CN110885768A - 一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用，步骤a.葡萄球菌的富集培养：从宣威火腿样品中取25g转移至225 mL含0.85%生理盐水及玻璃珠的三角瓶内，将三角瓶在漩涡振荡器上振荡3min，震荡后的梯度稀释，选取
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure 724499DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE003
三个稀释梯度分别在MSA平板选择培养基上进行涂布，30℃培养24h后挑选具有葡萄球菌形态的菌株，本发明以筛选的腐生葡萄球菌为发酵剂，制备干发酵香肠，应用该发酵剂制作的发酵香肠色泽鲜艳，具有浓郁的干腌风味，本发明生产的干发酵香肠工艺简单易操作、生产周期短，适合儿童和老年人食用，是一种优质干发酵香肠。

Description

一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用
技术领域
本发明涉及食品加工领域，特别是涉及一株腐生葡萄球菌，以及该菌株在发酵香肠中的应用。
背景技术
发酵香肠亦称生香肠，是指将绞碎的肉(常指猪肉或牛肉)和动物脂肪同糖、盐、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定的微生物特性和典型的发酵香味的肉制品。产品通常在常温条件下贮存、运输，并且不经过熟制处理直接食用。在发酵过程中，乳酸菌发酵碳水化合物形成乳酸，使香肠的最终pH值降低到4.5~5.5，这一较低的pH值使得肉中的盐溶性蛋白质变性，形成具有切片性的凝胶结构。较低的pH值与由添加的食盐和干燥过程降低的水分活度共同作用，保证了产品的稳定性和安全性。
长期以来，发酵香肠生产工艺都以自然发酵为主，这种传统的发酵方式带来了生产周期长、受季节影响严重、各批次质量不稳定等诸多问题。目前，从传统发酵肉制品中分离优良菌株并进行实际应用研究的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用，本发明从宣威火腿中分离抗氧化性强、发色效果好，本发明以筛选的腐生葡萄球菌为发酵剂，制备干发酵香肠，应用该发酵剂制作的发酵香肠色泽鲜艳，具有浓郁的干腌风味，本发明生产的干发酵香肠工艺简单易于操作、生产周期短，尤其适合儿童和老年人食用，是一种优质的干发酵香肠。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株腐生葡萄球菌，包括以下步骤：
步骤a.葡萄球菌的富集培养：从宣威火腿样品中取25g转移至225 mL含0.85%生理盐水及玻璃珠的三角瓶内，将三角瓶在漩涡振荡器上振荡3min，震荡后的梯度稀释，选取
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure 643893DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE003
三个稀释梯度分别在MSA平板选择培养基上进行涂布，30℃培养24h后挑选具有葡萄球菌形态的菌株；
步骤b.葡萄球菌的分离与纯化：在葡萄球菌分离培养基MSA上划线分离，30 ℃培养24h，反复划线分离两次后，将纯菌接种于液体培养基。
步骤c.葡萄球菌的生理生化鉴定和16SrDNA鉴定：通过酪素水解实验、产粘性实验、过氧化氢酶实验、凝固酶实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产酸产气实验、明胶液化实验、硫化氢实验、乙酰甲基甲醇实验，甲基红实验、运动性实验、淀粉去离子水解实验，糖（醇）发酵实验初步鉴定筛选的菌株为葡萄球菌，将葡萄球菌过夜培养后，提取基因组DNA，用细菌16S通用引物扩增16SrDNA，将扩增产物回收纯化后测序，测序结果在GenBank中比对分析，确定筛选菌株为腐生葡萄球菌。
优选的，所述腐生葡萄球菌应用在发酵香肠中。
