BR122017002790B1 - Processo de induzir um fenótipo em uma planta, processo para promover maior biomassa em uma planta e processo para a modulação da biomassa de uma planta - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes de conferir a característica de tamanho da planta, crescimento vegetativo, número de órgãos, arquitetura da planta, taxa de crescimento, vigor de plantas jovens, taxa de crescimento, rendimento de frutos e sementes, brotamento e/ou biomassa modulada em plantas. a presente invenção refere-se ainda ao uso destas moléculas de ácidos nucléicos e de polipeptídeos na produção de plantas transgênicas, células vegetais, materiais vegetais ou sementes de uma planta que possui tamanho da planta, crescimento vegetativo, número de órgãos, arquitetura da planta, taxa de crescimento, vigor de plantas jovens e/ou biomassa que são alterados em relação às plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares.

Description

PROCESSO DE INDUZIR UM FENÓTIPO EM UMA PLANTA, PROCESSO PARA PROMOVER MAIOR BIOMASSA EM UMA PLANTA E PROCESSO PARA A MODULAÇÃO DA BIOMASSA DE UMA PLANTA

[0001] Dividido do PI0520822-0, depositado em 29 de dezembro de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes de modular a taxa de crescimento vegetal, o crescimento vegetativo, o tamanho de órgãos, a arquitetura, o vigor de plantas jovens e/ou a biomassa em plantas. A presente invenção refere-se ainda ao uso das moléculas de ácidos nucléicos e polipeptídeos para a produção de plantas transgênicas, células vegetais, materiais vegetais ou sementes de uma planta que possuem taxa de crescimento, crescimento vegetativo, número de órgãos, arquitetura, vigor de plantas jovens e/ou biomassa modulada quando comparadas às das plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[0003] As plantas melhoradas especificamente para a agricultura, horticultura, conversão de biomassa e outras indústrias (por exemplo, indústria de papel, plantas como fábricas de produção para proteínas ou outros compostos) podem ser obtidas utilizando tecnologias moleculares. Como um exemplo, um grande valor agronômico pode resultar da modulação do tamanho de uma planta como um todo ou de qualquer um de seus órgãos ou do número de qualquer um de seus órgãos.

[0004] Similarmente, a modulação do tamanho e da estatura de uma planta inteira ou de uma parte particular de uma planta ou da taxa de crescimento ou do vigor de plantas jovens permite a produção de plantas melhor adequadas para uma indústria particular. Por exemplo, reduções na altura de plantas de cultivo específicas e espécies de árvores podem ser benéficas por permitirem uma colheita mais fácil. Alternativamente, o aumento da altura, da espessura ou do tamanho de órgãos, do número de órgãos pode ser benéfico através do fornecimento de mais biomassa útil para o processamento em alimentos, produtos alimentícios, combustíveis e/ou produtos químicos (ver o website do US Department of Energy para Energy Efficiency and Renewable Energy). Outros exemplos de características comercialmente desejáveis incluem o aumento do comprimento dos caules florais de flores para muda, o aumento ou a alteração do tamanho e do formato das folhas ou o aumento do tamanho das sementes e/ou dos frutos. As alterações no tamanho dos órgãos, no número de órgãos e da biomassa também resultam em alterações na massa de moléculas constituintes tais como produtos secundários e convertem as plantas em fábricas para estes compostos.

[0005] A disponibilidade e a manutenção de um fluxo que pode ser reproduzido de alimento e de produtos alimentícios para animais para a alimentação de animais e pessoas têm sido uma grande prioridade ao longo da história da civilização humana e se originam na agricultura. Especialistas e pesquisadores nos campos da ciência agronômica, na agricultura, na ciência de plantas de cultivo, na horticultura e na ciência florestal estão até hoje se esforçando constantemente para encontrar e produzir plantas com um maior potencial de alimentação de uma população mundial em crescimento e para garantir um fornecimento de matérias-primas que podem ser reproduzidas. O nível robusto de pesquisa nestes campos de ciência indica o nível de guias de importância em cada ambiente geográfico e clima em todos os lugares do mundo no fornecimento de fontes sustentáveis de alimentos, produtos alimentícios, produtos químicos e energia para a população.

[0006] A manipulação do desempenho das plantas de cultivo foi realizada convencionalmente durante séculos ao longo do cultivo de plantas. O processo de cultivo é, entretanto, tanto demorado como trabalhoso. Além disso, programas de cultivo apropriados têm que ser especialmente planejados para cada espécie vegetal relevante.

[0007] Por outro lado, grande progresso tem sido feito na utilização de abordagens genéticas moleculares para a manipulação de plantas para fornecer melhores plantas de cultivo. Através da introdução e da expressão de moléculas de ácidos nucléicos recombinantes em plantas, os pesquisadores estão agora direcionados para o fornecimento para a comunidade de espécies vegetais adaptadas para crescerem mais eficientemente e produzirem mais produto independentemente de ambientes geográficos e/ou climáticos exclusivos. Estas novas abordagens possuem a vantagem adicional de não serem limitadas a uma espécie vegetal, mas, ao invés disso, de poderem ser aplicadas a várias espécies vegetais diferentes (Zhang e outros (2004) Plant Physiol. 135: 615).

[0008] Apesar deste progresso, hoje em dia continua havendo uma grande necessidade de processos que podem ser aplicados de forma geral que melhoram o crescimento de plantas florestais e agrícolas para se adequarem a necessidades particulares dependendo das condições ambientais específicas. Para esta finalidade, a presente invenção está direcionada à manipulação vantajosa do tamanho das plantas, do número de órgãos, da taxa de crescimento vegetal, da arquitetura vegetal e/ou da biomassa para maximizar os benefícios de várias plantas de cultivo dependendo do benefício procurado e do ambiente particular em que a planta de cultivo tem que crescer, caracterizada pela expressão de moléculas de DNA recombinantes nas plantas. Estas moléculas podem ser provenientes da própria planta e simplesmente expressas em um nível maior ou menor ou as moléculas podem ser provenientes de espécies vegetais diferentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção, portanto, refere-se a moléculas de ácidos nucléicos isoladas e a polipeptídeos e ao uso dos mesmos na produção de plantas transgênicas, células vegetais, materiais vegetais ou sementes de plantas que possuem ciclos de vida, particularmente tamanho da planta, crescimento vegetativo, taxa de crescimento vegetal, número de órgãos, arquitetura vegetal e/ou biomassa, que são alterados em relação às plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições similares ou idênticas.

[0010] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um perito na técnica a qual esta invenção pertence.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] Figura 1. Alinhamento das sequências de aminoácidos de homólogos de Lead 29 (ME04717), SEQ ID NO. 93. As regiões con servadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.

[0012] Figura 2. Alinhamento das sequências de aminoácidos de homólogos de Lead 36 (ME03195), SEQ ID NO. 99. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.

[0013] Figura 3. Alinhamento das sequências de aminoácidos de homólogos de Lead 15 (ME04077), SEQ ID NO. 81. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.

[0014] Figura 4. Alinhamento das sequências de aminoácidos de homólogos de Lead ME04012, SEQ ID NO. 110. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.

[0015] Figura 5. Alinhamento das sequências de aminoácidos de homólogos de Lead Clone 691319, SEQ ID NO. 104. As regiões conservadas estão encerradas dentro de uma caixa. Uma sequência consenso é mostrada abaixo do alinhamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. A INVENÇÃO

[0016] A invenção do presente pedido de patente pode ser descrita por, mas não necessariamente limitada aos exemplos de modalidades a seguir.

[0017] A presente invenção descreve novas moléculas de ácidos nucléicos isoladas, moléculas de ácidos nucléicos que interferem com estas moléculas de ácidos nucléicos, moléculas de ácidos nucléicos que se hibridizam com estas moléculas de ácidos nucléicos e moléculas de ácidos nucléicos isoladas que codificam a mesma proteína por causa da degeneração do código do DNA. Modalidades adicionais do presente pedido de patente incluem ainda os polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácidos nucléicos isoladas da presente invenção.

[0018] Mais particularmente, as moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção compreendem: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a qualquer um dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, correspondentes às SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, respectivamente, (b) uma sequência de nucleotídeos que é complementar a qualquer uma das sequências de nucleotídeos de acordo com (a), (c) uma sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, (d) uma sequência de nucleotídeos que está na ordem inversa de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de acordo com (c) quando lida na direção 5" a 3', (e) uma sequência de nucleotídeos capaz de interferir com qualquer uma das sequências de nucleotídeos de acordo com (a), (f) uma sequência de nucleotídeos capaz de formar um duplex de ácidos nucléicos hibridizados com o ácido nucléico de acordo com qualquer um dos parágrafos (a) - (e) a uma temperatura de aproximadamente 40°C até aproximadamente 48°C abaixo de uma temperatura de fusão do duplex de ácidos nucléicos hibridizados e (g) uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das sequências de aminoácidos dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319 correspondentes às SEQ ID Nos. 81, 91, 93, 99, 110 e 104, respectivamente.

[0019] Modalidades adicionais da presente invenção incluem as sequências de polipeptídeos e das moléculas de ácidos nucléicos nas SEQ ID Nos. 80, 81, 90, 91, 92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 e 104.

[0020] A presente invenção incorpora ainda um vetor que compreende um primeiro ácido nucléico que possui uma sequência de nucleotídeos que codifica um sinal de transcrição e/ou de tradução de planta e um segundo ácido nucléico que possui uma sequência de nucleotídeos de acordo com as moléculas de ácidos nucléicos isoladas da presente invenção. Mais particularmente, o primeiro e o segundo ácido nucléicos podem estar ligados de forma operacional. Ainda mais particularmente, o segundo ácido nucléico pode ser endógeno a um primeiro organismo e qualquer outro ácido nucléico no vetor pode ser endógeno a um segundo organismo. Mais particularmente, o primeiro e o segundo organismos podem ser de espécies diferentes.

[0021] Em uma modalidade adicional da presente invenção, uma célula hospedeira pode compreender uma molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção encontrada na célula hospedeira da presente invenção pode ser endógena a um primeiro organismo e pode ser flanqueada por sequências de nucleotídeos endógenas a um segundo organismo. Ainda, o primeiro e o segundo organismos podem ser de espécies diferentes. Ainda mais particularmente, a célula hospedeira da presente invenção pode compreender um vetor de acordo com a presente invenção, que por si só compreende moléculas de ácidos nucléicos de acordo com aquelas da presente invenção.

[0022] Em uma outra modalidade da presente invenção, os polipeptídeos isolados da presente invenção podem compreender adicionalmente sequências de aminoácidos que são pelo menos 85% idênticas a qualquer um dos Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, correspondentes às SEQ ID Nos. 81, 91, 93, 99, 110 e 104, respectivamente.

[0023] Outras modalidades da presente invenção incluem métodos de introdução de um ácido nucléico isolado da presente invenção em uma célula hospedeira. Mais particularmente, uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção pode ser colocada em contato com uma célula hospedeira sob condições que permitam o transporte do ácido nucléico isolado para dentro da célula hospedeira. Ainda mais particularmente, um vetor que é descrito em uma modalidade anterior da presente invenção, pode ser introduzido dentro de uma célula hospedeira através do mesmo método.

[0024] Os métodos de detecção estão também disponíveis como modalidades da presente invenção. Particularmente, os métodos para a detecção de uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção em uma amostra. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção pode ser colocada em contato com uma amostra sob condições que permitam uma comparação da sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucléico isolada com uma sequência de nucleotídeos do ácido nucléico na amostra. Os resultados de tal análise podem então ser considerados para determinar se a molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção pode ser detectável e, portanto, está presente dentro da amostra.

[0025] Uma modalidade adicional da presente invenção compreende uma planta, uma célula vegetal, um material vegetal ou sementes de plantas que compreendem uma molécula de ácido nucléico isolada e/ou um vetor da presente invenção. Mais particularmente, a molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção pode ser exógena à planta, à célula vegetal, ao material vegetal ou à semente de uma planta.

[0026] Uma modalidade adicional da presente invenção inclui uma planta regenerada de uma célula vegetal ou semente de acordo com a presente invenção. Mais particularmente, a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou das sementes de uma planta da presente invenção preferencialmente possuem maior tamanho (em um todo ou em parte), maior crescimento vegetativo, maior número de órgãos e/ou maior biomassa (algumas vezes referidos coletivamente posteriormente aqui como maior biomassa), características de letalidade, esterilidade ou ornamentais quando comparadas com uma planta do tipo selvagem cultivada sob condições idênticas.

[0027] Além disso, a planta transgênica pode compreender uma primeira molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção, que codifica uma proteína envolvida na modulação do crescimento e das características fenotípicas e uma segunda molécula de ácido nucléico isolada que codifica um promotor capaz de controlar a expressão em plantas, em que o componente modulador do crescimento ou do fenótipo e o promotor estão ligados de forma operacional. Mais preferencialmente, o primeiro ácido nucléico isolado pode ser expresso de forma errada na planta transgênica da presente invenção e a planta transgênica pode exibir características moduladas quando comparadas com uma planta progenitora isenta do gene, quando a planta transgênica e planta progenitora são cultivadas sob condições ambientais idênticas. Em uma outra modalidade da presente invenção o crescimento e as características fenotípicas moduladas podem ser causados pela inativação de uma sequência particular, utilizando, por exemplo, um RNA interferente.

[0028] Uma modalidade adicional consiste em uma planta, uma célula vegetal, um material vegetal ou uma semente de uma planta de acordo com a presente invenção que compreende uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção, em que a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou da semente de uma planta, possuem o crescimento e as características fenotípicas moduladas quando comparadas com uma planta do tipo selvagem cultivada sob condições idênticas.

