CN110872605A - 酶催化制备l-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶催化制备L‑赤式‑对甲砜基苯丝氨酸的方法，特别是涉及利用L‑β‑羟基‑α‑氨基酸合成酶催化甘氨酸和对甲砜基苯丝氨酸制备L‑赤式‑对甲砜基苯丝氨酸的方法。本发明还涉及用于本发明方法的制备系统以及L‑β‑羟基‑α‑氨基酸合成酶。

Description

酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法
技术领域
本发明涉及酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，特别是涉及利用L-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸和对甲砜基苯丝氨酸制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法。本发明还涉及用于本发明方法的制备系统以及L-β-羟基-α-氨基酸合成酶。
背景技术
L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸是L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的非对映异构体。L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸是制备甲砜霉素和及其氟化衍生物氟甲砜霉素(氟苯尼考)的原料L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的前体物质。虽然L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸乙酯直接决定了氟苯尼考的质量和成本，但是，由于L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸可以经过化学转化获得L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸，如果能够以非常简单且低成本地制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，其也将具有十分重要的市场开发价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明一方面提供了酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，通过该方法能够以温和且环境友好的反应条件制备并通过简单分离就可得到L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。
另一方面，本发明提供了用于本发明方法的制备系统。
再一方面，本发明提供了用于本发明方法的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶。
具体实施方式
本发明提供了酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其中，L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸具有下述结构：
Figure BDA0001781042050000021
该方法包括以下步骤：
(a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应，
(b)固液分离得到包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相
在步骤(a)的反应体系中，甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下进行如下反应：
Figure BDA0001781042050000022
L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸
上述反应中生成L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸与L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。
在本文中，术语“L-β-羟基-α-氨基酸合成酶”泛指能够催化醛基(-CH(＝O))与氨基酸中的氨基(-NH2)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，特别是指能够催化醛基(-CH(＝O))与甘氨酸中的氨基(-NH2)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，尤其是指能够催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛发生缩合反应生成L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的酶，例如，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶包括L-苏氨酸醛缩酶、L-苯丝氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶等等。
在本发明中，应当理解所给出的数值点包括适当的偏差，例如所给出值±10％，优选±5％，更优选±3％，更优选±1％内的偏差。
在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在反应中的用量没有特别的要求。用量少，反应进行的慢，所需反应时间长；用量多，反应进行的快，所需反应时间短。可以根据反应需要选择和调节L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的用量。
在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性以其催化分解L-苯丝氨酸生成苯甲醛和甘氨酸的能力进行衡量。在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性定义为：在约30℃、pH为约8.5和L-苯丝氨酸浓度为约10mmol/L的条件下，每分钟催化L-苯丝氨酸生成1μmol苯甲醛所需的酶量为1个活力单位(U)。
在本发明中，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性测定方式为：
(1)底物溶液的配制：称取DL-苯丝氨酸(以其中的L-苯丝氨酸为酶的底物)于去离子水中，超声使其完全溶解，再加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，调节pH＝8.5，使得最终溶液中包含40mmol/L DL-苯丝氨酸、40μmol/L PLP。
(2)反应条件：取10μl酶液、190μl去离子水、200μl底物溶液于1.5ml离心管中混匀，于30℃下计时反应，反应10min时立即加入400μl 1.7％磷酸终止液混匀终止反应。取终止后的反应液测量其290nm处的吸光度，与苯甲醛浓度—290nm吸光度标准曲线进行比较，得到反应液中的苯甲醛浓度，进而计算得到L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活力单位。
需要说明的是，在本发明的方法中，甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应需要使用L-β-羟基-α-氨基酸合成酶进行催化，而不能使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶(例如D-苏氨酸醛缩酶)进行催化，因为D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应生成上述两个产物的手性对映体D-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和D-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。D构型产物需要通过复杂的化学法再转化获得L构型的产物。因此，使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶在生产中不能通过简单分离获得L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，即，使用D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应不能实现本发明的目的。
作为本发明的反应底物，甘氨酸易溶于水，而对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度非常低，需要加入助溶剂来在提高对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度。优选地，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸均以饱和状态溶解在反应体系中。优选地，对甲砜基苯甲醛以远大于其溶解度的量加入反应体系中。更优选加入到反应体系中的甘氨酸的摩尔量大于对甲砜基苯甲醛的摩尔量。例如，甘氨酸以0.5-2mol/L，例如0.6-1.5mol/L，例如0.8-1.2mol/L的浓度加入到反应体系中，对甲砜基苯甲醛以0.1-0.8mol/L，例如0.2-0.6mol/L，例如0.2-0.5mol/L的浓度加入到反应体系中。
