CN110894554A

CN110894554A - 一种检测鲤疱疹病毒ii型的引物探针组、试剂盒与应用

Info

Publication number: CN110894554A
Application number: CN201911128344.XA
Authority: CN
Inventors: 郝贵杰; 林锋; 沈锦玉; 盛鹏程; 潘晓艺
Original assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110894554B

Abstract

本发明公开了一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用，属于病毒检测技术领域，具体包括鲤疱疹病毒II型检测引物2对和1个标记探针，基于上述检测引物探针组的试剂盒和非诊断目的应用。本发明结合环介导等温扩增和核酸横向侧流检测，检测过程既无需昂贵的仪器设备，又提高了检测的可靠性。同现有的该病毒检测方法相比，本发明在检测灵敏度相同的基础上，还具有简便快速、特异性的特点，而且对人和环境安全，可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用。本发明可用于鲫鱼造血组织坏死症的快速检测及鲫鱼、金鱼的鲤疱疹病毒II型的跟踪检测、病毒监控，避免病毒传播流行，具有推广应用价值。

Description

一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，更具体的说是涉及一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用。

背景技术

鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpes virus2，CyHV-2)，也称为金鱼(Carassiusauratus)造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)，因该病原是第2个自鲤科鱼类分离的疱疹病毒，按照国际病毒分类委员会(ICTV)的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒II型。CyHV-2为DNA病毒，其核衣壳呈六角形或球形，直径为100-110nm，有囊膜的病毒粒子呈椭圆形，直径为175-200nm。CyHV-2具有极强的宿主特异性，只感染金鱼、鲫鱼及其普通变种，对金鱼和鲫鱼有很高的致病性，死亡率几乎可达100％，主要发生在春、秋季节，发病率受水温影响较大，15-25℃时易发病，水温高于25℃时，发病率降低。在日本、美国、澳大利亚、英国和中国都发生过该病爆发，对观赏鱼养殖业造成巨大冲击，引起较大经济损失。自2009年以来，在中国江苏省鲫鱼主养区域连年发生导致养殖鲫鱼爆发性死亡的出血性疾病，造成重大经济损失，经多家单位的科研工作者研究确认引起江苏养殖鲫鱼爆发性死亡的出血病为鲫造血组织坏死症(Crucian Carp HematopoieticNecrosis)，其病原为鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)。该病陆续蔓延至全国各地，对我国鲫鱼养殖的威胁越来越大，成为阻碍鲫鱼健康养殖的巨大瓶颈，也给我国鲫鱼养殖造成了极大的经济损失。

我国目前还没有针对CyHV-2的疫苗，因此研究与防控本病非常重要。传统的细胞分离及电镜观察费时费力，分子生物学检测方法是应用广泛的方法，也是最灵敏的方法，目前现有针对CyHV-2的分子生物学方法主要有普通PCR、实时荧光PCR、实时定量TaqMan PCR等等。

但在实际检测工作中，现有的检测技术操作较为繁琐，对实验条件及设备要求高，不利于操作。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物常规检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。

横向侧流(Latteral flow detect，LFD)检测试纸条是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。

因此，提供一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用，结合环介导等温扩增和核酸横向侧流检测是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鲤疱疹病毒II型的检测引物探针组，包括2对引物：CyHV-2-F3和CyHV-2-B3、CyHV-2-FIP和CyHV-2-BIP，和1个标记探针：CyHV-2-FITC-PROBE；引物和探针的序列如下：

