MX2011001896A - Incremento en la sedimentación de pared celular y biomasa en plantas. - Google Patents

Abstract

Se describe la modulación en la expresión en plantas de un gen que codifica WALLDOF, un factor de transcripción involucrado en la biogénesis de pared celular en plantas, que resulta en una sedimentación de pared celular incrementada y densidad de biomasa en plantas más alta.

Description

INCREMENTO EN LA : SEDIMENTACIÓN DE PARED CELULAR Y BIOMASA EN PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cultivos para cosecha con eficiencia mejorada de empaque del carbono fijo en los compuestos de almacenamiento. Más particularmente, la metodología y c'onstructos se dirigen a incrementar la sedimentación en 1 la pared celular y/o la biomasa de las plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los cultivos perennes para cosecha tales como la caña de azúcar, pasto varilla, Miscanthus (pasto elefante) y especies maderables son fuentes importantes de carbono fijado en la forma de azúcares t simples o mezclas complejas de celulosa y hemicelulosa . Éstos ' recursos de biomasa son objetivos importantes para diversas industrias, tales como la industria de la bioenergía, !que se enfocan actualmente en el desarrollo de recursos demandados por una población mundial creciente.

Los recursos de biomasa son útiles, por ejemplo, para la producción de etanol celulósico que pudiera desplazar potencialmente 30%; del consumo actual de petróleo en los EUA en el futuro próximo. Perlack et al., BIOMASS AS FEEDSTOCKS FOR A BIOENERGY AND BIOPRODUCTS INDUSTRY: THE TECHNICAL FEASIBILITY OF A BILLION-TON ANNUAL SUPPLY, ORNL/TM-2005/66 (2005) . Estas cargas lignocelulósicas han sido propuestas por ofrecer ventajas ambientales y económicas sobre los recursos energéticos actuales, debido a que requieren de menores entradas . agrícolas que los cultivos anuales para cosecha y pueden crecer en tierras agrícolamente marginales. Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 103: 11206-210 (2006) .

Se han hecho proyecciones que muestran que la demanda mundial de madera' se espera que crezca en 20% en la próxima década, debido a .un uso creciente de productos forestales, residuos maderables, y cultivos para cosecha para energía maderables para la producción de electricidad, combustible y biomaterial. Strauss and Bradshaw, TREE BIOTECHNOLOGY IN THE NEW MILLENNIUM: I TERNATIONAL SYMPOSIUM ON ECOLOGICAL AND SOCIETAL ASPECT OF TRANSGENIC PLANTATIONS, Oregon State University (2001); Mead, . Biomass and Bioenergy, 28: 249-66 (2005) .

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar plantaciones altamente productivas de árboles para reducir la presión en los bosques naturales, precedida por amplios avances en la reproducción en especies de árboles de plantación tales como el álamo y eucalipto. Hasta ahora' esto ha sido difícil debido a que el prolongado tiempo de generación en los1 árboles hace a la reproducción convencional un proceso muy lento. Las técnicas de ingeniería genética tienen el potencial de acortar ampliamente el intervalo de reproducción para: los árboles y 'permitir una reproducción más dirigida.

Los métodos para incrementar la asignación de carbono a las porciones arriba del suelo de las plantas incrementarían las tasas de crecimiento y los rendimientos de biomasa. Ragauskas et al., Science, 311: 484-89 (2006). En los árboles el carbono fijo se acumula principalmente en las paredes secundarias de las células, las cuales son el constituyente principal de la Madera. Las paredes secundarias están compuestas principalmente de celulosa, hemicelulosas y lignina. Durante la formación secundaria de las paredes, la biosíntesis de estos componentes de la pared celular' está altamente coordinada y depende de los genes reguladores maestros que controlan un enorme arreglo de genes individuales. A pfesar de los avances en el estudio de los genes biosintéticos de pared secundaria, poco se conoce acerca de los mecanismos moleculares que subyacen a la expresión coordinada de estos genes durante la formación de la madera. Zhong et al., Célula de planta, 19: 2776-92 (2006). : Existen varios tipos de procesos reguladores que controlan la expresión de genes, producción de proteínas, y el procesamiento y la' actividad de las proteínas. Uno de tales procesos involucra la actividad de los factores de transcripción, que son proteínas que pueden reconocer secuencias en el promotor de genes y, al enlazarse en tales secuencias en particular, modulan la tasa de t anscripción de tales genes. Se han identificado diversos factores de transcripción en varios organismos y se ha establecido su papel en el control de trayectorias biosintéticas particulares. Por ejemplo, la formación de perfiles de transcripción de : genes que se expresan diferencialmente durante la diferenciación in vitro del xilema en Zinnia (Demura et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 99: 15794-99, 2002) y Arabidops'is (Kubo et al., Genes Dev. , 19: 1855-60, 2005) o durante el crecimiento secundario en tallos y raíces de Arabidopsis (Oh et al., J. Exp. Bot . , 54: 2709-22, 2003; Zhao et al., Plant Physiol., 138: 803-18, 2005) y álamo (Hertzberg et al.,; Proc. Nati. Acad.. Sci. USA, 98: 14732-137, 2001) ha conducido a la identificación de diversas familias de factores de transcripción, que pueden estar involucradas en la regulación1 de la diferenciación del xilema o el crecimiento secundario. Similarmente , el análisis de microarreglo mostró que 182 factores de transcripción se expresan diferencialmente durante etapas de desarrollo diferentes de los tallos de inflorescencia de Arabidopsis . Ehlting et al., Plant J. , 42: 618-40 (2005). Aunque las funciones exactas de la mayoría de estos factores de transcripción asociados con el crecimiento secundario y el xilema se desconocen, proporcionan herramientas útiles para diseccionar los mecanismos moleculares que controlan el proceso complejo : de desarrollo del xilema, incluyendo el inicio de la . diferenciación, prolongación celular y engrosamiento de la pared secundaria.

Entre estos fact'ores de transcripción asociados con el crecimiento secundario o el xilema están un grupo de factores de transcripción de dominio DOF (para enlace de ADN con Una Extensión, por sus siglas en inglés). Las proteínas DOF son factores de transcripción específicos de las plantas que comparten un dominio de enlace al ADN en el N terminal altamente conservado y un dominio en el C terminal para la regulación de la transcripción. Yanagisawa, Trends Plant Sci., 7: 555-60 :(2002). El dominio de enlace al AND se caracteriza por 52' residuos de aminoácidos estructurados como un extensión Cys2/Cys2 Zn2+, la cual reconoce elementos reguladores en cié que contienen el núcleo común 5'-AAAG-3'. Umemura et al., Plant J. , 37 : 741-49 (2004); Yanagisawa & Schmidt, Plant J. , 17: 209-14 (1999).

Las proteínas DOF se han sugerido para participar en la regulación de procesos biológicos exclusivos de plantas tales como la expresión de genes regulada por la luz, asimilación fotosintética de carbono, acumulación de proteínas de almacenamiento de semillas, germinación, respuesta · a fitohormonas, expresión ' de genes específica de células protectoras, metabolismo flavonoide y biosíntesis de lípidos. Plesch et al., Plant J. , 28: 455-64 (2001); Moreno-Risueño et al., Plant J. , 51: 352-65 (2007); Wang et al., Plant J., 52: 716-29 (2007) . \ En el arroz, el elemento cis que más se presenta para todos los genes del factor de transcripción preferente de semillas se encontró que era 'AAAG, ' el sitio de núcleo requerido para el 'enlace de las proteínas Dof, lo que sugiere un papel esencial y más notable de los factores de transcripción DOF en redes reguladoras jerárquicas que controlan el desarrollo de semillas de arroz. Duan et al., Plant Mol. Biol . , !57 : 785-80 (2005).

La DOF1 de maíz se expresa en las hojas, tallos y raíces y tiene diferentes actividades de transactivación en protoplastos etiolados y ecológicos. DOF1 se activa en células de hojas iluminadas y puede estar involucrada en la regulación de la luz en genes acoplados a procesos dependientes de la luz. Yanagisawa and Sheen, Plant Cell, 10: 75-90 (1998): La DOFl del maíz también se ha sugerido para ser un regulador de la fosfoenolpiruvato carboxilasa fotosintética C4,. la cual cataliza la fijación primaria de C02 en la trayectoria fotosintética de C. Adicionalmente, potencia la transcripción desde el promotor de una dicinasa citosólica de ortofosfato. Ambas enzimas están involucradas en la síntesis de aminoácidos y la recaptura de C02 respirado. Se ha propuesto que la DOFl de maíz pudiera jugar un rol más general en la expresión de genes múltiples relacionados con el metabolismo del carbono. Véase Yanagisawa, Plant;J., 21: 281-88 (2000).

Otra proteína DOF específica del endosperma del maíz, nombrada factor de enlace de caja de prolamina (PBF), se demostró que interactúa con la proteína básica de cremallera de leucina Opaque2, un activador transcripcional conocido de la expresión del gen de prolamina (Vicente-Carbajosa et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 94: 7685-90, 1997). Existen otras proteínas homologas en el endosperma de otros cereales, tales como BPBF (PBF de cebada) y WPBF (PBF de trigo), ambas con propiedades de enlace al ADN similares como la PBF de maíz. Estas observaciones sugieren una conservación evolutiva de la función génica dé PBF, como un regulador importante de la expresión génica de proteínas . de almacenamiento entre cereales de grano pequeño, y soporta un escenario en donde las interacciones proteina-proteina sean importantes en las funciones DOF. Mena et al., Plant J. , 16: 53-62 (1998).

En el arroz 1 hay un miembro de la familia DOF (0SD0F3) que ha demostrado interactuar con un factor' de transcripción MYB del tipo R2R3 en la capa de aleurona, lo que resulta en la expresión inducida de diversos genes que codifican las enzimas hidroliticas (a-amilasas y ß-glucanasas ) que participan en la movilización de' las moléculas almacenadas. ashio, Plant Physiol., 133: 850-63 (20.03). La regulación génica en estas células de aleurona está bajo el control de las fitohormonas , principalmente la relación de giberelinas (GA) a ácido abscisico (ABA) . El patrón de acumulación observado del transcrito de PBF de cebada con la absorción de semillas sugiere que puede estar sobre-regulado por GA y funcionar como un represor de la transcripción con la germinación a través de la interacción con la caja de pirimidina del GARC . (complejo con respuesta a GA) , un elemento conservado en cis requerido para la inducción de GA identificada en los genes de hidrolasa de cereales. Mena et al., Plant Physiol:., 130: 111-19 (2002).

En la Arabidopsis hay 36 miembros de la familia DOF, dos de los cuales, DAG1 y DAG2 (Germinación que Afecta Dof por sus siglas en inglés)., también afecta la germinación de semillas por la respuesta de la luz a la concentración de giberelina, lo que juega posiblemente roles reguladores opuestos en los mismos genes maternos. Gualberti et al., Plant Cell, 14: 1253-63 (2002).

Adicionalmente, las proteínas DOF han sido descritas como parte de una, red reguladora que controla los metabolitos secundarios. A este respecto, OBP2, un gen DOF expresado de forma prominente en el floema de las hojas y otros órganos en Arabidopsis, ha demostrado activar la expresión de CYP83B1, un gen que participa en la síntesis de los glucosinolatos, un grupo de metabolitos secundarios que funcionan . como sustancias de defensa contra los herbívoros y microorganismos. Skirycz et al., Plant J. , 47: 10-24 (2006)·.

Otro miembro del gen DOF de Arabidopsis, AtDOF4;2, fue identificado como un gen que induce un fenotipo de planta de arbusto y que se involucra potencialmente en la regulación del metabolismo fenilpropanoide .

La sobre-expresión constitutiva y el silenciamiento mediado por ARNi de AtDOF4;2 provocó cambios recíprocos en la expresión de los genes biosintéticos flávonoides y la acumulación de flávonoides bajo condiciones de frío y elevada luz. Véase Skirycz et al., New Phytol., 175: 425-38 (2007).

La participación de las proteínas DOF en la regulación del metabolismo fenilpropanoide también se ha demostrado en los mutantes de Arabidopsis thaliana de-etiolado3 (det3) , pom-poml (poml) y lignificación ectópica I (elil) . Estos mutantes depositan ligninas en las células donde estos polímeros no se encontrarían normalmente. El análisis de microarreglo sugiere que los cambios en la expresión de los miembros específicos de las familias R2R3-MYB y del factor de transcripción DOF pueden contribuir a fenotipos de lignificación ectópica en estos mutantes. Rogers et al., New Phytol., 168: -123-40 (2005).

