detectar um ácido nucléico específico ou sequência de polipeptídeo. Adicionalmente, as células transformadas podem ser identificadas reconhecendo diferenças na taxa de crescimento ou uma característica morfológica de uma célula transformada em comparação com a taxa de crescimento ou uma característica morfológica de uma célula não transformada que é cultivada sob condições semelhantes. Ver WO 2004/076625.

Os métodos de regenerar uma planta transgênica de uma célula transformada ou cultura variam de acordo com as espécies de planta, mas

33/48 são baseados na metodologia conhecida. Por exemplo, os métodos para regeneração de plantas Nicotiana e Eucalyptus trangênicas são bem conhecidos.

Seleção e Análise de Plantas Geneticamente Modificadas

As plantas geneticamente modificadas são selecionadas por terem modulado a expressão do gene walldof em relação uma planta não transgênica das mesmas espécies. Adicionalmente, várias modalidades das plantas inventivas geneticamente modificadas podem ter aumentado a deposição na parede celular e a densidade de biomassa. Por exemplo, uma planta transgênica inventiva pode mandar caracterizar um fenótipo por (1) uma deposição na parede celular aumentada como visualizado e medido pela análise de histoquímica (2) uma área da parede alterada e percentagem da área da parede sobre a área de célula total de tal modo que a densidade de biomassa é aumentada porque a área da parede e a percentagem da área da parede são positivamente correlacionadas com a densidade de biomassa.

A frase expressão modulada se refere à modulação do nível do fator de transcrição WALLDOF compreendendo uma sequência de aminoácido enunciada na SEQ ID N°: 2 a níveis de 10 a 50% maior que aquele do polipeptídeo regulador endógeno, preferivelmente de 30 a 80% maior que aquele do polipeptídeo regulador endógeno, bem mais preferivelmente de 50 a 150% maior que aquele do polipeptídeo regulador endógeno, bem mais preferivelmente de 70 a 200% maior que aquele do polipeptídeo regulador endógeno, bem mais preferivelmente de 100 a 300% maior que aquele do polipeptídeo regulador endógeno. As plantas, a célula de planta, e as partes de planta possuindo o cassete de expressão também são fornecidas.

A frase deposição na parede celular, se refere à construção e à biossíntese de uma parede celular de planta através da deposição de moléculas estruturais ou não estruturais. Mais particularmente, as moléculas depositadas para a biossíntese da parede celular compreendem celuloses, hemiceluloses, polissacarídeo péctico, proteínas, lignina, suberinas, cera e cutina, mas não são de nenhum modo limitadas àqueles. A frase deposição

34/48 na parede celular também se refere tanto à síntese da parede celular primária como a secundária em qualquer célula de planta ou tecidos ou órgãos, que inclui mas não é limitado ao xilema, floema, parênquima, meristemas bem como ramos, raiz, tronco, folha, semente, botões de flor, entre quaisquer outros.

A frase deposição na parede celular aumentada se refere a um aumento quantitativo da espessura da parede celular para que a área da parede celular e a percentagem da área da parede sobre a área de célula total possam ser aumentadas de pelo menos 10 a 50% preferivelmente de pelo menos 30 a 80%, bem mais preferivelmente de pelo menos de 50 a 150%, bem mais preferivelmente de pelo menos 70 a 200%, bem mais preferivelmente de pelo menos 100 a 300% da área da parede celular e percentagem da área da parede sobre a área de célula total de uma planta não transformada.

A frase densidade de biomassa aumentada se refere a um aumento quantitativo da densidade de biomassa em relação a uma planta não transformada das mesmas espécies. A densidade de biomassa de uma planta projetada contanto que aqui possam ser aumentados de pelo menos 10 a 50% preferivelmente de pelo menos 30 a 80%, bem mais preferivelmente de pelo menos de 50 a 150%, bem mais preferivelmente forma pelo menos 70 a 200%, bem mais preferivelmente de pelo menos 100 a 300% da densidade de biomassa de uma planta não transformada.

Métodos para Quantificara Deposição na Parede Celular Aumentada

As plantas geneticamente modificadas fornecidas aqui podem ser caracterizadas por uma deposição na parede celular aumentada. Isto é atingido pela modulação da expressão de um gene walldof Modular expressão genética do walldof em uma célula de planta ou planta é atingido incorporando-se em um promotor de um construto de ácido nucléico, tal como aqueles supracitados que mostram um tecido preferido para a expressão. É também uma modalidade para gerar plantas transgênicas expressando uma proteína WALLDOF, preferivelmente sob o controle de promotores diferentes, tais como outros promotores específicos para o tecido ou promotores

35/48 constitutivos. A deposição na parede celular aumentada é atingida expressando uma quantidade conveniente da proteína WALLDOF em um tempo conveniente e localização. Tal ajuste fino pode ser feito determinando o promotor mais apropriado e também selecionando eventos transgênicos que mostram o nível de expressão desejado.