CyHV-2-F3：5’-GTTCATCAGAGGTGTCCGAC-3’，SEQ ID No.1；

CyHV-2-B3：5’-GGTCTTGCCACTCATGATCC-3’，SEQ ID No.2；

CyHV-2-FIP：

5’-CGACATCCATGTCACCAGCAGATTTTGATGCTTTACTGGAGGTC GG-3’，SEQ ID No.3；

CyHV-2-BIP：

5’-AAGTCACACGCTTTCCAGACGGTTTTGAAGCTGTTGAGCAGAAT GC-3’，SEQ ID No.4；

CyHV-2-FITC-PROBE：5’-TGATGATTATCAGCACGACC-3’，SEQ ID No.5；

其中CyHV-2-FIP为5’端生物素标记引物；CyHV-2-FITC-PROBE为5’端FITC标记探针。

进一步的：一种基于上述引物探针组的检测试剂盒，还包括10×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、检测试纸条缓冲液、阳性DNA质控品以及核酸横向侧流检测试纸条。

优选的：10×反应缓冲液的成分包括：200mM pH8.0～9.0Tris-HCl，100mM氯化钾，150mM硫酸铵，80mM硫酸镁，质量浓度1％Triton X-100，6M甜菜碱，14mM dNTP。

进一步的：一种非诊断目的检测鲤疱疹病毒II型的方法，包括下列步骤：

(1)样品DNA的提取：提取样品总DNA；

(2)环介导等温扩增：将步骤(1)提取的样品总DNA、上述引物探针组、BstDNA聚合酶和10×反应缓冲液混匀，进行环介导等温扩增得扩增产物；

(3)LFD试纸检测：用核酸横向侧流检测试纸条检测步骤(2)的扩增产物。

优选的：步骤(2)所述引物探针组具体包括80μM CyHV-2-F3和80μM CyHV-2-B3；480μM CyHV-2-FIP和480μM CyHV-2-BIP；0.5μM CyHV-2-FITC-PROBE。

优选的：步骤(2)具体为：

(21)根据待检样品份数，将上述引物探针组，10×反应缓冲液与8U Bst DNA聚合酶混匀，得预反应液，体积21μL；

(22)在步骤(21)预反应液加入4μL待检样品DNA，得到样品检测反应液；配制阳性反应体系：向预反应液中添加阳性DNA质控品，得到阳性反应液；将所述样品检测反应液和阳性反应液置于62～64℃，反应45～60min，得扩增产物。

优选的：步骤(3)具体为：

(31)取扩增产物5～10μL加到核酸横向侧流检测试纸条样品垫上；

(32)再向样品垫滴加50～100μL检测试纸条缓冲液，待缓冲液移动到核酸横向侧流检测试纸条另一端吸水垫时，反应结束；

(33)5～10分钟后，根据试纸条上的显色带判定检测结果，当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。

进一步的：上述的引物探针组在制备检测鱼类病毒感染的试剂盒中的应用。

优选的：鱼类病毒感染包括：鲫鱼或金鱼鲤疱疹病毒II型感染或鲫鱼造血器官坏死症。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用，取得的技术效果为本发明结合环介导等温扩增和核酸横向侧流检测，检测过程既无需昂贵的仪器设备，又提高了检测的可靠性。同现有的该病毒检测方法相比，本发明在检测灵敏度相同的基础上，还具有简便快速、特异性的特点，而且对人和环境安全，本发明提供的试剂盒可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，可用于鲫鱼造血组织坏死症的快速检测及鲫鱼、金鱼的鲤疱疹病毒II型的跟踪检测、病毒监控，避免病毒传播流行，具有推广应用价值。

具体的，本发明提供的检测应用节省时间且仪器设备要求低，本发明的提供的检测试剂盒检测时间短，可以在1小时内获得检测结果，比常规PCR节约2～3小时；而且不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。

本发明中提供的非诊断目的检测鲤疱疹病毒基因的应用，选用了专门针对微量DNA的DNA提取试剂盒，对低拷贝病毒样本、保存条件较差的鲤疱疹病毒DNA亦有良好的检测效果，对冻融次数多达20次的带毒样本依然具有100％的检出率，检测灵敏度达1.8×10^- ⁵ng/μL，即0.18pg/μL，可用于实验室检测以及流行病学研究。