En el álamo : hay 41 genes DOF, de acuerdo con Yang et al., Plant Physiol., 142: 820-30 (2006). Un análisis de secuencias de estos genes junto con los 36 genes DOF de Arabidopsis y 30 del arroz reveló 41 porciones conservadas, de las cuales una: EILKCPRCDSMNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKTCRRYWTKGGALRNVPVGGGCRKNKR, fue identificada como el dominio DOF. Id. , página 824 y Tabla I. Un árbol filogenético de probabilidad máxima, construido al usar secuencias de proteínas de longitud completa de estos' genes DOF genes, también resaltó los 27 pares de- genes parálogos en los nodos terminales del árbol. Id., página 825 y Figura 2.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Con base en 1 los descubrimientos de los inventores y entendimientos relacionados acerca de las proteínas DOF, se proporciona entre otros en esta descripción, una metodología para incrementar la sedimentación en la pared celular y/o la biomasa. El método inventivo comprende modular la expresión de una secuencia walldof en una célula de planta, . por ejemplo, al efectuar la sobre-expresión de tal secuencia en una planta transgénica, tal que la planta se caracterice por una densidad de biomasa incrementada. En una modalidad preferida, la planta transgénica es el producto de un proceso que comprende: (a) proporcionar un material de planta regenerable que se transforma con un constructo que comprende una secuencia de ADN walldof y, ligado operativamente a ello, un promotor que está activo en células de plantas; y luego (b) someter al material o plantas regenerados del material a una selección para la cual, al menos un criterio de selección es la sedimentación incrementada en la pared celular o densidad de biomasa incrementada, con relación a un estado no transformado. Ilustrativo de la secuencia de ADN walldof son (i) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 1 y (ii) la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2.

También se contempla un constructo que comprende una secuencia de ADN walldof y, ligado operativamente a ello, un promotor que está activo en células de plantas. En ambos, el constructo y el método antes mencionado, el promotor puede ser, por ejemplo', un promotor específico de órganos o de tejidos, tal como un promotor específico del xilema; un promotor preferido de órganos o de tejidos, tal como un promotor preferido de xilema, un promotor constitutivo, o un promotor inducible. 1 Por consiguiente, aspectos relacionados incluyen una célula de planta transgénica que comprende una secuencia heteróloga de ADN ' walldof . que se expresa bajo el control, por ejemplo, de un promotor específico/preferido de órganos o tejidos, promotor constitutivo, o promotor inducible. También se proporciona una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN walldof tal que la planta se caracteriza por densidad de biomasa incrementada, con relación .a un estado no transformado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 : muestra la expresión diferencial del gen walldof en diferentes tejidos de álamo.

La Figura 2 muestra la estructura en términos de estructura de intrón-éxón de los homólogos supuestos de WALLDOF. ; La Figura 3 muestra alineaciones múltiples de dicotiledóneas WALLDOF en las cuales las porciones conservadas 1 a 7 están resaltadas.

La Figura : 4 muestra alineaciones múltiples de monocotiledóneas . WALLDOF (en las cuales las porciones conservadas 1 a 7 están resaltadas).

La Figura 5¦ muestra en 5 (A) el orden y tamaño de las porciones WALLDOF y en 5(B) la secuencia de consenso de aminoácidos de las porciones WALLDOF 1 a 7.

La Figura ' 6 ilustra esquemáticamente el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención que 1 comprende un promotor preferido de cambium/xilema que impulsa la expresión de una secuencia de nucleótidos DOF de Populus deltoides (walldof) de la invención.

La Figura 7 muestra' secciones del tallo (nivel base) a través del xilema de una planta de control (7A) y un evento transgénico (7B) transformado con el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención teñido con el colorante azul ,de toluidina.

La Figura 8 muestra secciones del tallo en alta amplificación (ni el de base) de una planta de control (8A) y una linea transgénica (8B) de Populus trémula x Populus alba transformada con el cásete de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención. Las secciones teñidas con colorante azul de toluidina! muestran la sedimentación incrementada en la pared celular de las lineas transgénicas' cuando se comparan con las plantas de control no transformadas.

La Figura 9 muestra el área de la pared por célula (µp?2) de cuatro líneas transgénicas transformadas con el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención y tres plantas de control (media de tres replicados de plantas) . El asterisco denota las líneas transgénicas que tienen un área de la pared sobre las plantas de control no transgénicas de acuerdo con la prueba de Student incrementada estadísticamente de manera . importante .

La Figura 10 muestra el porcentaje de área celular ocupado por la' pared de cuatro líneas transgénicas transformadas con el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención y tres plantas de control (media de tres replicados de plantas) . El asterisco ; ( denota líneas transgénicas que tienen un porcentaje creciente estadísticamente importante de pared celular por célula sobre las plantas de cpntrol no transgénicas de acuerdo con la prueba de Student.' La Figura 11; muestra .la densidad aparente de la madera (g/cm3) de cuatro; líneas transgénicas transformadas con el vector plasmidial ,de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención y tres plantas de control (media de tres replicados de plantas). El 'asterisco denota líneas transgénicas que tienen un incremento estadísticamente importante en la densidad de la madera sobre las plantas de control no transgénicas de acuerdo con la prueba de Student.

La Figura 12 muestra las correlaciones positivas entre la densidad aparente de madera (g/cm3) y el porcentaje de área celular (%/por célula) ocupado por la pared.

La Figura 13 muestra los niveles de ARNm relativos de walldof al desarrollar el xilema de cuatro líneas transgénicas transformadas con el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de la invención y tres plantas de control (media de tres · replicados de plantas).

La Figura ?4 muestra comparaciones del fenotipo de plantas entre lineas transgénicas transformadas con el vector plasmidial de expresión de plantas pALELLYX-DOF de- la invención y plantas de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores actuales demos raron que un factor de transcripción de álamo DOF, llamado WALLDOF, juega un papel esencial en la sedimentación secundaria en la pared celular. Así, la sobre-expresión in planta de un gen walldof bajo el control, por ejemplo, de un promotor específico del xilema del álamo, resulta en plantas que despliegan un incremento dramático en la sedimentación secundaria de pared y una biomasa incrementada.

Aunque los inventores no se apegan a ninguna teoría en particular, WALLDOF se entiende que funciona como un cambio transcripcional : para el programa de desarrollo de sedimentación secundaria en paredes. Consecuentemente, la presente invención se refiere a una metodología y a constructos de ADN para modular el nivel de WALLDOF u otro, factor de transcripción relacionado en una planta, la constitución genética de lo cual refleja una introducción, preferiblemente infra-genómica , de un segmento de ADN que codifica tal factor de. transcripción, con lo que se incrementa la sedimentación en la pared celular y/o densidad de biomasa de la planta.

A este respecto, el término "expresión" denota la producción de un producto que es o que se relaciona con una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de un segmento de ADN ("producto génico"). La "sobre-expresión" se refiere a la producción de un organismo transgénico de un producto génico a: un nivel que excede el nivel de producción para ese producto ;e un organismo normal (no transgénico) . En este sentido, lá "sobre-expresión" no requiere de una expresión endógena del producto génico en el organismo no transgénico. Por ejemplo, la sobre-expresión, se puede presentar por la de-represión de un gen o la represión de un factor inhibidor. ¡ 7 Por lo tanto se puede hablar de sobre-expresión como un medio para "modular" la expresión de un ADN que codifica WALLDOF o un factor de transcripción relacionado (ver una discusión adicional a continuación) . Como una función de contexto, "modulación" o "modular" también puede tener una connotación que ;se extrae del uso común en la biología molecular de proteínas reguladoras; es decir, el enlace por una proteína reguladora de promotores para genes que se relacionan funcionalmente a un proceso biológico, tal como sedimentación en la pared celular, se dice que "modula" esos genes al incrementar o disminuir sus niveles de expresión respectivos. Consecuentemente, la sobre-expresión in planta de WALLDOF, se esperaría para modular los genes clave que controlan la sedimentación en la pared celular y la densidad de biomasa, tal ¡que se incrementarían o disminuirían sus niveles de expresión.

Para los propósitos actuales, la clase de factores de transcripción adecuados comprende sustituciones, adiciones, y eliminaciones con ' relación a SEQ ID NO: 2 que no alteran la función reguladora que caracteriza a la clase. Son ilustrativos de 'esos cambios aquellos mostrados en la presente Figura 5P, discutida a continuación.

Por consiguiente, se detalla una clase de ADNs, que codifican a tal ¦ factor de transcripción, que se pueden identificar y anotar funcionalmente por comparación de secuencias, conforme a cualquiera de un número de algoritmos disponibles para agrupar secuencias de genes sobre la base de agrupamiento o criterios de alineación, como se ilustra por Yang et al. (2006), infra. Asi, la presente descripción abarca ortólogos y parálogos de un gen comprendido de la secuencia de nucleótidos -establecida en SEQ ID NO: 1, asi como otros ADN que codifiquen una secuencia de proteínas que se relacione funcionalmente , como se describe anteriormente, a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2.

Un individuo familiarizado con la biología molecular de plantas también puede identificar tales ADNs por medio de metodología convencional que involucra la selección de las bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas con sondas de hibridación adecuadas. En particular, las secuencias de parálogos y ortólogos se pueden aislar con la ayuda de oligonucleótidos [ (degenerar) y métodos basados en PCR ejemplificados, por ejemplo, por PCR - THE BASICS 2nd ed. (Taylor & Francis, 2006); PCR PROTOCOLS - METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY '2nd ed. (Humana Press, 2003); REAL TIME PCR (BIOS ADVANCED METHODS) lst ed. (Taylor & E^rancis, 2006) .

Consecuentemente, la frase "secuencia de ADN walldof" denota una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que sé hibridiza bajo condiciones severas con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 y que codifica un factor de transcripción que pertenece a la clase funcional antes descrita, incluyendo cualquier proteina que comprenda las secuencias de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. (Las cursivas en: esta descripción denotan un gen, y las mayúsculas un producto codificado.) La categoría de secuencias de ADN walldof también incluye secuencias con al menos 40%, preferiblemente al menos 60%, especialmente preferiblemente ; al menos 80% y particularmente preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1. La determinación del porcentaje de identidad a este respecto se discute en mayor detalle a continuación.

En una modalidad, un constructo inventivo comprende una secuencia de ADN walldof ligada operativamente a un promotor preferido de tejido, el cual puede pero no se limita a un promotor preferido, vascular, un promotor preferido de xilema, un promotor preferido de cambium, un promotor preferido del tallo, un promotor preferido de madera, un promotor preferido del pedúnculo, y un promotor preferido de célula de parénquima. Es ilustrativo de los promotores adecuados a este respecto el conjunto de promotores preferidos de xilema descritos en la solicitud publicada PCT WO 2005/096805, la cual se incorporai aquí como referencia. Alternativamente, el constructo de ADN de la invención comprende una secuencia de ADN walldof ligada operativamente a un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de órganos o de tejidos, un promotor preferido de órganos o de tejidos, o cualquier otro promotor adecuado.

Ccnsecuenteménte , el material de plantas adecuadamente regenerable, tal' como el callo, se transforma con un constructo de ADN. como se describe anteriormente, y a partir del material de planta transformado se obtiene una planta en una forma convencional, como un transformante primario o progenie del mismo, en cuya planta se incrementa el nivel del factor de transcripción. En consecuencia, la planta despliega un incremento en la "sedimentación en la pared celular y en la densidad de biomasa, con relación a una planta en la cual ; el nivel del factor de transcripción no se incrementa por la metodología de ingeniería genética aquí descrita.

Como se discute anteriormente, por lo tanto, en una modalidad se desea proporcionar una planta transformada con un constructo de A'DN detallado, para propósitos ilustrativos, en la Figura 6. Por ejemplo, una planta transformada de la invención, que tiene incorporado en su genoma un constructo de ADN antes descrito, expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 en altos niveles, lo que resulta en la sedimentación incrementada en la pared celular y/o densidad de biomasa incrementada, con relación a .un estado no transformado (es decir, cuando se compara con una planta no transformada del mismo tipo o variedad) .

De acuerdo con otras modalidades, modular la expresión de una secuencia ! de ADN walldof en una planta provoca un incremento en el área de la pared por célula y el porcentaje del área de la pa'red sobre el área celular total. Debido a que el área de. la1 pared por célula y el porcentaje del área de la pared sobre el área celular total se correlacionan positivamente con. la densidad de biomasa, tal modulación resulta en densidad de biomasa incrementada.