[0029] O polinucleotídeo que confere maior biomassa ou vigor pode ser expresso de forma errada na planta transgênica da presente invenção e a planta transgênica pode exibir uma maior biomassa ou vigor quando comparada com uma planta progenitora isenta do polinucleotídeo, quando a planta transgênica e a planta progenitora são cultivadas sob condições ambientais idênticas. Em uma outra modalidade da presente invenção o fenótipo de maior biomassa ou vigor pode ser causado pela inativação de uma sequência particular, utilizando, por exemplo, um RNA interferente.

[0030] Uma outra modalidade consiste em uma planta, uma célula vegetal, um material vegetal ou uma semente de uma planta de acordo com a presente invenção que compreende uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção, em que a planta ou as plantas derivadas da planta, da célula vegetal, do material vegetal ou da semente de uma planta, possuem maior biomassa ou vigor quando comparadas com uma planta do tipo selvagem cultivada sob condições idênticas.

[0031] Uma outra modalidade da presente invenção inclui métodos de aumento da biomassa ou vigor em plantas. Mais particularmente, estes métodos compreendem a transformação de uma planta com uma molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, o método é um método de aumento da biomassa ou do vigor na planta transformada, em que a planta é transformada com uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo da presente invenção.

[0032] Os polipeptídeos da presente invenção incluem sequências consenso. As sequências consenso são aquelas que são mostradas nas figuras 1-5.

2. DEFINIÇÕES

[0033] Os termos a seguir são utilizados ao longo de todo este pedido de patente:

[0034] Biomassa: como utilizado aqui, "biomassa" refere-se ao material biológico útil incluindo um produto de interesse, cujo material deve ser coletado e é pretendido para o processamento adicional para isolar ou concentrar o produto de interesse. "Biomassa" pode compreender o fruto ou partes do mesmo ou sementes, folhas ou caules ou raízes em que estes fazem parte da planta que é de interesse particular para a finalidade industrial. "Biomassa", se referindo ao material vegetal, inclui qualquer estrutura ou estruturas de uma planta que contêm ou representam o produto de interesse.

[0035] Transformação: os exemplos de meios através dos quais esta pode ser realizada são descritos abaixo e incluem transformação mediada por Agrobacterium (de dicotiledôneas (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444), de monocotiledôneas (Yamauchi e outros (1996) Planta Mol Biol. 30: 321-9; Xu e outros (1995) Planta Mol. Biol. 27: 237; Yamamoto e outros (1991) Planta Cell: 371) e métodos de biolística (P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Acid Probes" Em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, P.C. vand der Vliet, ed., c. 1993 by Elsevier, Amsterdã), eletroporação, técnicas in planta e similares. Tal planta contendo o ácido nucléico exógeno é referida aqui como uma To para a planta transgênica primária e como uma T1 para a primeira geração.

[0036] Proteínas Comparáveis Funcionalmente ou Homólogos Funcionais: este termo descreve as proteínas que possuem pelo menos uma característica funcional em comum. Tais características incluem similaridade de sequência, atividade bioquímica, similaridade do padrão de transcrição e atividade fenotípica. Tipicamente, as proteínas comparáveis funcionalmente compartilham alguma similaridade de sequência ou pelo menos uma bioquímica. Dentro desta definição, os análogos são considerados como sendo comparáveis funcionalmente. Em adição, as proteínas comparáveis funcionalmente compartilham geralmente pelo menos uma atividade bioquímica e/ou fenotípica.

[0037] As proteínas comparáveis funcionalmente darão origem à mesma característica até um grau similar, mas não necessariamente o mesmo. Tipicamente, as proteínas comparáveis fornecem as mesmas características em que a medida quantitativa devida a uma das comparáveis é de pelo menos 20% da outra; mais tipicamente, entre 30 até 40%; ainda mais tipicamente, entre 50- 60%; ainda mais tipicamente entre 70 até 80%; ainda mais tipicamente entre 90 até 100% da outra.

[0038] Sequências heterólogas: "Sequências heterólogas" são aquelas que não estão ligadas de forma operacional ou não estão contíguas a cada outra na natureza. Por exemplo, um promotor do milho é considerado heterólogo a uma sequência de região codificadora de Arabidopsis. Ainda, um promotor de um gene que codifica um fator de crescimento do milho é considerado heterólogo a uma sequência que codifica o receptor do milho para o fator de crescimento. As sequências de elementos reguladores, tais como UTRs ou sequências de término da extremidade 3" que não se originam na natureza do mesmo gene que a sequência codificadora, são consideradas heterólogas à dita sequência codificadora. Os elementos ligados de forma operacional na natureza e contíguos a cada outro não são heterólogos a cada outro. Por outro lado, estes mesmos elementos permanecem ligados de forma operacional, mas se tornam heterólogos se a outra sequência de preenchimento for colocada entre eles. Assim, o promotor e as sequências codificadoras de um gene do milho que expressam um transportador de aminoácidos não são heterólogos um com cada outro, mas o promotor e a sequência codificadora de um gene do milho ligados de forma operacional de uma nova maneira são heterólogos.

[0039] Expressão errada: o termo "expressão errada" refere-se a um aumento ou a um decréscimo na transcrição de uma região codificadora em uma sequência de RNA complementar quando comparada com a do tipo selvagem. Este termo abrange ainda a expressão e/ou a tradução de um gene ou de uma região codificadora ou a inibição de tal transcrição e/ou tradução durante um período de tempo diferente quando comparada com a do tipo selvagem e/ou de uma localização não natural dentro do genoma da planta, incluindo um gene ou uma região codificadora de uma espécie vegetal diferente ou de um organismo que não é vegetal.

[0040] Porcentagem de identidade de sequência: como utilizado aqui, o termo "porcentagem de identidade de sequência" referese ao grau de identidade entre qualquer sequência de busca fornecida e uma sequência de objetivo. Uma sequência de ácido nucléico ou de aminoácidos de busca é alinhada com uma ou mais sequências de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de objetivo utilizando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros preestabelecidos), que permite que alinhamentos de sequências de ácidos nucléicos ou de proteínas sejam realizados ao longo de seu comprimento total (alinhamento global).

[0041] ClustalW calcula a melhor combinação entre uma sequência de busca e uma ou mais de objetivo e as alinha de forma que as identidades, as similaridades e as diferenças possam ser determinadas. Espaços de um ou mais resíduos podem ser inseridos dentro de uma sequência de busca, de uma sequência de objetivo ou ambas, para maximizar os alinhamentos de sequências. Para o alinhamento rápido em pares de sequências de ácidos nucléicos, são utilizados os parâmetros preestabelecidos a seguir: tamanho da frase: 2; tamanho da janela: 4; método de obtenção de escore: porcentagem; número de diagonais superiores: 4; e penalidade de espaço: 5. Para o alinhamento múltiplo de sequências de ácidos nucléicos, são utilizados os parâmetros a seguir: penalidade de abertura de espaço: 10,0; penalidade de extensão de espaço: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento rápido em pares de sequências de proteínas, são utilizados os parâmetros a seguir: tamanho da frase: 1; tamanho da janela: 5; método de obtenção de escore: porcentagem; número de diagonais superiores: 5; penalidade de espaço: 3. Para o alinhamento múltiplo de sequências de proteínas, são utilizados os parâmetros a seguir: matriz de peso: blosum; penalidade de abertura de espaço: 10.0; penalidade de extensão de espaço: 0,05; espaços hidrofílicos: "on"; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg e Lys; penalidades de espaço específico ao resíduo: "on". O resultado é um alinhamento de sequências que reflete a relação entre as sequências. O ClustalW pode ser realizado, por exemplo, no website do Baylor College of Medicine Search Launcher e no website do European Bioinformatics Institute na World Wide Web.

[0042] No caso de buscas de homólogos funcionais, para garantir que uma sequência de objetivo que possui a mesma função que a sequência de busca, o alinhamento tem que ser ao longo de pelo menos 80% do comprimento da sequência de busca de forma que a maior parte da sequência de busca seja coberta pela sequência de objetivo. Para determinar uma porcentagem de identidade entre uma sequência de busca e uma sequência de objetivo, o ClustalW divide o número de identidades no melhor alinhamento pelo número de resíduos comparados (as posições de espaços são excluídas) e multiplica por 100. O resultado é a porcentagem de identidade da sequência de objetivo em relação à sequência de busca. E observado que o valor de porcentagem de identidade pode ser arredondado para o decimal mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13 e 78,14 são arredondados para baixo para 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 e 78,19 são arredondados para cima para 78,2.

[0043] Regiões Reguladoras: o termo "região reguladora" refere-se às sequências de nucleotídeos que, quando ligadas de forma operacional a uma sequência, influenciam no início da transcrição ou no início da tradução ou no término da transcrição da dita sequência e na taxa dos ditos processos e/ou na estabilidade e/ou mobilidade de um produto da transcrição ou da tradução. Como utilizado aqui, o termo "ligada de forma operacional" refere-se ao posicionamento de uma região reguladora e a dita sequência para possibilitar a dita influência. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências intensificadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteínas, elementos que podem ser induzidos, sequências de ligação a proteínas, regiões não traduzidas a 5' e a 3'(UTRs), sítios de início da transcrição, sequências de término, sequências de poliadenilação e íntrons. As regiões reguladoras podem ser classificadas em duas categorias, promotores e outras regiões reguladoras.

[0044] Vigor de plantas jovens: como utilizado aqui, "vigor de plantas jovens" refere-se à característica da planta através da qual a planta emerge do solo mais rápido, possui uma taxa de germinação maior (isto é, germina mais rápido), possui um crescimento de plantas jovens mais rápido e maior e/ou germina mais rápido sob condições de frio quando comparadas com a do tipo selvagem ou de controle sob condições similares. O vigor de plantas jovens tem sido frequentemente definido como compreendendo as propriedades de semente que determinam "o potencial para emergência uniforme rápida e desenvolvimento de plantas jovens sob uma faixa ampla de condições de campo".

[0045] Estringência: "Estringência", como utilizado aqui é uma função do comprimento da sonda de molécula de ácido nucléico, da composição da sonda de molécula de ácido nucléico (conteúdo de G + C), da concentração de sal, da concentração de solvente orgânico e da temperatura de hibridização e/ou das condições de lavagem. A estringência é tipicamente medida através do parâmetro Tm, que é a temperatura em que 50% das moléculas de ácidos nucléicos complementares no ensaio de hibridização são hibridizadas, em termos de um diferencial de temperatura partindo de Tm. As condições de alta estringência são aquelas que fornecem uma condição de Tm - 5°C até Tm - 10°C. As condições de estringência média ou moderada são aquelas que fornecem Tm - 20°C até Tm - 29°C. As condições de baixa estringência são aquelas que fornecem uma condição de Tm - 40°C até Tm - 48°C. A relação entre as condições de hibridização e Tm (em °C) é expressa na equação matemática:
Tm = 81,5 - 16,6(log10[Na+]) + 0,41(%G+C) - (600/N) (I)
em que N é o número de nucleotídeos da sonda de molécula de ácido nucléico. Esta equação funciona bem para as sondas de 14 até 70 nucleotídeos de comprimento que são idênticas à sequência alvo. A equação abaixo, para Tm de híbridos de DNA-DNA, é útil para sondas que possuem comprimentos na faixa de 50 até mais de 500 nucleotídeos e para condições que incluem um solvente orgânico (formamida):
Tm = 81,5 + 16,6 log {[Na+]/(1 +0,7[Na+])}+ 0,41(%G+C)-500/L 0,63(% de formamida) (II)
em que L representa o número de nucleotídeos na sonda no híbrido (21). A Tm da Equação II é afetada pela natureza do híbrido: para os híbridos de DNA-RNA, a Tm é 10-15°C maior que a calculada; para os híbridos de RNA-RNA, a Tm é 20-25°C maior. Devido ao fato de que a Tm diminui aproximadamente 1°C para cada 1% de decréscimo na homologia quando uma sonda longa é utilizada (Frischauf e outros (1983) J. Mol. Biol, 170: 827-842), as condições de estringência podem ser ajustadas para favorecer a detecção de genes idênticos ou de membros de famílias relacionadas.

[0046] A Equação II é derivada assumindo que a reação está em equilíbrio. Portanto, as hibridizações de acordo com a presente invenção são mais preferencialmente realizadas sob condições de excesso de sonda e permitindo um tempo suficiente para atingir o equilíbrio. O tempo necessário para atingir o equilíbrio pode ser encurtado através da utilização de um tampão de hibridização que inclui um acelerador de hibridização tal como sulfato de dextrana ou um outro polímero de alto volume.

[0047] A estringência pode ser controlada durante a reação de hibridização ou após a hibridização ter ocorrido, alterando o sal e as condições de temperatura das soluções de lavagem. As fórmulas mostradas anteriormente são igualmente válidas quando utilizadas para computar a estringência de uma solução de lavagem. As estringências preferidas da solução de lavagem ficam dentro das faixas citadas anteriormente; a alta estringência fica 5-8°C abaixo da Tm, a estringência média ou moderada fica 26-29°C abaixo da Tm e a baixa estringência fica 45-48°C abaixo da Tm.

[0048] To: O termo "To" refere-se à planta inteira, a um explante ou a um tecido de calo, inoculado com o meio de transformação.

[0049] T1: O termo T1 refere-se à progênie da planta To, no caso da transformação da planta inteira ou à planta jovem regenerada no caso da transformação de explantes ou de tecido de calo.

[0050] T2: O termo T2 refere-se à progênie da planta T1. A progênie T2 é o resultado da autofertilização ou da polinização cruzada de uma planta T2.

[0051] T3: O termo T3 refere-se à progênie de segunda geração da planta que é o resultado direto de um experimento de transformação. A progênie T3 é o resultado da autofertilização ou da polinização cruzada de uma planta T2.