As plantas transformadas expressando os níveis desejados da proteína WALLDOF são selecionadas analisando por exemplo o número de cópia (análise de borrão do Sul), níveis de cópia de mRNA (por exemplo RTPCR que usa pares de iniciadores de sequência wa//óofDNA específicos ou flanqueia iniciadores) ou analisando a presença e o nível de proteínas WALLDOF em vários tecidos (por exemplo, análise por SDS-PAGE; ELISA, etc.). A expressão WALLDOF alta ou moderada de eventos é selecionada para testes adicionais até que um alto desempenho de elite com o construto integrado waHdofDNA seja obtido.

As plantas inteiras, as sementes, as células, os tecidos e a progênie (tais como híbridos de F1, sementes/plantas de F2, etc.) de algumas das plantas transformadas descritas acima são abrangidos aqui e podem ser identificados pela presença do transgene no DNA, como determinado, por exemplo, pelo total de uso de análise de PCR DNA genômico como padrão e uso de pares de iniciadores de PCR. Também os métodos diagnósticos por PCR “específicos ao evento” podem ser desenvolvidos, onde os iniciadores de PCR são baseados na planta DNA que flanqueia o gene quimérico inserido, veja a Patente U.S. N° 6.563.026. Similarmente, as impressões digitais AFLP especificas para o evento ou as impressões digitais RFLP podem ser desenvolvidas o que identifica a planta transgênica ou qualquer planta, semente, tecido ou derivado de células disto.

Entende-se que as plantas transgênicas fornecidas aqui preferivelmente não mostram fenótipos não desejados, tais como redução de rendimento, suscetibilidade melhorada de doenças (especialmente a necrótrofos) ou modificações arquitetônicas indesejadas (pequenhez, deformações) etc. e que, se tais fenótipos forem vistos na eleição prévia transformante, estes podem ser removidos procriando-se e métodos de seleção (cruzando /

36/48 cruzamento reverso / autocruzamento, etc.). Algumas das plantas transgênicas descritas aqui podem ser homozigotas ou hemizigotas para o transgene.

A deposição na parede celular aumentada pode ser determinada pela análise de seções histológicas de materiais biológicos, tais como o xilema de madeira. Em geral a análise é executada no tronco que pode ser uma seção transversal de por exemplo uma espessura de 10 pm, corada com a toluidina azul e observada sob um microscópio com iluminação direta. As medições da área da parede por célula podem ser feitas com o uso do software ImageTools.

Métodos para Quantificar a Densidade de Biomassa Aumentada

O aumento na deposição na parede celular resulta em um aumento da densidade de biomassa aparente. A densidade de biomassa pode ser determinada por qualquer método conveniente. Como um exemplo, é a metodologia de raio x que consiste no corte de discos de tronco com espessura de 1 mm e submeter-se estes discos à difração de raio x. As radiografias obtidas de discos de tronco são varridas e medidas no software de imagem digital usado como descrito, por exemplo, por Mothe et al, Ann. For. Sci, 55: 301-13 (1998).

Os exemplos específicos de métodos para obter plantas transgênicas expressando walldof gene bem como métodos para avaliar o efeito fenotípico do gene são apresentados. Eles estão destinados para serem exempfares e não limitação.

EXEMPLO 1. Identificação de Gene walldof em Álamo

Para desenvolver os métodos e fazer os construtos de DNA da presente invenção primeiramente procura-se fatores de transcrição que são preferidos expressados no xilema de álamo.

A coleta de sobre 400.000 ESTs de Popufus sp. disponível em GenBank foi procurada para o modelo específico para o tecido de genes expressados. Com esta finalidade as bibliotecas de cDNA feitas de tecidos de álamo diferentes, foram agrupadas em tecidos representativos: célula de suspensão, pontão apical, cavaco, ramo, semente, madeira, botão de flor, folha e raiz. Grupo de grupos gerados pelo programa CAP3 (Huang e Ma37/48 dan, Genoma Pes., 9:868-877, 1999) foi procurado para aqueles compostos de pelo menos 90% de leituras EST em bibliotecas que representam ramo de álamo e tecidos de madeira. Adicionalmente, nos grupos foram procurados aqueles compostos de pelo menos três leituras EST em ramo e tecidos de madeira e preferivelmente menos de duas leituras em outras bibliotecas.

