CN110872585A

CN110872585A - 用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶及其用途

Info

Publication number: CN110872585A
Application number: CN201810992381.4A
Authority: CN
Inventors: 罗晖; 常雁红; 王艺达; 肖莹; 田珺玮; 汪月; 孙宏旭; 胡清清
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN110872585B

Abstract

本发明涉及用SpyTag/SpyCatcher环化的L‑β‑羟基‑α‑氨基酸合成酶及其用途。

Description

用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶及其用途

技术领域

本发明涉及用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶及其在催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸中的用途。

背景技术

作为许多农药与医药活性成分的关键前体，L-β-羟基-α-氨基酸(丝氨酸衍生物)也是许多抗体、抗真菌剂、免疫抑制剂及抗癌药物的关键结构单元。以往合成L-β-羟基-α-氨基酸的方法由于各种局限具有低的立体选择性、前体昂贵以及需要各种化学计量手性助剂等缺陷。而L-β-羟基-α-氨基酸合成酶(包括L-苏氨酸醛缩酶，L-苯丝氨酸醛缩酶，丝氨酸羟甲基转移酶等)通过催化甘氨酸和相应的醛类化合物可一步合成L-β-羟基-α-氨基酸，且反应条件较为温和，不会产生其他化学法导致的污染问题。

酶分子一般在水相中进行催化，反应条件温和。但在L-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应过程中，可能需要在反应体系加入有机溶剂，这些有机溶剂的存在对酶的稳定性造成了不利的影响。因此，对酶分子进行改造使其稳定性提高就有重要意义。

发明内容

本发明的第一方面涉及用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶，其中所述L-β-羟基-α-氨基酸合成酶具有SEQ No.1或SEQ No.2的氨基酸序列，或者具有在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上进行1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L-β-羟基-α-氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。该环化的酶具有良好的热稳定性和有机溶剂耐受性。

本发明的又一方面涉及所述的用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸中的用途。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶，该环化的酶具有良好的热稳定性和有机溶剂耐受性，其中所述L-β-羟基-α-氨基酸合成酶具有SEQ No.1或SEQ No.2的氨基酸序列，或者具有在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上进行1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L-β-羟基-α-氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。

在本发明中，术语“L-β-羟基-α-氨基酸合成酶”泛指能够催化醛基(-CH(＝O))与氨基酸中的氨基(-NH₂)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，特别是指能够催化醛基(-CH(＝O))与甘氨酸中的氨基(-NH₂)发生缩合反应生成L-β-羟基-α-氨基酸的酶，尤其是指能够催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛发生缩合反应生成L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的酶，例如，L-β-羟基-α-氨基酸合成酶包括L-苏氨酸醛缩酶、L-苯丝氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶等等。

在本文中，将具有SEQ ID No.1氨基酸序列的酶称为酶24-1(该酶为L-苯基丝氨酸醛缩酶，属于L-β-羟基-α-氨基酸合成酶)，将具有SEQ ID No.2氨基酸序列的酶称为KT2440(该酶为L-苏氨酸醛缩酶，属于L-β-羟基-α-氨基酸合成酶)。本领域技术人员可以理解，在保持L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的酶活性的前提下，可以对SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列进行少量氨基酸残基(例如1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基)的替换、增加或缺失。

酶24-1可以通过下述方法得到：将能够翻译出SEQ ID No.1氨基酸序列的DNA序列重组到pET-28a质粒上，得到重组质粒pET28a-24-1，将所述重组质粒pET28a-24-1转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1，培养所述重组菌株使其表达酶24-1。

优选地，培养重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的方法可以如下：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在35-40℃下振荡培养5-18h，取培养振荡后的培养液以0.5-5％的接种量转接于乳糖培养基中，在20-37℃下振荡培养12-40h，振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其用高压匀浆机匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶24-1。

酶KT2440可以通过下述方法得到：将能够翻译出SEQ ID No.2氨基酸序列的DNA序列重组到pET28a质粒上，得到重组质粒pET28a-KT2440，将所述重组质粒pET28a-KT2440转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440，培养所述重组菌株使其表达酶KT2440。

优选地，培养重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的方法可以如下：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的单菌落接种到LB培养基中，在35-40℃下振荡培养5-18h，取培养振荡后的培养液以0.5-5％的接种量转接于乳糖培养基中，在20-37℃下振荡培养12-40h，振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其用高压匀浆机匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶KT2440。

为了构建环化的酶24-1或环化的酶KT2440，本发明利用全质粒MegaWHOP的方法(Miyazaki,K.,&Takenouchi,M.(2002).Creating random mutagenesis libraries usingmegaprimer PCR of whole plasmid.Biotechniques,33(5),1033-4.)，通过构建合成搭接引物，再将合成的引物和目的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶基因进行混合PCR获得含有SpyTag和SpyCatcher接头的目的基因片段，然后再将这一片段和SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒(从Addgene购得，质粒编号52656)混合，进行全质粒MegaWHOP PCR以获得含有SpyTag-24-1-SpyCatcher或SpyTag-2440-SpyCatcher的SpyTag/SpyCatcher环化酶的质粒DNA。接着，将MegaWHOP PCR产物用DpnI进行消化然后将其转化入BL21(DE3)中，液体LB培养后涂抗性平板进行筛选，经过核酸测序确定SpyTag/SpyCatcher环化的酶SR-24-1或SpyTag/SpyCatcher环化的酶SR-KT2440是否构建成功。

本发明的第二方面涉及用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸中的用途。具体来说，涉及用该环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。使用该环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的制备工艺具有环境友好且简单的特点。

在反应体系中，甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在该环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下进行如下反应：

上述反应中生成L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸与L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。

作为本发明的反应底物，甘氨酸易溶于水，而对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度非常低，需要加入助溶剂来在提高对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度。

上述制备方法可以包括如下步骤：

(a)使甘氨酸和对甲砜基苯甲醛在用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶存在下在含助溶剂的水溶液体系中反应，

(b)固液分离得到包含L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的液相和包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相，

(c)将步骤(b)中得到的液相降温以使L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀析出，

(d)固液分离得到沉淀析出的L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸；和

(e)任选地，将步骤(d)产生的液相用于步骤(a)的反应。

在本发明中，环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在反应中的用量没有特别的要求。用量少，反应进行的慢，所需反应时间长；用量多，反应进行的快，所需反应时间短。可以根据反应需要选择和调节环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的用量。

在本发明中，环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性以其催化分解L-苯丝氨酸生成苯甲醛和甘氨酸的能力进行衡量。在本发明中，环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性定义为：在约30℃、pH为约8.5和L-苯丝氨酸浓度为约10mmol/L的条件下，每分钟催化L-苯丝氨酸生成1μmol苯甲醛所需的酶量为1个活力单位(U)。

在本发明中，环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活性测定方式为：

(1)底物溶液的配制：称取DL-苯丝氨酸(以其中的L-苯丝氨酸为酶的底物)于去离子水中，超声使其完全溶解，再加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，调节pH＝8.5，使得最终溶液中包含40mmol/L DL-苯丝氨酸、40μmol/L PLP。

(2)反应条件：取10μl酶液、190μl去离子水、200μl底物溶液于1.5ml离心管中混匀，于30℃下计时反应，反应10min时立即加入400μl 1.7％磷酸终止液混匀终止反应。取终止后的反应液测量其290nm处的吸光度，与苯甲醛浓度—290nm吸光度标准曲线进行比较，得到反应液中的苯甲醛浓度，进而计算得到环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的活力单位。