3.CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DOS POLINUCLEOTIDEOS E DOS POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

[0052] As moléculas de ácidos nucléicos e os polipeptídeos da presente invenção são interessantes porque quando as moléculas de ácidos nucléicos são expressas de forma errada (isto é, quando expressas em uma Localização não natural ou em uma quantidade maior ou menor em relação à do tipo selvagem) produzem plantas que exibem biomassa, taxa de crescimento ou vigor de plantas jovens modulado quando comparadas com as plantas do tipo selvagem, como é evidenciado pelos resultados de vários experimentos divulgados abaixo. Esta característica pode ser utilizada para explorar ou maximizar os produtos vegetais. Por exemplo, as moléculas de ácidos nucléicos e os polipeptídeos da presente invenção são utilizados para aumentar a expressão de genes que fazem com que a planta tenha biomassa, taxa de crescimento ou vigor de plantas jovens modulado.

[0053] Devido ao fato de que as sequências e os métodos divulgados aumentam o crescimento vegetativo e a taxa de crescimento, os métodos divulgados podem ser utilizados para aumentar a produção de biomassa.
Por exemplo, as plantas que crescem de forma vegetativa possuem maior produção de biomassa, comparadas com uma planta da mesma espécie que não é modificada geneticamente para um crescimento vegetativo substancial. Os exemplos de aumentos na produção de biomassa incluem aumentos de pelo menos 5%, pelo menos 20% ou até pelo menos 50%, quando comparada com uma quantidade de produção de biomassa por uma planta da mesma espécie que não cresce de forma vegetativa.

[0054] A sequência de Lead 36 da presente invenção e seus homólogos funcionais, em particular, fornecem plantas transformadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimento por acre de alguma maneira no início da maturidade e uma estatura mais compacta (20%, 30%, 40% ou 60% mais compacta) com caules mais curtos, mas sem biomassa proporcionalmente reduzida. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos. A sequência de Lead 29 da presente invenção e seus homólogos funcionais, em particular, fornecem plantas transformadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimento por acre, de alguma maneira no início da maturidade e uma estatura mais compacta (20%, 30%, 40% ou 60% mais compacta) com caules mais curtos. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos. As sequências de Leads 15 e 28 da presente invenção e seus homólogos funcionais, em particular, fornecem plantas transformadas com maior rendimento, incluindo rendimento de frutos e rendimento por acre. Em tomates, isto resulta em plantas com maior rendimento de frutos em plantas mais compactas. No arroz, isto resulta em plantas com um maior número de brotos.

[0055] O ciclo de vida das plantas florescendo pode, em geral, ser dividido em três fases de crescimento: vegetativo, inflorescência e floral (fase tardia de inflorescência). Na fase vegetativa, o meristema apical dos brotos (SAM) gera folhas que mais tarde garantirão as fontes necessárias para a produção de prole fértil. Após o recebimento dos sinais ambientais e de desenvolvimento apropriados a planta altera o crescimento para floral ou reprodutivo e o SAM entra na fase de inflorescência (I) e dá origem a uma inflorescência com primórdios florais. Durante esta fase o destino do SAM e dos brotos secundários que surgem nas axilas das folhas é determinado por um conjunto de genes de identidade meristemática, dos quais alguns previnem e dos quais alguns promovem o desenvolvimento de meristemas florais. Uma vez estabelecida, a planta entra na fase de inflorescência tardia (Xu e outros (1995) Planta Mol. Biol. 27: 237) em que os órgãos florais são produzidos. Se os sinais ambientais e de desenvolvimento apropriados da planta que mudam o crescimento floral ou reprodutivo forem interrompidos, a planta não será capaz de entrar no crescimento reprodutivo, portanto, manterá o crescimento vegetativo.

[0056] O vigor das sementes ou de plantas jovens é uma característica importante que pode influenciar enormemente o crescimento bem-sucedido de uma planta, tal como plantas de cultivo. Condições ambientais adversas, tais como condições de secura, umidade, frio ou calor, podem afetar o ciclo de crescimento de uma planta e o vigor das sementes (isto é, a vitalidade e a resistência sob tais condições podem diferenciar entre o crescimento de plantas de cultivo bem-sucedido ou falho). O vigor de plantas jovens tem sido frequentemente definido como compreendendo as propriedades de sementes que determinam "o potencial para a emergência e o desenvolvimento uniformes rápidos de plantas jovens normais sob uma faixa ampla de condições de campo". Assim, seria vantajoso desenvolver sementes de plantas com maior vigor.

[0057] Por exemplo, o maior vigor de plantas jovens seria vantajoso para a produção de plantas de cereais tais como arroz, milho, trigo etc. Para estas plantas de cultivo, o crescimento pode frequentemente ser retardado ou interrompido através de temperaturas ambientais frias durante a estação de plantio. Em adição, a emergência e o brotamento rápidos do arroz permitiriam que os agricultores iniciassem um alagamento mais cedo que pode economizar água e suprimir o crescimento fraco. Os genes associados com o maior vigor de semente e/ou tolerância ao frio no arroz, portanto, têm sido pesquisados para a produção de variedades melhoradas de arroz. Ver, por exemplo, Pinson, S., "Molecular Mapping of Seedling Vigor QTLs in Tropical Rice", USDA Agricultural Research Service, 16 de dezembro de 2000.

[0058] O vigor de plantas jovens foi medido através de testes e ensaios diferentes, incluindo mais tipicamente um teste de tolerância ao frio e um teste de envelhecimento acelerado.

[0059] Algumas das sequências de nucleotídeos da invenção codificam fatores de transcrição de hélice-alça básicos (bHCH). Sabe-se que tais fatores de transcrição frequentemente controlam a expressão de vários genes em uma via. As proteínas básicas/hélice-alça-hélice (BHLH) são uma superfamília de fatores de transcrição que se ligam na forma de dímeros a sítios alvos de DNA específicos. Os fatores de transcrição bHLH foram bem caracterizados em eucariotos sem ser plantas e foram identificados como componentes reguladores importantes em processos biológicos diversos. Multas funções diferentes foram identificadas para tais proteínas em mamíferos, incluindo o controle da proliferação celular e a transcrição envolve frequentemente homo- ou heterodimerização. Os membros da família hélice-alçahélice básica R/B (bHLH) de fatores de transcrição vegetais estão envolvidos em uma variedade de processos de crescimento e de diferenciação.

[0060] Uma hélice-alça-hélice básica (bHLH) é um motivo estrutural de proteína que caracteriza uma família de fatores de transcrição. O motivo é caracterizado por duas α hélices conectadas por uma alça. Os fatores de transcrição deste tipo são tipicamente diméricos, cada um com uma hélice contendo resíduos de aminoácidos básicos que facilitam a ligação do DNA. Uma hélice é tipicamente menor e por causa da flexibilidade da alça permite a dimerização através do dobramento e do empacotamento contra uma outra hélice. A hélice maior contém tipicamente as regiões de ligação com o DNA. As proteínas bHLH tipicamente se ligam com uma sequência consenso chamada de um Ebox, CANNTG. O E-box canônico é CACGTG, entretanto alguns fatores de transcrição bHLH se ligam a sequências diferentes, que são frequentemente similares ao E-box. Os fatores de transcrição bHLH são frequentemente importantes no desenvolvimento ou na atividade celular.

4. OS POLINUCLEOTÍDEOS/POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

[0061] Os polinucleotídeos da presente invenção e as proteínas expressas através da tradução destes polinucleotídeos são apresentados na Listagem de Sequências, especificamente SEQ ID NOS. 80, 81, 90, 91, 92, 93, 98, 99, 109, 110, 103 e 104. A Listagem de Sequências também consiste em proteínas comparáveis funcionalmente. Os polipeptídeos que compreendem uma sequência dentro dos mesmos e definidos por uma das sequências consenso podem ser utilizados para as finalidades da invenção, isto é, para produzir plantas transgênicas com biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor de plantas jovens modulado.

5. USO DOS POLIPEPTÍDEOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS

[0062] Para utilizar as sequências da presente invenção ou uma combinação das mesmas ou de partes e/ou mutantes e/ou fusões e/ou variações das mesmas, são preparadas construções de DNA recombinante que compreendem as sequências de polinucleotídeos da invenção inseridas em um vetor e que são adequadas para a transformação de células vegetais. A construção pode ser feita utilizando técnicas de DNA recombinante padronizadas (ver, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nova York.) e pode ser introduzida na espécie vegetal de interesse, por exemplo, através da transformação mediada por Agrobacterium ou através de outros meios de transformação, por exemplo, como divulgado abaixo.

[0063] A estrutura do vetor pode ser qualquer uma das tipicamente utilizadas no campo tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs, PACs e vetores tais como, por exemplo, vetores do tipo ponte ("Shuffle cetors") bactérialevedura, vetores de fago lambda, vetores de fusão de T-DNA e vetores plasmideais (ver, Shizuya e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794-8797; Hamilton e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9975-9979; Burke e outros (1987) Science, 236: 806-812; Sternberg N. e outros (1990) Proc Natl Acad Sci U S A., 87: 103-7; Bradshaw e outros (1995) Nucl Acids Res, 23: 4850-4856; Frischauf e outros (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842; Huynh e outros, Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Approach, Vol. 1 Oxford: IRL Press (1985); Walden e outros (1990) Mol Cell Biol 1: 175-194).

[0064] Tipicamente, a construção compreende um vetor que contém uma molécula de ácido nucléico da presente invenção com quaisquer sequências reguladoras da transcrição e/ou da tradução tais como, por exemplo, promotores, UTRs e sequências de término na extremidade 3'. Os vetores também podem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de ligação de sustentação (SARs), marcadores, sequências homólogas e íntrons. O vetor também pode compreender um gene marcador que confere um fenótipo que pode ser selecionado nas células vegetais. O marcador pode preferencialmente codificar uma característica de resistência a biocidas, particularmente resistência a antibióticos, tal como a resistência, por exemplo, à canamicina, à bleomicina ou à higromicina ou resistência a herbicidas, tal como resistência, por exemplo, ao glifosato, à clorossulfurona ou à fosfinotricina.

[0065] Será entendido que mais de uma região reguladora pode estar presente em um polinucleotídeo recombinante, por exemplo, íntrons, intensificadores, regiões de ativação a montante, terminadores da transcrição e elementos que podem ser induzidos. Assim, mais de uma região reguladora pode estar ligada de forma operacional à dita sequência.

[0066] Para "ligar de forma operacional" uma sequência promotora a uma sequência, o sítio de início da tradução do quadro de leitura da tradução da dita sequência é tipicamente posicionado entre um e aproximadamente cinquenta nucleotídeos a jusante do promotor. Um promotor pode, entretanto, estar posicionado tanto quando aproximadamente 5.000 nucleotídeos a montante do sitio de início da tradução ou aproximadamente 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição. Um promotor compreende tipicamente pelo menos um promotor central (basal. Um promotor também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência intensificadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Por exemplo, um intensificador adequado é um elemento regulador em cis (-212 até -154) partindo da região a montante do gene da octopina sintase (ocs). Fromm e outros, The Plant Cell 1: 977-984 (1989).

[0067] Um promotor basal é a sequência mínima necessária para a montagem de um complexo de transcrição necessário para o início da transcrição. Os promotores basais incluem frequentemente um elemento "TATA box" que pode estar localizado entre aproximadamente 15 e aproximadamente 35 nucleotídeos a montante do sítio de início da transcrição. Os promotores basais também podem incluir um elemento "CCAAT box" (tipicamente a sequência CCAAT) e/ou uma sequência GGGCG, que pode estar localizada entre aproximadamente 40 e aproximadamente 200 nucleotídeos, tipicamente aproximadamente 60 até aproximadamente 120 nucleotídeos, a montante do sítio de início da transcrição.

[0068] A escolha dos promotores que serão incluídos depende de vários fatores, incluindo, mas não limitados à eficiência, à capacidade de seleção, à capacidade de indução, ao nível de expressão desejado e à expressão preferencial na célula ou no tecido. E uma questão de rotina para um perito na técnica modular a expressão de uma sequência através da seleção e do posicionamento de forma apropriada dos promotores e de outras regiões reguladoras em relação à dita sequência.

[0069] Alguns promotores adequados iniciam a transcrição somente ou predominantemente, em certos tipos de células. Por exemplo, um promotor que é predominantemente ativo em um tecido reprodutivo (por exemplo, fruto, óvulo, pólen, pistilos, gametófito feminino, célula ovo, célula central, nucelo, suspensos, célula sinérgida, flores, tecido embrionário, saco embrionário, embrião, zigoto, endosperma, integumento ou revestimento de semente) pode ser utilizado. Assim, como utilizado aqui, um promotor preferencial do tipo celular ou do tecido é um que controla a expressão preferencialmente no tecido alvo, mas que também pode levar a alguma expressão em outros tipos de células ou tecidos. Os métodos para a identificação e para a caracterização de regiões promotoras no DNA genômico vegetal incluem, por exemplo, os descritos nas referências a seguir: Jordano e outros, Plant Cell, 1: 855-866 (1989); Bustos e outros, Plant Cell, 1: 839-854 (1989); Green e outros, EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier e outros, Plant Cell, 3, 309-316 (1991); e Zhang e outros, Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).

[0070] Os exemplos de várias classes de promotores são descritos abaixo. Alguns dos promotores indicados abaixo são descritos em maiores detalhes rios Pedidos de Patentes U.S. Nos de Série 60/505.689; 60/518.075; 60/544.771; 60/558.869; 60/583.691; 60/619.181; 60/637.140; 10/950.321;10/957.569; 11 /058.689; 11 /172.703; 11 /208.308; e PCT/US05/23639. Será considerado que um promotor pode satisfazer os critérios para uma classificação baseada em sua atividade em uma espécie vegetal e ainda satisfazer os critérios para uma classificação diferente baseada em sua atividade em uma outra espécie vegetal.