Os grupos selecionados então foram alinhados, usando o algoritmo de Blast-X com um recorte no valor de e <= 1e'⁵ (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), para sequências de uma Arabidopsis thaliana curada com fator de transcrição do banco de dados composto das sequências obtidas do Servidor de Informação sobre Regulador Genético da Arabidopsis (AGRIS) banco de dados AtTFDB. Os resultados foram guardados em um banco de dados local dos fatores de transcrição do Populus sp. e pesquisados via uma interface baseada na web para filtrar sequências do fator de transcrição específicas de genes expressados especificamente ou preferivelmente no ramo e/ou nos tecidos de madeira do Populus sp.

Entre um grupo de fatores de transcrição que foram expressados em um ramo e/ou madeira de maneira preferida, um grupo que representa um membro da família do fator de transcrição DOF com uma expressão preferida ao perfil do ramo foi encontrado (figura 1). O EST que representa este fator de transcrição DOF continha 99% de estrutura de leitura aberta a 768bp idênticos à estrutura de leitura aberta de Populus tríchocarpa no modelo estExt_fgenesh4_pg. C_LG_XV0093. Por causa da sua associação com a deposição na parede celular, será denominado WALLDOF (para a parede (wall) associada à proteína de domínio DOF).

EXEMPLO 2. Identificação de Homólogos wa lido fero Álamo e Outras Plantas

De acordo com um estudo de filogenético o WALLDOF é parte de um grupo ou ciado compreendido de Ptr DOF40, Ptr_DOF02, PTR_DOF06, Ptr_D0F15, Ptr_DOF25, 0s02g45200 (NCBI ID: 0s02g0673700), Os04g47990 (NCBI ID: 0s04g0567800), Os02gl5350 (NCBI ID: 0s02g0252400),

AT2G46590, AT3G61850, AT4G24060, AT1G64620, e AT4G00940. Yang et al., Plant Physiol., 142: 820-30 (2006).

Pela análise de similaridade de sequência, determinada via uma

38/48 pesquisa de BLAST, por exemplo, outras sequências de outras plantas são identificadas: duas de genoma de uva (Vitis vinifera - Phtozome/JGI ID GSVIVT00037222001 e GSVIVT00006675001), duas de genoma de soja (Glycine max - anotação de GenBank ID DOF21 - gi|112363396|gb|ABI16022.1 | - e DOF28-gi|112363398|gb|ABI16023.1 |). Dentre outras gramas, dois genes DOF putativos do sorgo (JGI ID Sb04g032040,1 e Sb06g025680.1) são semelhantes a WALLDOF. É possível identificar dois DOFs semelhantes na montagem atual do genoma de milho (Tigr AZM5 - http://maize.tigr.Org/ release5.0/azm5.shtml): O DOF1 vem do contig AZM5 18231 e o DOF2 vem do contig AZM5 4711.

Além de sequência e similaridade de filogenético, os genes walldoZ-similares acima compartilham estruturas de éxon do íntron semelhantes bem como domínios de proteína conservados comuns. A figura 2 mostra as similaridades quanto à estrutura de éxon do íntron (dentro da região de codificação). Os genes walldof semelhantes apresentam uma estrutura composta de dois éxons, exceto Ptr DOF06, Ptr DOF25, AT4G00940, e Os02g15350.

Para analisar motivos putativos relacionados a membros WALLDOF-semelhantes acima, analisa-se o alinhamento de dicotiledôneos e monocotiledôneos separadamente. A figura 3 mostra a similaridade entre dicotiolédones e a figura 4 mostra a similaridade entre monocotilédones. Ambos os conjuntos de alinhamentos, quando analisados em conjunto, resultaram nos motivos descritos na figura 5. Isto é uma indicação que os membros WALLDOF-semelhantes putativos de espécies diferentes, que são codificadas por genes de parálogo, como definido acima, compartilham estes motivos comuns na sua sequência de proteína.