在本发明中，可以使用的助溶剂选自以下中的一种或多种：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000(PEG 6000)、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、乙腈、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙醇胺(DMAE)、乙二醇二甲醚(DME)、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠(SDS)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、β-环糊精和亚硫酸氢钠。优选选自DMSO、DMF、乙醇和丙酮。
优选地，助溶剂在水溶液中的体积浓度不超过60％，优选地，不超过55％，不超过50％，不超过45％，不超过40％，不超过35％。优选地，助溶剂的体积浓度为至少5％，至少10％，至少12％，至少15％，至少20％，至少22％，至少25％，至少30％。
可以在步骤(a)中的反应体系中加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，5-磷酸吡哆醛作为L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的辅酶可以提高酶的活性。但是，5-磷酸吡哆醛在本发明的方法中不是必须的。在加入5-磷酸吡哆醛的情况下，5-磷酸吡哆醛的加入量可以为不超过200μmol/L，例如不超过100μmol/L，不超出80μmol/L，不超过60μmol/L，不超过50μmol/L。
步骤(a)的反应可以在宽范围的温度条件下进行，例如，4-50℃的温度范围内，10-30℃的温度范围内，15-28℃的温度范围内。反应温度可以根据所使用的酶进行适当调节。
步骤(a)的反应体系的pH可以在5-10的范围内，例如，6-9的范围内，6-8的范围内，6-7的范围内。可以在反应体系中使用缓冲液，也可以不使用缓冲液。从简化工艺的角度来说，优选不使用缓冲液。
步骤(a)的反应优选在搅拌下进行，搅拌可以连续进行，也可以间断进行。搅拌速度没有特别的限制，只要使得反应体系处于大致的混合均匀状态即可。在不同的反应容器中，可以根据需要调节适合的搅拌速度。
在酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法中，重要的是将L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸与L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸进行分离。二者作为非对映体结构，根据常规的分离方法难以进行分离。提高酶的选择性是一种方法，也就是说，使得L-β-羟基-α-氨基酸合成酶仅选择性催化合成L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。但是，这种方法尚处于探索阶段。另外，即使D-β-羟基-α-氨基酸合成酶(例如D-苏氨酸醛缩酶)能够实现高的选择性，但是，如前所述，D构型对映体不具有生物活性，需要通过复杂的化学法再转化获得L构型的产物，因此，这依然不能实现条件温和且环境友好且简单的目标。换句话说，高选择性的D-β-羟基-α-氨基酸合成酶依然不能实现本发明的目标。
在本发明方法的步骤(a)中，出人意料的发现，在本发明中描述的条件下，随着反应的进行，L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸能够从反应体系中沉淀出来。为了加速这一沉淀进程，优选加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种。但是，从降低生产成本的角度，也可以不加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种。这一发现使得对酶的选择性没有高的要求，只要能够催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛进行上述反应的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶都可以用于本发明的方法中。但是，仍然优选将高选择性的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶用于本发明的方法中。
如果在反应中加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，其加入时间点没有特别的限制，可以随反应物一同加入到反应体系，也可以在反应开始之后反应结束之前加入，例如在反应过程中0-72小时内的任意时间内，例如，在反应开始后0小时，1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，26小时，28小时，30小时，33小时，35小时，38小时，40小时，42小时，45小时，48小时，50小时，52小时，55小时，58小时，60小时，62小时，65小时，68小时，70小时或72小时。
在步骤(a)中，随着反应的不断进行，L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸不断沉淀，而随着L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的沉淀，上述反应的平衡不断被打破，使得反应不断朝着生成L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方向进行。另外，由于酶催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛生成L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸和L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的反应是可逆反应，未沉淀的L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸会被催化重新分解为甘氨酸和对甲砜基苯甲醛。因此，理论上，加入到反应体系中的所有反应物可能全部被转变为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。但是，可以理解的是，在实际操作过程中，不需要等到所有的反应物都转变为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。
优选地，根据使用的酶的量以及反应温度等反应条件，步骤(a)的反应时间可以在宽的范围内选择，例如，反应可以进行2-150个小时，例如5-80个小时，10-75个小时。
在停止反应后，将反应体系固液分离得到包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相(步骤(b))。所述固液分离操作可以采用常规的固液分离手段，例如过滤、离心或抽滤等。但是，可以理解的是，可以在L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸发生沉淀后的任何时间点进行分离操作。
任选地，在分离获得包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相后，对该固相进行洗涤，例如，使用水和/或有机溶剂进行洗涤，所述有机溶剂可以为丙酮、乙腈、DMSO、DMF等；优选去离子水和丙酮。洗涤可以进行多次，例如2-5次。
通过本发明的方法不仅可以容易地且环境友好地制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，而且可以通过简单分离获得高纯度的L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。
本发明的又一方面涉及用于本发明的方法的制备系统，该制备系统包括：1)反应装置，该反应装置用于使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应；2)固液分离装置。或者，该制备系统由上述装置1)和2)组成。
所述反应装置没有特别的限制，可以是用于生物催化反应的常用反应器，例如，釜式反应器，机械搅拌式反应器，鼓泡式反应器等等，只要在该反应器中能够进行甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中的反应。
所述固液分离装置也没有特别的限制，可以是固液分离常用的分离装置，例如过滤器、抽滤器、离心机等等，只要能够实现本发明的方法中的固液分离即可。
本发明的系统的特别之处是将这两种装置的组合使用。也就是说，对应于本发明的方法的各个步骤的组合，相应地组合使用上述各种装置。而在现有技术中，没有发现将这两种装置进行组合用于L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的制备。