[0071] Outras Regiões Reguladoras: Uma região não traduzida a 5' (UTR) pode ser incluída nas construções de ácidos nucléicos descritas aqui. Uma UTR a 5' é transcrita, mas não é traduzida e fica entre o sítio de início do produto da transcrição e o códon de início da tradução e pode incluir o nucleotídeo +1. Uma UTR a 3' pode ser posicionada entre o códon de início da tradução e o final do produto da transcrição. As UTRs podem ter funções particulares tal como o aumento da estabilidade do mRNA ou a atenuação da tradução. Os exemplos das UTRs a 3' incluem, mas não estão limitados aos sinais de poliadenilação e às sequências de término da transcrição, por exemplo, uma sequência de término da nopalina sintase.

[0072] Vários promotores podem ser utilizados para controlar a expressão dos genes da presente invenção. As sequências de nucleotídeos de tais promotores são apresentadas nas SEQ ID NOS: 1-79. Algumas dessas podem ser promotores de expressão ampla, outras podem ser mais preferenciais a tecidos.

[0073] Pode-se dizer que um promotor é "de expressão ampla" quando promove a transcrição em muitos, mas não necessariamente todos os tecidos vegetais ou as células vegetais. Por exemplo, um promotor de expressão ampla pode promover a transcrição de uma sequência ligada de forma operacional em um ou mais do broto, ponta do broto (ápice) e folhas, mas fracamente ou de forma alguma em tecidos tais como raízes ou caules. Como um outro exemplo, um promotor de expressão ampla pode promover a transcrição de uma sequência ligada de forma operacional em um ou mais do caule, broto, ponta do broto (ápice) e folhas, mas pode promover a transcrição de forma fraca ou nenhuma em tecidos tais como tecidos reprodutivos e sementes em desenvolvimento. Os exemplos não limitantes de promotores de expressão ampla que podem ser incluídos nas construções de ácidos nucléicos fornecidas aqui incluem o p326 (SEQ ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YPO190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) e PT0633 (SEQ ID NO: 7). Exemplos adicionais incluem o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor da manopina sintase (MAS), os promotores 1' ou 2' derivados do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor 34S do vírus mosaico da escrofulária, os promotores da actina tal como o promotor da actina do arroz e promotores de ubiquitina tal como o promotor da ubiquitina-1 do milho. Em alguns casos, o promotor 35S de CaMV é excluído da categoria de promotores de expressão ampla.

[0074] Os promotores ativos nas raízes controlam a transcrição no tecido radicular, por exemplo, endoderme radicular, epiderme radicular ou tecidos vasculares radiculares. Em algumas modalidades, os promotores ativos nas raízes são promotores preferenciais de raízes, isto é, controlam a transcrição somente ou predominantemente no tecido radicular. Os promotores preferenciais de raiz incluem o YP0128 (SEQ ID NO: 52), YP0275 (SEQ ID NO: 63), PT0625 (SEQ ID NO: 6), PT0660 (SEQ ID NO: 9), PT0683 (SEQ ID NO: 14) e PT0758 (SEQ ID NO: 22). Outros promotores preferenciais de raiz incluem o PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0688 (SEQ ID NO: 15) e PT0837 (SEQ ID NO: 24), que controlam a transcrição primariamente no tecido radicular e até uma menor extensão nos óvulos e/ou nas sementes. Outros exemplos de promotores preferenciais de raiz incluem os subdomínios específicos à raiz do promotor 35S de CaMV (Lam e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7890-7894 (1989)), promotores específicos às células de raiz relatados por Conkling e outros, Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990) e o promotor do gene RD2 do tabaco.

[0075] Em algumas modalidades, os promotores que controlam a transcrição no endosperma em maturação podem ser úteis. A transcrição partindo de um promotor de endosperma em maturação começa tipicamente após a fertilização e ocorre primariamente no tecido do endosperma durante o desenvolvimento das sementes e é tipicamente maior durante a fase de celularização. São mais adequados os promotores que são ativos predominantemente no endosperma em maturação, embora os promotores que também são ativos em outros tecidos possam algumas vezes ser utilizados. Os exemplos não limitantes de promotores de endosperma em maturação que podem ser incluídos nas construções de ácidos nucléicos fornecidas aqui incluem o promotor da napina, o promotor da Arcelina-5, o promotor do gene da faseolina (Bustos e outros (1989) Plant Cell 1(9): 839-853), o promotor do inibidor da tripsina da soja (Riggs e outros (1989) Plant Cell 1(6): 609-621), o promotor ACP (Baerson e outros (1993) Plant Moi 8101, 22(2): 255-267), o gene da estearoil-ACP dessaturase (Siocombe e outros (1994) Plant Physiol 104(4): 167-176), a subunidade a' da soja do promotor da R-conglicinina (Chen e outros (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 8560-8564), o promotor da oleosina (Hong e outros (1997) Plant Moi Biol 34(3): 549-555) e os promotores da zeína, tais como o promotor da zeína de 15 kD, o promotor da zeína de 16 kD, o promotor da zeína de 19 kD, o promotor da zeína de 22 kD e o promotor da zeína de 27 kD. São também adequados o promotor Osgt-1 do gene da glutelina-1 do arroz (Zheng e outros (1993) Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842), o promotor do gene da beta-amilase e o promotor do gene da hordeína da cevada. Outros promotores do endosperma em maturação incluem o YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12) e PT0708 (SEQ ID NO: 17).

[0076] Os promotores que controlam a transcrição nos tecidos de ovário tais como a parede do óvulo e o mesocarpo também podem ser úteis, por exemplo, um promotor da poligalacturonidase, o promotor TRX da banana e o promotor da actina do melão. Outros tais promotores que controlam a expressão gênica preferencialmente nos óvulos são YP0007 (SEQ ID NO: 30), YP0111 (SEQ ID NO: 46), YP0092 (SEQ ID NO: 38), YPO103 (SEQ ID NO: 43), YP0028 (SEQ ID NO: 33), YP0121 (SEQ ID NO: 51), YP0008 (SEQ ID NO: 31), YP0039 (SEQ ID NO: 34), YPO115 (SEQ ID NO: 47), YPO119 (SEQ ID NO: 49), YP0120 (SEQ ID NO: 50) e YP0374 (SEQ ID NO: 68).

[0077] Em algumas outras modalidades da presente invenção, os promotores de saco embrionário/endosperma inicial podem ser utilizados com a finalidade de controlar a transcrição da sequência de interesse nos núcleos polares e/ou na célula central ou em precursores para os núcleos polares, mas não nas células ovo ou nos precursores para as células ovo. São mais adequados os promotores que controlam a expressão somente ou predominantemente nos núcleos polares ou nos precursores para os mesmos e/ou na célula central. Um padrão de transcrição que se estende dos núcleos polares para o desenvolvimento do endosperma inicial também pode ser encontrado com os promotores preferenciais do saco embrionário/endosperma inicial, embora a transcrição tipicamente diminua significativamente no desenvolvimento do endosperma tardio durante e após a fase de celularização. A expressão no zigoto ou no embrião em desenvolvimento tipicamente não está presente com os promotores de saco embrionário/endosperma inicial.

[0078] Os promotores que podem ser adequados incluem os derivados dos genes a seguir: viviparous-1 de Arabidopsis (ver, GenBank No. U93215); atmycl de Arabidopsis (ver, Urao (1996) Plant Mol. Biol., 32: 571-57; Conceicao (1994) Plant, 5: 493- 505); FIE de Arabidopsis (GenBank No. AF129516); MEA de Arabidopsis; FIS2 de Arabidopsis (GenBank No. AF096096); e FIE 1.1 (Patente U.S. N° 6.906.244). Outros promotores que podem ser adequados incluem os derivados dos genes a seguir: MAC1 do milho (ver, Sheridan (1996) Genetics, 142: 1009.1020); Cat3 do milho (ver, GenBank No. L05934; Abler (1993) Plant Mol. Biol, 22: 10131-1038). Outros promotores incluem os promotores de Arabidopsis a seguir: YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0101 (SEQ ID NO: 41), YP0102 (SEQ ID NO: 42), YP0110 (SEQ ID NO: 45), YPO117 (SEQ ID NO: 48), YPO119 (SEQ ID NO: 49), YP0137 (SEQ ID NO: 53), DME, YP0285 (SEQ ID NO: 64) e YP0212 (SEQ ID NO: 60). Outros promotores que podem ser úteis incluem os promotores do arroz a seguir: p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102 e pOsYp285.

[0079] Os promotores que controlam preferencialmente a transcrição em células zigóticas após a fertilização podem fornecer expressão preferencial no embrião e podem ser úteis para a presente invenção. São mais adequados os promotores que controlam preferencialmente a transcrição em embriões em estágio inicial antes do estágio central, mas a expressão no estágio tardio e nos embriões em maturação também é adequada. Os promotores preferenciais de embrião incluem o promotor de transferência de lipídeos da cevada (Ltpl) (Plant Cell Rep (2001) 20: 647-654, YP0097 (SEQ ID NO: 40), YP0107 (SEQ ID NO: 44), YP0088 (SEQ ID NO: 37), YP0143 (SEQ ID NO: 54), YP0156 (SEQ ID NO: 56), PT0650 (SEQ ID NO: 8), PT0695 (SEQ ID NO: 16), PT0723 (SEQ ID NO: 19), PT0838 (SEQ ID NO: 25), PT0879 (SEQ ID NO: 28) e PT0740 (SEQ ID NO: 20).

[0080] Os promotores ativos no tecido fotossintético com a finalidade de transcrição em tecidos verdes tais como folhas e caules são de interesse particular para a presente invenção. São mais adequados os promotores que controlam a expressão somente ou predominantemente em tais tecidos. Os exemplos de tais promotores incluem os promotores da ribuiose-1,5- bisfosfato carboxilase (RbcS) tal como o promotor RbcS do lanço oriental (Larix laricina), o promotor cab6 de pinheiro (Yamamoto e outros (1994) Plant Cell Physiol. 35: 773-778), o promotor do gene Cab-1 do trigo (Fejes e outros (1990) Plant Mol. Biol. 15: 921-932), o promotor CAB-1 do espinafre (Lubberstedt e outros (1994) Plant Physiol. 104: 997-1006), o promotor cabl R do arroz (Luan e outros (1992) Plant Cell 4: 971-981), o promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka e outros (1993) Proc Natl Acad. Sci USA 90: 9586-9590), o promotor Lhcbl *2 do tabaco (Cerdan e outros (1997) Plant Mol. Biol. 33: 245-255), o promotor do simportador de sacarose-H+ SUC2 de Arabidopsis thaliana (Truernit e outros (1995) Plant 196: 564-570) e os promotores da proteína da membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores que controlam a transcrição nos caules, nas folhas e no tecido verde são PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).

[0081] Em algumas outras modalidades da presente invenção, podem ser desejados promotores que podem ser induzidos. Os promotores que podem ser induzidos controlam a transcrição em resposta a estímulos externos tais como agentes químicos ou estímulos ambientais. Por exemplo, os promotores que podem ser induzidos podem conferir transcrição em resposta a hormônios tal como o ácido giberélico ou o etileno ou em resposta à luz ou à seca. Os exemplos de promotores que podem ser induzidos pela seca são YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26), YP0381 (SEQ ID NO: 71), YP0337 (SEQ ID NO: 66), YP0337 (SEQ ID NO: 66), PT0633 (SEQ ID NO: 7), YP0374 (SEQ ID NO: 68), PT0710 (SEQ ID NO: 18), YP0356 (SEQ ID NO: 67), YP0385 (SEQ ID NO: 73), YP0396 (SEQ ID NO: 74), YP0384 (SEQ ID NO: 72), YP0384 (SEQ ID NO: 72), PT0688 (SEQ ID NO: 15), YP0286 (SEQ ID NO: 65), YP0377 (SEQ ID NO: 69) e PD1367 (SEQ ID NO: 79). Os exemplos de promotores induzidos pelo nitrogênio são PT0863 (SEQ ID NO: 27), PT0829 (SEQ ID NO: 23), PT0665 (SEQ ID NO: 10) e PT0886 (SEQ ID NO: 29). Um exemplo de um promotor que pode ser induzido pela sombra é PR0924 (SEQ ID NO: 78).

[0082] Outros promotores: outras classes de promotores incluem, mas não estão limitados aos promotores preferenciais à folha, preferenciais ao caule/broto, preferenciais ao calo, preferenciais à célula guarda, tal como PT0678 (SEQ ID NO: 13) e preferenciais à senescência. Os promotores denominados YP0086 (SEQ ID NO: 36), YP0188 (SEQ ID NO: 58), YP0263 (SEQ ID NO: 62), PT0758 (SEQ ID NO: 22), PT0743 (SEQ ID NO: 21), PT0829 (SEQ ID NO: 23), YP0119 (SEQ ID NO: 49) e YP0096 (SEQ ID NO: 39), como descrito nos pedidos de patentes referidos anteriormente, também podem ser úteis.

[0083] Alternativamente, a expressão errada pode ser realizada utilizando um sistema de dois componentes, em que o primeiro componente consiste em uma planta transgênica que compreende um ativador da transcrição ligado de forma operacional com um promotor e o segundo componente consiste em uma planta transgênica que compreende uma molécula de ácido nucléico da invenção ligada de forma operacional com a sequência/região de ligação ao alvo do ativador da transcrição. As duas plantas transgênicas são cruzadas e a molécula de ácido nucléico da invenção é expressa na progênie da planta. Em uma outra modalidade alternativa da presente invenção, a expressão errada pode ser realizada possuindo as sequências do sistema de dois componentes transformadas em uma linhagem de planta transgênica.

[0084] Uma outra alternativa consiste na inibição da expressão de um polipeptídeo modulador da biomassa ou do vigor em uma espécie vegetal de interesse. O termo "expressão" referese ao processo de conversão da informação genética codificada em um polinucleotídeo em RNA através da transcrição do polinucleotídeo (isto é, através da ação enzimática de uma RNA polimerase) e em proteína, através da tradução do mRNA. "Regulação para mais" ou "ativação" refere-se à regulação que aumenta a produção de produtos da expressão em relação a estados basais ou nativos, enquanto que "regulação para menos" ou "repressão" refere-se à regulação que diminui a produção em relação a estados basais ou nativos.