一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用，腐生葡萄球菌应用在发酵香肠的步骤：
步骤a.腐生葡萄球菌发酵剂干粉的制备：应用酪胨酵母浸出粉琼脂培养基（PYA）将腐生葡萄球菌活化后，其中腐生葡萄球菌的活菌数大于
Figure 878696DEST_PATH_IMAGE004
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE005
，摇瓶扩大培养，在转数为10000 r/min的情况下离心10min，然后收集菌体制成浓缩菌悬浮液，加入保护剂，进行真空冷冻干燥过夜，制成发酵剂干粉，活菌计数达到
Figure 134140DEST_PATH_IMAGE006
；
步骤b.原料肉预处理：选择猪的前肘肉，冷水清洗，除去浮油和污物，沥干水分，将处理好的肉品肥瘦分割，肥肉切丁冷冻，备用；
步骤c.接种：按照0.2-0.5%的接种量与步骤b中准备的原料混匀；
步骤d.腌制：每100 g肉中加入辅料食盐2.8g、白砂糖1g、白酒1.5 g、辣椒粉0.8g、花椒粉0.5g、胡椒粉0.05g、五香粉0.05g、亚硝酸钠7.5μg，搅拌均匀后，在4℃条件下，腌制10 h；
步骤e.灌肠：将肉馅温度控制在4℃以下，灌入猪肠衣中，灌制好的肠衣的直径在2cm；
步骤f.发酵：将灌肠后的香肠放置在25～30℃的环境中发酵3-5天，相对湿度控制在80-90%；
步骤g.成熟：发酵结束后在10-15℃，相对湿度60-70%，成熟干燥15-30天。
优选的，所述保护剂由脱脂乳10.0%、甘露醇5.0%、乳糖5.2%和甘油2.5%组成。
优选的，所述前肘肉的瘦肉75%，肥肉25%。
优选的，所述腐生葡萄球菌来源于传统干腌火腿内部，为腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)YQS16，保藏编号为CGMCCNo.18351。
本发明提供了一株腐生葡萄球菌及其在干发酵香肠制备中的应用，具备以下有益效果：
（1）本发明制备的香肠与自然发酵的干发酵香肠相比，接种腐生葡萄球菌后显著提高了发酵香肠的红度值（a*）、黄度值（b*）和亮度（L*），赋予了发酵香肠鲜亮的玫瑰红色，具有非常好的发色效果。
（2）提高了发酵香肠的硬度、弹性、咀嚼性、回复性、胶着性和粘聚性，使香肠具有非常好的质地和口感；显著降低了发酵香肠的水分活度、脂肪氧化和蛋白质氧化值，延长了发酵香肠的保质期。
（3）发酵第30天，接菌组的氨基酸总量和必需氨基酸总量显著提高，分别提高了50%和16%；游离脂肪酸中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分别提高了5.46%和31.02%；
（4）本发明接菌组的酯类和酸类显著提高，赋予了发酵香肠特征性的水果风味，具有典型的干腌风味；接菌组显著改善了发酵香肠的外观、质地，提供了良好的风味和诱人的滋味，显著提高了发酵香肠的总体接受度。
附图说明
图1为本发明发酵香肠发酵过程中颜色变化；
图2为本发明发酵香肠成熟过程中TBARS变化结果；
图3为本发明发酵香肠成熟过程中蛋白质氧化结果；
图4为本发明腐生葡萄球菌YQS16的显微形态；
图5为本发明的葡萄球菌YQS16的生长曲线；
图6为本发明的腐生葡萄球菌YQS16的最适生长温度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
腐生葡萄球菌YQS16的筛选、鉴定、生产特性及安全性
步骤a.葡萄球菌的富集培养：从宣威火腿样品中取25 g转移至225mL含0.85%生理盐水及玻璃珠的三角瓶内，将三角瓶在漩涡振荡器上振荡3min，震荡后的梯度稀释，选取
Figure 336452DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 601954DEST_PATH_IMAGE003
三个稀释梯度分别在MSA平板选择培养基上进行涂布，30℃培养24h后挑选具有葡萄球菌形态的菌株；
步骤b.葡萄球菌的分离与纯化：在葡萄球菌分离培养基MSA上划线分离，30℃培养24h，反复划线分离两次后，将纯菌接种于液体培养基。