Conforme a determinados aspectos, la modulación de la expresión de una ¡secuencia de ADN walldof en una célula de planta, tales cómo células de plantas angiospermas o traqueida xilar dé gimnosperma, incrementa la sedimentación en la pared celular, como se visualiza y mide por análisis histoquimicos , químicos y físicos. estándar. Por ejemplo, ver A GUI DE TO WOOD MICROTOMY: MAKING QUALITY MICROSLIDES OF WOOD SECTIONS, Ist ed:, Ivés, ed. Ivés, Suffolk, 2001; PLANT MICROTECHNIQUE y MICROSCOPY, Ruzin, ed. Oxford University Press, New York,. 1999; CHARACTERIZATION OF LIGNOCELLULOSIC MATERIALS, Hu, ed. Blackwell Publishing, 2008; PREPARATION OF WOOD fOR CHEMICAL ANALYSIS, Tappi T 264 cm-97, Tappi Press, Atlanta, 1997. ; Más generalmente, la metodología y constructos aquí descritos se pueden implementar para incrementar la densidad de biomasa en un amplio rango de plantas, tales como pero no limitado a especies' de Eucalipto, especies de Álamo, coniferas, sauce> caña de azúcar, sorgo, trigo, maíz, algodón, frijol de soja, alfalfa, vegetales (incluyendo pero no limitado a brócoli, coliflor, col, rábano, col china, cebolla, zanahoria, pepino, pimiento, tomate, berenjena, calabacita, calabaza seca, calabaza, okra, espinaca, frijol seco, puerro o poro, chícharo, lechuga, hinojo, frijol de jardín, remolachas, etc.), melones, sandías, cañóla (colza), arroz, cebada, cacahuate, gandul o frijol de palo, mijo, gandul o frijol dé palo, mijo, uvas, bayas (incluyendo pero no limitado a mora azul, zarzamora, frambuesa, mora de morera, arándano, 'baya de Boysen, etc.), frutos de árboles (incluyendo pero no limitado a ciruela, durazno, nectarina, chabacano o albaricoque, kiwi, granada, mango, higo, naranja, limón, lima, naranja sanguina, toronja, manzana, plátano, y los similares), árboles de nueces (coco, nuez de. Castilla (Inglesa y negra),, nuez pacana, almendra, avellana, nuez del Brasil, nuez de nogal americano, bellota) , plantas productoras oleaginosas -' (incluyendo pero no limitado a girasol, colza, etc.) pasto Sudán, pasto elefante, pasto varilla, pasto africano, y pasto cola de gato o plumacho, entre otros.

Al usar las metodologías y constructos aguí descritos, una planta se puede preparar por ingeniería genética para incrementar la biomasa para una variedad de aplicaciones e industrias, incluyendo pero no limitado a industria de la pulpa y papel, productos forestales en general, cargas para biomasa, biomateriales para bioenergía, cereales, bebidas, dulcería, azúcares y edulcorantes; fibras; colorantes; taninos; pinturas; resinas; látices, hidrogeles, pinturas, aceites, ceras, perfumes, flores y ornamentales, colorantes para alimentos, . especies, hierbas,. medicinas, productos farmacéuticos, farmacéuticos para nutrición, bambú, corcho, y madera .

Así, dependiendo de la planta y la biomasa .en particular necesaria para una aplicación o industria dadas, una planta con biomasa o densidad de biomasa creciente puede mostrar uno o más de los siguientes fenotipos no limitativos, altura incrementada; peso, tamaño o número de hojas; longitud y grosor de los brotes; longitud, grosor y ramificación de las raíces; producción, de semillas por planta; floración; números y tamaños de células en los tejidos, incluyendo tejidos formadores de madera; y desarrollo de los órganos reproductores de las plantas.

Todos los términos técnicos en esta descripción son de uso común en bioquímica, biología molecular o agricultura y tienen su significado convencional, al menos que se indique de otra manera. Tal significado, está reportado en, por ejemplo, en: MOLECULAR CLONING:.A LABORATORY MANUAL, 3rd ed . , vol. 1-3, ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press,, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed . Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience , New York, 1988 (con actualizaciones periódicas) ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. : Las metodologías que involucran técnicas de biología de plantas se describen aquí y también se describen en detalle en tratados tales ¡'como METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE ' MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory . Press , Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Diversas técnicas que utilizan PCR se describen, por ejemplo, en Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS Y APPLICATIONS, Acacemic . Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach and Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares PCR-cebador se pueden derivar de secuencias conocidas por técnicas conocidas tales como el uso de programas de computadora pretendidos para ese propósito, por ejemplo, Primer, Versión 0.5, 1991, Instituto hitehead para Investigación Biomédica, Cambridge, MA. Los métodos para síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-62 (1981), y Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (19181) .

Las digestiones de enzimas de restricción, fosforilaciones, ligaciones y transformaciones se hicieron como se describen! en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed . (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.! Al menos que se especifique de otra manera, todos los reactivos y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI) , Invitrogen (Gaithersburg, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) .

Los términos "codificación" y "codificar" se refieren al proceso por el cual un gen, a través de los mecanismos de transcripción y 'traducción, proporciona información a una célula a partir de la cual se puede ensamblar una serie de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos especifica para producir una proteína activa. Debido a la degeneración del código genético, ciertos cambios de bases en la secuencia de ADN no cambian la secuencia de aminoácidos de una proteina . Consecuentemente, ' la presente descripción abarca cualquier modificación a. una .secuencia de nucleótidos que no afecta sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína codificada.

El término "alineación" se refiere aquí a un número de secuencias de nucleótidos o aminoácidos alineadas en comparación a lo largo de manera que los componentes, es decir, bases de nucleótidos o residuos de aminoácidos, en común ("idéntico"), "similar" y/o diferente puedan ser gráfica y fácilmente identificadas. Adicionalmente, el término "alineación" incluye alineaciones globales y locales entre cualquiera ; de dos o más secuencias. Entre otras aplicaciones, "alineación" se puede usar para determinar los números de componentes en común ("idénticos") y por lo tanto la "identidad" entre dos o más secuencias de nucleótidos o péptidos. "Alineación" también puede usarse para determinar los números de componentes "similares" y por lo tanto "similitud" entre dos o más nucleótidos o secuencias de péptidos. Asi, "alineación" se puede usar para determinar la "homología" entre; secuencias y para identificar los "dominios conservados" y la relación dentro de esos dominios. Las alineaciones de secuencias y registros para la identidad y/o similitud en porcentaje de secuencias se puede determinar al usar programas de computadora conocidos en la técnica, tales como el paquete ,GCG Wisconsin versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9585 Scranton Road, San Diego, Calif. 92121-3752 USA, o EmbossWin versión 2.10.0 (al usar el programa "aguja"). Alternativamente, la similitud o identidad en porcentaje se puede determinar al buscar contra bases de datos, al usar algoritmos tales como FASTA, BLAST, entre algunos otros . : Los términos "identidad" ' y "similitud, " así como "idéntico" y "similar," respectivamente, se pueden determinar por alineación de 'al menos dos secuencias de nucleótidos o de dos péptidos, por, medio de un algoritmo de alineación global y/o local.. Los : valores de identidad son los números o valores en porcentaje de posiciones que, después de la alineación con al menos una de las secuencias aquí proporcionadas, tienen exactamente los mismos nucleótidos o aminoácidos en las mismas posiciones en una secuencia dada. Los valores de similitud son los números o valores en porcentaje de posiciones que, después de la alineación con al menos una de las secuencias aquí proporcionadas, tienen nucleótidos o aminoácidos similares en las mismas posiciones en una secuencia dada. Se entiende por lo tanto que aminoácidos similares son aquellos con propiedades similares, lo cual incluye .pero no se limita a, aminoácidos ácidos, aminoácidos básicos, aminoácidos aromáticos, aminoácidos alifáticos, aminoácidos polares y aminoácidos no polares, entre otras propiedades. También se entiende · por lo tanto que nucleótidos "idénticos" o aminoácidos se consideran "similares", también. Así, las secuencias se pueden referir como "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando comparten al menos 90% y 70% de identidad de secuencias sobre su longitud completa, respectivamente.

El término "homología," como se usa en esta descripción, se refiere a una ¡similitud de secuencia entre una secuencia de referencia aquí proporcionada y al menos un . fragmento de un inserto de clon recientemente formado en secuencia o su secuencia de aminoácidos codificada. Las secuencias que son homologas, es decir, que comparten una importante similitud de secuencia, con alguna (s) secuencia (s) aquí descrita (s), también se contemplan. Además, las secuencias que son homologas a aquellas aquí descritas se pueden derivar de cualquier planta de elección, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, y particularmente especies de plantas agricolamente importantes. Se conocen diversos métodos diferentes para ' identificar y definir estas secuencias funcionalmente homologas, los cuales se pueden clasificar como "ortólogos" y "parálogos," respectivamente. Los ortólogos son genes, en especies diferentes, que tienen una secuencia similar: y una función similar y que se derivan por medio de un evento de formación de especies. Debido a que las plantas tienen ancestros comunes, muchos genes en algunas especies de plantas tendrán un gen ortólogo correspondiente en otra especie dé planta. Una vez que se ha identificado una secuencia ortóloga, la función del "ortólogo" se puede deducir a partir ,de la función identificada de la secuencia de referencia. 'Los parálogos son genes estructuralmente relacionados dentro de una especie sencilla y se derivan por un evento de duplicación, por lo cual las proteínas codificadas respectivas pueden retener funciones similares. Para los propósitos actuales, un parálogo adecuado de un gen que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 1 debería; codificar una proteína con una actividad reguladora transcripcional comparable.

Por la frase ' "molécula ( s) aislada(s) de ácido nucleico" se pretende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido retirada de' su ambiente nativo. Por ejemplo, las moléculas recombinantes de ADN contenidas en un constructo de ADN se consideran! aisladas para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas aisladas de AND incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospederas heterólogas o moléculas de ADN que se purifican, parcial o sustaricialmente, en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen transcritos de ARN in vitro de las moléculas de ADN. de la presente invención. Las moléculas aisladas de ácido, nucleicos incluyen además tales moléculas producidas sintéticamente.

La frase "ácido nucleico heterólogo" se refiere a un ácido nucleico, AND o ARN, que ha sido introducido dentro de una célula (o el precursor de la célula) . Tal ácido nucleico heterólogo puede comprender segmentos que son una copia de una secuencia que se encuentra naturalmente en la célula dentro de la cual ha sido introducida, o fragmentos de las mismas.' 1 La presente [ descripción proporciona metodología y constructos para incrementar la sedimentación en la pared celular y densidad de biomasa de la planta. Como un ejemplo no limitativo, ; se proporciona el 'incremento de la sedimentación en la pared celular y densidad de la madera en el álamo. La madera es esencialmente una matriz de paredes celulares y espacios celulares de aire a partir del xilema secundario. Megraw, WOOD QUALITY FACTORS IN LOBLOLLY PINE (Tappi Press, 1985), página 88. En este sentido, la densidad de la madera se determina por el grosor de la pared celular, el área de sección transversal del paso de los vasos, y el número de los vasos involucrados en el transporte de agua a través del tallo, Roder.ick y Berry, New Phytol . 149: 473 (2001); Preston et al., New Phytologist 170: 807-18 (2006). Se ha demostrado en Eucalyptus y otras especies de angiospermas que la densidad de la Madera se correlaciona negativamente con1 la conductividad hidráulica y el área de sección transversal de los vasos. Thomasa et al., Forest Ecology and Management 193: 157-65 (2004); Preston et al., New Phytologist, : 170: 807-18 (2006) . Otros ejemplos no limitativos incluyen el incremento en la sedimentación en la pared celular y/o ;biomasa en una diversidad de plantas, tales como frijol de soja, maíz, trigo, cañóla, algodón, soya, cañóla, alfalfa, caña de azúcar, y arroz, para una diversidad de aplicaciones qüe incluyen pero no se limitan a cereales; bebidas; producto's de dulcería; azúcares y edulcorantes; alimentos para :animales; . fibras; colorantes; taninos; pinturas; resinas; látices; hidrogeles; pinturas; aceites; ceras; perfumes; ; flores y ornamentales; colorantes para alimentos; especias; hierbas; medicinas; productos farmacéuticos; y farmacéuticos de nutrición.

Secuencias de Nucléotidos y Polipéptidos Las secuencias de ADN walldof se ilustran por, pero no se limitan a, la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, asi como por las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden las variantes de SEQ ¡ID NO: 1, con una o más bases eliminadas, sustituidas, insertadas, o adicionadas, variantes las cuales codifican los polipéptidos caracterizados por la actividad WALLDOF, como se describe anteriormente.