[0085] Um número de métodos baseados em ácidos nuciéicos, incluindo RNA anti-senso, clivagem de RNA direcionada por ribozima e RNA interferente (RNAi) também pode ser utilizado para inibir a expressão de proteínas nas plantas. A tecnologia anti-senso é um método bem-conhecido. Neste método, um segmento de ácido nucléico do gene endógeno é clonado e ligado de forma operacional a um promotor de forma que o filamento anti-senso de RNA é transcrito. O vetor recombinante é então transformado nas plantas, como descrito anteriormente e o filamento antisenso de RNA é produzido. O segmento de ácido nucléico na precisa não ser a sequência inteira do gene que será reprimido, mas tipicamente será substancialmente idêntica a pelo menos uma parte do gene endógeno que será reprimido. Geralmente, uma maior homologia pode ser utilizada para compensar o uso de uma sequência mais curta. Tipicamente, uma sequência de pelo menos 30 nucleotídeos é utilizada (por exemplo, pelo menos 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos ou mais).

[0086] Assim, por exemplo, um ácido nucléico isolado fornecido aqui pode ser um ácido nucléico anti-senso a um dos ácidos nucléicos mencionados anteriormente que codificam um polipeptídeo modulador da biomassa. Um ácido nucléico que diminui o nível de um produto da transcrição ou da tradução de um gene que codifica um polipeptídeo que modula a biomassa é transcrito em um ácido nucléico anti-senso similar ou idêntico à sequência codificadora senso do polipeptídeo modulador da biomassa ou da taxa de crescimento. Alternativamente, o produto da transcrição de um ácido nucléico isolado pode ser similar ou idêntico à sequência codificadora senso de um polipeptídeo modulador da biomassa ou da taxa de crescimento, mas um RNA que não está poliadenilado, não possui a estrutura de cap a 5' ou contém um íntron que não pode ser processado.

[0087] Em um outro método, um ácido nucléico pode ser transcrito em uma ribozima ou um RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. (ver a Patente U.S. N2 6.423.885). As ribozimas podem ser planejadas para se parearem especificamente com virtualmente qualquer RNA alvo e clivar a estrutura fosfodiéster em uma localização específica, inativando funcionalmente assim o RNA alvo. Os ácidos nucléicos heterólogos podem codificar robizimas planejadas para clivar produtos da transcrição de mRNA particulares, prevenindo assim a expressão de um polipeptídeo. Ribozimas "cabeça de martelo" são úteis para destruir mRNAs particulares, embora várias ribozimas que clivam mRNA nas sequências de reconhecimento específicas ao sítio possam ser utilizadas. As ribozimas "cabeça de martelo" clivam os mRNAs nas localizações determinadas pelas regiões flanqueadoras que formam pares de bases complementares com o mRNA alvo. O único requerimento é que o RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeos 5'-UG-3'. A construção e a produção de ribozimas "cabeça de martelo" são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.254.678 e a WO 02/46449 e as referências citadas nas mesmas. As sequências de ribozimas "cabeça de martelo" podem estar encerradas dentro de um RNA estável tal como um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência de clivagem in vivo. Perriman e outros (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13): 6175-6179; de Feyter e Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Capítulo 43, "Expressing Ribozymes in Plantas", Editado por Turner, P.C, Humana Press Inc., Totowa, NJ. As RNA endorribonucleases tal como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila e que foi descrita extensivamente por Cech e colaboradores pode ser útil. Ver, por exemplo, a Patente U.S. Nº 4.987.071.

[0088] Podem ser utilizados os métodos baseados na interferência de RNA (RNAi). A interferência de RNA é um mecanismo celular para regular a expressão de genes e a replicação de vírus. Acredita-se que este mecanismo seja mediado por moléculas de RNA interferentes pequenas de filamento duplo. Uma célula responde a tal RNA de filamento duplo através da destruição do mRNA endógeno que possui a mesma sequência que o RNA de filamento duplo. Os métodos para o planejamento e para a preparação dos RNAs interferentes são conhecidos pelos peritos na técnica; ver, por exemplo, a WO 99/32619 e a WO 01/75164. Por exemplo, pode ser preparada uma construção que inclui uma sequência que é transcrita em um RNA interferente. Tal RNA pode ser um que pode se anelar com ele mesmo, por exemplo, um RNA de filamento duplo que possui uma estrutura de haste-alça. Um filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é similar ou idêntica à sequência codificadora senso do polipeptídeo de interesse e que possui de aproximadamente 10 nucleotídeos até aproximadamente 2.500 nucleotídeos de comprimento. O comprimento da sequência que é similar ou idêntica à sequência codificadora senso pode ser de 10 nucleotídeos até 500 nucleotídeos, de 15 nucleotídeos até 300 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 100 nucleotídeos ou de 25 nucleotídeos até 100 nucleotídeos. O outro filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência anti-senso do polipeptídeo modulador de biomassa de interesse e pode ter um comprimento que é mais curto, o mesmo ou mais longo que o filamento correspondente da sequência senso. A porção de alça de um RNA de filamento duplo pode ser de 10 nucleotídeos até 5.000 nucleotídeos, por exemplo, de 15 nucleotídeos até 1.000 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 500 nucleotídeos ou de 25 nucleotídeos até 200 nucleotídeos. A porção de alça do RNA pode incluir um íntron. Ver, por exemplo, a WO 99/53050.

[0089] Em alguns métodos baseados em ácidos nucléicos para a inibição da expressão gênica em plantas, um ácido nucléico adequado pode ser um análogo de ácido nucléico. Os análogos de ácido nucléico podem ser modificados no grupamento de base, no grupamento de açúcar ou na estrutura de fosfato para aumentar, por exemplo, a estabilidade, a hibridização ou solubilidade do ácido nucléico. As modificações no grupamento de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina e 5-metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. As modificações do grupamento de açúcar incluem a modificação do 2' hidroxila do grupamento de ribose para formar açúcares 2-0- metila ou 2'-O-alila. A estrutura de desoxirribose fosfato pode ser modificada para produzir ácidos nucléicos de morfolino, em que cada grupamento de base é ligado a um anel morfolino de seis membros ou ácidos nucléicos peptídicos, em que a estrutura de desoxifosfato é substituída por uma estrutura de pseudopeptídeo e as quatro bases são mantidas. Ver, por exemplo, Summerton e Weller, 1997, Antisense Nucieic Acid Drug Dev., 7: 187-195; Hyrup e outros, 1996, Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23. Em adição, a estrutura de desoxifosfato pode ser substituída por, por exemplo, uma estrutura de fosforotioato ou fosforoditioato, uma estrutura de fosforoamidita ou de alquil fosfotriéster.

Transformação

[0090] As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser introduzidas no genoma ou na célula da planta hospedeira apropriada através de uma variedade de técnicas. Estas técnicas, capazes de transformar uma ampla variedade de espécies vegetais superiores, são bem conhecidas e descritas na literatura técnica e científica (ver, por exemplo, Weising e outros (1988) Ann. Rev. Genet, 22: 421 e Christou (1995) Euphytica, 85: 13-27).

[0091] Uma variedade de técnicas conhecidas na técnica está disponível para a introdução do DNA em uma célula vegetal hospedeira. Estas técnicas incluem a transformação de células vegetais através de injeção (Newell (2000)), microinjeção (Griesbach (1987) Plant Sci. 50: 69-77), eletroporação de DNA (Fromm e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824), PEG(Paszkowski e outros (1984) EMBO J. 3: 2717), uso de bíolística (Klein e outros (1987) Nature 327: 773), fusão de células ou de protoplastos (Willmitzer, L. (1993) Transgenic Plants. Em: lotechnology, A Multi-Volume Comprehensive treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Püler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659, VCH Weínheim-New York-Basel-Cambridge) e através de T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens (Crit. Rev. Plant. Sci. 4: 1-46; Fromm e outros (1990) Biotechnology 8: 833-844) ou Agrobacterium rhizogenes (Cho e outros (2000) Planta 210: 195-204) ou outros hospedeiros bacterianos (Brootghaerts e outros (2005) Nature 433: 629-633), por exemplo.

[0092] Em adição, um número de métodos de transformação não estáveis que é bem-conhecido na técnica pode ser desejável para a presente invenção. Tais métodos incluem, mas não estão limitados à expressão transitória (Lincoin e outros (1998) Plant Mol. Biol. Rep. 16: 1-4) e à transfecção viral (Lacomme e outros (2001), "Genetically Engineered Viruses" (C.J.A. Ring e E.D. Biair, Eds). Pp. 59-99, BIOS Scientific Publishers, Ltd. Oxford, UK).

[0093] As sementes são obtidas partindo das plantas transformadas e utilizadas para testar a estabilidade e a herança. Geralmente, duas ou mais gerações são cultivadas para garantir que a característica fenotípica seja mantida de forma estável e transmitida.

[0094] Um perito na técnica reconhece que após o cassete de expressão ser estavelmente incorporado nas plantas transgênicas e confirmado como sendo operacional, pode ser introduzido em outras plantas através do cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de técnicas de cruzamento padronizadas pode ser utilizada, dependendo da espécie que será cruzada.

[0095] As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser utilizadas para conferir a característica de um tempo de florescimento alterado.

[0096] As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção codificam proteínas apropriadas de qualquer organismo, mas são preferencialmente encontradas em plantas, fungos, bactérias ou animais.

[0097] Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser aplicados em qualquer planta, preferencialmente plantas superiores, que pertencem às classes de Angiospermae e Gymnospermae. As plantas das subclasses das Dicotylodenae e das Monocotyledonae são particularmente adequadas. As plantas dicotiledôneas pertencentes às ordens Magniolales, Illiciales, Laurales, Piperales Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Sal/cales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales e Asterales, por exemplo, também são adequadas. As plantas monocotiledôneas pertencentes às ordens Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchidales também podem ser úteis nas modalidades da presente invenção. Os exemplos adicionais incluem, mas não estão limitados às plantas que pertencem à classe Gymnospermae que são Pinales, Ginkgoales, Cycadales e Gnetales.

[0098] Os métodos da presente invenção são preferencialmente utilizados em plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para bioconversão e/ou florestamento. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, tabaco, colza de semente oleosa, beterraba de açúcar, tomates, pepinos, pimentas, feijões, ervilhas, frutos cítricos, abacates, pêssegos, maçãs, pêras, bagas, ameixas, melões, berinjelas, algodão, soja, girassóis, rosas, poinsetia, petúnia, guaiúle, repolhos, espinafre, alfalfa, alcachofras, cana-deaçúcar, mimosa, Servicea lespedera, milho, trigo, arroz, centeio, cevada, sorgo e gramíneas tal como Panicum virgatum, bambu gigante, capim-de-burro, sorgo bravo ou turfa, painço, cânhamo, bananas, choupos, eucalipto e coníferas. São de interesse as plantas cultivadas para a produção de energia, as assim chamadas plantas de cultivo para energia, tais como plantas de folhas amplas como alfalfa, cânhamo, tupinambu e gramíneas tais como sorgo, Panicum vírgatum, sorgo bravo e similares.

Homólogos Abrangidos pela Invenção

[0099] É sabido na técnica que um ou mais aminoácidos em uma sequência podem ser substituídos por outro(s) aminoácido(s), cuja carga e polaridade são similares àquelas do aminoácido substituído, isto é, uma substituição conservativa de aminoácidos, resultando em uma alteração biologicamente/funcionalmente silenciosa. Os substitutos conservativos para um aminoácido dentro da sequência de polipeptídeo podem ser selecionados de outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Os aminoácidos podem ser divididos nos quatro grupos a seguir: (1) aminoácidos ácidos (carregados negativamente), tais como o ácido aspártico e o ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (carregados positivamente), tais como arginina, histidina e lisina; (3) aminoácidos polares neutros, tais como serina, treonina, tirosina, asparagina e glutamina; e (4) aminoácidos não polares neutros (hidrofóbicos) tais como glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, cisteína e metionina.

[0100] As moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção podem compreender sequências que diferem daquelas que codificam uma proteína ou um fragmento da mesma selecionadas do grupo que consiste em Leads 15, 28, 29, 36, ME04012 e Clone 691319, SEQ ID Nos. 80, 90, 92, 98, 109 e 103, respectivamente, devido ao fato de que a sequência de ácido nucléico diferente codifica uma proteína que possui uma ou mais alterações de aminoácidos conservativas.

[0101] Os equivalentes biologicamente funcionais dos polipeptídeos ou os fragmentos dos mesmos, da presente invenção podem ter aproximadamente 10 ou menos alterações de aminoácidos conservativas, mais preferencialmente aproximadamente 7 ou menos alterações de aminoácidos conservativas e mais preferencialmente aproximadamente 5 ou menos alterações de aminoácidos conservativas. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o polipeptídeo possui entre aproximadamente 5 e aproximadamente 500 alterações conservativas, mais preferencialmente entre aproximadamente 10 e aproximadamente 300 alterações conservativas, ainda mais preferencialmente entre aproximadamente 25 e aproximadamente 150 alterações conservativas e mais preferencialmente entre aproximadamente 5 e aproximadamente 25 alterações conservativas ou entre 1 e aproximadamente 5 alterações conservativas.

Identificação de Moléculas de Ácidos Nucléicos Úteis e Suas Sequências de Nucleotídeos Correspondentes

[0102] As moléculas de ácidos nucléicos e as sequências de nucleotídeos das mesmas, da presente invenção foram identificadas através do uso de uma variedade de seleções que podem prever as sequências de nucleotídeos que fornecem plantas com tamanho, crescimento vegetativo, taxa de crescimento, número de órgãos, arquitetura da planta e/ou biomassa alterada. Uma ou mais das seleções a seguir foram, portanto, utilizadas para a identificação das sequências de nucleotídeos (e de aminoácidos) da presente invenção.