需要说明的是，在本发明的方法中，甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应需要使用环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶进行催化，而不能使用环化的D-β-羟基-α-氨基酸合成酶(例如D-苏氨酸醛缩酶)进行催化，因为环化的D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应生成上述两个产物的手性对映体D-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和D-赤式-对甲砜基苯丝氨酸。由于D构型对映体不具有生物活性，需要通过复杂的化学法再转化获得L构型的产物。因此，使用环化的D-β-羟基-α-氨基酸合成酶在生产中不能通过简单分离获得L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，即，使用环化的D-β-羟基-α-氨基酸合成酶催化甘氨酸与对甲砜基苯甲醛的反应不能实现本发明的目的。

作为本发明的反应底物，甘氨酸易溶于水，而对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度非常低，需要加入助溶剂来在提高对甲砜基苯甲醛在水中的溶解度。优选地，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸均以饱和状态溶解在反应体系中。优选地，对甲砜基苯甲醛以远大于其溶解度的量加入反应体系中。更优选加入到反应体系中的甘氨酸的摩尔量大于对甲砜基苯甲醛的摩尔量。例如，甘氨酸以0.5-2mol/L，例如0.6-1.5mol/L，0.8-1.2mol/L的浓度加入到反应体系中，对甲砜基苯甲醛以0.1-0.8mol/L，例如0.2-0.6mol/L，0.2-0.5mol/L的浓度加入到反应体系中。

在本发明中，可以使用的助溶剂选自以下中的一种或多种：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000(PEG 6000)、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、乙腈、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙醇胺(DMAE)、乙二醇二甲醚(DME)、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠(SDS)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、β-环糊精和亚硫酸氢钠。优选选自DMSO、DMF、乙醇和丙酮。

优选地，助溶剂在水溶液中的体积浓度不超过60％，优选地，不超过55％，不超过50％，不超过45％，不超过40％，不超过35％。优选地，助溶剂的体积浓度为至少5％，至少10％，至少12％，至少15％，至少20％，至少22％，至少25％，至少30％。

可以在步骤(a)中的反应体系中加入5-磷酸吡哆醛(PLP)，5-磷酸吡哆醛作为环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶的辅酶可以提高酶的活性。但是，5-磷酸吡哆醛在本发明的方法中不是必须的。在加入5-磷酸吡哆醛的情况下，5-磷酸吡哆醛的加入量可以为不超过200μmol/L，例如不超过100μmol/L，不超出80μmol/L，不超过60μmol/L，不超过50μmol/L。

步骤(a)的反应可以在宽范围的温度条件下进行，例如，4-50℃的温度范围内，10-30℃的温度范围内，15-28℃的温度范围内。一般而言，温度越高，反应速度越快；温度越低，反应速度越慢。因此，根据酶的催化反应特点选择所需反应温度。

步骤(a)的反应体系的pH可以在5-10的范围内，例如，6-9的范围内，6-8的范围内，6-7的范围内。可以在反应体系中使用缓冲液，也可以不使用缓冲液。从简化工艺的角度来说，优选不使用缓冲液。

步骤(a)的反应优选在搅拌下进行，搅拌可以连续进行，也可以间断进行。搅拌速度没有特别的限制，只要使得反应体系处于大致的混合均匀状态即可。在不同的反应容器中，可以根据需要调节适合的搅拌速度。

优选地，进行步骤(a)的反应直到反应体系的反应达到平衡状态。但是，也不是必须达到反应平衡状态，可以在达到平衡状态前终止反应。根据使用的酶的量以及反应温度等反应条件，反应时间可以在宽的范围内选择，例如，反应可以进行2-75个小时，例如5-70个小时，10-68个小时，10-45个小时，10-40个小时。

在本发明方法的步骤(a)中，出人意料的发现，在本发明中描述的条件下，随着反应的进行，L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸能够从反应体系中沉淀出来，而L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸却可以保持溶解状态。为了加速L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸这一沉淀进程，优选加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种。但是，从降低生产成本的角度，也可以不加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种。

如果在反应中加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，其加入时间点没有特别的限制，可以随反应物一同加入到反应体系，也可以在反应开始之后反应结束之前加入，例如在反应过程中0-72小时内的任意时间内，例如，在反应开始后0小时，1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，26小时，28小时，30小时，33小时，35小时，38小时，40小时，42小时，45小时，48小时，50小时，52小时，55小时，58小时，60小时，62小时，65小时，68小时，70小时或72小时。

在步骤(a)中，随着反应的不断进行，L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸不断沉淀，而L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸在液相中不断的积累。在达到平衡状态时，液相中的L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸含量很少，大部分的L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀出。优选地，在反应达到平衡状态后，将反应体系固液分离得到包含L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的液相和包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相(步骤(b))。所述固液分离操作可以采用常规的固液分离手段，例如过滤、离心或抽滤等。但是，可以理解的是，不是必须等到反应达到平衡状态才可以进行上述固液分离操作，也可以在达到平衡状态前进行上述固液分离操作。

在步骤(c)中，将包含L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的液相降温至10℃以下，例如，9℃以下、8℃以下、7℃以下、6℃以下、5℃以下、4℃以下、3℃以下、2℃以下、1℃以下，0℃以下；但是，考虑到实际操作条件限制，一般降温到-5℃以上，例如-4℃以上，-3℃以上、-2℃以上、-1℃以上。L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸从液相中沉淀析出。理论上初步认为，该沉淀析出可能包括了结晶过程和普通析出过程的混合。为了加快这一沉淀析出进程，优选加入L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，但是从降低生产成本的角度，也可以不加入L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸晶种。

步骤(c)中的沉淀析出所用时间没有具体的限制，只要液相中的至少一部分(优选大部分)L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸沉淀析出出来即可。可以根据降温速度、降温温度和所用降温设备等条件进行综合确定。一般情况下，降温沉淀析出所用时间在0.5-36小时范围内，例如1-25小时范围内，1-15小时范围内，1-5小时范围内。

在沉淀析出完成后，在步骤(d)中，通过固液分离得到沉淀析出的L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸。所述固液分离操作可以采用常规的固液分离手段，例如过滤、离心或抽滤等。

除了前述步骤(a)至(d)之外，还可以包括步骤(e)：将步骤(d)产生的液相用于步骤(a)的反应。也就是说，将分离L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸之后的液相重新用于步骤(a)的反应。在该分离后的液相中加入对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，不加或仅少量补加环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶就可以直接重新用于反应，这可以大大降低生产成本，实现反应体系的重复套用。

在本发明中，应当理解所给出的数值点可以包括适当的偏差，例如所给出值±10％，优选±5％，更优选±3％，更优选±1％内的偏差。

以下通过实施例示例性地说明本发明，但是可以理解的是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例

酶制备例1

具有SEQ No.1的氨基酸序列的酶24-1的制备

(1)合成pET28a-24-1质粒，将能够翻译出SEQ ID No.1氨基酸序列的DNA序列SEQID No.3基因进行合成，并插入到pET28a质粒的BamHI-HindIII之间，即得重组质粒pET28a-24-1，将所述重组质粒pET28a-24-1转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1。

(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1使其表达所述酶24-1，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.95g/L，KH₂PO₄ 3.4g/L，NH₄Cl 2.67g/L，Na₂SO₄ 0.7g/L，MgSO₄0.24g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶24-1。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为33U/mL。

酶制备例2

具有SEQ No.2的氨基酸序列的酶KT2440的制备

(1)合成pET28a-KT2440质粒，将能够翻译出SEQ ID No.2氨基酸序列的DNA序列SEQ ID No.4基因进行合成，并插入pET28a质粒的BamHI-HindIII之间，即得重组质粒pET28a-KT2440，将所述重组质粒pET28a-KT2440转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440。

(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440使其表达所述酶KT2440，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-KT2440的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与酶制备例1中相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶KT2440。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为13.6U/mL。