EXEMPLO 3. Isolamento e Clone de walldof de Populus deltoldes (a) Preparação do mRNA de Populus deltoldes ramo/xilema e síntese do cDNA:

O cavaco foi removido de cortes de tronco de árvores de Populus deltoldes de um ano. A parte interior do tronco, contendo ramo, xilema e medula, foi cortada em pequenas partes, congeladas no nitrogênio líquido e usadas para a extração de RNA usando o método de extração com brometo

39/48 de cetiltrimetil-amônio (CTAB). Ver Aldrich e Cullis, Plant Mol. Biol. Peport, 11: 128-41 (1993). cDNA foi sintetizado usando RNA total como padrão. A primeira fita de cDNA foi produzida por RT-PCR SuperScript usando transcriptase reversa II (Invitrogen) e um oligo iniciador (dT). cDNA de fita dupla foi obtido pela reação de polimerase subsequente, usando iniciadores específicos para o gene, como descrito abaixo.

(b) Projeto de Iniciadores de PCR e reação RT-PCR:

Oligômeros baseados em Populus trichocarpa o modelo estExt_ fgenesh4_pg genético. C_LG_XV0093 foram sintetizados como iniciadores de PCR, incluindo a região em volta do primeiro códon de ATG ou em volta do códon de terminação do ORF principal que codifica o polipeptídeo para amplificar a região de codificação inteira do ORF principal. As sequências dos iniciadores foram:

DOFNCO (SEQ. ID. N°: 3).

'-ATCCATGGATACTTCTACTCAGTGGCCACAGG - 3' DOFXBA (SEQ. ID. N°: 4).

'-ACTCTAGATTACCATGATCCACCACCTAACATTC - y O acúmulo de cDNA obtido em (a) foi usado como o padrão em uma reação de PCR com os iniciadores de SEQ. ID. N°: 3 e 4. O PCR envolveu 40 ciclos de 1 minuto em 94°C, 1 minuto em 51 °C, e 2 minutos em 72°C seguido por uma etapa extra do alongamento em 72°C durante 7 minutos. Os produtos de PCR foram isolados por eletroforese em gel de agarose de 1,0% seguido por coloração de brometo de etídio do gel da eletroforese e detecção de bandas amplificadas em um transluminador de UV. A banda amplificada detectada foi verificada e cortada do gel de agarose com uma lâmina. As partes de gel foram transferidas para microtubos de 1,5 mL, e os fragmentos de DNA foram isolados e purificados com o uso de um kit de limpeza e purificação de banda de gel PCR GFX (Amersham). Os fragmentos de DNA recuperados foram subclonados em um vetor de clone comerciaimente disponível, transformados em E. coli, e depois usados para preparar o plasmídio de DNA, que então foi sequenciado pelo método dideoxi, usando protocolos padrão. Ver Messing, Methods in Enzymol, 101: 20-78 (1983). A

40/48 sequência de nucleotídeo resultante, enunciada em SEQ. ID. N°: 1,codifica o polipeptídeo WALLDOF identificado aqui com a SEQ. ID. N°: 2.

EXEMPLO 4. Transformação de P. tremula χ P. alba Híbrida mediada por

Agrobacterium

A molécula de ácido nucléico isolada de Populus deltoides e obtida no Exemplo 2 foi clonada em um vetor de expressão a jusante de um gene cumarato-4-hidroxilase preferido do xilema (C4H) promotor, como descrito na WO 2005/096805 (figura 6). O construto de expressão resultante foi amplificado em E. coli, e depois transformado no Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404.

O híbrido de álamo de tipo selvagem (Populus tremula x Populus aiba) foi transformado com Agrobacterium tumefaciens transportando o construto obtido no Exemplo 3. Os segmentos de tronco pecíolos e intermodais in vitro que micropropagaram as plantas foram usados como explantas. Os brotos transformados foram selecionados no meio de regeneração contendo 100 mg/L da canamicina e deixados enraizar no meio de Murashige e Skoog. As plantas selecionadas foram posteriormente transferidas para o solo e cultivadas na estufa.

Os eventos transgênicos foram verificados por PCR. A integração do construto genético no genoma das plantas transgênicas foi confirmada pela análise de PCR do gene de marcador selecionável (canamicina) e o gene walidof.

EXEMPLO 5. A Sobre-expressão de walidof Aumenta a Deposição na Parede Celular em Álamo Transgênico

A análise histológica do xilema foi executada na parte inferior do tronco de árvores de álamo de dois meses transformadas com o construto obtido no Exemplo 3. As seções de tronco foram seccionadas transversalmente (10 pm de espessura) de tipo selvagem e linhagens transgênicas com um microtomo (LEICA RM2255) equipado de uma faca de aço. As seções foram submetidas à coloração com toluidina azul e observadas sob um microscópio com iluminação direta.