Una "variante" es un nucleótido o secuencia de aminoácidos que se desvia del estándar, o dado, nucleótido o secuencia de aminoácidos de un gen o proteina en particular. Los términos "isoforma, " "isotipo," y "análogo" también se refieren a formas "variantes" . de un nucleótido o una secuencia de aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos 'que se altera por la adición, remoción, o sustitución de uno o más aminoácidos, o un cambio en la secuencia de nucleótidos se puede considerar una secuencia "variante". La variante puede tener cambios "conservadores", en donde un aminoácido sustituido tiene! propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, el reemplazo de leucina con isoleucina. Una variante puede tener cambios "no conservadores", po:r ejemplo, el reemplazo de una glicina con un triptofano. Variaciones análogas menores también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambas.

La guia para la determinación de cuales residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o eliminar, se puede encontrar al usar programas de cómputo bien conocidos tales como la Suite Vector NTI (InforMax, D) . La "variante" también puede referirse a un "gen- mezclado" como se describe, por ejemplo, en varias patentes cedidas a Maxygen, Inc. (Redwood City, CA) , tales como las patentes de E.U.A. No. 6,251,674 y No. 6,500,639. Consecuentemente, una "variante" se puede tomar de variantes de secuencias y polinucleótidos deseados que se modifican de acuerdo con los métodos y el razonamiento descrito en la patente de E.U.A. No. 6,132,970, la cual se incorpora en la presente como referencia.

Las secuencias de polipéptidos WALLDOF ejemplares incluyen pero no se limitan a la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, asi- como secuencias de · polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados, insertados, o adicionados que conservan todavía la actividad WALLDOF. Las secuencias WALLDOF incluyen secuencias de polipéptidos que tienen al menos una porción de consenso de aminoácidos, preferiblemente ají menos dos porciones de consenso de aminoácidos, más preferiblemente al menos tres porciones de consenso de aminoácidos, más preferiblemente al menos cuatro porciones de consenso de aminoácidos, más preferiblemente al menos cinco porciones de consenso de aminoácidos, lo más preferiblemente al menos seis porciones de consenso de aminoácidos y lo; más preferiblemente las siete porciones de consenso de aminoácidos como se describen en la Figura 5. La presente descripción también abarca uno o más dominios conservados WALLDOF formados por al menos una porción de consenso de aminoácidos, preferiblemente al menos dos porciones de consenso de aminoácidos, más · preferiblemente al menos tres porciones de consenso de aminoácidos, más preferiblemente al menos cuatro porciones de consenso de aminoácidos, más preferiblemente al menos cinco porciones de consenso de aminoácidos, lo más preferiblemente al menos seis porciones de consenso de aminoácidos y lo más preferiblemente las siete porciones de consenso de aminoácidos como, se describen en la Figura 5.

Adicionalmen e , pueden existir formas múltiples de WALLDOF, las cuales se pueden deber a la modificación post-traduccional de un producto génico, o a forma múltiples de los genes respectivos walldof. Las secuencias que tienen tales modificaciones y que codifican un factor de transcripción WALLDOF también se incluyen.

En esta descripción, un "dominio conservado" o una "región conservada" es una región que está altamente conservada entre determinadas secuencias de polinucleótido o polipéptido, es decir, en donde hay un grado relativamente alto de similitud de secuencia entre las distintas secuencias. También, estos términos se refieren a dominios de secuencias de polipéptidos , los cuales se codifican por secuencias de polinu.cleótidos, que forman estructuras tridimensionales ; y unidades funcionales relativamente conservadas a lo largo de la evolución. Las frases "dominio conservado" o "región conservada" también abarcan unidades compactas, locales, y . semi-independientes , a menudo estables y plegadas de manera independiente, formadas por el empaque de "porciones de consenso de aminoácidos" codificadas por las secuencias de polinucleótidos .

La frase "porción de consenso de aminoácidos" se refiere a la porción o subsecuencia de una secuencia de polipéptidos que está sustancialmente conservada entre los polipéptidos.

Análisis de Secuencias Se incluye en la categoría de secuencias "variantes", las secuencias que hibridizan a una secuencia de referencia de ADN walldof. Para los propósitos actuales, dos secuencias se hibridizan cuando forman un complejo de hebra doble en una solución de hibridación de SSC 6X, 0.5% SDS, solución Denhardt 5X y lOODg de ADN de portador no específico. Véase Ausubel et al., supra, en la sección 2.9, complemento 27 (1994). Las secuencias se pueden hibridizar a "severidad moderada", lo cual se define como una temperatura de 60°C en una solución de hibridación de SSC 6X, 0.5% SDS, solución de Denhardt 5X y ???µ? de ADN de portador no especifico. Para hibridación de "alta severidad", la temperatura se incrementa hasta 68°C. Después de la reacción de hibridación de severidad moderada, los nucleótidos se lavan en una solución de SSC 2X más 0.05% SDS durante cinco veces a temperatura ambiente, con lavados posteriores con SSC 0. IX más SDS al 0.1% a 60°C por 1 hora. Para alta severidad, la temperatura de lavado se incrementa hasta 68°C. Alguien con experiencia ordinaria en la técnica puede seleccionar fácilmente tales condiciones al variar la temperatura durante la reacción de hibridación y proceso de lavado, la concentración de sales durante la reacción de hibridación y proceso de lavado, y asi sucesivamente. Para los propósitos actuales, nucleótidos hibridizados son aquellos que se detectan al usar 1 ng de una sonda radioetiquetada que tenga una radioactividad especifica de 10,000 cpm/ng,' donde los nucleótidos hibridizados estén claramente visibles después de la exposición a una película de rayos X a 70°C por no más de 72 horas.

La presente descripción abarca tales moléculas de ácido nucleico que son al menos 40%. 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a una secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID NO: 1.

Se prefieren las moléculas de ácido nucleicos que tengan al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Las diferencias ;entre dos secuencias de ácidos nucleicos pueden presentarse en las posiciones de 5' o 3' terminal de la secuencia de nucieótidos de referencia o en alguna parte entre aquellas posiciones terminales, interpuestas ya sea individualmente entre ios nucieótidos en la secuencia de referencia o en ;uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como un asunto práctico, el establecimiento de si alguna molécula de ácido nucleico en particular es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucieótidos de referencia implica una comparación hecha entre dos moléculas, al usar algoritmos conocidos en la técnica y que se pueden determinar convencionalmente al usar programas de cómputo públicamente disponibles tales como el algoritmo BLASTN. Véase Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389- i 402 (1997) . ; Constructos de ácido nucleico En un aspecto1, la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 se incorpora dentro de un constructo de ácido nucleico que es adecuado para introducción dentrc de una planta o célula.

Así, tal constructo de ácido nucleico se puede usar para modular la expresión del gen walldof en una planta o célula de planta. La modulación de la expresión del gen walldof en una planta o célula de planta se logra al incorporar en el constructo de ácido nucleico un promotor tal como los que se describen en la solicitud PCT WO 2005/096805, antes incorporada, los cuales efectúan una expresión preferida del tejido. Otros promotores constitutivos o preferidos de tejido se pueden integrar dentro de un constructo de AD .

La sedimentación en la pared celular y la densidad de biomasa de, la planta se pueden modificar al introducir un constructo de ácido nucleico como se describe en la presente. También se proporcionan cé^las de plantas que contienen tales constructos; plantas derivadas allí a partir de tener expresión de gen .walldof modificada y la progenie de tales plantas. | Como una fuente de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican WALLDOF, un ADNc o ADN genómico o polinucleótido sintético adecuados pueden ser usados. Los métodos para el ^aislamiento de secuencias de ADN walldof adecuadas se describen, supra. Las secuencias que codifican todo, o sustancialmente todo, el factor de transcripción pueden así ser obtenidas. Las longitudes adecuadas de esta secuencia de ADN se pueden cortar para uso por medio de enzimas de restricción. Cuando se usa el ADN genómico¦ como la fuente de la secuencia base parcial para la transcripción, es posible usar ya sea las regiones de intrón o exón o una combinación de ambas.

Para obtener constructor adecuados para modificar la expresión del gen walldof en células de plantas, la secuencia de ADNc como se encuentra en el ADNc del factor de transcripción o la secuencia de genes como se encuentra en el cromosoma de la . planta se pueden usar. Los constructos recombinantes de 'ácidos nucleicos se pueden hacer al usar técnicas estándar. Por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos para transcripción se puede obtener al tratar un vector que contiene la secuencia con las enzimas de restricción para cortar el segmento apropiado. La secuencia ' de ácidos nucleicos para transcripción también se puede generar al combinar los pares de bases y ligar los oligonucleótidos , sintéticos o al usar oligonucleótidos sintéticos en una ;reacción en cadena de polimerasa (PCR) para dar sitios de restricción adecuados en cada extremo. La secuencia de ácidos nucleicos luego se clona en un vector que contiene elementos reguladores adecuados, tales como secuencias de terminador cadena abajo y de promotor cadena arriba.

Un aspecto importante de la presente descripción es el uso de constructos de ácidos nucleicos en donde una secuencia codificadora de WALLDOF está ligada operativamente a una o más secuencias reguladoras, que impulsan la expresión de la secuencia codificadora de WALLDOF en determinados tipos de células, órganos, o tejidos sin afectar indebidamente el desarrollo normal o la fisiología de la planta.

"Promotor" refleja una región de ADN cadena arriba desde el inicio de la transcripción que se involucra en. el reconocimiento y< enlace de polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor constitutivo" es uno que está activo a lo largo de la vida de la planta y bajo la mayoría de las condiciones ambientales. Los promotores específicos de tejido, preferidos de tejido, específicos de órganos, específicos de tipo celular, y promotores inducibles constituyen la clase de "promotores no constitutivos." "Ligado operativamente" se refiere a la ligadura funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción de 'la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, "ligado operativamente" significa que las ;secuencias de ácidos nucleicos que se ligan están contiguas. 1 Los promotores útiles para la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos introducida dentro de una célula para incrementar la ¦ expresión del gen walldof pueden ser promotores- constitutivos, tales como el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV) , o promotores específicos de tejido, preferidos de tejido, específicos de órganos, preferidos de Órganos, específicos de tipo celular, promotores inducibles, o algunos otro(s) promotor (es) adecuado (s) . Por ejemplo, al usar promotor específico del sistema vascular, específico del xilema, o promotor preferido de xilemas, se , puede modificar la actividad WALLDOF específicamente en muchos tejidos tales como los tejidos vasculares, especialmente xilema. El uso de un promotor constitutivo afecta en general los niveles de enzimas y las funciones en todas las partes de la planta, mientras que el uso de un promotor preferido de tejido permite dirigir la expresión modificada de genes a partes específicas de plantas, lo que conduce a fenotipos más controlables.

Así, se puede encontrar conveniente usar un promotor que impulse la expresión durante la biogénesis de la pared celular, por lo cual el factor de transcripción WALLDOF se modularía solamente en los órgano(s) o tejido(s) o tipo de célula (s) en las cuales su acción se requiere. Como se usa aquí, "promotor .preferido de xilema" significa que las moléculas de ácido nucleico aquí descritas son más activas en el xilema en comparación con algún otro tejido de .planta. Los promotores preferidos de xilema que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a, el promotor del gen de cumarato-4 -hidroxilasa (C4H) preferido de xilema, el promotor de gen de tubulina preferido de xilema (TUB) , y el promotor del gen de protei'na de transferencia de lipidos preferido de xilema (LTP) . Otros promotores adecuados preferidos de xilema se describen en WO .2005/096805, supra.

Un constructo puede contener también secuencias de terminación las cuales se colocan cadena abajo de las moléculas de ácidos nucleicos aquí descritas, tal que se termine la transcripción del ARNm, y se agreguen secuencias polyA. Ejemplos de tales terminadores son el terminador 35S del virus mosaico; de la coliflor "(CaMV) y el terminador del gen de nopalina sintasa (TNOS) . El constructo también puede contener potenciadores , codones de inicio, secuencias de señal de empalme, y secuencias de dirección.

Un constructo puede contener opcionalmente un marcador de selección por lo cual las células transformadas se pueden identificar en cultivo. El marcador puede asociarse con la molécula heteróloga de ácido nucleico, es decir, el gen ligado operativamente a un promotor. Como se usa aquí, el término "marcador" .se refiere a un gen que codifica un aspecto o un fenotipo 'que permite la selección de, o el cribado para, una , planta o célula que contiene el marcador.

En las plantas, por ejemplo, el gen marcador puede codificar resistencia a antibióticos o herbicidas. Esto permite la selección de células transformadas de entre las células que no se transforman ; o transfectan.