酶制备例3

SpyTag/SpyCatcher环化的酶SR-24-1的制备

本实施例的酶SR-24-1具有SEQ ID No.5所述的氨基酸序列结构，所述酶SR-24-1通过以下方法得到：

(1)设计、合成具有SEQ ID No.6所述DNA序列结构的上游引物和具有SEQ ID No.7所述DNA序列结构的下游引物，用所述两引物以酶制备例1中所述pET28a-24-1质粒为模板进行PCR扩增，所得到的产物为MegaWHOP扩增所需的长引物，用所述长引物以SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒(Addgene编号#52656)为模板进行MegaWHOP扩增，经过扩增后SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒中的β-内酰胺酶(β-Lactamase)基因被替换为具有SEQ ID No.3所述DNA序列结构的基因，得到能够翻译出SEQ ID No.5所述氨基酸序列结构的具有SEQ ID No.8所述DNA序列结构的基因，扩增所得到的产物经DpnI消化后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1。

(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1使其表达所述酶SR-24-1，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-24-1的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与酶制备例1中相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述酶SR-24-1。通过前述活性测定方法，测得酶液的酶活为13U/mL。

酶制备例4

SpyTag/SpyCatcher环化的酶SR-KT2440的制备

本实施例的环化酶SR-KT2440具有SEQ ID No.9所述的氨基酸序列结构，所述酶SR-KT2440通过以下方法得到：

(1)设计、合成具有SEQ ID No.10所述DNA序列结构的上游引物和具有SEQ IDNo.11所述DNA序列结构的下游引物，用该两引物以酶制备例2中pET28a-KT2440质粒为模板进行PCR扩增，所得到的产物为MegaWHOP扩增所需的长引物，用所述长引物以SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒(Addgene编号#52656)为模板进行MegaWHOP扩增，经过扩增后SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒中的β-内酰胺酶(β-Lactamase)基因被替换为具有SEQ ID No.12所述DNA序列结构的基因，得到能够翻译出SEQ ID No.9所述氨基酸序列结构的具有SEQ ID No.12所述DNA序列结构的基因，扩增所得到的产物经DpnI消化后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-KT2440。

(2)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-KT2440使其表达所述环化酶SR-KT2440，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-KT2440的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与前述乳糖培养基相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述环化酶SR-KT2440。酶液的酶活为10.5U/mL。

对比酶制备例1

环化的头孢菌素C酰化酶SR-CCA的制备

本对比例的环化头孢菌素C酰化酶SR-CCA具有SEQ ID No.13所述的氨基酸序列结构，所述环化头孢菌素C酰化酶SR-CCA通过以下方法得到：

(1)pET28a-CCA质粒，按文献(Wang,Y.,Yu,H.,Song,W.,An,M.,Zhang,J.,Luo,H.,&Shen,Z.(2012).Overexpression of synthesized cephalosporin C acylasecontaining mutations in the substrate transport tunnel.Journal of bioscienceand bioengineering,113(1),36-41.)制备，将能够翻译出具有SEQ ID No.14氨基酸序列的头孢菌素C酰化酶CCA的DNA序列SEQ ID No.15插入pET-28a质粒BamHI-HindIII之间，即得重组质粒pET28a-CCA。

(2)设计、合成具有SEQ ID No.16所述DNA序列结构的上游引物和具有SEQ IDNo.17所述DNA序列结构的下游引物，用所述两引物以(1)中所述pET28a-CCA质粒为模板进行PCR扩增，所得到的产物为MegaWHOP扩增所需的长引物，用所述长引物以SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒(Addgene编号#52656)为模板进行MegaWHOP扩增，经过扩增后SpyTag-β-Lactamase-SpyCatcher质粒中的β-内酰胺酶(β-Lactamase)基因被替换为具有SEQ ID No.15所述DNA序列结构的基因，得到能够翻译出SEQ ID No.13所述氨基酸序列结构的具有SEQ ID No.18所述DNA序列结构的基因，扩增所得到的产物经DpnI消化后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即得所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-CCA。

(3)培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-CCA使其表达所述环化头孢菌素C酰化酶SR-CCA，具体包括以下步骤：将所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SR-CCA的单菌落接种到LB培养基中，在37℃下振荡培养12h，取振荡培养后的培养基以2.5％的接种量转接于乳糖培养基(成分与前述乳糖培养基相同)中，在28℃下振荡培养24h；振荡培养结束后离心收集细胞，向收集的细胞中加入去离子水重悬细胞，将其置于高压匀浆机中匀浆破碎，将破碎液离心，收集上清液，即得所述环化头孢菌素C酰化酶SR-CCA。酶液的酶活为5.66U/mL。

(4)采用与(3)同样的方法培养所述重组菌株BL21(DE3)/pET28a-CCA使其表达头孢菌素C酰化酶，得到头孢菌素C酰化酶CCA。酶液的酶活为6.96U/mL。

实施例1

酶24-1和环化的酶SR-24-1的热稳定性评价

将酶制备例1和酶制备例3的酶液分别放置到60℃温度下处理60min，振荡摇晃均匀后取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。酶制备例1中的酶24-1的残留酶活比例为42.7％，酶制备例3的环化酶SR-24-1的残留酶活比例为91.8％。

实施例2

酶KT2440和环化酶SR-KT2440的热稳定性评价

将酶制备例2和酶制备例4的酶液分别放置到50℃温度下处理60min，振荡摇晃均匀后取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。酶制备例2中的酶KT2440的残留酶活比例为18.4％，酶制备例4的环化酶SR-KT2440的残留酶活比例为32.4％。

实施例3

酶24-1和环化酶SR-24-1的变性剂耐受能力的评价

将酶制备例1和酶制备例3的酶液加入到4M的盐酸胍变性剂中，室温孵育30min后，取出测定酶活。以未经任何处理的酶液(溶液中变性剂浓度为0M)酶活为100％，计算得到变性剂浓度下残余酶活百分比。酶制备例1中的酶24-1的残留酶活比例为3.6％，酶制备例3的环化酶SR-24-1的残留酶活比例为38.6％。

实施例4

酶24-1和环化酶SR-24-1的DMSO耐受能力的评价

在酶制备例1和酶制备例3的酶液中，加入终浓度为30％浓度的DMSO，常温处理一段时间后，取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。酶制备例1中的酶24-1的残留酶活比例为68.2％，酶制备例3的环酶SR-24-1的残留酶活比例为100.7％。

实施例5

酶24-1和环化酶SR-24-1的乙醇耐受能力的评价

在酶制备例1和酶制备例3的酶液中，加入终浓度为30％浓度的乙醇，常温处理36h后，取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。酶制备例1的酶24-1的残留酶活比例为55.9％，酶制备例3的环化酶SR-24-1的残留酶活比例为96.8％。

实施例6

酶24-1和环化酶SR-24-1的甲醇耐受能力的评价

在酶制备例1和酶制备例3的酶液中，加入终浓度为50％浓度的甲醇，常温处理一段时间后，取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。酶制备例1中的酶24-1的残留酶活比例为14.1％，酶制备例3的环化酶SR-24-1的残留酶活比例为74.8％。

实施例7

环化酶SR-24-1在30％乙醇中催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸

取去离子水27.5ml于250ml锥形瓶中，加入5.63g甘氨酸，混匀后加入25ml酶制备例3中制备得到的环化酶SR-24-1酶液，混匀后加入22.5ml乙醇(占总体积的约30体积％)，混匀后加入0.994mg 5-磷酸吡哆醛，混匀后加入5.53g对甲砜基苯甲醛，28℃摇床200rpm振荡反应，反应39h后抽滤获得包含L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的固相和包含L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸的液相，经核磁和高压液相色谱法确定，固相主要成分为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，将液相降温到4℃，搅拌1h，再抽滤，获得滤饼，经核磁和高压液相色谱法确定，滤饼主要成分为L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸，其中滤饼中L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸与L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的比例为83.5:16.5。