[0103] A presente invenção é adicionalmente exemplificada pelos exemplos a seguir. Não é pretendido que os exemplos limitem de forma alguma o âmbito do presente pedido de patente e seus usos.

6. EXPERIMENTOS QUE CONFIRMAM A UTILIDADE DOS POLINUCLEOTÍDEOS E DOS POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO Protocolos Gerais Transformação de Arabidopsis Mediada por Agrobacterium

[0104] Plantas de Arabidopsis thaliana Wassilewskija (WS) do tipo selvagem são transformadas com plasmídeos Ti contendo clones na orientação senso em relação ao promotor 35S. Um vetor de plasmídeo Ti útil para estas construções, CRS 338, contém o gene marcador selecionável de planta fosfinotricina acetiltransferase (PA7) construído pela Ceres, que confere resistência a herbicida às plantas transformadas.

[0105] Dez eventos transformados independentemente são tipicamente selecionados e avaliados em relação ao seu fenótipo qualitativo na geração T1.

[0106] Preparação de Mistura de Solo: O solo 24L SunshineMix #5 (Sun Gro Horticultura, Ltd., Bellevue, WA) é misturado com a vermiculita 16L Therm-O-Rock (Therm-O-Rock West, Inc., Chandler, AZ) em uma misturadora de cimento para produzir uma mistura de solo de 60:40. À mistura de solo são adicionados 2 Colheres de Sopa de grânulos Marathon 1% (Hummert, Earth City, MO), 3 Colheres de Sopa de OSMOCOTE® 14-14-14 (Hummert, Earth City, MO) e 1 Colher de Sopa do fertilizante Peters 20-20-20 (J,R. Peters, Inc., Allentown, PA), que são primeiramente adicionados em 11,35 L (3 galões) de água e então adicionados ao solo e mistuados vigorosamente. Geralmente, vasos de 10,16 cm (4 polegadas) de diâmetro são preenchidos com a mistura de solo. Os vasos são então cobertos com 51,61 cm2 (8 polegadas quadradas) de rede de náilon.

[0107] Plantio: utilizando uma seringa de 60 mL, 35 mL da mistura de sementes são aspirados. 25 gotas são adicionadas em cada vaso. Cúpulas de propagação translúcidas são colocadas na parte superior dos vasos que são então colocados sob tela para estufa a 55% e subirrigados através da adição de 2,54 cm (1 polegada) de água.

[0108] Manutenção das Plantas: 3 até 4 dias após o plantio, as tampas e a tela para estufa são removidos. As plantas são regadas quando necessário. Após 7-10 dias, diminuem-se os vasos para 20 plantas por vaso utilizando fórceps. Após 2 semanas, todas as plantas são subirrigadas com fertilizante Peters a uma taxa de 1 Colher de Sopa por 3,78 L (galão) de água. Quando os “bolts” possuírem aproximadamente 5-10 cm de comprimento, são cortados entre o primeiro nó e a base do caule para induzir "bolts" secundários. A infiltração por gotejamento é realizada 6 até 7 dias após o corte.

[0109] Preparação de Agrobacterium: a 150 mL de YEB fresco é adicionado 0,1 mL de cada de carbenicilina, espectinomicina e rifampicina (cada um à concentração estoque de 100 mg/mL). São obtidos blocos de partida de Agrobacterium (bloco de 96 cavidades com culturas de Agrobacterium crescidas até uma DO600 de aproximadamente 1,0) e é inoculado um recipiente de cultura por construção através da transferência de 1 mL da cavidade apropriada no bloco de partida. As culturas são então incubadas com agitação a 27°C. As culturas são centrifugadas após atingirem uma D06® de aproximadamente 1,0 (aproximadamente 24 horas). 200 mL do meio de infiltração são adicionados aos péletes ressuspensas de Agrobacterium. O meio de infiltração é preparado através da adição de 2,2 g de sais de MS, 50 g de sacarose e 5 pL de benzilaminopurina a 2 mg/mL em 900 mL de água.

[0110] Infiltração por Gotejamento: os vasos são invertidos e submersos durante 5 minutos de forma que a parte aérea da planta fique na suspensão de Agrobacterium. E permitido que as plantas cresçam normalmente e a semente é coletada.

[0111] Seleção Fenotípica de Alta Transferência de Mutantes com Expressão Errada: a semente é igualmente dispersa em solo saturado com água nos vasos e colocada em um resfriador a 4°C na escuridão durante duas noites para promover uma germinação uniforme. Os vasos são então removidos do resfriador e cobertos com uma tela para estufa a 55% durante 4-5 dias. Os cotiledôneos são completamente expandidos neste estágio. FINALE® (Sanofi Aventis, Paris, França) é borrifado sobre as plantas (3 mL de FINALE® diluído em 1,41 L (48 oz.) de água) e isto é repetido a cada 3-4 dias até que fiquem apenas os transformantes.

[0112] Seleção: a seleção é realizada rotineiramente em quatro estágios: Muda, Roseta, Florescência e Senescência.

[0113] Muda - o período de tempo após os cotiledôneos terem emergido, mas antes que a 3á folha verdadeira comece a ser formada.

[0114] Roseta - o período de tempo partindo da emergência da 3ª folha verdadeira até logo antes do "bolt" primário começar a se alongar.

[0115] Florescimento - o período de tempo partindo da emergência do "bolt" primário até o início da senescência (com a exceção de registro do tempo de florescência por si só, a maior parte das observações deve ser feita no estágio em que aproximadamente 50% das flores se abriram).

[0116] Senescência - o período de tempo após o início da senescência (com a exceção da "senescência retardada", a maior parte das observações deve ser feita após a planta ter secado completamente). As sementes são então coletadas.

[0117] Seleções: a seleção em relação ao maior tamanho, crescimento vegetativo e/ou biomassa é realizada tirando medidas, especificamente medidas de T2 foram feitas como a seguir:

[0118] Dias até Bolt = número de dias entre o plantio das sementes e a emergência da primeira inflorescência.

[0119] Número de Folhas da Roseta at Bolt = número de folhas da roseta presentes no momento da emergência da primeira inflorescência.

[0120] Área da Roseta = área da roseta no momento da emergência da inflorescência inicial, utilizando a fórmula ((LxW)*3,14)/4.

[0121] Altura = comprimento da inflorescência mais longa partindo da base até o ápice. Esta medida foi feita no término da florescência/início da senescência.

[0122] Espessura da Inflorescência Primária = diâmetro da inflorescência primária 2,5 cm acima da base. Esta medida foi feita no término da florescência/início da senescência.

[0123] Número de Inflorescência = número total de inflorescências únicas. Esta medida foi feita no término do florescimento/início da senescência.

[0124] A PCR foi utilizada para a amplificação do inserto de cDNA na planta T2 escolhida aleatoriamente. Este produto da PCR foi então sequenciado para confirmar a sequência nas plantas.

RESULTADOS:

[0125] As plantas transformadas com os genes de interesse foram selecionadas como descrito anteriormente em relação às características de crescimento e fenotípicas moduladas. As observações incluem aquelas em relação à planta inteira, assim como a de partes da planta, tais como das raízes e das folhas. As observações para transformantes com cada sequência de polinucleotídeos são observadas na Listagem de Sequências para cada uma das sequências de nucleotídeos testadas e para o polipeptídeo codificado correspondente. As características moduladas (isto é, os fenótipos observados) são citadas através de uma entrada no campo das "características variadas" para cada sequência respectiva. O "Fenótipo" observado na Listagem de Sequências para cada sequência relevante inclui ainda uma citação da utilidade de tal sequência com base nas observações. [0126] As observações feitas para os vários transformantes podem ser categorizadas, dependendo do tecido vegetal relevante para a observação e da utilidade da sequência de nucleotídeos/polipeptídeo utilizada para fazer tal transformante. A Tabela 1 correlaciona as observações abreviadas na listagem de sequências com as observações feitas para cada transformante (a coluna de "descrição"), o tecido da observação, o fenótipo associado dessa maneira com o transformante e a utilidade consequente da sequência de nucleotídeos inserida e do polipeptídeo codificado (a coluna de "tradução").

[0126] As observações feitas para os vários transformantes podem ser categorizadas, dependendo do tecido vegetal relevante para a observação e da utilidade da sequência de nucleotídeos/polipeptídeo utilizada para fazer tal transformante. A Tabela 1 correlaciona as observações abreviadas na listagem de sequências com as observações feitas para cada transformante (a coluna de "descrição"), o tecido da observação, o fenótipo associado dessa maneira com o transformante e a utilidade consequente da sequência de nucleotídeos inserida e do polipeptídeo codificado (a coluna de "tradução").

[0127] Para alguns dos polinucleotídeos/polipeptídeos da invenção, a listagem de sequências inclui ainda (em uma seção de "característica variada") uma indicação de dominante(s) identificado(s) importante(s) e a função correspondente do domínio ou identificada através da comparação com bancos dedados pfam disponíveis publicamente.

[0128] Partindo dos resultados relatados na Tabela 1 e na Listagem de Sequências, pode ser observado que os nucleotídeos/polipeptídeos da invenção são úteis, dependendo da respectiva sequência individual, para a obtenção de plantas com características de crescimento e fenotípicas modificadas, incluindo:
a. tamanho da planta modulado, incluindo maior e menor altura ou comprimento;
b. crescimento vegetativo modulado (maior ou menor);
c. número de órgãos modulado;
d. maior biomassa;
e. esterilidade;
f. letalidade das plantas jovens;
g. desenvolvimento ou colheita acelerada das plantas de cultivo;
h. tempo de florescência acelerado;
i. tempo de florescência retardado;
j. senescência retardada;
k. maior tolerância à seca ou ao estresse;
l. maior clorofila e capacidade fotossintética;
m. maior conteúdo de antocianina;
n. maior crescimento de raiz e maior captação de nutrientes;
o. maior ou menor peso ou tamanho da semente, maior conteúdo de carbono ou nitrogênio da semente;
p. rendimento de semente/fruto modificado, incluindo maior ou maior conteúdo de fruto;
q. maior folhagem;
r. utilidade de produzir produtos nutracêuticos/farmacêuticos nas plantas;
s. letalidade da planta;
t. menor conteúdo de fibras da semente para fornecer maior digestibilidade;
u. aparência ornamental modificada com folhas, flores, coloração ou folhagem modificada;
v. esterilidade modificada nas plantas;
w. maior capacidade de crescer na sombra;
x. maior tolerância ao estresse biótico;
y. maior tolerância à densidade e a baixo teor de fertilizante;
z. maior tolerância a pH alto ou baixo, a teores de nitrogênio ou de fosfato baixos ou altos;
aa. maior tolerância ao estresse oxidativo;
bb. melhor composição química;
cc. formato de folha alterado;
dd. maior tolerância ao estresse abiótico;
ee. maior tolerância ao estresse ao frio;
ff. maior teor de amido;
gg. número reduzido ou nenhuma semente;
hh. maior resistência da planta;
ii. comprimento de flor modificado;
jj. inflorescências mais longas;
kk. teor de fibras na semente modificado;
ll. formato do fruto modificado;
mm. composição do fruto modificada;
nn. rendimento de semente modificado;
oo. arquitetura da planta modificada, tal como quantidade o ângulo de ramificação modificado, estrutura da folha modificada
pp. maior fuga da sombra.

Exemplo 1: Lead 28 – ME04701- Clone 1952 - cDNA 13499809 (SEQ ID NO: 90) Análise qualitativa das plantas T1:

[0129] Todos os 10 dos eventos produziram rosetas com mais folhas e mais inflorescências que o controle. As plantas eram também ligeiramente menores que o controle (Tabela 1-1). O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando um 35S::cDNA diferente, mas que não podiam ser distinguidas das do tipo selvagem WS não transformadas. Este método de classificação de fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores.
Tabela 1-1. Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 13499809T1

Análise Quantitativa das Plantas T2:

[0130] Os Eventos ME04701-08 e ME04701-09 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2. Estes dois eventos foram selecionados porque possuíam os fenótipos mais vantajosos. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação a ambos os eventos. As plantas transgênicas exibiam um maior número de inflorescências em um nível de 0,05 de significância estatística (Tabela 1-2). As plantas T2 não tinham significativamente mais folhas que os controles, ao contrário de T1. ME04701-08 tinha florescimento ligeiramente mais tardio que o controle. ME04701-09 tinha rosetas significativamente maiores que o controle. Todas as plantas citadas na tabela como ME04701-08 e ME04701-09 eram as progênies de segregação da T1 que exibiam o fenótipo de interesse. Todas as plantas citadas na tabela como Controle -08 ou -09 eram as progênies de segregação de T2 que não exibiam o fenótipo e não continham o transgene (controles internos; Tabela 1-2).

[0131] As frequências de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculada por um teste de Chi-quadrado (Tabela 1-2 e dados não mostrados).

[0132] O aumento no número de inflorescências para os dois eventos era muito menor que o aumento observado quando o proporção 35S era utilizado para expressar este cDNA (dados não mostrados). Esta evidência sustenta adicionalmente a hipótese dos presentes inventores de que o grau de expressão/dosagem do produto gênico é altamente relevante para a intensidade do fenótipo observado. Utilizando um promotor com um padrão de expressão diferente, foi possível manter o fenótipo positivo do fenótipo de 35S observado anteriormente, enquanto os aspectos negativos de infertilidade observados anteriormente eram removidos. Evidentemente, o proveito que se obtém é diminuir o fenótipo positivo, embora esse fosse significativamente mantido.
Tabela 1-2. Fenótipos quantitativos observados nos eventos p326F::cDNA 13499809 T2 (PIT = Espessura da Inflorescência Primária)

DISCUSSAO/SUMÁRIO DE LEAD:

[0133] • A superexpressão de Lead 28/cDNA 13499809 com um promotor adequado resulta em um aumento no número de inflorescências. Como este é uma proteína rica em glicina (GRP) há um efeito provável sobre a estrutura da parede celular que afeta a expansão ou a adesão celular, o posicionamento diferente de planos celulares e/ou oportunidades diferentes para o início da inflorescência. Seria interessante combinar este gene com o gene que codifica uma proteína desconhecida com um AP2 que também afeta o crescimento e o desenvolvimento da planta.