A figura 7 mostra seções de tronco através do xilema, da medula

41/48 ao ramo, de uma planta não transformada (A) e uma linhagem transgênica transformada com o construto obtido no Exemplo 2 (B). É possível ver que a espessura da parede celular aumentou dramaticamente no evento transgênico quando em comparação com a planta não transformada. Isto mostra claramente um aumento dramático da deposição na parede celular causada pela expressão modulada de walldof no evento transformado. Também, há uma redução marcada na largura de lúmen de células no evento transformado. A figura 8 apresenta uma ampliação mais alta de um tronco a seção transversal do mesmo evento transformado mostrado na figura 6 em comparação com uma planta não transformada. Pode ser claramente observada uma redução marcante na largura do lúmen como consequência da espessura aumentada da parede celular.

As medições da área da parede da célula indicaram um engrossamento dramático de paredes de célula em replicata dos eventos transformados. Os Eventos A.4.2, B.3.1 e B.4.1 apresentaram um aumento na área da parede por célula de 255%, 77% e 55%, respectivamente, quando em comparação com plantas não transformadas (figura 9).

A percentagem da área da parede sobre a área de célula total foi significativamente aumentada nas plantas transformadas que variaram de 38% a 82% em comparação com 27% sobre a área de célula total das plantas de controle não transformadas (figura 10).

EXEMPLO 6. Sobre-expressão de walldof Aumenta a Densidade Aparente da Madeira em Álamos

O aumento na deposição na parede celular resultou em um aumento na densidade aparente de madeira de plantas transformadas. Para a determinação de densidade aparente da madeira, amostras (espessura de 1 mm) do tronco a parte inferior foram cortadas usando uma serra de lâmina dupla. As ripas finas com teor de umidade de 12% (MC) foram examinadas por raios-X usando um Hewlett Pakard Faxitron (Modelo 43805 N) anteriormente ajustado (tempo: 5 minutos; energia: 16 Kv; intensidade: 3 mA). Os filmes (Kodak, Filme Diagnóstico X-Omat XKI, 24 X 18 cms) foram desenvolvidos usando procedimentos normais. As radiografias das plantas transfor42/48 madas e não transformadas foram avaliadas em uma escala de 256 cinzas com resolução de 1.000 dpi. As medições da microdensidade de raio x (densitometria de raio x) foram feitas nesta imagem digital pelo software CERD. Mothe et al, Ann. For. Sci, 55: 301-13 (1998). Uma metodologia de perfis de densitometria, descritos por Walker e Doob, Wood Fiber Sci, 20: 35-43 (1998), foi usada para determinar a densidade aparente média da madeira.

Os Eventos A.4.2, B.3.1 e B.4.1 mostraram um aumento de 84%, 38% e 32% na densidade aparente da madeira, respectivamente, quando em comparação com plantas não transformadas (figura 11). O álamo é considerado uma planta de madeira suave com uma densidade de madeira aproximadamente 300 a 400 g/cm³. Os eventos transformados da invenção mostraram uma densidade de madeira de aproximadamente 0,66 g/cm³ em eventos B.3.1 e B4.1, e aproximadamente 0,82 g/cm³ no evento 4.2 comparando com uma densidade de madeira de aproximadamente 0,42 g/cm³ nas plantas não transformadas (figura 11). A deposição na parede celular aumentada contribui muito para os resultados de densidade de madeira, já que se mostrou que a correlação entre estes dois atributos foi de 0,97 (figura 12).

EXEMPLO 7. Deposição na Parede Celular Aumentada Correlacionada com a Expressão Aumentada do walldof

Para determinar a abundância de cópias walldof e correlacionar o nível da expressão walldof com a intensidade do fenótipo observado, executa-se a reação de cadeia de polimerase por transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) usando RNA isolado do xilema desenvolvido de plantas de álamo não transformadas e quatro eventos transformados analisados como descrito acima. O tecido congelado em N2 líquido foi moído ao pó com grau e pilão, e o RNA total foi isolado com o uso do método de extração com brometo de cetiltrimetil-amônio (CTAB) (Aldrich e Cullis, Plant Mol. Biol. Reporí., 11:128-141, 1993). RNA total foi tratado com o DNasel (Promega), e cDNA e a primeira fita foi sintetizada com a SuperScript II Transcriptase Reversa (Invitrogen) que usou 1 pg de RNA total. Um décimo do cDNA foi usado em combinação com 0 gene de iniciadores específicos em concentração