本发明所提供的试剂盒操作简便且无毒无害，结果直观易判定，处于生产一线的技术员和养殖户都可以按步骤指导进行操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为扩增时间对环介导等温扩增的影响示意图，其中，M：DL1000DNA Marker；泳道1：15min；泳道2：30min；泳道3：45min；泳道4：60min。

图2为扩增温度对环介导等温扩增的影响示意图，其中，M：DL1000DNA Marker；泳道1：60℃；泳道2：61℃；泳道3：62℃；泳道4：63℃；泳道5：64℃；泳道6：65℃。

图3为特异性实验结果示意图，其中，M：DL1000DNA Marker；泳道1：CyHV-2；泳道2：鲤疱疹病毒I型(CyHV-1)；泳道3：鲤疱疹病毒III型(KHV)；泳道4：草鱼呼长孤病毒(GCRV)；泳道5：鲤春病毒血症病毒SVCV；泳道6：空白对照。

图4为灵敏度实验结果示意图，其中，M：DL2000DNA Ladder Marker；左图泳道1～9：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的病毒DNA，起始扩增模板浓度1.8ng；泳道N：无模板；右侧图为相应浓度的核酸横向侧流(LFD)试纸检测示意图。

图5为检测样品中CyHV-2的结果示意图，其中，M：DL2000DNA Marker(TaKaRa公司)；左图泳道1：阴性对照样品检测结果；泳道2-5：分别为鲫鱼肝、脾、肾、脑组织样品；泳道6：阳性对照样品检测结果；右图为相应核酸横向侧流(LFD)试纸检测显色结果(C代表质控线，T代表检测线)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用，所涉及的单一组分均采购自市售渠道，未提及的方法均为实验室常规方法，例如，鲫鱼病样采集自浙江省湖州市某养殖场；所用引物与探针由南京金斯瑞生物公司合成；Bst DNA聚合酶(大片段)购自New England BIPolabs公司；核酸侧流(LFD)检测试纸条(包被抗FITC抗体)购自百道亨仪器设备(北京)有限公司等；dNTP、购自Takara公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司等，在此不再一一赘述，对具体采购品牌不做限定。

实施例1

一种鲤疱疹病毒II型的检测引物探针组，包括2对引物：CyHV-2-F3和CyHV-2-B3、CyHV-2-FIP和CyHV-2-BIP以及1个标记探针：CyHV-2-FITC-PROBE；引物探针序列如下：

CyHV-2-F3：5’-GTTCATCAGAGGTGTCCGAC-3’，(SEQ ID No.1)；

CyHV-2-B3：5’-GGTCTTGCCACTCATGATCC-3’，(SEQ ID No.2)；

CyHV-2-FIP：

5’

-CGACATCCATGTCACCAGCAGATTTTGATGCTTTACTGGAGGTCG G-3’，(SEQ ID No.3)；

CyHV-2-BIP：

5’

-AAGTCACACGCTTTCCAGACGGTTTTGAAGCTGTTGAGCAGAATG C-3’，(SEQ ID No.4)；

CyHV-2-FITC-PROBE：5’-TGATGATTATCAGCACGACC-3’，(SEQ ID No.5)；

一种基于上述引物探针组的检测试剂盒，还包括10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、检测试纸条缓冲液、阳性DNA质控品以及核酸横向侧流检测试纸条。

其中，10×反应缓冲液的成分包括：200mM pH8.0～9.0Tris-HCl，100mM氯化钾，150mM硫酸铵，80mM硫酸镁，质量浓度1％Triton X-100，6M甜菜碱，14mM dNTP。

实施例2

DNA的提取：

分别取25mg鲫鱼肝、脾、肾、脑待测组织，共4份，用微量总DNA提取试剂盒(QIAampDNA Mini Kit)提取样本总DNA作为阳性模板。同时设置阴性对照(正常无病毒鲫鱼)。