[0134] • Este polinucleotídeo/proteína pode ser uma especialmente útil para controlar o número/taxa de divisão celular nos meristemas sem perturbar a morfologia geral da planta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um promotor apropriado para regular O tamanho e a taxa de crescimento de muitos órgãos individuais.

[0135] • A maior biomassa vegetativa pode fornecer uma proporção de fonte:escoadouro e uma maior fixação de carbono em sacarose e amido, levando a um maior rendimento.

[0136] • Mais inflorescências fornecem a oportunidade de mais flores e, portanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e número de inflorescências pode fornecer um aumento significativo no rendimento.

Resultados de Testes de Campo do Tomate

[0137] O Clone 1952 foi transformado no tomate sob o controle do plasmídeo p326. 4 eventos transgênicos independentes foram selecionados para o teste de campo. Os resultados são mostrados na Tabela 1-3 a seguir. Na média, há um aumento no peso total da planta, no peso do fruto e na porcentagem de frutos vermelhos por planta. O evento 4 não exibiu uma melhora no desempenho. Se o evento 4 não for considerado na análise o peso médio da planta, o peso de fruto e a porcentagem de frutos vermelhos aumentam cada para aproximadamente 115% do controle.
Tabela 1-3. Resultados dos Testes de Campo do Tomate

Exemplo 2: Lead 29 - ME04717 — Clone 123905 - cDNA 12562634 (SEQ ID NO:92)

[0138] • A expressão ectópica do Ceres cDNA 12562634 sob o controle do promotor 326D induz um número de fenótipos incluindo:

[0139] ͦ Maior número de inflorescências

[0140] ͦ Continuação da iniciação da folha da roseta após o florescimento para gerar um número de folhas geral maior.

[0141] • A expressão errada do Ceres cDNA 12562634 pode ser útil para aumentar a ramificação e o número de inflorescências. Isto pode ter um impacto significativo sobre o número de sementes.

Análise qualitativa das plantas T1:

[0142] Utilizando o promotor 326D, 9 dos 10 eventos produziram rosetas com mais folhas e mais inflorescências que o controle (Tabela 1). Um dos 9 eventos também tinha defeitos de fertilidade, muito parecido com o que foi observado utilizando o 35S::cDNA 12562634. O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando construções, diferentes de 35S::cDNA e que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores.
Tabela 2-1. Fenótipos qualitativos observados nos eventos p326D::cDNA 12562634 T1 (2 eventos com os fenótipos mais vantajosos foram escolhidos para a avaliação de T2)

Análise quantitativa das plantas T2:

[0143] Os Eventos ME04717-03 e ME04717-05 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação a ambos os eventos. As plantas transgênicas exibiam um maior número de inflorescências até um nível de 0,05 de significância estatística. ME04717-03 também tinha rosetas significativamente maiores que o controle. Todas as plantas citadas na Tabela 2-2 como ME04717-03 e ME04717-05 eram as progênies de segregação da T1 que exibiam o fenótipo de interesse. Todas as plantas citadas na Tabela 2-2 como Controle -03 ou -05 eram as progênies de segregação de T2 que não exibiam o fenótipo e não continham o transgene (controles internos; Tabela 2-2).

[0144] As frequências de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado por um teste de chi-quadrado (dados não mostrados).

[0145] Deve ser observado que o aumento no número de inflorescências para os eventos documentados abaixo era menor que o aumento observado nos eventos 35S::cDNA 12532634 (dados não mostrados). Outros eventos de p326D::cDNA 12532634 T2, não mostrados neste relato, continham vários insertos. Algumas das progênies de T2 destes eventos contendo vários insertos exibiam alguns efeitos negativos (defeitos de fertilidade e nanismo) similares às progênies de T2 dos eventos 35S::cDNA 12532634. Esta evidência sustenta ainda a hipótese dos presentes inventores de que o grau de expressão/dosagem do produto gênico é altamente relevante para a intensidade do fenótipo observado. Utilizando um novo promotor e criando transgênicos com um único inserto, foi possível manter o fenótipo positivo do fenótipo de 35S observado anteriormente, enquanto que os aspectos observados anteriormente eram removidos. Uma consequência da realização desta meta é uma diminuição do grau do fenótipo positivo, embora este fosse mantido em um nível muito significativo.
Tabela 2-2. Fenótipos quantitativos observados nos eventos p326D::cDNA 12562634 T2 (PIT = Espessura da Inflorescência Primária)

SUMÁRIO/DISCUSSÃO DO LEAD:

[0146] • A expressão ectópica do Ceres cDNA 12562634 sob o controle do promotor 326D induz um número de fenótipos incluindo maior número de inflorescências e mais folhas.

[0147] • A expressão errada do Ceres cDNA 12562634 pode ser útil para aumentar a ramificação e o número de inflorescências. Isto pode ter um impacto significativo sobre o número de sementes.

[0148] • Há ainda provavelmente um impacto positivo sobre índice de colheita embora este não tivesse ainda sido medido.

[0149] • Este gene/proteína pode ser uma especialmente* útil para o controle da taxa de divisão celular nos meristemas sem perturbar a morfologia geral da planta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um promotor apropriado para regular o tamanho e a taxa de crescimento de muitos órgãos individuais.

[0150] • A maior biomassa vegetativa pode fornecer uma proporção maior de fonte:escoadouro e uma maior fixação de carbono em sacarose e amido, levando a um maior rendimento.

[0151] • Mais inflorescências fornecem a oportunidade de mais flores e, portanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e número de inflorescências pode fornecer uma melhora significativa no rendimento.

Resultados do Teste de Rendimento do Tomate

[0152] O Gene 123905 foi também transferido para o tomate sob o controle do promotor p326. 4 eventos transgênicos independentes foram caracterizados no campo. Um número de eventos independentes foi originalmente avaliado e 4 foram selecionados para análise adicional com base na expressão do gene, na presença de um inserto simples e no fenótipo das plantas observado na estufa. Sementes T2 homozigotas foram plantadas no campo em um planejamento em blocos completo aleatório. Cada evento tinha uma linhagem de controle correspondente. Os resultados de peso da planta, do peso total de plantas individuais, de peso total do fruto por planta, da porcentagem de frutos vermelhos por planta e do índice de colheita são mostrados na Tabela 2-3 abaixo. Os resultados indicam que os eventos 1 e 21 tinham uma massa de folha substancialmente reduzida enquanto mantinham rendimentos comparáveis com os dos controles. Assim, seu índice de colheita aumentou. Estes eventos também aumentaram em relação à porcentagem de frutos vermelhos por planta. O evento 14 tinha maior biomassa e rendimento.
Tabela 2-3. Resultados do Teste no Campo do Tomate

[0153] Em resumo, as plantas de tomate transformadas com o gene 123905 tendiam a ter mais ramificações e folhas e mais fruto quando comparadas com a de controle.

Resultados do Teste de Campo do Arroz

[0154] O Gene 123905 foi transformado no cultivar de arroz Kitaake sob o controle de p326. Cinco (5) eventos transgênicos independentes foram avaliados no campo em um planejamento em blocos completo aleatório. As características avaliadas eram brotos por planta, dias até o florescimento, ângulo da folha, altura da planta, biomassa em gramas por planta, rendimento em gramas por planta e rendimento do canteiro total em gramas, cujos resultados são mostrados abaixo nas Tabelas 2-4, 2-5 e 2-6. Cada evento resultou em um aumento no número de brotos por planta.
Tabela 2-4. Resultados dos Testes de Campo do Arroz

[0155] Vários eventos mostraram reduções significativas em relação à altura. O evento 8-3 exibiu um aumento na altura, na biomassa e no rendimento em relação ao controle. Embora geralmente menores no rendimento e com estatura significativamente reduzida, o evento 1 e o evento 12 produzem biomassa similar a dos controles indicando um aumento na densidade da biomassa em relação a dos controles.
Tabela 2-5. Resultados dos Testes de Campo do Arroz

Observações na estatura reduzida no arroz

[0156] O Gene 123905 foi transformado no cultivar de arroz Kitaake sob o controle de p326. Foram realizadas medidas para determinar quais internodos eram reduzidos em comprimento, em que o internodo I é o internodo mais acima e o internodo V é o internodo mais abaixo. Nos eventos 1, 4 e 12 que possuem estatura significativamente reduzida em relação à do controle, os internodos III e IV são significativamente reduzidos em comprimento, enquanto os internodos I e II são reduzidos apenas ligeiramente ou de forma alguma.
Tabela 2-6. Resultados dos Testes de Campo do Arroz

Observações na germinação no arroz

[0157] As linhagens transgênicas 123905-1 e 123905-12-3 germinam 1 até 2 dias mais rápido que a semente do controle Kitaake.

Exemplo 3: Lead 36 – ME03195 – Clone 679923 – Cdna 13594332 (SEQ ID NO:98)

[0158] O Clone 679923 na biblioteca de cDNA da soja da Ceres, contém o cDNA 13594332, que codifica um fator de transcrição similar ao do gene LEAFY PETIOLE (LEP) de Arabidopsis. Esta sequência de proteína contém um domínio AP2. O cDNA foi colocado no Ceres Misexpression Pipeline porque foi determinado como sendo um suposto ortólogo de um gene conhecido de Arabidopsis (LEP).

Análise qualitativa das plantas T1:

[0159] Todos os 5 eventos produziram rosetas maiores com folhas ligeiramente enroladas com pouco até nenhum alongamento dos pecíolos e inflorescências muito curtas comparados com os dos controles. Estas plantas tinham também um retardo no tempo de florescência em vários dias e não tinham defeitos de fertilidade (Tabela 3-1). O "controle" transgênico era um conjunto de plantas expressando uma fusão 35S::cDNA diferente e que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores. Após a coleta das sementes, também era evidente que estas plantas produziam um número de sementes significativamente maior em relação ao dos mutantes típicos de sua altura.
Tabela 3-1. Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 13594332 T1

Análise quantitativa das plantas T2

[0160] A hipótese original formulada partindo das observações de T1 era que as plantas 35S::cDNA podem ter um índice de colheita significativamente maior. Os eventos ME03195-02 e ME03195-04 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2 para testar esta hipótese. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação a ambos os eventos. As frequências de segregação das plantas em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado através de um teste de chiquadrado (dados não mostrados).

[0161] Após análises detalhadas de T2, foi determinado o seguinte em relação aos transgênicos (os resultados abaixo são estatisticamente significativos em um nível de 0,05 ou melhor através do teste-t a não ser que seja citado de outra maneira):

[0162] • O tempo de florescência (dias to bolt) era 5-8 dias depois dos controles.

[0163] • O número de folhas da roseta at bolt era maior em aproximadamente 2,5 folhas.

[0164] • A área da roseta era 2-3 vezes maior que a dos controles.

[0165] • A altura era aproximadamente 1/2 da dos controles.

[0166] • O peso total da semente não era significativamente diferente do dos controles.

[0167] • O peso seco total da planta era ligeiramente maior para o evento -04 e não era diferente dos controles para o evento -02.

[0168] • O índice de colheita era ligeiramente menor que o dos controles.

[0169] • O dobro de sementes era produzido por altura unitária da planta que nos controles.

[0170] Os detalhes podem ser encontrados nas Tabelas 3-2 e 3- 3.
Tabela 3-2. Fenótipos quantitativos observados nos eventos p35S::cDNA 13594332 T2

Tabela 3-3. Fenótipos quantitativos observados nos eventos p35S::cDNA 13594332 T2

[0171] Cada um dos eventos -02 e -04 tinha três plantas T2 que exibiam uma forma muito mais grave do fenótipo descrito anteriormente. Estas plantas tinham bolting gravemente mais tarde, tinham pouco alongamento das inflorescências e eram quase estéreis. Partindo de outros experimentos utilizando estas linhagens de plantas (dados não mostrados), foi determinado que o fenótipo prejudicial é causado por um efeito de dosagem/inserto homozigoto, sugerindo que as plantas hemi/heterozigotas forneciam uma característica benéfica de maior produção de sementes por altura unitária, mas que as linhagens homozigotas forneciam o fenótipo negativo. As análises estatísticas dos presentes inventores comparavam os controles internos com as plantas que continham o transgene e o fenótipo benéfico. Todas as plantas contendo o transgene com o fenótipo prejudicial foram omitidas das análises estatísticas nas Tabelas 3-2 e 3-3.

Exemplo 4: ME04012 – Gemini ID 5000F6 (SEQ ID NO: 109)

[0172] ME04012 contém um clone genômico que codifica um suposto Citocromo P450. A linhagem de planta ME04012 estava sendo analisada em relação à tolerância à seca quando foi observado que 15/20 plantas no evento -03 exibiam um fenótipo de arquitetura da planta. 6/15 eram uma versão mais fraca exibindo apenas um caule ondulado. 9/15 eram fortes e exibiam um caule ondulado, menor altura e menor ramificação e ângulos do pedicelo.

Exemplo 5: Lead 15 — ME04077 — Clone 92459 - cDNA 12561537 (SEQ ID NO: 80)

[0173] O Clone 92459 na biblioteca de cDNA de Arabidopsis da Ceres, contém o cDNA 12561537, que codifica MADS Affecting Flowering 1 (MAF1) de Arabidopsis. O cDNA foi colocado no Ceres Misexpression Pipeline porque é um fator de transcrição. Os fatores de transcrição são de interesse particular porque podem afetar muitos genes simultaneamente e, portanto, possuem uma maior probabilidade de produzir um fenótipo alterado em Arabidopsis quando superexpressos.