实施例8

酶SR-2440在DMSO中催化制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸

取去离子水27.5ml于250ml锥形瓶中，加入5.63g甘氨酸，混匀后加入25ml酶制备例3中制备得到的酶SR-24-1酶液，混匀后加入22.5ml DMSO(占总体积的30％)，混匀后加入0.994mg 5-磷酸吡哆醛，混匀后加入5.53g对甲砜基苯甲醛，28℃摇床200rpm振荡反应，反应72h后，进行抽滤获得滤饼。用去离子水清洗收集的滤饼，再用丙酮清洗3次滤饼，洗去未反应完全的底物对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干，所得即为L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸，经高效液相色谱分析，纯度为94.5％，得率62％。

对比例1

头孢菌素C酰化酶SR-CCA的热稳定性评价

将对比酶制备例1的头孢菌素C酰化酶CCA和环化的头孢菌素C酰化酶SR-CCA酶液分别放置到55℃温度下处理40min，振荡摇晃均匀后取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。头孢菌素C酰化酶的残留酶活比例为11.7％，环化的头孢菌素C酰化酶SR-CCA的残留酶活比例为9.9％。

对比例2

头孢菌素C酰化酶SR-CCA的DMSO耐受能力评价

在对比酶制备例1的头孢菌素C酰化酶CCA和环化的头孢菌素C酰化酶SR-CCA酶液中，加入终浓度为30％浓度的DMSO，常温处理40h后，取一定量酶液反应测定酶活，并将该酶活数据与不进行任何处理的初始酶活进行对比，计算残余酶活百分比。头孢菌素C酰化酶的残留酶活比例为80.3％，环化的头孢菌素C酰化酶的残留酶活比例为70.8％。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<210> 1

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Asn Gly Glu Thr Ser Arg Pro Pro Ala Leu Gly Phe Ser Ser Asp

1 5 10 15

Asn Ile Ala Gly Ala Ser Pro Glu Val Ala Gln Ala Leu Val Lys His

20 25 30

Ser Ser Gly Gln Ala Gly Pro Tyr Gly Thr Asp Glu Leu Thr Ala Gln

35 40 45

Val Lys Arg Lys Phe Cys Glu Ile Phe Glu Arg Asp Val Glu Val Phe

50 55 60

Leu Val Pro Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ala Leu Cys Leu Ser Ala Met

65 70 75 80

Thr Pro Pro Trp Gly Asn Ile Tyr Cys His Pro Ala Ser His Ile Asn

85 90 95

Asn Asp Glu Cys Gly Ala Pro Glu Phe Phe Ser Asn Gly Ala Lys Leu

100 105 110

Met Thr Val Asp Gly Pro Ala Ala Lys Leu Asp Ile Val Arg Leu Arg

115 120 125

Glu Arg Thr Arg Glu Lys Val Gly Asp Val His Thr Thr Gln Pro Ala

130 135 140

Cys Val Ser Ile Thr Gln Ala Thr Glu Val Gly Ser Ile Tyr Thr Leu

145 150 155 160

Asp Glu Ile Glu Ala Ile Gly Asp Val Cys Lys Ser Ser Ser Leu Gly

165 170 175

Leu His Met Asp Gly Ser Arg Phe Ala Asn Ala Leu Val Ser Leu Gly

180 185 190

Cys Ser Pro Ala Glu Met Thr Trp Lys Ala Gly Val Asp Ala Leu Ser

195 200 205

Phe Gly Ala Thr Lys Asn Gly Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Val Leu

210 215 220

Phe Asn Thr Ser Leu Ala Thr Glu Met Ser Tyr Arg Arg Lys Arg Ala

225 230 235 240

Gly His Leu Ser Ser Lys Met Arg Phe Leu Ser Ala Gln Ile Asp Ala

245 250 255

Tyr Leu Thr Asp Asp Leu Trp Leu Arg Asn Ala Arg Lys Ala Asn Ala

260 265 270

Ala Ala Gln Arg Leu Ala Gln Gly Leu Glu Gly Leu Gly Gly Val Glu

275 280 285

Val Leu Gly Gly Thr Glu Ala Asn Ile Leu Phe Cys Arg Leu Asp Ser

290 295 300

Ala Met Ile Asp Ala Leu Leu Lys Ala Gly Phe Gly Phe Tyr His Asp

305 310 315 320

Arg Trp Gly Pro Asn Val Val Arg Phe Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr

325 330 335

Ala Glu Asp Val Asp His Leu Leu Asn Gln Val Arg Leu Ala Ala Asp

340 345 350

Arg Thr Gln Glu Arg

355

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Thr Asp Lys Ser Gln Gln Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Ser Gly Ile

1 5 10 15

Cys Pro Glu Ala Trp Val Ala Met Glu Lys Ala Asn Arg Gly His Asp

20 25 30

Arg Ala Tyr Gly Asp Asp Gln Trp Thr Glu Arg Ala Ser Glu Tyr Phe

35 40 45

Arg Asn Leu Phe Glu Thr Asp Cys Glu Val Phe Phe Ala Phe Asn Gly

50 55 60

Thr Ala Ala Asn Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Cys Gln Ser Tyr His

65 70 75 80

Ser Val Ile Cys Ser Glu Thr Ala His Val Glu Thr Asp Glu Cys Gly

85 90 95

Ala Pro Glu Phe Phe Ser Asn Gly Ser Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ser

100 105 110

Val Asn Gly Lys Leu Thr Pro Gln Ser Ile Arg Glu Val Ala Leu Lys

115 120 125

Arg Gln Asp Ile His Tyr Pro Lys Pro Arg Val Val Thr Ile Thr Gln

130 135 140

Ala Thr Glu Val Gly Thr Val Tyr Arg Pro Asp Glu Leu Lys Ala Ile

145 150 155 160

Ser Ala Thr Cys Lys Glu Leu Gly Leu Asn Leu His Met Asp Gly Ala

165 170 175

Arg Phe Thr Asn Ala Cys Ala Phe Leu Gly Cys Ser Pro Ala Glu Leu

180 185 190

Thr Trp Lys Ala Gly Val Asp Val Leu Cys Phe Gly Gly Thr Lys Asn

195 200 205

Gly Met Ala Val Gly Glu Ala Ile Leu Phe Phe Asn Arg Gln Leu Ala

210 215 220

Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Cys Lys Gln Ala Gly Gln Leu Ala Ser Lys

225 230 235 240

Met Arg Phe Leu Ser Ala Pro Trp Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Ala