本发明的再一方面涉及可以用于本发明的方法的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶。如上所述，能够催化上述反应的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶都可以用于本发明的方法，优选地，在本发明的方法中使用具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的酶。
在本文中，将具有SEQ ID No.1氨基酸序列的酶称为酶24-1(该酶为L-苯基丝氨酸醛缩酶，属于L-β-羟基-α-氨基酸合成酶)，将具有SEQ ID No.2氨基酸序列的酶称为酶KT2440(该酶为L-苏氨酸醛缩酶，属于L-β-羟基-α-氨基酸合成酶)。本领域技术人员可以理解，在保持L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的酶活性的前提下，可以对SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列进行少量氨基酸残基(例如1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基)的替换、增加或缺失。
可选地，在本发明的方法中也可以使用SpyTag/SpyCatcher环化的酶24-1(该酶称为酶SR-24-1)或SpyTag/SpyCatcher环化的酶KT2440(该酶称为酶SR-KT2440)。SpyTag/SpyCatcher环化酶24-1是指用SpyTag/SpyCatcher技术将酶24-1进行环化获得的酶，SpyTag/SpyCatcher环化的酶KT2440是指用SpyTag/SpyCatcher技术将酶2440进行环化获得的酶。
酶24-1可以通过下述方法得到：将能够翻译出SEQ ID No.1氨基酸序列的DNA序列重组到pET-28a质粒上，得到重组质粒pET28a-24-1，将所述重组质粒pET28a-24-1转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1，培养所述重组菌株使其表达酶24-1。
优选地，培养重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的方法可以如下：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在35-40℃下振荡培养5-18h，取培养振荡后的培养液以0.5-5％的接种量转接于乳糖培养基中，在20-37℃下振荡培养12-40h，振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其用高压匀浆机匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶24-1。
酶KT2440可以通过下述方法得到：将能够翻译出SEQ ID No.2氨基酸序列的DNA序列重组到pET28a质粒上，得到重组质粒pET28a-KT2440，将所述重组质粒pET28a-KT2440转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440，培养所述重组菌株使其表达酶KT2440。
优选地，培养重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的方法可以如下：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的单菌落接种到LB培养基中，在35-40℃下振荡培养5-18h，取培养振荡后的培养液以0.5-5％的接种量转接于乳糖培养基中，在20-37℃下振荡培养12-40h，振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其用高压匀浆机匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶KT2440。
以下通过实施例示例性地说明本发明，但是可以理解的是，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例
酶制备例1
具有SEQ No.1的氨基酸序列的酶24-1的制备
(1)合成pET28a-24-1质粒，将能够翻译出SEQ ID No.1氨基酸序列的DNA序列SEQID No.3基因进行合成，并插入到pET28a质粒BamHI-HindIII之间，即得重组质粒pET28a-24-1，将所述重组质粒pET28a-24-1转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1。
(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1使其表达所述酶24-1，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4·12H2O 8.95g/L，KH2PO43.4g/L，NH4Cl 2.67g/L，Na2SO40.7g/L，MgSO40.24g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶24-1。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为33U/mL。
酶制备例2
具有SEQ No.2的氨基酸序列的酶KT2440的制备
(1)合成pET28a-KT2440质粒，将能够翻译出SEQ ID No.2氨基酸序列的DNA序列SEQ ID No.4基因进行合成，并插入到pET28a质粒BamHI-HindIII之间，即得重组质粒pET28a-KT2440，将所述重组质粒pET28a-KT2440转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440。
(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440使其表达所述酶KT2440，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与酶制备例1中相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶KT2440。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为13.6U/mL。
酶制备例3
SpyTag/SpyCatcher环化的酶SR-24-1的制备
本实施例的酶SR-24-1具有SEQ ID No.5所述的氨基酸序列结构，所述酶SR-24-1通过以下方法得到：
(1)设计、合成具有SEQ ID No.6所述DNA序列结构的上游引物和具有SEQ ID No.7所述DNA序列结构的下游引物，用所述两引物以酶制备例1中所述pET28a-24-1质粒为模板进行PCR扩增，所得到的产物为MegaWHOP扩增所需的长引物，用所述长引物以SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒(Addgene编号#52656)为模板进行MegaWHOP扩增，经过扩增后SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒中的β-内酰胺酶(β-Lactamase)基因被替换为具有SEQ ID No.3所述DNA序列结构的基因，得到能够翻译出SEQ ID No.5所述氨基酸序列结构的具有SEQ ID No.8所述DNA序列结构的基因，扩增所得到的产物经DpnI消化后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1。
(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1使其表达所述酶SR-24-1，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与酶制备例1中相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶SR-24-1。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为13U/mL。
实施例1
酶KT2440在30％DMSO中催化200mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的KT2440酶酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)的有机溶剂DMSO，加入2.76g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中振荡反应72h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为98.5％，得率65％。
对比例1
酶KT2440无助溶剂催化200mM对甲砜基苯甲醛