[0174] • A expressão ectópica do Ceres cDNA 12561537 sob o controle do promotor 35S induz um número de fenótipos incluindo:

• ͦ Plantas mais altas
• ͦ Inflorescências mais densas
• ͦ Rosetas maiores
• ͦ Maior número de folhas na roseta
• ͦ Florescimento retardado

[0175] • A expressão errada do Ceres cDNA 12561537 pode ser útil para aumentar o tamanho/biomassa geral da planta.

Análise qualitativa das plantas T1:

[0176] Todos os dez eventos tinham florescência tardia, produziam rosetas maiores com mais folhas e inflorescências densas altas comparadas com as dos controles (Tabela 5-1). O "controle" transgênico era um conjunto de plantas diferentes expressando 35S::cDNA que não podiam ser distinguidas do tipo selvagem WS não transformado. Este método de classificação dos fenótipos é típico para o projeto de fenotipagem morfológica em grande escala dos presentes inventores.
Tabela 5-1. Fenótipos qualitativos observados nos eventos 35S::cDNA 12561537 T1

Análise quantitativa das plantas T2:

[0177] Os eventos ME04077-06 e ME04077-10 foram avaliados em maiores detalhes na geração T2. Dezoito indivíduos foram plantados e observados em relação ao evento 06, enquanto 17 indivíduos foram plantados e observados em relação ao evento 10. As plantas transgênicas para ambos os eventos exibiam maior espessura da inflorescência primária, maior número de folhas da roseta, uma roseta maior e um retardo no tempo de florescência em um nível de 0,05 de significância estatística (Tabela 5-2). As plantas de ambos os eventos eram visivelmente muito mais altas que as dos controles, mas apenas o evento -10 era quantitativamente mais alto em um nível de 0,05 de significância estatística através do teste t. Se um número maior de controles internos estivesse disponível para o evento -06, este evento muito provavelmente se encaixaria sob o mesmo grau de significância através do mesmo teste. Ambos os eventos tinham fertilidade normal. Todas as plantas citadas na Tabela como ME04077-06 e ME04077-10 eram as progênies de segregação do evento T1 que foi confirmado como contendo o transgene em teste. Todas as plantas citadas na Tabela como Controle -06 ou Controle -10 eram as progênies de segregação de T2 que não continham o transgene em teste (controles internos).

[0178] Ambos os eventos produzem significativamente mais sementes que o controle, como seria esperado para uma planta com florescência tardia fértil típica.

[0179] O evento ME04077-06 tinha 12 plantas contendo o transgene que exibiam o fenótipo benéfico e 3 plantas contendo o transgene que pareciam ser do tipo selvagem (estas três foram omitidas das análises estatísticas na Tabela 5-2). O evento ME04077-10 tinha 9 plantas contendo transgene que exibiam o fenótipo benéfico e 1 planta contendo o transgene que parecia ser do tipo selvagem. As análises estatísticas dos presentes inventores comparavam os controles internos com as plantas com o fenótipo benéfico que continham o transgene.

[0180] As frequências de segregação do transgene em teste sugerem que cada evento contém um único inserto, que é calculado por um teste de Chi-quadrado. As sementes de T2 segregam 3R:1S para ambos os eventos (dados não mostrados).
Tabela 5-2. Fenótipos quantitativos observados nos eventos 35S::cDNA 12561537 T2

SUMÁRIO/DISCUSSÃO DO LEAD:

[0181] • A expressão ectópica do cDNA 12561537 com um promotor constitutivo forte (35S) resulta em plantas mais altas, com inflorescências mais densas, uma roseta maior e mais folhas da roseta.

[0182] • O aumento no tamanho da planta observado através dessa expressão é acompanhado por um retardo no tempo de florescência, mas nenhuma redução na fertilidade.

[0183] • Pode também ser um gene útil para aumentar o crescimento da raiz, dado o padrão de expressão similar nos meristemas do broto e nas células de extremidade de raiz.

[0184] • A maior biomassa vegetativa pode fornecer uma maior proporção de fonte:escoadouro e uma maior fixação de carbono em sacarose e amido, levando a um maior rendimento.

[0185] • Inflorescências mais altas fornecem a oportunidade de mais flores e, portanto, mais sementes. A combinação de maior biomassa e estatura da inflorescência pode fornecer um aumento significativo no rendimento.

[0186] • Inflorescências mais densas podem prevenir contra "ruptura" pelo vento, chuva ou seca.

[0187] • A vantagem de biomassa e a vantagem de fotossíntese presumida devem ser úteis no milho e na soja.

[0188] • Este gene/proteína pode ser um especialmente útil para o controle do número/taxa de divisão celular nos meristemas sem perturbar a morfologia geral da planta. Pode ser desenvolvida em plantas de cultivo com um promotor apropriado para regular o tamanho e a taxa de crescimento de muitos órgãos individuais. A proteína pode ser útil para criar caules mais robustos no milho e prevenir contra a "ruptura".

Resultados de Teste no Campo do Tomate

[0189] Este Lead 15 (clone 92459) foi transformado no tomate sob o controle do plasmídeo p13879. 1 evento transgênico foi selecionado para o teste no campo. Este evento mostra um aumento na biomassa, como mostrado abaixo nos resultados da Tabela 5-3.
Tabela 5-3. Resultados do Teste de Campo do Tomate

Exemplo 6: Determinação de Sequências Homólogas Funcionais

[0190] As sequências "Lead", como descrito anteriormente nos Exemplos 1 - 5, são utilizadas para a identificação de homólogos funcionais das sequências iniciais lead (guia) e, junto com tais sequências, são utilizados para determinar uma sequência consenso para um certo grupo de sequências inicial e de homólogos funcionais.

[0191] Uma sequência de objetivo é considerada um homólogo funcional de uma sequência de busca se as sequências de objetivo e de busca codificarem proteínas que possuem uma função e/ou uma atividade similar. Um processo conhecido como Reciproca) BLAST (Rivera e outros, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1998, 95: 6239-6244) é utilizado para a identificação de sequências homólogas funcionais potenciais partindo de bancos de dados consistindo em todas as sequências peptídicas disponíveis publicamente e de propriedade, incluindo NR do NCBI e as traduções de peptídeos dos clones da Ceres.

[0192] Antes de começar um processo de Reciprocal BLAST, um polipeptídeo de busca específico é verificado contra todos os peptídeos de suas espécies de fonte utilizando BLAST com a finalidade de identificar polipeptídeos que possuem identidade de sequência de 80% ou maior com o polipeptídeo de busca e um comprimento do alinhamento de 85% ou maior ao longo da sequência mais curta no alinhamento. O polipeptídeo de busca e quaisquer dos polipeptídeos identificados mencionados anteriormente são denominados como um "cluster".

[0193] O processo principal de Reciprocal BLAST consiste em duas rodadas de buscas com BLAST; busca para frente e busca para trás. Na etapa de busca para frente, uma sequência polipeptídica de busca, "polipeptídeo A, da espécie de fonte SA é submetida ao BLAST contra todas as sequências de proteínas de uma espécie de interesse. As coincidências principais são determinadas utilizando uma faixa de valor de E de 10-5 e uma faixa de identidade de 35%. Entre as coincidências principais, a sequência que possui o valor de E mais baixo é denominada como a melhor coincidência e considerada um homólogo funcional potencial. Qualquer outra coincidência principal que tenha uma identidade de sequência de 80% ou maior com a melhor coincidência ou com o polipeptídeo de busca original é considerada também um homólogo funcional potencial. Este processo é repetido para todas as espécies de interesse.

[0194] Na rodada de busca para trás, as coincidências principais identificadas na busca para frente de todas as espécies são utilizadas para realizar uma busca de BLAST contra todas as sequências de proteínas ou polipeptídicas da espécie de fonte SA. Uma coincidência principal proveniente da busca para frente que retornou um polipeptídeo do "cluster" mencionado anteriormente como a melhor coincidência também é considerada como um homólogo funcional potencial.

[0195] Os homólogos funcionais são identificados através de inspeção manual das sequências homólogas funcionais potenciais. Os homólogos funcionais representativos são mostrados nas figuras 1-5. Cada figura representa um grupo de sequência inicial/busca alinhada com as sequências de objetivo homólogas funcionais identificadas correspondentes. As sequências lead e suas sequências homólogas funcionais correspondentes são alinhadas para a identificação de aminoácidos conservados e para a determinação de uma sequência consenso que contém um resíduo de aminoácido que ocorre frequentemente em posições particulares nas sequências alinhadas, como mostrado nas figuras 1-5.

[0196] Cada sequência consenso é então compreendida das regiões ou dos domínios identificados e conservados numerados, com algumas das regiões conservadas sendo separadas por um ou mais resíduos de aminoácidos, representados por um traço (-), entre as regiões conservadas.

[0197] Os polipeptídeos úteis da invenção , por - tanto , incluem cada uma das sequências inicial e homólogas funcionais mostradas nas figuras 1-5, assim como as sequências consenso mostradas em tais figuras. A invenção abrange também outros polipeptídeos úteis construídos com base na sequência consenso e nas regiões conservadas identificadas. Assim, os polipeptídeos úteis incluem aqueles que compreendem uma ou mais das regiões conservadas numeradas em cada tabela de alinhamento em uma figura individual representada nas figuras 1-5, em que as regiões conservadas podem ser separadas por traços. Os polipeptídeos úteis incluem ainda aqueles que compreendem todas as regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1-5, compreendendo alternativamente todas as regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento individual e na ordem que é apresentada em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1- 5. Os polipeptídeos úteis também incluem aqueles que compreendem todas das regiões conservadas numeradas em uma tabela de alinhamento individual e na ordem que é apresentada em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1 -5, em que as regiões conservadas são separadas por traços, em que cada traço entre duas regiões conservadas adjacentes é compreendido dos aminoácidos apresentados na tabela de alinhamento para as sequências inicial e/ou homólogas funcionais nas posições que definem o traço particular. Tais traços na sequência consenso podem ter um comprimento que varia do comprimento do menor número de traços em uma das sequências alinhadas até o comprimento do maior número de traços em uma das sequências alinhadas.

[0198] Tais polipeptídeos úteis podem também ter um comprimento (um número total de resíduos de aminoácidos) igual ao comprimento identificado para uma sequência consenso ou um comprimento que varia da sequência mais curta até a mais longa em qualquer família fornecida de sequências inicial e homólogas funcionais identificadas em uma tabela de alinhamento individual selecionada das figuras 1-5.

[0199] A presente invenção abrange ainda nucleotídeos que codificam os polipeptídeos descritos anteriormente, assim como os complementos dos mesmos e incluindo alternativas dos mesmos com base na degeneração do código genético.

[0200] A invenção sendo descrita dessa maneira, será evidente para um perito na técnica que várias modificações dos materiais e dos métodos para a prática da invenção podem ser feitas. Tais modificações devem ser consideradas dentro do âmbito da invenção que é definido pelas reivindicações em anexo.

[0201] Cada uma das referências da litera tura de patentes e de per iódicos citadas aqui é expressamente incorporada aqui em sua totalidade através de tal citação.

Claims (6)

1. Processo de induzir um fenótipo em uma planta caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende a introdução em uma célula vegetal de um ácido nucléico que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em:

   • (a) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; e
   • (b) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80; em que a dita sequência de nucleotídeos está ligada de forma operacional a uma região reguladora heteróloga,

   em que o fenótipo compreende uma planta mais alta, inflorescências mais densas, rosetas maiores, ou maior número de folhas na roseta em relação à planta de controle na qual a sequência de nucleotídeo não é ectopicamente expressa.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste em YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12), PT0708 (SEQ ID NO: 17), PT0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0678 (SEQ ID NO: 13), PT0688 (SEQ ID NO: 15), PT0837 (SEQ ID NO: 24), do promotor da "napins", do promotor da Arcelina-5, do promotor do gene da faseolina, do promotor do inibidor da tripsina da soja, do promotor de ACP, do gene da estearoil-ACP dessaturase, da subunidade α' do promotor da β-conglicinina da soja, do promotor da oleosina, do promotor da zeína de 15 kD, do promotor da zeína de 16 kD, do promotor da zeína de 19 kD, do promotor da zeína de 22 kD, do promotor da zeína de 27 kD, do promotor de Osgt-1, do promotor do gene da beta-amilase e do promotor do gene da hordeína da cevada.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste em p326 (SEO ID NO: 76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26) e PT633 (SEQ ID NO: 7), do promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), do promotor da manopina sintase (MAS), dos promotores 1' ou 2' derivados do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, do promotor 34S do vírus mosaico da escrofulária, dos promotores da actina tais como o promotor da actina do arroz e dos promotores da ubiquitina tais como o promotor da ubiquitina-1 do milho.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região reguladora é um promotor selecionado do grupo que consiste nos promotores da ribulose1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) tal como o promotor RbcS do lariço oriental (Larix laricina), o promotor cab6 de pinheiro, o promotor do gene Cab-1 do trigo, o promotor CAB-1 do espinafre, do promotor cab1R do arroz, do promotor da piruvato ortofosfato diquinase (PPDK) do milho, do promotor Lhcb1*2 do tabaco, do promotor do simportador de sacarose-H+ SUC2 de Arabidopsis thaliana e dos promotores da proteína de membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS, PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).
5. Processo para promover maior biomassa em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende:
   (a) a transformação de uma planta com uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das sequências inicial, homólogas funcionais ou consenso na molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em:

   • (A) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; e
   • (B) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80; em que a dita sequência de nucleotídeos está ligada de forma operacional a uma região reguladora heteróloga, e

   (b) a expressão da dita sequência de nucleotídeos na dita planta transformada, em que a dita planta transformada possui uma maior biomassa ou um maior vigor de plantas jovens quando comparada com uma planta que não foi transformada com a dita sequência de nucleotídeos.
6. Processo para a modulação da biomassa de uma planta caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende a alteração do nível de expressão na dita planta de uma molécula de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em:

   • (a) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; e
   • (b) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO. 80; em que a dita sequência de nucleotídeos está ligada de forma operacional a uma região reguladora heteróloga.

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