Ejemplos de marcadores de selección adecuados incluyen sin limitación adenosina desaminasa, dihidrofolato reductasa, higromicina- -fosfotransferasa, timidina cinasa, xantina-guanina fosfo-ribosiltransferasa, resistencia a glifosato y glufosinato, y: amino-glicósido 3' -0-fosfotransferasa (resistencia a ;kanamicina, neomicina y G418) . Estos marcadores pueden, incluir resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, y gentamicina. El constructo también puede contener el gen marcador de selección Bar, el cuál le otorga Resistencia a los análogos de fosfinotricina herbicidas como el glufosinato de amonio. Thompson et al., EMBO J. 9: '2519-23 (1987) . También se conocen otros marcadores de selección adecuados.

Los marcadores visibles tales como la proteína verde fluorescente (GFP) pueden ser usados. Los métodos para la identificación o selección de plantas transformadas con base en el control de la división celular también se han descrito. Véase WO 2000/052Í68 y O 2001/059086.

Las secuencias de replicación, de origen bacteriano o viral, también se¦ pueden incluir para permitir que se clone el constructo en un hospedero bacteriano o de fagos. Preferiblemente, se usa un origen de replicación procariótico de rango amplio de hospedero. Un marcador de selección para bacterias se puede incluir para permitir la selección de células bacterianas que llevan el constructo deseado. Los marcadores de selección procarióticos adecuados también incluyen la resistencia a antibióticos tales como kanamicina o tetraciclina .

Otras secuencias de ácidos nucleicos que codifican funciones adicionales también pueden estar presentes en el constructo, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, cuando Agrobacterium es él hospedero, las secuencias de ADN-T se pueden incluir para facilitar la . transferencia posterior hacia y la incorporación dentro de los cromosomas de las plantas. : Plantas para Ingeniería Genética La presente descripción permite la manipulación genética de plantas para Incrementar la sedimentación en la pared celular y/o densidad de biomasa, por medio de la modulación de una secuencia de polinucleótidos que codifica WALLDOF.

A este respecto, las plantas incluyen sin limitación especies de Eucalyptus, especies de Álamo, coniferas, sauce, caña de azúcar, sorgo, trigo, maíz, algodón, frijol de soja, alfalfa, vegetales (incluyendo pero no limitado a brócoli, coliflor, col, rábano, col china,' cebolla, zanahoria, pepino, pimiento, tomate, berenjena, calabacita, calabaza seca, calabaza, okra, ' espinaca, frijol seco, puerro o poro, chícharo, lechuga, hinojo, frijol de jardín, remolachas, etc.), melones, sandías, cañóla (colza), arroz, cebada, cacahuate, gandul o frijol de palo, mijo, uvas, bayas (incluyendo pero: no limitado ¦ a mora azul, zarzamora, frambuesa, mora de morera, arándano, baya de Boysen, etc.), frutos de árboles (incluyendo pero no limitado¦ a ciruela, durazno, nectarina, chabacano o albaricoque, kiwi, granada, mango, higo, naranja, limón, lima, naranja sanguina, toronja, manzana, plátano, i y los similares), árboles de nueces (coco, nuez de Castilla (Inglesa y negra), nuez pacana, almendra, avellana, nuez del Brasil, nuez de nogal americano, bellota), plantas productoras oleaginosas (incluyendo pero no limitado a girasol, colza, ¦ etc.) pasto Sudán, pasto elefante, pasto varilla, pasto afiricano, y pasto cola de gato o plumacho, entre otros. Sin iembargo, . esta lista no es de ninguna manera limitativa,- ya que otros tipos de plantas se conocerán por aquellos expertos; en la técnica y se pueden usar para incrementar la sedimentación celular y la biomasa.

La presente ' invención es útil en particular para preparar por ingeniería plantas para una diversidad de industrias y aplicaciones que incluyen pero no se limitan a la industria de la pulpa y papel y la industria de bioenergia, productos forestales en general, cargas para biomasa, biomateriales para bioenergia, cereales, bebidas, productos de dulcería, azúcares y edulcorantes; fibras; colorantes; taninos; pinturas; resinas; látices, hidrogeles, pinturas, aceites, ceras, perfumes, flores y ornamentales, colorantes para alimentos, especies, hierbas, medicinas, productos farmacéuticos, farmacéuticos para nutrición, bambú, corcho, y madera.

La manipulación genética abarca cualquier metodología para introducir un ácido nucleico en un organismo hospedero o de otra manera modificar la expresión genética del organismo. Por ejemplo, una ;planta se modifica genéticamente cuando se transforma con ¦ una secuencia de polinucleotidos que incrementa la expresión de un gen, tal como walldof, y por ello incrementa ,1a sedimentación en la pared celular y densidad de biomasa. En contraste, una planta que ·?? se transforma con una secuencia de polinucleotidos es una planta de control y se refiere como una planta "no transformada".

En determinadas modalidades, las plantas genéticamente modificadas se seleccionan que ltienen un constructo de ADN que incorpora el gen walldof en su genoma. Como un ejemplo, una planta transgénica de álamo así transformada se distingue de una planta de álamo no transformada por el hecho de que comprenden al menos una copia de la molécula de ácido nucleico establecida en SEQ- ID NO: 1 integrada establemente dentro de su genóma además de copias de tal molécula que se presentan naturalmente en la planta de álamo no transformada.

"Planta" es ¦ un término que abarca plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo hojas, tallos, raices, etc. ) , maderas verdes, células de plantas diferenciadas o no diferenciadas, y progenie de la misma. El material de plantas incluye, sin limitación cultivos en suspensión de maderas verdes, embriones, regiones meristemáticas , tejidos callosos, hojas, raices, brotes, tallos, fruto, gametofitos, esporofitos, polen, y ' microesporas . La clase de plantas que se pueden usar es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores afines para técnicas de ingeniería genética, incluyendo angiospermas, tanto plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, así como gimnospermas . El término también 'denota cualquier material celulósico de plantas que se pueda manipular genéticamente, incluyendo pero no limitado a ¡células de plantas diferenciadas o no diferenciadas, prbtoplastos , plantas completas, tejidos de plantas, u órganos dé plantas, o. cualquier componente de una planta tal como una hoja, tallo, raíz, botón, tubérculo, fruto, rizoma, o los similares. Como se usa aquí, "propágulo" incluye una estructura con la capacidad de dar lugar a una planta nueva, por ejemplo, una semilla, una espora, o una parte del cuerpo vegetativo capaz de crecimiento independiente si se desprende del precursor.

En esta descripción,, el término "bioenergia" denota energía útil, renovable producida a partir de materia orgánica, la conversión de carbohidratos complejos de materia orgánica en energía. La materia orgánica puede usarse ya sea directamente como , combustible , quemarse como es para producir electricidad, procesarse en líquidos y gases, o ser un residuo de procesamiento y conversión.

El término ¦ "biomasa" significa cualquier materia orgánica que está disponible en una base renovable o recurrente, incluyendo cultivos agrícolas (es decir alimento y fibra) cultivos: para cosecha y árboles, madera y residuos de madera, plantas (incluyendo plantas acuáticas) , pastos y otros materiales^ residuales. La biomasa se produce generalmente en una forma sustentable a partir de agua, nutrientes minerales, y. dióxido de carbono por fotosíntesis.

Un incremento en la biomasa o la densidad de biomasa se puede observar por un incremento en al menos uno del fenotipo de planta que in luye pero no se limita a altura; peso, tamaño o números¦ de hojas; longitud y grosor de los brotes; longitud, grosor y ramificación de las raíces; producción de semillas por planta; floración; números y tamaños de células en tejidos, incluyendo tejidos formadores de madera; y desarrollo de órganos reproductores de las plantas.

Métodos Ilustrativos para la Modificación Genética Una secuencia de polinucleótidos, tal como una secuencia de ADN walldof,' se puede integrar establemente en un genoma de planta en diversas maneras conocidas en la técnica. Tanto las células de plantas del angiosperma o gimnosperma de monocotiledóneas y dicotiledóneas pueden ser transformadas. i Por ejemplo, ver Klein et al., Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al., C. R. Acad. Sci . Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al., Mol. Gen. Genet . 204:383-396 (1986); Paszowski et al . , , EMBO ' J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi et al., Célula de planta Rep . 13: 26 15-286 (1994) . Las especies de Agrobacterium talles como A. turnefaciens y A. rhizogenes pueden ser usadas,; por ejemplo, de acuerdo con Nagel et al., Microbiol Lett 67: 325 (1990). Adicionalmente, se pueden transformar las plantas por transformación de Rhizobium, Sinorhizobium o Mesorhizobium. Broothaerts et al., Nature 433: 629-633 (2005);. ' Métodos adicionales · para modificar genéticamente una planta o célula incluye, pero no se limita a, electroporación, bombardeo con pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature. 327:70-73), precipitación con fosfato de calcio, y fusión con polietilenglicol, transferencia dentro de los granos de polen en germinación, transformación directa (Lorz et al., Mol. Genet. 199: 179-182 (1985)), y otros métodos conocidos en la técnica. Si se emplea un marcador de selección, tal como resistencia a la kanamicina, se hace más fácil determinar cuáles células se han transformado exitosamente. Los genes marcadores pueden estar incluidos dentro < de los pares de sitios de recombinación reconocidos por recombinasas especificas tales como ere o flp para facilitar la remoción del . marcador después de la selección. Ver ,1a solicitud de patente publicada No. 2004/0143874. \ Para los propósitos de esta descripción, una secuencia de ADN walldof ligada operativamente a un promotor se puede introducir dentro de una planta o célula. Por ejemplo, un constructo ilustrativo puede comprender una secuencia walldof ligada operativamente a un promotor preferido de xilema.

Transformación de :Plantas La presente , descripción comprende la manipulación genética de plantas, especialmente plantas mencionadas supra o cualquier planta' útil para cualquier industria o aplicación descrita supra, para incrementar la sedimentación en la pared celular y/o densidad de biomasa.

La frase "planta transgénica" se refiere á una planta que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que también está presente per se en otro organismo o especie o que se optimiza, con relación al uso del codón hospedero, desde otro organismo o especie. Tanto las células de plantas de angiospermas -o gimnospermas de monocotiledóneas o dicotiledóneas sé pueden transformar en diversas formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, ver Klein et al., Biotechnology 4: 583-90 (1993); Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-99 (1993); Bent et al., Mol. Gen. Genet . 204: 383-96 (1986); Paszo ski et al., EMBO J. 3: 2717-22 (1984); Sagi et al., Plant Cell Rep. 13: 262-66 (1994)-. Las especies Agrobacterium tales como A. turnefaciens y A. rhizogenes se pueden usar de acuerdo con Nagel et al., Microbiol Lett 67: 325 (1990), por ejemplo. Adicionalmente, las plantas se pueden transformar por transformación con Rhizobium , Sinorhizobium o Mesorhizobiu . Broothaerts et al., Nature 433: ; 629-33 (2005). También, la frase "planta transgénica" se refiere a una planta que ha incorporado una secuencia de ADN, ¦ que incluye pero no se limita a genes que no se presentan normalmente en un genoma de planta hospedero, las secuencias de ADN no se transcriben normalmente en ARN o traducen en una proteina ("expresada") , o cualquiera de otros genes o secuencias de ADN que se desea introducir en la planta no transformada, tales como genes que normalmente se pueden presentar en. la planta no transformada pero que se desea ya sea para modificar genéticamente o tener expresión alterada. La categoría de "planta transgénica" incluye ambos un transformante primario y una planta que incluye un transformante en su linaje, por ejemplo, po-r medio de introgresión estándar u otro procedimiento de reproducción.

Por ejemplo, Agrobacterium se puede transformar con un vector de expresión de. planta por medio de electroporación, por ejemplo, después de lo cual el Agrobacterium media la introducción del vector expresión en células de plantas. Los métodos adicionales para realizar esto incluyen pero no se limitan a electroporación, bombardeo con pistola de partículas, precipitación con fosfato de calcio, y fusión de polietilenglicol , ; transferencia en granos de polen en germinación, transformación, directa , Lorz et al., Mol. Genet . 199: 179-82 (1985), y otras técnicas conocidas. Si un marcador de selección, tal como resistencia a la kanamicina, se emplea, esto hace más fácil determinar qué células se han transformado exitosamente. Los genes marcadores se pueden incluir dentro ide pares de sitios de recombinación reconocidos por re'combinasas específicas, tal como ere o flp, para facilitar la eliminación del marcador después de la selección. Véase Solicitud publicada de E.U.A. No. 2004/0143874.