(1)在50ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的酶KT2440酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，加入2.76g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中振荡反应36h，反应结束后取样进行高效液相色谱分析，没有发现L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀。
实施例2
酶KT2440在30％DMSO中催化400mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的酶KT2440酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)有机溶剂DMSO，加入5.53g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于15℃的200rpm的摇床中振荡反应72h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为94.9％，得率68.5％。
实施例3
酶KT2440在15％DMSO中催化400mM对甲砜基苯甲醛
(1)在38.75ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的酶KT2440酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加11.25ml(占总体积的约15体积％)有机溶剂DMSO，加入5.53g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于15℃和200rpm的摇床中振荡反应72h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为91.2％，得率56％。
实施例4
酶24-1在30％DMSO中催化400mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例1的酶24-1酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)有机溶剂DMSO，加入5.53g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于15℃和200rpm的摇床中振荡反应72h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为85.7％，得率56％。
实施例5
酶KT2440在30％DMSO中催化300mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的酶KT2440酶液，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)有机溶剂DMSO，加入5.53g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中震荡反应72h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为94.5％，得率58.7％
对比例2
酶24-1无助溶剂催化200mM对甲砜基苯甲醛
(1)在50ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例1的酶24-1酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，加入2.76g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中振荡反应72h，反应结束后取样进行高效液相色谱分析，没有发现L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀。
实施例6
酶24-1在30％DMF中催化400mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例1的酶24-1酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)有机溶剂DMF，加入5.53g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中振荡反应108h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，所得沉淀中L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸纯度为92.5％，得率为44.3％。
实施例7
酶KT2440在30％DMSO中催化100mM对甲砜基苯甲醛
(1)在27.5ml去离子水中，先超声溶解底物5.63g甘氨酸，加入25ml的上述酶制备例2的酶KT2440酶液，及0.994mg的辅酶因子PLP，再添加22.5ml(占总体积的约30体积％)有机溶剂DMSO，加入1.38g对甲砜基苯甲醛，溶液pH值为约6.5。
(2)将整个催化反应体系，置于28℃和200rpm的摇床中振荡反应36h，反应结束后进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，沉淀中L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸含量为96.2％，得率为56.5％。
实施例8
环化酶SR-24-1在DMSO体系中进行催化
取去离子水27.5ml于250ml锥形瓶中，加入5.63g甘氨酸，混匀后加入25ml酶制备例3中制备得到的环化酶SR-24-1酶液，混匀后加入22.5mlDMSO(占总体积的约30体积％)混匀后加入0.994mg 5-磷酸吡哆醛，混匀后加入5.53g对甲砜基苯甲醛，28℃摇床200rpm振荡反应，反应144h后抽滤获得滤饼，用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，沉淀中L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸含量为95.7％，得率为53.5％。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。
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Claims (8)

1.酶催化制备L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法，包括以下步骤：
(a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应；
(b)固液分离得到包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相。
2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)的反应温度在4-50℃之间，例如10-30℃之间，15-28℃之间。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(a)中加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，优选在搅拌下加入。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中加入5-磷酸吡哆醛。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述助溶剂选自以下物质：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯醚、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙醇胺、乙二醇二甲醚、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠、3-吗啉丙磺酸、β-环糊精和亚硫酸氢钠；优选选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇和丙酮。
6.权利要求1-5中任一项述的方法，其中，助溶剂在水溶液体系中的体积浓度为5-60％，例如10-50％，或20-40％。
7.用于权利要求1-6任一项所述方法的制备系统，该制备系统包括：1)反应装置，该反应装置用于使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应；和2)固液分离装置。
8.用于权利要求1-6中任一项所述方法的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶，具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或者具有在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上进行1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L-β-羟基-α-氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。
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