步骤c.葡萄球菌的生理生化鉴定和16SrDNA鉴定：通过酪素水解实验、产粘性实验、过氧化氢酶实验、凝固酶实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产酸产气实验、明胶液化实验、硫化氢实验、乙酰甲基甲醇实验，甲基红实验、运动性实验、淀粉去离子水解实验，糖（醇）发酵实验初步鉴定筛选的菌株为葡萄球菌，将葡萄球菌过夜培养后，提取基因组DNA，用细菌16S通用引物扩增16SrDNA，将扩增产物回收纯化后测序，测序结果在GenBank中比对分析，确定筛选菌株为腐生葡萄球菌。
表1-1腐生葡萄球菌生理生化鉴定结果
Figure 956844DEST_PATH_IMAGE008
注:“+” 反应阳性或生长; “-” 反应阴性或不生长。
步骤d. 生产性能评价：
（1）硝酸盐耐受性
以3%的接种量将葡萄球菌接种于含150 mg/kg的NaNO2的MSA培养基中，培养24h后以空白培养基为对照，600nm测定吸光值。
（2）耐盐实验
3%接种量接种葡萄球菌于含12%氯化钠的MSA培养基，培养24h后以空白培养基为对照，600nm测吸光值。
（3）耐低温实验
3%接种量接种葡萄球菌于MSA培养基，15℃培养24h后以空白培养基为对照，600nm测吸光值。
（4）耐酸实验
3%接种量接种葡萄球菌于pH=3.0的MSA液体培养基中，培养24h后以空白培养基为对照，600nm测吸光值。
（5）蛋白酶活力
应用福尔马林法测定，取3只试管标号，分别加入1mL 2%酪蛋白溶液，40℃预热2min，向各试管中分别加入1mL葡萄球菌菌液，再向1号试管中加入2mL三氯乙酸，在40℃下准确保温10min，取出2、3号管，立即向管中加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL终止反应，继续置于水浴中保温10min，离心后取上清液lmL，先后加入0.4mol/L碳酸钠10mL、福林试剂lmL，在40℃水浴中显色20min，于680nm波长处进行比色。
（6）脂肪酶活力
收集细菌到离心管内，6500 r/min离心后取上清50μL，吸取37℃，5 min预热好的底物缓冲液2mL，快速混匀，并计时，在420nm处30s后测吸光值为A1，将比色液倒入试管，37 ℃水浴10 min后30 s时读取吸光值A2，并求出两次吸光值差。
（7）硝酸盐还原酶活力
吸取40 mL葡萄球菌液于50 mL带塞比色管中，于标准管与试样管中分别加入2mL4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3~ 5min后各加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至50mL，混匀，静置15min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度。
（8）过氧化氢酶（CAT）活性检测
收集细菌到试管内，6500 r/min离心后弃上清，细菌数量（104个）：提取液体积（mL）=500~1000：1，超声波破碎细菌（功率20%，超声3 s，间隔9 s,重复30次），8000g,4 ℃离心10min，取上清，240nm测吸光值。
表1-2 腐生葡萄球菌性能评价
Figure DEST_PATH_IMAGE009
注：指标1、2、3、4表示在OD600nm下的吸光度值
由表1-2可知，从火腿中筛选的该株腐生葡萄球菌具有优秀的生产特性，具有耐亚硝酸盐、食盐、耐低温、耐酸的特性，而且具有很好的产蛋白酶、脂肪酶的活力，同时具有硝酸盐还原能力和过氧化氢酶活性。表明，该株腐生葡萄球菌性能优秀，非常适合作为发酵剂应用于发酵肉制品的生产中。
步骤d. 腐生葡萄球菌的安全性评价
（1）葡萄球菌氨基酸脱羧酶活性的测定
在生物氨检测培养基中分别加入酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸制成四种培养基，灭菌后加入3%葡萄球菌发酵液，以不加氨基酸为对照，30 ℃培养24 h后观察颜色，呈紫色为阳性，对照管为黄色。
（2）葡萄球菌抗生素耐受性实验