43/48 de 500 nM e SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR foi executada em um Sistema de Detecção de Sequência Prisma ABl 7000 (Applied Biosystems). Para a amplificação de cópias walldof, os iniciadores de oligonucleotídeo walldof Twd (5-TGCAAGAATTCAAGCCATC-3') e WALLDOF Rev (5-GCAGCAGGTTCCAAGTAATG-3') foram usados. Populus trichocarpa sequência genética actina (estext_genewisel_VI. C I 850029), foi usada como um gene de referência para normalizar quantidades padrão, e foi amplificada com os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo ACTIN Fwd (5'-GCTGTCCTTTCCCTGTATGC-3') e ACTIN Rev (5'-ACGACCAGCAAGATCCAAAC-3’). A amplificação foi executada em 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, e 45 ciclos em 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. A especificidade da reação de amplificação foi avaliada pela análise das curvas de dissociação. A proporção entre as quantidades do walldof e os produtos amplificados de ACTIN foi calculada com o uso do método 2'^AÁCt (Livak e Schmittgen, Methods, 25:402-108, 2001). Os níveis transcritos de walldof em relação àqueles de ACTIN foram calculados como a média de valores obtidos de três amostras independentes usadas como replicatas biológicas.

Os eventos transgênicos que apresentaram um aumento na deposição na parede celular e na densidade aparente da madeira tinham um nível de expressão genético walldof mais alto no tronco quando em comparação com plantas não transformadas. Quanto maior a expressão genética walldof mais forte o nível dos fenótipos relacionados com a deposição na parede celular e a densidade de madeira.

O evento A.4.2, que mostrou a densidade aparente da madeira mais alta e deposição na parede celular, apresentou um aumento de 14 vezes no nível de expressão genético walldof quando em comparação com plantas não transformadas. Os Eventos B.3.1 e B.4.1, com o aumento semelhante em densidade de madeira e deposição na parede celular, também mostraram um aumento semelhante no nível de expressão genético walldof relacionado para controlar plantas (aumento de 6 e 7 vezes, respectivamente) como mostrado na figura 13.

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EXEMPLO 8. A Taxa de Crescimento é Semelhante em Plantas Transformadas e Não transformadas

A alocação de carbono para aumentar a deposição na parede e densidade de madeira não interferiu com o crescimento de planta e desenvolvimento como mostrado pela taxa de crescimento de planta (figura 14). As plantas transformadas cresceram com a mesma eficiência que as plantas de controle após 2 meses na estufa.

EXEMPLO 9. Sobre-expressão de iva//cfof Aumenta o Teor de Celulose

Para analisar se a sobre-expressão de walldof modifica a composição de madeira, o material de tronco de planta cultivado em estufa foi moído com um moinho Wiley para passar por uma tela de 40-60 mesh e depois extraído por soxhlet com a acetona por 5 h. O material livre de extratos foi usado para todas as análises adicionais. O teor de lignina foi determinado com Klason modificado, onde o tecido de tronco moído extraído (0,3 g) foi tratado com 3 ml de H2SO4 de 72% de acordo com Coleman et al, Plant Biotechnof J, 4:87-101 (2006). Os cadinhos secos foram pesados para determinar o Kiason (lignina ácida e insolúvel) gravimetricamente para lignina. O filtrado também foi analisado para a lignina ácida e solúvel pela absorbância em 205 nm. As concentrações de carboidrato no hidrolisado foram determinadas ao uso de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (DX-500; Dionex) equipado de uma coluna de troca iônica (Dionex) de PA1, um detector de pulso amperométrico com um eletrodo de ouro, e um Spectra AS 3500 autoinjetor (Spectra-Physics). Cada experimento foi corrido em duplicata. A determinação da proporção S/G de cada amostra livre de extrato foi obtida pela oxidação com nitrobenzeno. Methods in Lignin Chemistry, editores Lin e Vance, Springer Verlag, Berlim, 1992. Ver a Tabela 2.

A sobre-expressão de WALLDOF em plantas apresentou aumento da celulose de até 12%, e uma redução geral de carboidratos de hemicelulose. Como mostrado na Tabela 1, a redução do teor de hemicelulose foi considerada principalmente por uma redução na manose (tão baixo como 42% do teor de tipo selvagem no evento A.4.2) e arabinose (tão baixo como 72% do teor de tipo selvagem no evento A.4.2).