245 250 255

Trp Leu Arg His Gly Asn His Ala Asn His Cys Ala Gln Leu Leu Ala

260 265 270

Ser Leu Val Ser Asp Leu Pro Gly Val Glu Leu Met Phe Pro Val Glu

275 280 285

Ala Asn Gly Val Phe Leu Gln Met Pro Glu His Ala Ile Glu Ala Leu

290 295 300

Arg Gly Lys Gly Trp Arg Phe Tyr Thr Phe Ile Gly Ser Gly Gly Ala

305 310 315 320

Arg Phe Met Cys Ser Trp Asp Thr Glu Glu Ala Arg Val Arg Glu Leu

325 330 335

Ala Ala Asp Ile Arg Thr Ile Ile Gly Gly

340 345

<210> 3

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgaatggtg aaacatcacg tccaccagct ctaggttttt catcagataa tattgctggt 60

gcttcaccag aagttgctca agctctagtt aaacattctt ctggtcaggc tggtccgtac 120

ggtactgacg aactgaccgc tcaggttaaa cgtaaattct gcgaaatctt cgaacgtgac 180

gttgaagttt tcctggttcc gaccggtact gctgctaacg ctctgtgcct gtctgctatg 240

accccgccgt ggggtaacat ctactgccac ccggcttctc acatcaacaa cgacgaatgc 300

ggtgctccgg aatttttctc taacggtgct aaactgatga ccgttgacgg tccggctgct 360

aaactggaca tcgttcgtct gcgtgaacgt acccgtgaaa aagttggtga cgttcacacc 420

acccagccgg cttgcgtttc tatcacccag gctaccgaag ttggttctat ctacaccctg 480

gacgaaatcg aagctatcgg tgacgtttgc aaatcttctt ctctgggtct gcacatggac 540

ggttctcgtt tcgctaacgc tctggtttct ctgggttgct ctccggctga aatgacctgg 600

aaagctggtg ttgacgctct gtctttcggt gctaccaaaa acggtgttct ggctgctgaa 660

gctatcgttc tgttcaacac ctctctggct accgaaatgt cttaccgtcg taaacgtgct 720

ggtcacctgt cttctaaaat gcgtttcctg tctgctcaga tcgacgctta cctgaccgac 780

gacctgtggc tgcgtaacgc tcgtaaagct aacgctgctg ctcagcgtct ggctcagggt 840

ctggaaggtc tgggtggtgt tgaagttctg ggtggtactg aagctaacat cctgttctgc 900

cgtctggact ctgctatgat cgacgctctg ctgaaagctg gtttcggttt ctaccacgac 960

cgttggggtc cgaacgttgt tcgtttcgtt acctctttcg ctaccaccgc tgaagacgtt 1020

gaccacctac taaatcaagt acgactagct gctgatcgta ctcaggaacg ataa 1074

<210> 4

<211> 1041

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgacagata aatcacaaca atttgcttca gataattatt caggtatttg tccagaagca 60

tgggttgcaa tggaaaaagc aaatcgtggt catgatcgtg cttacggtga cgaccagtgg 120

accgaacgtg cttctgaata cttccgtaac ctgttcgaaa ccgactgcga agttttcttc 180

gctttcaacg gtactgctgc taactctctg gctctggctt ctctgtgcca gtcttaccac 240

tctgttatct gctctgaaac cgctcacgtt gaaaccgacg aatgcggtgc tccggaattt 300

ttctctaacg gttctaaact gctgaccgct gcttctgtta acggtaaact gaccccgcag 360

tctatccgtg aagttgctct gaaacgtcag gacatccact acccgaaacc gcgtgttgtt 420

accatcaccc aggctaccga agttggtact gtttaccgtc cggacgaact gaaagctatc 480

tctgctacct gcaaagaact gggtctgaac ctgcacatgg acggtgctcg tttcaccaac 540

gcttgcgctt tcctgggttg ctctccggct gaactgacct ggaaagctgg tgttgacgtt 600

ctgtgcttcg gtggtactaa aaacggtatg gctgttggtg aagctatcct gttcttcaac 660

cgtcagctgg ctgaagactt cgactaccgt tgcaaacagg ctggtcagct ggcttctaaa 720

atgcgtttcc tgtctgctcc gtgggttggt ctgctggaag acggtgcttg gctgcgtcac 780

ggtaaccacg ctaaccactg cgctcagctg ctggcttctc tggtttctga cctgccgggt 840

gttgaactga tgttcccggt tgaagctaac ggtgttttcc tgcaaatgcc ggaacacgct 900

atcgaagctc tgcgtggtaa aggttggcgt ttctacacct tcatcggttc tggtggtgct 960

cgtttcatgt gctcttggga caccgaagaa gctcgtgttc gtgaactagc tgctgatatc 1020

cgtacaatca tcggtggtta a 1041

<210> 5

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys

20 25 30

Pro Thr Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly Met Asn Gly Glu Thr Ser Arg

35 40 45

Pro Pro Ala Leu Gly Phe Ser Ser Asp Asn Ile Ala Gly Ala Ser Pro

50 55 60

Glu Val Ala Gln Ala Leu Val Lys His Ser Ser Gly Gln Ala Gly Pro

65 70 75 80

Tyr Gly Thr Asp Glu Leu Thr Ala Gln Val Lys Arg Lys Phe Cys Glu

85 90 95

Ile Phe Glu Arg Asp Val Glu Val Phe Leu Val Pro Thr Gly Thr Ala

100 105 110

Ala Asn Ala Leu Cys Leu Ser Ala Met Thr Pro Pro Trp Gly Asn Ile

115 120 125

Tyr Cys His Pro Ala Ser His Ile Asn Asn Asp Glu Cys Gly Ala Pro

130 135 140

Glu Phe Phe Ser Asn Gly Ala Lys Leu Met Thr Val Asp Gly Pro Ala

145 150 155 160

Ala Lys Leu Asp Ile Val Arg Leu Arg Glu Arg Thr Arg Glu Lys Val

165 170 175

Gly Asp Val His Thr Thr Gln Pro Ala Cys Val Ser Ile Thr Gln Ala

180 185 190

Thr Glu Val Gly Ser Ile Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Glu Ala Ile Gly

195 200 205

Asp Val Cys Lys Ser Ser Ser Leu Gly Leu His Met Asp Gly Ser Arg

210 215 220

Phe Ala Asn Ala Leu Val Ser Leu Gly Cys Ser Pro Ala Glu Met Thr

225 230 235 240

Trp Lys Ala Gly Val Asp Ala Leu Ser Phe Gly Ala Thr Lys Asn Gly

245 250 255

Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Val Leu Phe Asn Thr Ser Leu Ala Thr

260 265 270

Glu Met Ser Tyr Arg Arg Lys Arg Ala Gly His Leu Ser Ser Lys Met

275 280 285

Arg Phe Leu Ser Ala Gln Ile Asp Ala Tyr Leu Thr Asp Asp Leu Trp

290 295 300

Leu Arg Asn Ala Arg Lys Ala Asn Ala Ala Ala Gln Arg Leu Ala Gln

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Leu Gly Gly Val Glu Val Leu Gly Gly Thr Glu Ala

325 330 335

Asn Ile Leu Phe Cys Arg Leu Asp Ser Ala Met Ile Asp Ala Leu Leu

340 345 350

Lys Ala Gly Phe Gly Phe Tyr His Asp Arg Trp Gly Pro Asn Val Val

355 360 365

Arg Phe Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr Ala Glu Asp Val Asp His Leu

370 375 380

Leu Asn Gln Val Arg Leu Ala Ala Asp Arg Thr Gln Glu Arg Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser

405 410 415

Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr

420 425 430

His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly

435 440 445

Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp

450 455 460

Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr

465 470 475 480

Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala

485 490 495

Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys

500 505 510

Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

515 520

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

gacgaagggt tcagggggtt ccggtatgaa tggtgaaaca tcacg 45

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

tggcgcctcc gctgccacca ctccctcgtt cctgagtacg atcagc 46

<210> 8

<211> 1566

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgggagccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggttc agggggttcc 120

ggtatgaatg gtgaaacatc acgtccacca gctctaggtt tttcatcaga taatattgct 180

ggtgcttcac cagaagttgc tcaagctcta gttaaacatt cttctggtca ggctggtccg 240

tacggtactg acgaactgac cgctcaggtt aaacgtaaat tctgcgaaat cttcgaacgt 300

gacgttgaag ttttcctggt tccgaccggt actgctgcta acgctctgtg cctgtctgct 360

atgaccccgc cgtggggtaa catctactgc cacccggctt ctcacatcaa caacgacgaa 420

tgcggtgctc cggaattttt ctctaacggt gctaaactga tgaccgttga cggtccggct 480

gctaaactgg acatcgttcg tctgcgtgaa cgtacccgtg aaaaagttgg tgacgttcac 540

accacccagc cggcttgcgt ttctatcacc caggctaccg aagttggttc tatctacacc 600

ctggacgaaa tcgaagctat cggtgacgtt tgcaaatctt cttctctggg tctgcacatg 660

gacggttctc gtttcgctaa cgctctggtt tctctgggtt gctctccggc tgaaatgacc 720

tggaaagctg gtgttgacgc tctgtctttc ggtgctacca aaaacggtgt tctggctgct 780

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gacgacctgt ggctgcgtaa cgctcgtaaa gctaacgctg ctgctcagcg tctggctcag 960

ggtctggaag gtctgggtgg tgttgaagtt ctgggtggta ctgaagctaa catcctgttc 1020

tgccgtctgg actctgctat gatcgacgct ctgctgaaag ctggtttcgg tttctaccac 1080

gaccgttggg gtccgaacgt tgttcgtttc gttacctctt tcgctaccac cgctgaagac 1140

gttgaccacc tactaaatca agtacgacta gctgctgatc gtactcagga acgagggagt 1200

ggtggcagcg gaggcgccat ggttgatacc ttatcaggtt tatcaagtga gcaaggtcag 1260

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attagtacat ggatttcaga tggacaagtg aaagatttct acctgtatcc aggaaaatat 1440

acatttgtcg aaaccgcagc accagacggt tatgaggtag caactgctat tacctttaca 1500

gttaatgagc aaggtcaggt tactgtaaat ggcaaagcaa ctaaaggtga cgctcatatt 1560

taatga 1566

<210> 9

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys

20 25 30

Pro Thr Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly Met Thr Asp Lys Ser Gln Gln

35 40 45

Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Ser Gly Ile Cys Pro Glu Ala Trp Val Ala

50 55 60

Met Glu Lys Ala Asn Arg Gly His Asp Arg Ala Tyr Gly Asp Asp Gln

65 70 75 80

Trp Thr Glu Arg Ala Ser Glu Tyr Phe Arg Asn Leu Phe Glu Thr Asp

85 90 95

Cys Glu Val Phe Phe Ala Phe Asn Gly Thr Ala Ala Asn Ser Leu Ala

100 105 110

Leu Ala Ser Leu Cys Gln Ser Tyr His Ser Val Ile Cys Ser Glu Thr

115 120 125

Ala His Val Glu Thr Asp Glu Cys Gly Ala Pro Glu Phe Phe Ser Asn

130 135 140

Gly Ser Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ser Val Asn Gly Lys Leu Thr Pro

145 150 155 160

Gln Ser Ile Arg Glu Val Ala Leu Lys Arg Gln Asp Ile His Tyr Pro

165 170 175

Lys Pro Arg Val Val Thr Ile Thr Gln Ala Thr Glu Val Gly Thr Val

180 185 190

Tyr Arg Pro Asp Glu Leu Lys Ala Ile Ser Ala Thr Cys Lys Glu Leu

195 200 205

Gly Leu Asn Leu His Met Asp Gly Ala Arg Phe Thr Asn Ala Cys Ala

210 215 220

Phe Leu Gly Cys Ser Pro Ala Glu Leu Thr Trp Lys Ala Gly Val Asp

225 230 235 240

Val Leu Cys Phe Gly Gly Thr Lys Asn Gly Met Ala Val Gly Glu Ala

245 250 255

Ile Leu Phe Phe Asn Arg Gln Leu Ala Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Cys

260 265 270

Lys Gln Ala Gly Gln Leu Ala Ser Lys Met Arg Phe Leu Ser Ala Pro

275 280 285

Trp Val Gly Leu Leu Glu Asp Gly Ala Trp Leu Arg His Gly Asn His

290 295 300

Ala Asn His Cys Ala Gln Leu Leu Ala Ser Leu Val Ser Asp Leu Pro

305 310 315 320

Gly Val Glu Leu Met Phe Pro Val Glu Ala Asn Gly Val Phe Leu Gln

325 330 335

Met Pro Glu His Ala Ile Glu Ala Leu Arg Gly Lys Gly Trp Arg Phe

340 345 350

Tyr Thr Phe Ile Gly Ser Gly Gly Ala Arg Phe Met Cys Ser Trp Asp

355 360 365

Thr Glu Glu Ala Arg Val Arg Glu Leu Ala Ala Asp Ile Arg Thr Ile

370 375 380

Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Met Val Asp Thr Leu

385 390 395 400

Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu

405 410 415

Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly

420 425 430

Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys

435 440 445

Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu

450 455 460

Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr

465 470 475 480

Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val

485 490 495

Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

500 505

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

gacgaagggt tcagggggtt ccggtatgac agataaatca caacaatttg c 51

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

tggcgcctcc gctgccacca ctcccaccac cgatgattgt acgg 44

<210> 12

<211> 1533

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgggagccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggttc agggggttcc 120

ggtatgacag ataaatcaca acaatttgct tcagataatt attcaggtat ttgtccagaa 180

gcatgggttg caatggaaaa agcaaatcgt ggtcatgatc gtgcttacgg tgacgaccag 240

tggaccgaac gtgcttctga atacttccgt aacctgttcg aaaccgactg cgaagttttc 300

ttcgctttca acggtactgc tgctaactct ctggctctgg cttctctgtg ccagtcttac 360

cactctgtta tctgctctga aaccgctcac gttgaaaccg acgaatgcgg tgctccggaa 420

tttttctcta acggttctaa actgctgacc gctgcttctg ttaacggtaa actgaccccg 480

cagtctatcc gtgaagttgc tctgaaacgt caggacatcc actacccgaa accgcgtgtt 540

gttaccatca cccaggctac cgaagttggt actgtttacc gtccggacga actgaaagct 600

atctctgcta cctgcaaaga actgggtctg aacctgcaca tggacggtgc tcgtttcacc 660

aacgcttgcg ctttcctggg ttgctctccg gctgaactga cctggaaagc tggtgttgac 720

gttctgtgct tcggtggtac taaaaacggt atggctgttg gtgaagctat cctgttcttc 780

aaccgtcagc tggctgaaga cttcgactac cgttgcaaac aggctggtca gctggcttct 840

aaaatgcgtt tcctgtctgc tccgtgggtt ggtctgctgg aagacggtgc ttggctgcgt 900

cacggtaacc acgctaacca ctgcgctcag ctgctggctt ctctggtttc tgacctgccg 960

ggtgttgaac tgatgttccc ggttgaagct aacggtgttt tcctgcaaat gccggaacac 1020

gctatcgaag ctctgcgtgg taaaggttgg cgtttctaca ccttcatcgg ttctggtggt 1080

gctcgtttca tgtgctcttg ggacaccgaa gaagctcgtg ttcgtgaact agctgctgat 1140

atccgtacaa tcatcggtgg tgggagtggt ggcagcggag gcgccatggt tgatacctta 1200

tcaggtttat caagtgagca aggtcagtcc ggtgatatga caattgaaga agatagtgct 1260

acccatatta aattctcaaa acgtgatgag gacggcaaag agttagctgg tgcaactatg 1320

gagttgcgtg attcatctgg taaaactatt agtacatgga tttcagatgg acaagtgaaa 1380

gatttctacc tgtatccagg aaaatataca tttgtcgaaa ccgcagcacc agacggttat 1440

gaggtagcaa ctgctattac ctttacagtt aatgagcaag gtcaggttac tgtaaatggc 1500

aaagcaacta aaggtgacgc tcatatttaa tga 1533

<210> 13

<211> 937

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys

20 25 30

Pro Thr Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly Met Thr Met Ala Ala Lys Thr