Las plantas transgénicas sin genes marcadores se pueden producir usando un segundo plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica el marcador, distinto de un primer plásmido que comprende una secuencia de ADN walldof. El primer y segundo plásmidos o porciones de los mismos se introducen en la: misma célula de planta, tal que el gen marcador de selección que se expresa de forma transitoria, células de plantas transformadas se identifican, y las plantas transformadas se obtienen en lo que la secuencia de ADN walldof se integra establemente en el genoma y el gen marcador de selección no se integra establemente. Véase Solicitud publicada de E.U.A. No. 2003/0221213. Las plantas transgénicas también se pueden producir sin marcadores de selección, como las plantas se pueden analizar por diversos métodos que incluyen sin limitación secuenciación de PCR y ADN.

Los métodos de transformación de Agrobacterium discutidos arriba ;se conocen que son útiles para transformar dicotiledóneas. Adicionalmente , de la Pena et al., Nature 325: 274-76 (1987), Rhodes et al., Science 240: 204-07 (1988), y Shimamato et al., Nature 328: 274-76 (1989), documenta la metodología . para usar Agrobacterium a transformar monocotiledóneas de cereales. También, ver Bechtold et al.,' Methods Mol Biol. 82: 259-66 (1998), que ilustra infiltración de vacio por transformación mediada por Agrobacterium . ; Las células : de plantas se pueden transformar con un constructo de ácido nucleico ' descrito en la presente sin el uso de un marcador de selección o visible y organismos transgénicos se pueden identificar al detectar la presencia del constructo introducido. La> presencia de una proteina, polipéptido, o molécula de ácido nucleico en una célula particular se puede medir para determinar si, por ejemplo, una célula se ha transformado exitosamente o transíectado . Por ejemplo, y como rutina en la técnica, la presencia del constructo introducido se puede detectar por PCR u otros métodos adecuados : para detectar un ácido nucleico especifico o secuencia de polipéptido. Adicionalmente, las células transformadas se pueden identificar al reconocer diferencias en la velocidad de crecimiento o una característica morfológica de una célula transformada comparada con la velocidad de crecimiento o una característica morfológica de una célula no transformada que se cultiva bajo condiciones similares. Véase WO 2004/076625.

Los métodos para regenerar una planta transgénica de una célula transformada o cultivo varía de acuerdo con . las especies de planta pero se basan en metodología conocida. Por ejemplo, los métodos para regeneración de plantas de Nicotiana y Eucalyptus transgénicas son bien conocidos.

Selección y Análisis de Plantas Genéticamente Modificadas Las plantas genéticamente modificadas se seleccionan que tienen expresión modulada del gen walldof con relación a una planta no transgé'nica de la misma especie. Adicionalmente, diversas modalidades de las plantas genéticamente modificadas inventivas pueden tener sedimentación incrementada en la pared celular y densidad de biomasa. Por ejemplo, una planta transgénica inventiva puede tener un fenotipo caracterizado por (1) una sedimentación incrementada en la pared celular como se visualiza; y mide, por análisis histoquímico (2) una área de la pared .alterada y porcentaje de área de la pared sobre el área celular total tal que la' densidad de biomasa se incrementa debido ;al área de la pared y porcentaje de área de la pared sé correlacionan positivamente con densidad de biomasa.

La frase "expresión modulada" se refiere a modular el nivel del factor de transcripción WALLDOF que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2 en niveles desde 10 hasta "50% más altos que el polipéptido regulador endógeno, preferiblemente desde 30 hasta 80% más altos que del, polipéptido regulador endógeno, más preferiblemente desde 50 hasta 150% más altos que del polipéptido regulador endógeno, más preferiblemente desde 70 hasta 200% más altos que del polipéptido regulador endógeno, más preferiblemente 100 hasta 300% más altos que del polipéptido regulador endógeno. Las plantas, célula de planta, y partes de la planta que tienen el cásete de expresión también se proporcionan.

La frase "sedimentación en la pared celular,", se refiere a la construcción y biosintesis de una pared cellular de planta a través de la sedimentación de moléculas estructurales o no. estructurales. Más particularmente, las moléculas depositadas por biosintesis de pared celular comprenden celulosas, hemicelulosas, polisacáridos pécticos, proteínas, ligninas, suberinas, cera y cutina, pero no es de ninguna manera que limita a estos. La frase "sedimentación en la pared celular" también se refiere a ambas síntesis de pared celular primaria y secundaria en cualquiera de las células de plantas o tejidos u órganos, lo cual incluye "pero no se limita a xilema, floema, parénquima, meristemas, así como cambium, raíz, tallo, hoja, madera verde, botones "de flores, entre muchos otros.

La frase "sedimentación incrementada en la pared celular" se refiere a un incremento cuantitativo del grosor de pared celular manera que el área de pared celular porcentaje del área de la pared sobre el área celular se puede incrementar desde al menos 10 hasta 50% preferiblemente , desde al menos 30 hasta 80%, más preferiblemente ; desde al menos 50 hasta 150%, más preferiblemente desde al menos 70 . hasta 200%, más preferiblemente desde al menos 100 hasta 30C% del área de pared celular y porcentaje del área de la pared sobre el área celular total de una planta no transformada.

La frase "densidad de biomasa incrementada" se refiere a un incremento cuantitativo de densidad de biomasa relativo a una planta no transformada de la misma especie. La densidad de biomasa de una planta fabricada por ingeniería como se proporciona en la presente se puede incrementar desde al menos 10 hasta 50% preferiblemente desde al menos 30 hasta 80%, más preferiblemente desde al. menos 50 hasta 150%, más preferiblemente desde al menos 70 hasta 200%, más preferiblemente desde al menos 100 hasta 300% de la densidad de biomasa de una jplanta no transformada.

Métodos para Cuantificar Sedimentación Incrementada en la Pared Celular ; Las plantas modificadas genéticamente proporcionadas en la presente se pueden caracterizar por una sedimentación " 55 incrementada en la pared celular. Esto sé alcanza al modular la expresión de un gen walldof. Modular la expresión de gen walldof en una planta o célula de planta se alcanza al incorporar en un constructo de ácido nucleico un promotor tal como los citados en supra que muestran una expresión preferida de tejido. También es una modalidad para generar plantas transgénicas que expresan la proteina WALLDOF, preferiblemente bajo el control de promotores diferentes, tales como otros promotores específicos de tejidos o promotores constitutivos. La sedimentación incrementada en la pared celular se alcanza al expresar una cantidad adecuada de proteína WALLDOF en un tiempo y ubicación adecuados. Tal sintonización fina se puede hacer al determinar el promotor más apropiado, y. también al seleccionar los "eventos" transgénicos que muestren el nivel de expresión deseado.

Las plantas transformadas que expresan niveles deseados de proteína WALLDOF se seleccionan por ejemplo al analizar el número de copias (análisis Southern blot) , niveles de transcripción mARN (por ejemplo RT-PCR usando pares de cebador o pares de flanqueo específicos de la secuencia de ADN walldof) o al ¡analizar la presencia y nivel de proteínas WALLDOF en diversos tejidos (por ejemplo ensayos SDS-PAGE; ELISA, etc) . Los eventos que expresan WALLDOF alto o moderado se seleccionan por pruebas adicionales hasta que se obtiene un evento de élite de alto rendimiento con un constructo de ADN walldof integrado estable.

Las plantas enteras, semillas, células, tejidos y progenie (tales como híbridos Fl, semillas/plantas F2, etc.) de cualquiera de . las plantas transformadas descritas anteriormente se abarcan aquí y se pueden identificar por la presencia del transgen en el ADN, como se determina, por ejemplo, por análisis PCR usando ADN genómico total, como plantilla y usando pares de cebador PCR específico walldof. También métodos de diagnóstico PCR por "evento específico" se pueden desarrollar, donde los cebadores PCR se basan en el ADN de planta que acompaña, el gen quimérico insertado, ver Patente de E.U.A. No. 6,563,026. Similarmente , el polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados AFLP específico del evento o polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción RFLP se puede desarrollar lo que identifica la planta transgénica o cualquier planta, madera verde, tejido o células derivadas del mismo.

Se entiende; que las plantas transgénicas aquí proporcionadas preferiblemente no muestran fenotipos no deseados, tales' como reducción del rendimiento, susceptibilidad mejorada a enfermedades (especialmente a necrotrófos) o cambios arquitectónicos no deseados (enanismo, deformaciones) et¿- y que, si tales fenotipos se observan en los transformantes primarios, éstos se pueden separar por métodos de reproducción y selección (cruzamiento/cruzamiento regresivo/autopolinización, etc.). Cualquiera de las plantas transgénicas descritas en la presente pueden ser homocigotos o hemicigotos por el transgen.

La sedimentación incrementada en la pared celular puede determinarse por el análisis de las secciones histológicas de materiales biológicos tales como el xilema de la madera. En general, el análisis se efectúa en el tallo que puede estar en sección transversal en por ejemplo 10 Dm de grosor, teñido con azul de toluidina. y. observado bajo un microscopio de luz. Las mediciones del área de la pared por célula se pueden hacer al usar el software ImageTools.

Métodos para Cuantificar la Densidad de Biomasa Incrementada El incrementó en la sedimentación en la pared celular resulta en un incremento de la densidad aparente de biomasa. La densidad de biomasa se . puede determinar por cualquier método adecuado. Como un ejemplo está la metodología de rayos X que consiste en cortar discos del tallo de 1 mm de grosor y someter a estos discos a la difracción por rayos X. Las radiografías obtenidas de los discos del tallo se escanean y miden al usar software, de imágenes digitales como se describe, por ejemplo, por Mothe et al., Ann. For. Sci., 55: 301-13 (1998) Los ejemplos específicos de métodos para obtener plantas transgénicas que expresan gen walldof así como métodos para evaluar el efecto fenotípico del gen se presentan. Significa que son¦ ej emplares y no limitativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Identificación del gen walldof en Álamo Para desarrollar los métodos y hacer los constructos de ADN de la presente invención se buscaron primeramente los factores de transcripción que se exprésan preferiblemente en el xilema del álamo.

La biblioteca de más de 400,000 ESTs de la especie Populus disponible en GenBank se buscó por el patrón específico de tejido de genes expresados. Para este propósito las colecciones de ADNc hechas de diferentes tejidos de álamo, se agruparon en tejidos representativos: célula de suspensión, brote [ apical, corteza, cambium, semilla, madera, botón de flores, raíces y hojas. Un conjunto de grupos generados por el programa CAP3 (Huang and Madan, Genome Res., 9:868-877, 1999) se buscó por aquellos compuestos de al menos 90% de EST se lee. de bibliotecas que representan el cambium del álamo y tejidos de madera. Adicionalmente, los grupos se buscaron por aquellos compuestos de al menos tres lecturas EST de tejidos de cambium y de madera y preferiblemente menos de dos lecturas de otras colecciones.

Los grupos seleccionados se alinearon luego, usando el algoritmo Blast-X con un corte e-valor<= le-5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), a secuencias de una base de datos! de factor de transcripción de ñrabidopsis tha liana curada compuesta de secuencias obtenidas de la base de datos AtTFDB de Servidor de Información de Regulador de Gen Arabidopsis (AGRIS) . Los resultados se almacenaron en una base de datos local de factores de transcripción de la especie Populus y buscaron por medio de una interfaz basada en web para filtrar secuencias de factor de transcripción especificas de genes expresados específicamente o preferiblemente en los tejidos de cambium y/o madera de Populus sp.

Entre un grupo de factores de transcripción que se expresaron en una \ manera preferida de cambium y/o madera, se encontró un grupo! que representa un miembro de familia de factor de transcripción DOF con un perfil de expresión preferido de cambium (Figura 1) . El EST que representa este factor de transcripción ' DOF contiene un marco de lectura abierto de 768 bp; 99% idéntico al cuadro de lectura abierto de modelo de gen' estExt_fgenesh4_pg . C_LG_XV0093 de Populus trichocarpa. Debido a su asociación con sedimentación en la pared celular, se nombró WALLDOF (por proteína de dominio DOF asociada con pared) ..

EJEMPLO 2. Identificación de Homólogos walldof en Álamo y Otras Plantas : De acuerdo con un estudio filogenético WALLDOF es parte de un grupo o ciado compuesto de Ptr_DOF40, Ptr_DOF02, PTR_DOF06, Ptr_D0F15, Ptr_DOF25, Os02g45200 (NCBI ID: Os02g0673700) , Os04g47990 (NCBI ID: Os04g0567800 ) , Os02gl5350 (NCBI ID: Os02g0;252.400 ) , AT2G46590, AT3G61850, AT4G24060, AT1G64620, y AT4G00940. Yang et al., Plant Physiol . , 142: 820-30 (2006) .