环介导等温(LAMP)扩增：

(1)根据待检样品数4份(1～4组)，阳性(5组)和阴性(6组)对照各1份，故，配置6份10×反应缓冲液，分别加8U Bst DNA聚合酶(大片段)，80μM CyHV-2-F3和80μM CyHV-2-B3，480μM CyHV-2-FIP和480μM CyHV-2-BIP，0.5μM CyHV-2-FITC-PROBE，得预反应液体积为21μL/管，并分别标号；

(2)1～4组分别吸取4μL不同浓度的待检样品DNA加入核酸检测反应管中，混合均匀；5组添加阳性DNA质控品，6组阴性仅添加纯水；

(3)将各反应管置于64℃水浴锅中进行环介导等温(LAMP)扩增60min，得扩增产物；

各扩增产物进行梯度凝胶电泳：

(1)配置2％的琼脂糖凝胶，加样孔分别加入5μL扩增产物，其中泳道1：阴性对照样品检测结果；泳道2-5：分别为鲫鱼肝、脾、肾、脑组织样品扩增产物；泳道6：阳性对照；

(2)电泳30分钟后凝胶成像，结果见图1的左图。

再将各扩增产物，分别利用核酸侧流(LFD)检测试纸条检验，结果见图1的右图，具体步骤为：

取扩增产物5μL加到核酸横向侧流检测试纸条样品垫上；

再向样品垫滴加50μL检测试纸条缓冲液，待缓冲液移动到核酸横向侧流检测试纸条另一端吸水垫时，反应结束；

5分钟后，根据试纸条上的显色带判定检测结果，当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。

结果表明，由图1的左图可见阶梯状的扩增条带；利用核酸侧流(LFD)检测试纸条检验扩增产物结果(图1的右图)与电泳结果吻合。表明本发明检测准确度100％。

实施例3

为研究扩增时间对环介导等温扩增的影响，取病毒阳性样品，按实施例1环介导等温(LAMP)扩增步骤进行处理，区别在于，在64℃水浴锅中，分别进行等温扩增15、30、45和60min，再将各扩增产物分别进行梯度凝胶电泳，其中，M：DL1000DNA Marker；泳道1：15min扩增产物；泳道2：30min扩增产物；泳道3：45min扩增产物；泳道4：60min扩增产物。

结果表明，45～60min扩增产物凝胶电泳效果更为清晰，60min扩增时间最优(参见图2)。

实施例4

为研究扩增温度对环介导等温扩增的影响，取病毒阳性样品，按实施例1环介导等温(LAMP)扩增步骤进行处理，区别在于，分别于60、61、62、63、64和65℃水浴锅中，等温扩增60min，再将扩增产物分别进行梯度凝胶电泳，M：DL1000DNA Marker；泳道1：60℃；泳道2：61℃；泳道3：62℃；泳道4：63℃；泳道5：64℃；泳道6：65℃

结果表明，62～64℃扩增产物凝胶电泳效果更为清晰，64℃扩增最优(参见图3)。

实施例5

特异性实验：

取不同病毒样本，分别按实施例1环介导等温(LAMP)扩增步骤进行处理，具体的病毒样本分别为鲤疱疹病毒II型CyHV-2、鲤疱疹病毒I型(CyHV-1)、鲤疱疹病毒III型(KHV)、草鱼呼长孤病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)；再将扩增产物分别进行梯度凝胶，M：DL1000DNA Marker；泳道1：鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)、电泳泳道2：鲤疱疹病毒I型(CyHV-1)；泳道3：鲤疱疹病毒III型(KHV)；泳道4：草鱼呼长孤病毒(GCRV)；泳道5：鲤春病毒血症病毒SVCV；泳道6：空白对照。

结果见图4。结果表明本发明提供的检测方法具有较好的特异性。

实施例6

灵敏度实验：

(1)配置2％的琼脂糖凝胶，加样孔分别加入5μL模板分别为10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的病毒DNA，起始扩增模板浓度18ng；