35 40 45

Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu

50 55 60

Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp

65 70 75 80

Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala

85 90 95

Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr

100 105 110

Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala

115 120 125

Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys

130 135 140

Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Ala Ala Gly Val Asn Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu

165 170 175

Pro Ile Glu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro

180 185 190

Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser

195 200 205

Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala

210 215 220

Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu

225 230 235 240

Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala

245 250 255

Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp

260 265 270

Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro

275 280 285

Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg

290 295 300

Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp

305 310 315 320

Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro

325 330 335

His Asn Ala His Asn Gly Lys Val Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe

340 345 350

Met Asp Thr His Asp Leu Tyr Leu Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg

355 360 365

Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp

370 375 380

Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu

385 390 395 400

Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala

405 410 415

Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp

420 425 430

Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp

435 440 445

Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Val Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp

450 455 460

Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg

465 470 475 480

Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His

485 490 495

Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp

500 505 510

Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp

515 520 525

Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala

530 535 540

Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp

545 550 555 560

Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu

565 570 575

Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala

580 585 590

Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala

595 600 605

Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr

610 615 620

Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro

625 630 635 640

Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp

645 650 655

Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asn Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly

660 665 670

Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln

675 680 685

Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr

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His Pro Leu Ser Ala Gln Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro

705 710 715 720

Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly

725 730 735

Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Glu Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Cys Arg

740 745 750

Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe

755 760 765

His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn

770 775 780

Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp

785 790 795 800

Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Ser Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala Gly

805 810 815

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser

820 825 830

Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala

835 840 845

Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala

850 855 860

Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr

865 870 875 880

Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys

885 890 895

Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr

900 905 910

Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly

915 920 925

Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

930 935

<210> 14

<211> 774

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val

20 25 30

Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg

50 55 60

Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala

65 70 75 80

Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg

85 90 95

Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala

100 105 110

Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Gly Val Asn Ala Phe

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala

130 135 140

Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg

145 150 155 160

Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu

165 170 175

Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp

180 185 190

Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu

195 200 205

Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu

210 215 220

Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile

245 250 255

Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala

260 265 270

Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val

275 280 285

Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Asn Ala His Asn Gly Lys Val Ala

290 295 300

Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Thr His Asp Leu Tyr Leu Glu

305 310 315 320

Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu

325 330 335

Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp

340 345 350

Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly

355 360 365

Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala

370 375 380

Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser

385 390 395 400

Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Val Asp

405 410 415

His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val

420 425 430

Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val

435 440 445

Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu

450 455 460

Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr Ala

465 470 475 480

Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp

485 490 495

Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val Ala

500 505 510

Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr

515 520 525

Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Gly

530 535 540

Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile Ala

545 550 555 560

Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr Asn

565 570 575

Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly Leu

580 585 590

Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val Ser

595 600 605

Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asn Asp

610 615 620

Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser Glu

625 630 635 640

Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly Glu

645 650 655

Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ser Ala Gln Phe Pro Ala

660 665 670

Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly

675 680 685

Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Glu Ala

690 695 700

Thr Tyr Gly Ala Leu Cys Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp

705 710 715 720

Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser

725 730 735

Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val

740 745 750

Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Ser Ser

755 760 765

Gln Glu Leu Val Pro Ala

770

<210> 15

<211> 2325

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgacgatgg cggcgaaaac cgatcgtgaa gcactgcagg cggcactgcc accgttaagc 60

ggtagtctga gcatcccggg tctgagtgca ccggttcgtg tgcaacgtga cggttggggt 120

attccgcaca tcaaagcaag cggtgaggca gacgcgtatc gcgcattagg cttcgttcat 180

gcgcaagatc gtctgtttca aatggagtta acgcgtcgta aagccttagg tcgtgcggcc 240

gagtggttag gcgccgaagc cgcggaagca gacattttag ttcgtcgctt aggcatggaa 300

aaagtgtgtc gccgcgattt tgaagcgctg ggcgcagagg cgaaggatat gttacgtgcc 360

tatgcagccg gtgtgaacgc atttttagcg agcggtgcgc cattaccgat tgaatatagc 420

ttattaggtg ccgaaccaga gccgtgggaa ccatggcata gcatcgccgt gatgcgccgt 480

ctgggcctgc tgatgggcag tgtgtggttc aagctgtggc gcatgctggc gttaccggtg 540

gttggcgcag caaatgcgct gaaactgcgt tacgatgacg gcggtcaaga tctgttatgc 600

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gttgatgcat tactgaaagc gatgggcggt gatgccagcg acgcagcagg tggtggtagc 720

aataactggg ccgtggcacc aggtcgtacc gccacgggtc gtccgattct ggcgggtgac 780

ccgcatcgtg tgtttgaaat tccgggtatg tatgcccagc atcatctggc gtgtgatcgt 840

tttgatatga ttggtctgac ggtgccaggt gttccgggct tcccgcacaa tgcccataat 900

ggcaaagtgg cgtactgtgt gacgcatgca tttatggata cccatgatct gtatctggaa 960

cagtttgcgg aagatggtcg cacggcgcgt tttggtaatg aatttgagcc ggttgcgtgg 1020

cgtcgtgacc gtattgcagt tcgcggtggt gcggaccgcg aattcgatat tgtggaaacc 1080

cgtcatggcc cagtgatcgc cggtgacccg ctggaaggtg cagcactgac cttacgtagt 1140

gtgcagtttg cagaaaccga cctgagcttc gattgcctga cccgtatgcc gggtgccagc 1200

accgtggcgc agctgtacga tgcaacgcgt ggctggggct tagtggacca caatttagtg 1260

gcaggcgatg ttgcaggcag tatcggccat ctggtgcgtg cgcgcgtgcc aagccgtccg 1320

cgcgaaaatg gctggctgcc agtgccaggt tggagcggtg agcatgagtg gcgtggttgg 1380

attccacatg aagccatgcc gcgtgtgatt gacccaccag gtggtctgat cgttacggcg 1440

aataaccgtg tggttgccga cgaccacccg gattatctgt gtacggattg ccatccaccg 1500

taccgtgcgg aacgtattat ggaacgcctg gttgcgagtc cggcctttgc cgttgatgat 1560

gcagccgcga ttcatgcaga caccttaagc ccgcacgttg gtctgctgcg tgcccgttta 1620

gaagcgctgg gcatccaggg tagtctgcca gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg 1680

tgggatggtc gtatggatgc gggtagccaa gcagcaagcg catacaatgc gtttcgtcgt 1740

gcattaacgc gtctggttac cgcgcgtagc ggcctggaac aagccattgc gcacccgttt 1800

gccgccgtgc caccgggcgt tagtccgcaa ggccaagtgt ggtgggcagt tccaacgtta 1860

ttacgcaatg acgacgcagg tatgttaaag ggctggagct gggatgaagc gttaagcgaa 1920

gccctgagtg ttgcgacgca aaacttaacg ggtcgcggtt ggggcgagga acatcgtcca 1980

cgctttaccc atccgctgag cgcccagttt ccggcgtggg ccgcactgct gaacccggtt 2040

agtcgcccaa tcggcggtga tggcgatacc gttctggcga atggtttagt tccgagcgcc 2100

ggtccagagg ccacctatgg tgcgctgtgc cgttatgtgt ttgatgtggg taattgggat 2160

aatagccgtt gggtggtgtt tcatggcgcg agcggtcatc cggcgagccc acactatgcg 2220

gaccagaatg cgccgtggag tgattgtgcg atggttccaa tgctgtatag ttgggatcgt 2280

attgcggcgg aggcagtttc gagtcaagaa ttagtgccgg cgtga 2325

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

gaagggttca gggggttccg gtatgacgat ggcggcgaaa accgatcg 48

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

cgcctccgct gccaccactc cccgccggca ctaattcttg actcgaaact gcc 53

<210> 18

<211> 2817

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgggagccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggttc agggggttcc 120