Mediante un análisis de similitud de secuencias, determinado por medio de una búsqueda BLAST, por. ejemplo, se identifican otras secuencias de otras plantas: dos del genoma de la uva (Vitis vinifera - Phtozome/JGI ID GSVIVT00037222001; y GSVIVT00006675001 ) , dos del genoma del frijol de soja '(Glycine max - anotación de GenBank ID D0F21 - gi I 112363396 I gb IABI16022.1 I - y DOF28 gi I 112363398 I gb I ABI16023.1 I ) .· Dentro de otras hierbas, dos genes DOF supuestos de sorgo (JGI ID SbO 4g032040.1 y Sb06g025680.1) son similares a WALLDOF. Es posible identificar dos DOFs similares en el montaje actual del genoma de : maíz. (Tigr AZM5 http://maize.tigr.Org/release5.0/azm5.shtral) : DOF1 viene del contig AZM5_18231 y D0F2 viene del contig AZM5_4711.

Además de la' secuencia y similaridad filogenética, los genes similares 'walldof anteriores comparten estructuras intrón-exón similares asi como dominios de proteina conservados comunes. La Figura 2 muestra las similitudes en términos de estructura intrón-exón (dentro de la región de codificación) ., Los genes walldof similares presentes en una estructura compuesta.de dos exones, excepto Ptr_DOF06, Ptr_DOF25, AT4G00940, y Os02gl5350.

Con objeto , de analizar las porciones supuestas relacionadas con, miembros similares WALLDOF anteriores, hemos analizado la alineación de dicotiledóneas y monocotiledóneas de forma separada. La Figura 3 muestra la similitud entre dicotiledóneas y la Figura 4 muestra la similitud entre \ monocotiledóneas. Ambos conjuntos de alineaciones, cuando se analizan juntos, resultan en -las porciones descritas en la Figura 5. Esto es una indicación de que los miembros similares WALLDOF supuestos de diferentes especies, que se codifican por genes "parálogos", como se define arriba, comparten estas porciones comunes; en su secuencia de proteina.

EJEMPLO 3. , Aislamiento y Clonación de walldof a partir de Populus deltoides ' (a) Preparación de mARN de cambium/xilema de Populus deltoides y síntesis de ADNc: La corteza se eliminó de cortes de raíz de árboles Populus deltoides] de un año de edad. La parte interior de,l tallo, que contiene cambium, xilema y médula, se cortó en piezas pequeñas, :se congeló en nitrógeno líquido y se usó para extracción de ARN al usar el método de extracción de bromuro de cetiltrimetil-amonio (CTAB) . Véase Aldrich and Cullis, Plant Mol.1 Biol . Report., 11: 128-41 (1993). El ADNc se sintetizó usando ARN total como plantilla. La primera hebra de ADNc se produjo por RT-PCR usando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) y un cebador oligo(dT). El ADNc de hebra doble se obtuvo por la reacción posterior de polimerasa, al usar cebadores específicos de genes, como se describe a continuación. (b) Diseño dej Cebadores PCR y reacción RT-PCR: Los oligómjeros basados en modelo de gen estExt_fgenesh4_pg . C_LG_XV0093 de Populus trichocarpa se sintetizaron como, cebadores por PCR, incluyendo ya sea la región alrededor del primer codón ATG o alrededor del codón de terminación del ORF principal que codifica el polipéptido para amplificar la región de codificación completa del ORF princiapl. Las secuencias de los cebadores fueron: DOFNCO (SEQ. ID. NO: 3) 5'- ATCCATGGATACTTCTACTCAGTGGCCACAGG - 3' DOFXBA (SEQ. ID. NO: 4) 5'- ACTCTAGATTACCATGATCCACCACCTAACATTC - 3' El banco de ADNc obtenido en (a) se usó como la plantilla en una reacción de PCR con los cebadores de la SEQ. ID. NOs : 3 y 4. El PCR que implica 40 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a: 51°C, y 2 minutos a 72°C seguido por una etapa extra de alargamiento en 72°C por 7 minutos. Los productos de PCR se aislaron por electroforesis de gel en agarosa al 1.0% seguido por teñido de bromuro de etidio del gel procesado por electroforesis y detección de bandas amplificadas en un transiluminador UV. La banda amplificada detectada fue verificada y cortada del gel de agarosa con una navaja de afeitar. Las piezas de gel se transfirieron a microtubos 1.5 mL, y los fragmentos de ADN se aislaron y purificaron usando un PCR GFX limpio y kit de purificación de banda de gel (Amersham) . Los fragmentos de ADN recuperados se subclonaron en jun vector de clonación comercialmente disponible, transformado en E. coli, y luego usados para preparar ADN de plásmido, que luego fue secuenciado por el método de dideoxi,^ usando protocolos estándar. Véase Messing, Methods in Enzympl., 101: 20-78 (1983) . La secuencia de nucleotides resultante, establecida en la SEQ. ID. NO: 1, codifica el polipéptido WALLDOF identificado aquí con la SEQ. ID. NO: 2. ; EJEMPLO 4. Transformación mediada por Agrohacterium de Híbrido de P. trémula x P. alba La molécula de ácido nucleico aislada de Populus deltoides y obtenida en el Ejemplo 2 se clonó en un vector de expresión cadena debajo de un promotor del gen de cumarato-4-hidroxilasa (C4H) preferido del xilema, como se describe en O 2005/096805 (Figura 6) . El constructo de expresión resultante fue amplificado en E. coli, y luego transformado en una cepa de Agrohacterium tumefaciens LBA4404.

Híbrido de álamo de tipo 'natural {Populus trémula x Populus alba) se transformó con Agrohacterium tumefaciens que lleva el constructo obtenido en el Ejemplo 3. Los peciolos y los segmentos del tallo intermodal de las plantas micropropagadas in vitro fueron usados como explantes. Los brotes transformados se seleccionaron en medio de regeneración que contiene 100 mg/L de kanamicina y permitió a la raíz en el medio de Murashige y Skoog. Las plantas seleccionadas se transíirieron posteriormente al suelo y se hicieron crecer en el invernadero.

Los eventos transgénicos fueron verificados por PCR. La integración del constructo génico en el genoma de las plantas transgénicas fue confirmado por análisis PCR del gen marcador seleccionable (kanamicina) y el gen walldof.

EJEMPLO 5. Sobre-expresión de walldof Incrementa la Sedimentación en la pared celular en Álamo Transgénico Los análisis histológicos de xilema se realizaron en la parte inferior del tallo de árboles de álamo de dos meses de edad transformado : con el constructo obtenido en -el Ejemplo 3. Las secciones del tallo fueron transversales (grosor 10 Dm) de lineas tipo natural y transgénicas con un micrótomo (LEICA RM2255) equipadas 1 con un cuchillo de acero. Las secciones se sometieron a teñido de azul de toluidina y se observó bajo un microscopio de luz.

La Figura 7 : muestra secciones del tallo transversales del xilema, desde médula hasta cambium, de una planta no transformada (?) y un evento transgénico transformado con el constructo obtenido en el Ejemplo 2 (B) . Es posible ver que el grosor de la pared celular ha incrementado drásticamente en el evento transgénico cuando se comparó con la planta no transformada. Esto muestra claramente un aumento dramático de sedimentación en la pared celular causado por la expresión modulada de walldof en el evento transformado. También, hay una disminución marcada en el ancho de luz de células en el evento transformado. La Figura 8 presenta una modificación mayor de un tallo en sección transversal del mismo evento transformado mostrado en la Figura 6 comparado con una planta no transformada. Se puede claramente observar una disminución marcada en el ancho de luz como una consecuencia del aumento de grosor de la pared celular.

Las mediciones del área de la pared de la célula indica engrosamiento dramático de paredes celulares en replicados de los eventos transformados. Los eventos A.4.2, B.3.1 y B.4.1 presentan un incremento en el área de la pared por célula de 255%, 77% y 55%, respectivamente, cuando se compara con plantas no transformadas (Figura 9).

El porcentaje de área de la pared sobre el área celular total se incrementó significativamente en las plantas transformadas que varían desde 38% hasta 82% comparado con el 27% sobre el área ; celular total de las plantas de control no transformadas (Figura 10).

EJEMPLO 6. Sobre-expresión de walldof Incrementa la Densidad Aparente 'de la Madera en Álamo El incremento en la sedimentación en la pared celular resultó en un incremento en la densidad aparente de la madera de plantas transformadas. Para la determinación de la densidad aparente ; de la madera, se cortaron muestras (1 mm grosor) de la parte inferior del tallo al usar una sierra de navaja doble. Los listones delgados en 12% de contenido de humedad (MC) fueron radiografiados usando un Hewlett Packard Faxitron (Modelo ¦ 43805 N) previamente ajustado (tiempo: 5 minutos; energía:' 16 Kv; intensidad: 3 mA) . Las películas (Kodak, Diagnostic Film X-Omat XK1, 24 X 18 cm) se desarrollaron usando procedimientos normales. Las radiografías de plantas transformadas y no transformadas se exploraron en una, escala de 256 grises con resolución 1,000 dpi. Las mediciones de microdensidad de rayos x (densitometría de ;rayos x) se hicieron en esta imagen digital por software CERD. Mothe et al., Ann . For. Sci., 55: 301-13 (1998). . Una metodología para perfiles de densitometría, descrito por Walker and Doob, Madera F,iber Sci., 20: 35-43 (1998), se usó para determinar la densidad media aparente de la madera.

Los eventos Á.4.2, B.3.1 y B.4.1 muestran un incremento de 84%, 38% y 32% en la densidad de la madera aparente, respectivamente, j cuando se compara con plantas no transformadas (Figura 11) .¦ El álamo se considera una planta de madera suave con una densidad de la madera alrededor de 300 hasta 400 g/cm3. Los eventos transformados de la invención muestran densidad de la madera de alrededor de 0.66 g/cm3 en eventos B.3.1. y B4.1, y alrededor de 0,82 g/cm3 en evento ?.4.2 como, se compara con la densidad de la madera de alrededor de 0,42 g/cm3 en las plantas no transformadas (Figura 11). La, sedimentación incrementada en la pared celular contribuye en gran medida a los resultados de la densidad de la madera, ya que la correlación entre estos dos atributos se mostró que es 0,97 (Figura 12).

EJEMPLO 7. Sedimentación incrementada en la pared celular correlacionada con la Expresión Aumentada de walldof Para determinar la abundancia de transcriptos walldof y para correlacionar el nivel de expresión walldof con la intensidad del fenotipo observado, se realiza reacción en cadena de polime asa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) usando ' ARN aislado de xilema en desarrollo de plantas de álamo! no transformadas y los cuatro eventos transformados analizados como se describe anteriormente. Tejido congelado 'en N2 liquido se molió hasta reducirlo a polvo con mortero y maja, y el ARN total se aisló usando el método de extracción de bromuro cetiltrimetil-amonio (CTAB) (Aldrich and Cull s, Plant Mol. Biol. Report., 11:128-141, 1993). El ARN total se trató con DNasel (Promega), y ADNc de ¦ primera hebra s;e sintetizó con Transcriptasa Inversa SuperScript II (Invitrogen) usando 1 pg de ARN total. Una décima parte del ;ADNc se usó en combinación con cebadores específicos de gen en concentración 500 nM y Mezcla Maestra de PCR SYBR Verde (Applied Biosystems) . El PCR se efectuó en un Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Para la amplificación de los transcritos de walldof, se usaron cebadores de oligonucleótidos walldof, Delantero ( 5' -TGCAAGAATTCAAGCCATC-3' ) y WALLDOF Reverso (5'-GCAGCAGGTTCCAAGTAATG-3' ) . La secuencia de genes de actina de Populus trichocarpa ( estext_genewisel_Vl . C_1850029) , usada I como un gen de referencia para normalizar las cantidades de plantilla, se amplificó con los ¦ siguientes cebadores de oligonucleótidos ACTIN Delantero ( 5 ' -GCTGTCCTTTCCCTGTATGC-3 ' ) y ACTIN Reverso ( 5 ' -ACGACCAGCAAGATCCAAAC-3 ' ) . La amplificación se efectuó a 50°C por 2 rain,, 95°C por 10 min, y 45 ciclos en 95°C por 15 seg y 60°C por 1 min. La especificidad de la reacción de amplificación se evaluó por el análisis de lais curvas de disociación. La relación entre las cantidades de . los productos amplificados walldof y ACTIN se calculó usando: el método 2-AACt (Livak and Schmittgen, Methods, 25:402-408, 2001). Los niveles de transcripto walldof relativos : a aquellos de ACTIN se calcularon como el promedio de valores obtenidos de tres muestras independientes usadas como replicados biológicos.