采用哥伦比亚琼脂平板（加入10%去纤维蛋白的羊血），分别进行下列的抗生素药敏纸片的测试：氯林可霉素（2μg）、红霉素、甲基钠霉素、新霉素（5μg）、氨苄青霉素、托普霉素、洁霉素（10μg）、庆大霉素、氯霉素、奴佛卡因、利福平、四环素、万古霉素、戊氧基青霉素（30μg），37 ℃培养18 h，观察菌株的抗性或敏感性。
Figure 829859DEST_PATH_IMAGE010
表1-3腐生葡萄球菌抗生素抗性结果
注：“R”表示抗药性；“S”表示药物敏感
Figure DEST_PATH_IMAGE011
表1-4 葡萄球菌氨基酸脱羧酶活性测定结果
注：“-”为无活性
我们应用国际上通用的认可的3个指标来确定该株腐生葡萄球菌的安全性，由表1-3和1-4可知，该株腐生葡萄球菌是安全的，可以作为肉品发酵剂放心使用。
实施例2
腐生葡萄球菌在发酵香肠中的应用
主要包括以下几个步骤：
步骤a.腐生葡萄球菌发酵剂干粉的制备：应用酪胨酵母浸出粉琼脂培养基（PYA）将腐生葡萄球菌（活菌数大于
Figure 575924DEST_PATH_IMAGE012
）活化后，摇瓶扩大培养，在转数为10000r/min，离心10min；然后收集菌体制成浓缩菌悬浮液。加入保护剂（脱脂乳10.0%、甘露醇5.0%、乳糖5.2%、甘油2.5%），进行真空冷冻干燥过夜，制成发酵剂干粉，活菌计数达到
Figure DEST_PATH_IMAGE013
；
步骤b.原料肉预处理：选择猪的前肘肉（瘦肉75%，肥肉25%），冷水清洗，除去浮油和污物，沥干水分。将处理好的肉品肥瘦分割，肥肉切丁冷冻，备用；
步骤c.接种：按照0.2%的接种量与步骤b中准备的原料混匀；
步骤d.腌制：每100 g肉中加入辅料食盐2.8 g、白砂糖1g、白酒1.5 g、辣椒粉0.8g、花椒粉0.5g、胡椒粉0.05g、五香粉0.05 g、亚硝酸钠7.5μg，搅拌均匀后，在4℃条件下，腌制10h；
步骤e.灌肠：将肉馅温度控制在4℃以下，灌入猪肠衣中；灌制好的肠衣的直径在2cm左右；
步骤f.发酵：25～30℃发酵3-5天，相对湿度控制在80-90%；
步骤g.成熟：在10-15℃，相对湿度60-70%，成熟干燥15-30天。
干发酵香肠的品质和感官评价结果如图1所示：
由图1可知，接种腐生葡萄球菌组均呈发酵肉制品特有暗红色。接菌组红度值增加，与葡萄球菌的还原作用相关，葡萄球菌还原亚硝酸盐所产生的一氧化氮能够与肌红蛋白结合形成亚硝肌红蛋白，进而赋予发酵肉制品玫瑰红色。
发酵香肠成熟过程中TBARS变化结果如图2所示以及发酵香肠成熟过程中蛋白质氧化结果如图3所示：
由图2和图3可知，在整个发酵过程中，接菌（腐生葡萄球菌）组的脂肪氧化和蛋白质氧化值显著低于对照组，说明接种腐生葡萄球菌有效抑制过氧化物的产生，提高了发酵香肠的安全性和货架期。
表2-1发酵香肠成熟第30天游离氨基酸含量变化
Figure 588934DEST_PATH_IMAGE015
由表2-1可知，发酵第30天游离氨基酸含量变化如，接菌腐生葡萄球菌组游离氨基酸的总量比对照组提高了54%；其中鲜味氨基酸（Glu）含量提高了38%，甜味氨基酸（Gly）含量提高了75%，必需氨基酸（Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Lys、Met、His）含量提高了16%，使香肠营养性更强，更易于消化和吸收。氨基酸是一类呈味物质，发酵肉制品中其含量的增加可使其风味更浓郁。
表2-1发酵香肠成熟第30天游离脂肪酸含量变化
Figure 107957DEST_PATH_IMAGE016
Figure 934837DEST_PATH_IMAGE017
如表2-2可知，接菌组和对照组都检出12种游离脂肪酸，其中饱和脂肪酸（SFA）4种，不饱和脂肪酸（UFA）8种。不饱和脂肪酸中单不饱和脂肪酸（MUFA）5种，多不饱和脂肪酸（PUFA）3种。结果表明，接种腐生葡萄球菌后，发酵香肠的营养性更强，更易于消化和吸收。游离脂肪酸（FFA）为风味的主要前体物，香肠中一定含量的游离脂肪酸对风味的形成具有重要意义；不饱和脂肪酸易氧化生产烷烃、烯烃、醛类、酸类、醇类和酮类，其中醛类、酸类、醇类和酮类的阈值低，对风味有重要影响。