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Tabela 1. Composição de carboidrato (% de peso de madeira seca) de madeira de tronco em controle e álamo transgênico.

Linhas	Glicose	Xilose	Manose
Tipo selvagem	38,07 (0,17)	18,27 (0-17)	1,12(0,08)
A.4.2	42,45 (0,30)	16,95 (0,25)	0,48 (0,12)
B.3.1	42,10 (0,20)	17,35 (0,05)	0,54 (0,06)
B.4.1	42,55 (0,55)	17,90 (0,00)	0,68 (0,02)
A.1.10	39,10 (0,30)	18,40 (0,20)	1,21 (0,09)

Tabela 1.- continuação-

Linhas	Galactose	Arabinose	Ramnose
Tipo selvagem	0,80 (0,00)	0,35 (0,02)	0,46 (0,03)
A.4.2	0,68 (0,02)	0,25 (0,01)	0,37 (0,01)
B.3.1	0,75 (0,01)	0,26 (0,01)	0,41 (0,01)
B.4.1	0,75 (0,01)	0,33 (0,02)	0,44 (0,01)
A.1.10	0,85 (0,00)	0,37 (0,02)	0,48 (0,01)

Os valores médios e os erros padrão (em parênteses) são infor5 mados para análises duplicadas de linhas independentes n.

O tipo selvagem, n = 3; linhas transgênicas, n = 2.

Os dados de carboidratos foram analisados por ANOVA. Os valores que são significativamente diferentes do tipo selvagem são indicados em negrito (teste de Tukey; P <0,05).

Tabela 2. Teor de lignina e composição de madeira de tronco em álamo controle e transgênico.

Lignina (% em peso de mad. seca) Monom. Lign. (umol/q Klason lign)

Linhas	Insoluv. em ácido	Solúvel em ácido	Lignina total	Siringil	Guaíacil	S:G
Tipo selvagem	18,17	3,87	22,04	1.203,51	528,53	2,29
	(0,33)	(0,32)	(0,65)	(69,09)	(43,30)
A.4.2	19,02	2,57	21,59	858,39	599,21	1,43

(0,36) (0,15) (0,22) (37,19) (8,27)

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Linhas	Insoluv. em ácido	Solúvel em ácido	Lignina total	Siringil	Guaiacil	S:G
B.3.1	18,94	2,94	21,88	976,96	593,38	1,65
	(0,36)	(0,06)	(0,30)	(61,95)	(32,27)
B.4.1	17,98	3,22	21,20	929,96	512,67	1,81
	(0,06)	(0,26)	(0,32)	(79,13)	(15,52)
A.1.10	18,50	4,13	22,63	1,143,84	513,72	2,23
	(0,52)	(0,30)	(0,22)	(28,64)	(33,33)

Os valores médios e os erros padrão (em parênteses) são informados para análises duplicadas de linhas independentes n.

O tipo selvagem, n = 3; linhas transgênicas, n = 2.

Os dados foram analisados por ANOVA. Os valores que são significativamente diferentes do tipo selvagem são indicados em negrito (teste de Tukey; P <0,05).

EXEMPLO 10. Walldof ateia a expressão de genes envolvidos no metabolismo de carboidrato e nitrogênio

Para identificar genes de objetivo de candidato diretamente ou indiretamente controlado pelo fator de transcrição walldof, as análises de microarranjo foram executadas para comparar a sobre-expressão de walldof nas plantas linhagem A.4.2 e do tipo selvagem.

Troncos de três replicatas biológicas do tipo selvagem e três replicatas biológicas de linhagem transgênica A.4.2 são colhidos, e imediata15 mente congelados em nitrogênio líquido, e guardados em -80°C para extração de RNA. Para o isolamento de RNA, os troncos foram descavados, e o xilema que se desenvolve foi raspado com uma lâmina. O xilema foi moído a um pó fino sob nitrogênio líquido, e o RNA total foi extraído de cada amostra pelo uso do procedimento descrito por Chang et al, Plant Mol. Bio. I Rep.