(2)电泳30分钟后凝胶成像，再将相应浓度的病毒DNA。利用核酸侧流(LFD)检测试纸条检验扩增产物，结果见图5的左图，M：DL2000DNA Ladder Marker；泳道1～9：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的病毒DNA，起始模板浓度18ng；泳道N：无模板；右图为相应浓度的病毒DNA的核酸横向侧流(LFD)试纸检测示意图。

结果表明，阶梯状的扩增条带与试纸检测结果吻合，灵敏度为1.8×10^-5ng/μL，即0.18pg/μL。

综上，特异性实验结果和灵敏度检测结果表明本发明具有较好的特异性和灵敏度。即本发明结合环介导等温扩增和核酸横向侧流检测(LAMP-LFD)检测试剂盒和非诊断检测方法具有很大的应用前景。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<120> 一种检测鲤疱疹病毒II型的引物探针组、试剂盒与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttcatcaga ggtgtccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtcttgcca ctcatgatcc 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacatccat gtcaccagca gattttgatg ctttactgga ggtcgg 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagtcacacg ctttccagac ggttttgaag ctgttgagca gaatgc 46

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgatgattat cagcacgacc 20

Claims

1.一种鲤疱疹病毒II型的检测引物探针组，其特征在于，包括2对引物：CyHV-2-F3和CyHV-2-B3、CyHV-2-FIP和CyHV-2-BIP，和1个标记探针：CyHV-2-FITC-PROBE；引物和探针的序列如下：

CyHV-2-F3：5’-GTTCATCAGAGGTGTCCGAC-3’，SEQ ID No.1；

CyHV-2-B3：5’-GGTCTTGCCACTCATGATCC-3’，SEQ ID No.2；

CyHV-2-FIP：

5’-CGACATCCATGTCACCAGCAGATTTTGATGCTTTACTGGAGGTCGG-3’，SEQ ID No.3；

CyHV-2-BIP：

5’-AAGTCACACGCTTTCCAGACGGTTTTGAAGCTGTTGAGCAGAATGC-3’，SEQ ID No.4；

CyHV-2-FITC-PROBE：5’-TGATGATTATCAGCACGACC-3’，SEQ ID No.5；

2.一种基于权利要求1所述引物探针组的检测试剂盒，其特征在于，还包括10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、检测试纸条缓冲液、阳性DNA质控品以及核酸横向侧流检测试纸条。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的10×反应缓冲液的成分包括：200mM pH8.0～9.0Tris-HCl，100mM氯化钾，150mM硫酸铵，80mM硫酸镁，质量浓度1％TritonX-100，6M甜菜碱，14mM dNTP。

4.一种非诊断目的检测鲤疱疹病毒II型的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)样品DNA的提取：提取样品总DNA；

(2)环介导等温扩增：将步骤(1)提取的样品总DNA、权利要求1所述引物探针组、BstDNA聚合酶和10×反应缓冲液混匀，进行环介导等温扩增得扩增产物；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物探针组具体包括80μMCyHV-2-F3和80μM CyHV-2-B3；480μM CyHV-2-FIP和480μM CyHV-2-BIP；0.5μM CyHV-2-FITC-PROBE。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

(21)根据待检样品份数，将所述引物探针组，10×反应缓冲液与8U Bst DNA聚合酶混匀，得预反应液，体积21μL；

(22)在步骤(21)所述预反应液加入4μL待检样品DNA，得到样品检测反应液；配制阳性反应体系：向预反应液中添加阳性DNA质控品，得到阳性反应液；将所述样品检测反应液和阳性反应液置于62～64℃，反应45～60min，得扩增产物。

7.如权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：

(31)取所述扩增产物5～10μL加到核酸横向侧流检测试纸条样品垫上；

(32)再向所述样品垫滴加50～100μL检测试纸条缓冲液，待所述缓冲液移动到所述核酸横向侧流检测试纸条另一端吸水垫时，反应结束；

8.权利要求1所述的引物探针组在制备检测鱼类病毒感染的试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述鱼类病毒感染包括：鲫鱼或金鱼鲤疱疹病毒II型感染或鲫鱼造血器官坏死症。