表2-3 葡萄球菌发酵香肠感官评定结果
Figure 451269DEST_PATH_IMAGE018
从评价结果（表2-3）可知，接菌组显著改善了发酵香肠的外观、质地，提供了良好的风味，和诱人的滋味，明显提高发酵香肠香肠的总体接受度。

Claims (6)

1.一株腐生葡萄球菌，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a.葡萄球菌的富集培养：从宣威火腿样品中取25g转移至225 mL含0.85%生理盐水及玻璃珠的三角瓶内，将三角瓶在漩涡振荡器上振荡3min，震荡后的梯度稀释，选取
Figure DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure 516276DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure DEST_PATH_IMAGE003
三个稀释梯度分别在MSA平板选择培养基上进行涂布，30℃培养24h后挑选具有葡萄球菌形态的菌株；
步骤b.葡萄球菌的分离与纯化：在葡萄球菌分离培养基MSA上划线分离，30 ℃培养24h，反复划线分离两次后，将纯菌接种于液体培养基；
步骤c.葡萄球菌的生理生化鉴定和16SrDNA鉴定：通过酪素水解实验、产粘性实验、过氧化氢酶实验、凝固酶实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产酸产气实验、明胶液化实验、硫化氢实验、乙酰甲基甲醇实验，甲基红实验、运动性实验、淀粉去离子水解实验，糖（醇）发酵实验初步鉴定筛选的菌株为葡萄球菌，将葡萄球菌过夜培养后，提取基因组DNA，用细菌16S通用引物扩增16SrDNA，将扩增产物回收纯化后测序，测序结果在GenBank中比对分析，确定筛选菌株为腐生葡萄球菌。
2.根据权利要求1所述的一株腐生葡萄球菌其特征在于：所述腐生葡萄球菌应用在发酵香肠中。
3.根据权利要求2所述的一株腐生葡萄球菌在干发酵香肠制备中的应用，其特征在于：腐生葡萄球菌应用在发酵香肠的步骤：
步骤a.腐生葡萄球菌发酵剂干粉的制备：应用酪胨酵母浸出粉琼脂培养基（PYA）将腐生葡萄球菌活化后，其中腐生葡萄球菌的活菌数大于
Figure 423884DEST_PATH_IMAGE004
，摇瓶扩大培养，在转数为10000 r/min的情况下离心10min，然后收集菌体制成浓缩菌悬浮液，加入保护剂，进行真空冷冻干燥过夜，制成发酵剂干粉，活菌计数达到
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；
步骤b.原料肉预处理：选择猪的前肘肉，冷水清洗，除去浮油和污物，沥干水分，将处理好的肉品肥瘦分割，肥肉切丁冷冻，备用；
步骤c.接种：按照0.2-0.5%的接种量与步骤b中准备的原料混匀；
步骤d.腌制：每100 g肉中加入辅料食盐2.8g、白砂糖1g、白酒1.5 g、辣椒粉0.8g、花椒粉0.5g、胡椒粉0.05g、五香粉0.05g、亚硝酸钠7.5μg，搅拌均匀后，在4℃条件下，腌制10 h；
步骤e.灌肠：将肉馅温度控制在4℃以下，灌入猪肠衣中，灌制好的肠衣的直径在2cm；
步骤f.发酵：将灌肠后的香肠放置在25～30℃的环境中发酵3-5天，相对湿度控制在80-90%；
步骤g.成熟：发酵结束后在10-15℃，相对湿度60-70%，成熟干燥15-30天。
4.根据权利要求3所述的一株腐生葡萄球菌在干发酵香肠制备中的应用，其特征在于：所述保护剂由脱脂乳10.0%、甘露醇5.0%、乳糖5.2%和甘油2.5%组成。
5.根据权利要求3所述的一株腐生葡萄球菌在干发酵香肠制备中的应用，其特征在于：所述前肘肉的瘦肉75%，肥肉25%。
6.根据权利要求3所述的一株腐生葡萄球菌发酵香肠制备中的应用，其特征在于：所述腐生葡萄球菌来源于传统干腌火腿内部，为腐生葡萄球菌（Staphylococcussaprophyticus）YQS16。
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