11:4 (1993). A qualidade de RNA foi determinada com o uso de um bioanalisador Agilent 2100. Para cada amostra, 10 pg de RNA total foram transcrito reverso, marcado, e hibridizado à Tabela de Genoma de Álamo de acordo com os protocolos do fabricante (Affymetrix). A Tabela de Genoma de Álamo inclui 61.251 conjuntos de sonda que representam mais de 56.055 cópias

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A análise de dados de GeneChip foi executada com o uso de uma suite BioConductor em R usando a embalagem Affy descrita por Gautier et al., Bioinformatics 20:307-315 (2004). A correção de fundo, a normalização, e sumarização do valor de expressão foram executadas usando análise de Média Robusta de Multichip. Os conjuntos de sonda de chamada presentes foram avaliados por uma função Affy MasScalIs. Qualquer gene com o sinal ausente ou marginal em todas das amostras foi removido da análise. As comparações entre plantas transgênicas e o tipo selvagem foram executadas com o uso da embalagem Limma. Smith, Stat. Appl Genet. MoL Biol, 3:3 (2004). Os genes diferencial mente expressados foram identificados usando o teste de t corrigido para a taxa de falsa determinação. Benjamini e Hochberg, J. R. Stat. Soc. Ser. B 57:289-300 (1995). O limiar de valor de P corrigido foi definido a 0,05.

As análises de transcriptoma do xilema dos eventos walldof usando a Tabela de Genoma de Affymetrix Genechip Poplar identificaram 825 genes que foram diferencialmente expressados, incluindo grupo de genes envolvidos com metabolismo de nitrogênio e carboidrato, síntese da parede celular e metabolismo e modificação de fenilpropanoide.

Dentro do metabolismo de nitrogênio, os dados de microarranjo confirmaram o nível de expressão de infrarregulado dos genes de glutamato desidrogenases GDHI e GDH2. Além disso, os níveis de cópia de GS2, isoformados de glutamina sintetase do cloroplasto, são elevados na sobreexpressão de álamos por walldof. Como o amônio liberado pela reação de PAL é reassimilado pela glutamina sintetase, este aumento é esperado nos transformantes.

Além disso, os níveis de cópia de quatro genes que codificam enzimas envolvidas na degradação de amido (isto é, um gene semelhante à alfa amilase [AMY3], dois genes de fosforilase alfa-glucano e um diquinase alfa-glucano [SEXI]) foram elevados na linha sobre-expressada do walldof, ao passo que aquela de grandes subunidades de ADP-glicose pirofosforase [AGP2 e AGP3], foram reduzidos. Estes dados apontaram para um esgota48/48 mento aumentado do amido. Analisa-se o amido total em plantas transgênicas (Tabela 3) e observa-se uma redução de até 32% no teor de amido em plantas transgênicas.

Relacionado à organização da parede celular, os níveis de cópia de nove proteínas arabinogalactano putativas (AGP) foram alterados. Sete foram infrarregulados e dois foram elevados.

Os níveis de cópia de quatro genes cujos níveis de expressão são tipicamente elevados durante a formação de lignina foram aumentados na linha sobre-expressada pela walldof. quatro genes que codificam lacca10 ses. Além de tudo, a análise de transcriptomo revelou diferenças no metabolismo de constituintes da parede celular (lignina, carboidratos, e proteínas) e

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar pelo menos uma dentre deposição na parede celular e densidade de biomassa, caracterizado pelo fato de que compreende modular a expressão de uma sequência walldofDNA em uma planta transgênica transformada com uma construção que compreende uma sequência de DNA walldof e, operavelmente ligada à mesma, um promotor que é ativo em plantas, em que a referida sequência de DNA walldof consiste na SEQ ID NO: 1.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita modulação compreende a efetuar a superexpressão da dita sequência em uma planta transgênica, de tal modo que a dita planta apresenta uma densidade de biomassa aumentada.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita planta transgênica é o produto de um processo compreendendo:

   (a) fornecer material de planta regenerável que é transformado com uma construção que compreende uma sequência walldofDNA e, operavelmente ligada à mesma, um promotor que é ativo em células de planta; e depois (b) submeter o dito material ou plantas regeneradas do dito material a uma seleção para a qual pelo menos um critério de seleção é a densidade de biomassa aumentada em relação um estado não transformado.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é um promotor preferido do xilema.

   Petição 870180060873, de 13/07/2018, pág. 15/17

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5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é um promotor constitutivo.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a SEQ ID NO: 1 codifica a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2.
7. 7. Construção, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA walldof, que consiste na SEQ ID NO: 1, operavelmente ligado ao mesmo, um promotor exógeno que é ativo em células de planta.
8. 8. Método para aumentar o teor de celulose, caracterizado pelo fato de que compreendendo a modulação da expressão de uma sequência de DNA walldof, que consiste na SEQ ID NO: 1, em uma célula de planta.

   Petição 870180060873, de 13/07/2018, pág. 16/17

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