ggtatgacga tggcggcgaa aaccgatcgt gaagcactgc aggcggcact gccaccgtta 180

agcggtagtc tgagcatccc gggtctgagt gcaccggttc gtgtgcaacg tgacggttgg 240

ggtattccgc acatcaaagc aagcggtgag gcagacgcgt atcgcgcatt aggcttcgtt 300

catgcgcaag atcgtctgtt tcaaatggag ttaacgcgtc gtaaagcctt aggtcgtgcg 360

gccgagtggt taggcgccga agccgcggaa gcagacattt tagttcgtcg cttaggcatg 420

gaaaaagtgt gtcgccgcga ttttgaagcg ctgggcgcag aggcgaagga tatgttacgt 480

gcctatgcag ccggtgtgaa cgcattttta gcgagcggtg cgccattacc gattgaatat 540

agcttattag gtgccgaacc agagccgtgg gaaccatggc atagcatcgc cgtgatgcgc 600

cgtctgggcc tgctgatggg cagtgtgtgg ttcaagctgt ggcgcatgct ggcgttaccg 660

gtggttggcg cagcaaatgc gctgaaactg cgttacgatg acggcggtca agatctgtta 720

tgcattccgc caggcgtgga agcggagcgt ctggaggccg acttagcggc attacgtcca 780

gccgttgatg cattactgaa agcgatgggc ggtgatgcca gcgacgcagc aggtggtggt 840

agcaataact gggccgtggc accaggtcgt accgccacgg gtcgtccgat tctggcgggt 900

gacccgcatc gtgtgtttga aattccgggt atgtatgccc agcatcatct ggcgtgtgat 960

cgttttgata tgattggtct gacggtgcca ggtgttccgg gcttcccgca caatgcccat 1020

aatggcaaag tggcgtactg tgtgacgcat gcatttatgg atacccatga tctgtatctg 1080

gaacagtttg cggaagatgg tcgcacggcg cgttttggta atgaatttga gccggttgcg 1140

tggcgtcgtg accgtattgc agttcgcggt ggtgcggacc gcgaattcga tattgtggaa 1200

acccgtcatg gcccagtgat cgccggtgac ccgctggaag gtgcagcact gaccttacgt 1260

agtgtgcagt ttgcagaaac cgacctgagc ttcgattgcc tgacccgtat gccgggtgcc 1320

agcaccgtgg cgcagctgta cgatgcaacg cgtggctggg gcttagtgga ccacaattta 1380

gtggcaggcg atgttgcagg cagtatcggc catctggtgc gtgcgcgcgt gccaagccgt 1440

ccgcgcgaaa atggctggct gccagtgcca ggttggagcg gtgagcatga gtggcgtggt 1500

tggattccac atgaagccat gccgcgtgtg attgacccac caggtggtct gatcgttacg 1560

gcgaataacc gtgtggttgc cgacgaccac ccggattatc tgtgtacgga ttgccatcca 1620

ccgtaccgtg cggaacgtat tatggaacgc ctggttgcga gtccggcctt tgccgttgat 1680

gatgcagccg cgattcatgc agacacctta agcccgcacg ttggtctgct gcgtgcccgt 1740

ttagaagcgc tgggcatcca gggtagtctg ccagcggaag aactgcgtca gaccctgatc 1800

gcgtgggatg gtcgtatgga tgcgggtagc caagcagcaa gcgcatacaa tgcgtttcgt 1860

cgtgcattaa cgcgtctggt taccgcgcgt agcggcctgg aacaagccat tgcgcacccg 1920

tttgccgccg tgccaccggg cgttagtccg caaggccaag tgtggtgggc agttccaacg 1980

ttattacgca atgacgacgc aggtatgtta aagggctgga gctgggatga agcgttaagc 2040

gaagccctga gtgttgcgac gcaaaactta acgggtcgcg gttggggcga ggaacatcgt 2100

ccacgcttta cccatccgct gagcgcccag tttccggcgt gggccgcact gctgaacccg 2160

gttagtcgcc caatcggcgg tgatggcgat accgttctgg cgaatggttt agttccgagc 2220

gccggtccag aggccaccta tggtgcgctg tgccgttatg tgtttgatgt gggtaattgg 2280

gataatagcc gttgggtggt gtttcatggc gcgagcggtc atccggcgag cccacactat 2340

gcggaccaga atgcgccgtg gagtgattgt gcgatggttc caatgctgta tagttgggat 2400

cgtattgcgg cggaggcagt ttcgagtcaa gaattagtgc cggcggggag tggtggcagc 2460

ggaggcgcca tggttgatac cttatcaggt ttatcaagtg agcaaggtca gtccggtgat 2520

atgacaattg aagaagatag tgctacccat attaaattct caaaacgtga tgaggacggc 2580

aaagagttag ctggtgcaac tatggagttg cgtgattcat ctggtaaaac tattagtaca 2640

tggatttcag atggacaagt gaaagatttc tacctgtatc caggaaaata tacatttgtc 2700

gaaaccgcag caccagacgg ttatgaggta gcaactgcta ttacctttac agttaatgag 2760

caaggtcagg ttactgtaaa tggcaaagca actaaaggtg acgctcatat ttaatga 2817

Claims

1.用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶，其中，所述L-β-羟基-α-氨基酸合成酶具有SEQ No.1或SEQ No.2的氨基酸序列，或者具有在SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列基础上进行1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L-β-羟基-α-氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶，具有SEQID No.5或SEQ ID No.9的氨基酸序列，或者具有在SEQ ID No.5或SEQ ID No.9所示的氨基酸序列基础上进行1-10个或1-5个或1-3个氨基酸残基替换、增加或缺失但具有L-β-羟基-α-氨基酸合成酶活性的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的用SpyTag/SpyCatcher环化的L-β-羟基-α-氨基酸合成酶在制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸中的用途。

4.权利要求3所述的用途，其中，制备L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸和/或L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸的方法如下：

(d)固液分离得到沉淀析出的L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸；和

(e)任选地，将步骤(d)产生的液相用于步骤(a)的反应。

5.权利要求4所述的用途，其中，所述助溶剂选自以下物质：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2,2-二甲基丙醇、乙二醇、丙三醇、巯基乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯醚、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙醇胺、乙二醇二甲醚、甲基叔丁基醚、四丁基溴化铵、三乙胺、咪唑、吡啶、二甲基四氢呋喃、十二烷基磺酸钠、3-吗啉丙磺酸、β-环糊精和亚硫酸氢钠；更优选选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇和丙酮。

6.权利要求5所述的用途，其中，助溶剂在水溶液体系中的体积浓度为5-60％，例如10-50％，或20-40％。

7.权利要求4-6任一项所述的用途，其中，步骤(a)的反应温度在4-50℃之间，例如10-30℃之间，15-28℃之间；和/或，步骤(c)的降温温度在-5℃至25℃之间，例如0-10℃之间，0-4℃之间。

8.权利要求4-6任一项所述的用途，其中，在步骤(a)中加入5-磷酸吡哆醛。

9.权利要求4-6任一项所述的用途，其中，在步骤(a)的反应期间加入L-赤式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，优选在搅拌下加入；和/或在步骤(c)的降温期间加入L-苏式-对甲砜基苯丝氨酸晶种，优选在搅拌下加入。