Los eventos transgénicos que presentaron un incremento en la sedimentación en la pared celular y en densidad de la madera aparente tuvieron un mayor nivel de expresión de gen walldof en el tallo cuando se compara con las plantas no transformadas. Cuánto mayor sea el nivel de expresión de gen walldof más fuer.tes son los fenotipos relacionados a la sedimentación en la pared celular y densidad de la madera.

El evento A. .2, que muestra la más alta densidad de la madera aparente y sedimentación en la pared celular, presenta un incremento de. 14 veces en nivel de expresión de gen walldof cuando se' compara con ' las plantas no transformadas. Los eventos B.3.11 y B.4.1, con un incremento similar en la densidad de la madera y sedimentación en la pared celular, también ' muestran ; un incremento similar en el nivel de expresión del gen walldof con relación a las plantas de control (incremento de 6 y 7 veces, respectivamente) como se muestra en la Figura 13.

EJEMPLO 8. Tasa de Crecimiento es Similar en Plantas Transformadas y No Transformadas La asignación de carbono para incrementar la sedimentación de pared y densidad de la madera no interfiere con el crecimiento, de planta y desarrollo como se, muestra por la velocidad de [ crecimiento de planta (Figura 14). Las plantas transformadas crecen con la misma eficiencia como las plantas de control; después de 2 meses en el invernadero.

EJEMPLO 9. Sobre-expresión de walldof Incrementa el Contenido de Celulosa Para analizar si la sobre-expresión walldof modifica la composición de l madera, material de tallo de planta que crece en invernadero se molió con un molino Wiley para pasar a través de un tamiz de 40-60' mallas y luego un equipo Soxhlet extrae con acetona por 5 h. El material libre de extracción se usó para todos los análisis adicionales. El i J contenido de lignina se determinó con un Klason modificado, donde el tejido de tallo de la tierra extraído (0.3 g) se trató con 3 mi de 72% .H2S04 de acuerdo con Coleman et al., Plant Biotechnol .1 J. , 4:87-101 (2006). Los crisoles secos se pesaron para determinar lignina Klason (lignina insoluble en ácido) gravimétricamente . El filtrado se analizó también por lignina soluble en ácido por absorbancia en 205 nm. Se determinaron las ¡ concentraciones . de carbohidratos en el hidrolizado mediante el uso de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) (iDX-500; Dionex) equipado con una columna de intercambio de iones PA1 (Dionex), un detector amperométrico de pulsos con un electrodo de oro, y un autoinyector Spectra AS 3500 (Spectra-Physics) . Cada experimento se corrió por duplicado. La determinación de la relación S/G de cada muestra libre de extracción se obtuvo po oxidación de nitrobenceno . Methods in Lignin Chemistry, eds . Lin and Vanee, Springer Verlag, .Berlín, 1992. Véase Tabla 2.

Las plantas j con sobreexpresión de WALLDOF presentan hasta 12% de celulosa incrementada, y una reducción general en carbohidratos de hemicelulosa . Como se muestra en la Tabla 1, la reducción en contenido de hemicelulosa se contabilizó principalmente por una disminución en mañosa (tan bajo como 42% de contenido de tipo silvestre en evento A.4.2) y arabinosa (tan bajo como 72% de contenido de tipo¦ silvestre en evento A . .2 ) . ; Tabla 1. Composición de carbohidrato (% de peso de madera seca) de madera del tallo en álamo de control y transgenico .

Lineas Glucosa Xilosa Mañosa Galactosa Arabinosa Raíanosa Tipo 38 07 18. 27 1.12 0.80 0.35 0.46 natural (0 17) (0. 17) (0.08) (0.00) (0.02) (0.03) XA.4. 2 42 45 16. 95 0.48 0.68 0.25 0.37 (0 30) (0. 25) (0.12) (0.02) (0.01) (0.01) B.3. 1 42 10 17. 35 0.54 0.75 0.26 0.41 (0 20) (0. 05) (0.06) (0.01) (0.01) (0.01) B .4. 1 42 55 17. 90 0.68 0.75 0.33 0.44 (0 55) (0. 00) (0.02) (0.01) (0.02) (0.01) A.l. 10 39 10 18. 40 1.21 0.85 0.37 0.48 (0 30) (0. 20) (0.09) (0.00) (0.02) (0.01) Valores medios y; errores estándares (en paréntesis) se reportan por análisis en duplicado de líneas independientes n .

Tipo natural, n = 3; Líneas transgénicas , n = 2.

Los datos de carbohidratos se analizaron por ANOVA. Los valores que son significativamente diferentes de tipo natural se indican en negritas (prueba de Tukey; P < 0.05) .

Tabla 2. Contenido de lignina y composición de madera de tallo en álamo de control y transgenico.

Lignina (% en peso de madera seca) Monómeros de lignina (uiaol/g 1 lignina Klason) Lineas Insolubles Solubles Lignina Siringil Guaiacil S G en ácido en ácido Total Tipo 18 17 3.87 22 04 1, 203.51 528.53 2 29 natural (0 33) (0.32) ¦ (0 65) (69.09) (43.30) A. .2 19 02 ; 2.57 21 59 858.39 599.21 1 43 (0 36) ; (0.15) (0 22) (37.19) (8.27) B.3.1 18 94 2.94 21 88 976.96 593.38 1 65 (0 36) ' (0.06) (0 30) (61.95) (32.27) B.4.1 17 98 · 3.22 21 20 929.96 512.67 1 81 (0 06) (0.-26) (0 32) (79.13) (15.52) A.1.10 18 50 1 4.13 22 63 1,143.84 513.72 2 23 (0 52) ; (0.30) (0 22) (28.64) (33.33) I Valores medios errores estándares (en paréntesis) se reportan por análisis en duplicado de lineas independientes n . 1 Tipo natural, n = ;3; Lineas transgénicas, n = 2.

Los datos se analizaron por ANOVA. Los valores que son significativamente; diferentes de tipo natural se indican en negrita (prueba Tu}cey; P < 0.05) .

EJEMPLO 10. Walldof afecta la expresión de genes involucrados en el metabolismo de nitrógeno y carbohidratos Para identificar genes objetivo candidato directamente o indirectamente controlados por el factor de transcripción walldof, los análisis de rnicroarreglo se realizaron para comparar sobreexpresión de la linea walldof A. .2 y plantas tipo natural.

Los tallos dé tres replicados biológicos de tipo natural y tres replicados; biológicos de la linea transgénica A.4.2 fueron cosechados', y congelados de inmediato en nitrógeno liquido, y mantenidos a -80°C para extracción del ARN . Para el aislamiento del ARN se retiró la corteza de los tallos, y se raspó el xilema en desarrollo con una navaja de afeitar. El xilema se molió a un polvo fino bajo nitrógeno liquido, 'y ARN total se extrajo de cada muestra usando el procedimiento descrito por Chang et al., Plant Mol. Bio.l Rep. 11:4 (1993).

La calidad de ARN se determinó usando un bioanalizador i Agilent 2100. Para cada muestra, 10 pg de ARN total se transcribió de forma inversa, se etiquetó, e hibridizó al Arreglo de Genoma.de Álamo de acuerdo con los protocolos del fabricante (Affymetrix) . El Arreglo de Genoma de Álamo incluye 61,251 conjuntos de sondas que representan más de 56,055 transcripto^ (Affymetrix) .

El análisis de datos GeneChip fue efectuado al usar la suite BioConductor en R al usar el paquete Affy descrito por Gautier et al., Bioinformatics 20:307-315 (2004). La corrección del respaldo, normalización, y resumen de los valores de expresión se efectuó al usar el análisis Robust Multichip Average. Los conjuntos de sondas de llamada presentes se asignaron por función Affy Mas5calls. Cualquiera de los genes con señal ausente o marginal en todas las muestras fue sepa'rado del análisis. Las comparaciones entre plantas transgénicas y tipo natural se realizaron usando el paquete Limma. Smith, Stat. Appl. Genet. Mol. Biol., 3:3 (2004). Los genes diferencialmente expresados se identificaron usando la prueba t corregida de velocidad de descubrimiento falsa. Benjamini and Hochberg, J. R. Stat. Soc. Ser. B 57:¡289-300 (1995). El umbral del valor P corregido se estableció a 0.05.

El análisis i de transcriptoma de Xilema de eventos walldof usando Arreglo de Genoma de Álamo Affymetrix Genechip identifica 825 genes ¦ que se expresan diferencialmente, incluyendo un conjunto de genes implicados con metabolismo de nitrógeno y carbohidratos, modificación y síntesis de pared celular y metabolismo fenilpropanoide .

Dentro del metabolismo de nitrógeno, los datos de microarreglo confirmaron el nivel de expresión sub-regulado de genes de glutámato dehidrogenasa GDHl y . GDH2. Por otra parte, niveles de transcripción de GS2, una isoforma de glutamina sintetasa de cloroplastos, se elevan en álamos que sobreexpresan el walldof. Dado que el amonio liberado por la reacción PAL se re-asimila por glutamina sintetasa, este incremento se espera en los transformantes.

Además, los niveles de transcripción de cuatro genes que codifican enzimas :implicadas en la degradación de almidón (es decir, un gen como alfa-amilasa [AMY3], dos genes de fosforilasa alfa-glucan y un diquinasa alfa-glucan [SEX1]) se elevaron en la linea sobreexpresada walldof, mientras que las subunidades grandes de pirofosforasa ADP-glucosa [AGP2 y AGP3] , se redujeron. Estos datos señalaron a un rompimiento creciente del almidón. Se ha analizado el almidón total en plantas transgénicas (Tabla 3). y se ha observado una disminución hasta 32% en contenido de almidón en las plantas transgénicas.

Relacionado con la organización de pared celular, los niveles de transcripción de nueve proteínas de arabinogalactano supuestas (AGP) se alteraron. Siete se sub-regularon y dos se elevaron.

Los niveles : de transcripción de cuatro genes cuyos niveles de expresión se elevan típicamente durante la formación de lignina se incrementaron en la · línea sobreexpresada walldof: cuatro genes que codifican lacasas.

En general, el análisis de transcriptoma revela diferencias en el metabolismo de constituyentes de pared celular (lignina, carbohidratos, y proteínas) y de metabolismo de nitrógeno y carbono.

Tabla 3. Contenido de almidón de madera de tallo en álamo de control y transgenico .

Almidón Líneas Total (%) A.4.2 5.02 B.4.2 5.70 Tipo 6.66 natural

Claims (14)

. 31 NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar al menos una de sedimentación en ' la pared celular y densidad de biqmasa, caracterizado porque comprende modular la expresión de una secuencia de ADN walldof en una célula de planta.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la modulación comprende efectuar la sobre-expresión de dicha secuencia en una planta transgénica, tal que dicha planta se caracteriza por una densidad de biomasa incrementada.

3. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la planta transgénica es el producto de un proceso que comprende: (a) proporcionar un material de planta regenerable que se transforma con ;un constructo compuesto de una secuencia de ADN walldof y, ligado operativamente a ello, un promotor que está activo en células de plantas; y entonces (b) someter ' al material o plantas regeneradas del material a una selección para lo cual al menos un criterio de selección es la,' sedimentación incrementada en la pared celular o densidad de biomasa incrementada, relativas a un estado no transformado.

4., El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el' promotor es un promotor preferido de xilema .

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones ;l-5, caracterizado porque la secuencia walldof codifica la secuencia de . aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. ;

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia walldof es la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1.

8. Un constrúcto caracterizado porque está compuesto de una secuencia de ÁDN walldof y, ligado operativamente a ello, un promotor que está activo en células de plantas.

9. Una célula de planta transgénica caracterizada porque comprende una secuencia heteróloga de ADN walldof que se expresa bajo el control de un promotor preferido de xilema o un promotor constitutivo.

10. Una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN walldof tal que la planta se caracteriza por densidad de biomasa incrementada, relativa a un estado no transformado.

11. Un método para incrementar el contenido de celulosa, caracterizado porque comprende modular la expresión de una secuencia de ADN walldof en una célula de planta.

12. Un producto de planta procesado caracterizado porque comprende una cantidad . detectable de un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia walldof que está bajo el control de un promotor heterologo.

13. El producto de planta procesado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el producto comprende un pienso, una harina, una harina en polvo, un extracto, una pulpa, o un homogeneizado, en donde el pienso, harina, harina en, polvo, extracto, pulpa, o homogeneizado se obtiene de al menos una parte de la planta.

14. El producto de planta procesado de conformidad con la reivindicación :13, caracterizado porque la parte de planta es un tallo, una hoja, una raíz, una flor, cambium, madera, un tubérculo, o una semilla.