CN110832302B - 用于计数和/或表征细胞的测量试管 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于计数和/或表征细胞的测量试管(1)，所述测量试管(1)包括基部(11)和从基部(11)延伸以与基部一起形成光学测量室(13)的透明侧向外壳(12)；所述基部(11)具有直径为30至100μm的通孔(111)以便细胞通过，其特征在于，所述基部(11)和所述透明侧向外壳(12)形成既适合阻抗测量又适合光学测量的一件式试管(1)。本发明还涉及用于表征细胞的系统，包括所述测量试管(1)。

Description

用于计数和/或表征细胞的测量试管

技术领域

本发明涉及流式细胞术的技术领域，特别是例如测量试管(cuvette)和这种测量试管的支撑件的流式细胞术配件。

背景技术

如今，流式细胞术使得确定细胞特征和属性，如细胞大小、细胞内容物、DNA含量等成为可能。它还使研究这些特征在细胞群内的变化和分布成为可能，最终导致细胞间亚群的识别，例如组成血液的各种细胞的分化。

而且，流式细胞术是一种快速方法。通常，每分钟有几千个细胞被表征。因此，它能够实现罕见细胞亚群的计数和表征。这些亚群的罕见性通常使它们不能通过显微镜观察和表征，特别是由于无法对这些亚群获得在统计学上可接受的大量测量数据。

此外，由于近年来光学传感器的改善，尤其是它们检测强度越来越低的信号的能力的改善，可以一方面通过阻抗测量，另一方面通过光学测量既测量细胞的体积又获取关于细胞内容物的信息。

流式细胞术本质上包括使得细胞单独地在相对于细胞大小的大横截面液流中通过。这种液流的末端是喷嘴，喷嘴具有孔，孔的大小被设置成防止两个或多个细胞同时通过或随时间推移过密通过。液流和孔之间的流量不变，细胞的速度随着液流的直径减小在喷嘴的出口增加，细胞在具有喷嘴直径的液体射流中达到每秒几千级别的速度。

细胞体积的测量通过测量喷嘴孔两侧的阻抗来实现。事实上，细胞的体积与细胞在导电介质(库特系统)中通过所引起的阻抗变化有关，细胞被认为是电绝缘的。体积被绝对地确定，不管细胞的形状如何。

此外，细胞通过喷嘴孔提供了细胞一定程度的流体动力对中，还有它们的取向。因此，有可能准确地定位从喷嘴流出并将细胞包含于激发源发射的光束中的射流。当细胞穿过光束时，它使一定数量的光信号扩散，这些光信号适于由细胞计使用以确定细胞的属性。这些光信号包括:

-光在细胞上的反射，由于液体和细胞之间的指数不同，而且细胞的不同组成部分之间的指数也不同，由入射光线的一部分的反射表示；

-光在细胞上的折射，由进入细胞的光线的偏移表示；和

-光在细胞上的衍射，基本上在范围从几度到360度的立体角下。

所有这些信号都由光学收集系统收集，然后根据它们的波长(20到50nm或30到40nm之间的中-高宽度)由光学过滤器的系统分离，最后到达各种光传感器。这些各种传感器可能适用于：

-测量细胞的前向散射；

-测量细胞的侧向散射；

-测量细胞的吸光度；和

-测量细胞的荧光。

前向散射是由于到达细胞膜的表面上的一部分入射光由细胞膜表面的散射。该部分散射光与入射光的波长相同。它沿着入射光的轴线感测。它提供关于细胞的大小和平均折射率的信息。

侧向散射是由于经过细胞膜的入射光部分由细胞内细胞器在所有空间方向上的散射。它可以被光电倍增管或雪崩光电二极管感测。它利用了折射和反射属性，提供关于细胞内容物的精细异质性的信息。

吸光度需要稳定的激发源。它与细胞的直径和细胞内细胞器的吸收指数成正比。

当细胞被一个或多个荧光色标记时，荧光色在其激发过程中在所有空间方向上发出一个或多个波长大于激发源的荧光。干涉过滤器能够将各种荧光波长分离(通常分为20至50nm或30至40nm的中-高宽光谱)，并将其分别送入光电倍增管。所测得的荧光强度取决于与细胞结合的荧光分子的数量。例如，在使用DRACQ 5标记物(它是一种被动穿过细胞的细胞质膜并特别与DNA结合的荧光色)的情况下，可以提取关于核细胞的信息。该DRACQ 5标记物在622nm和676nm处有两个吸收高峰，并在240nm和314nm处在紫外范围中具有另外两个吸收高峰。它发出红光范围的荧光，波长在665～800nm之间。通常使用的过滤器是二色型过滤器，它在入射光束的90°处反射所有低于650nm的光谱成分，并传输大于650nm的光谱成分。根据光源的定义，第一过滤器自然地以光源的波长为中心，带宽约为50nm。因此，在这个设置中，可以为每个粒子测量三个物理量：代表粒子体积的电测量，与细胞的折射率相关的消光测量，最后是与分析细胞的核酸含量相关的荧光测量。

流式细胞术有利地用于血液学研究，能够实现各种病毒、感染和寄生虫的诊断和治疗监控以及健康细胞的功能研究。通过流式细胞术，可以对不同类型的血细胞进行计数和表征。

例如，应用于白细胞的流式细胞术可以确定它们的总数，并根据它们的形态进行区分，通过细胞体积的阻抗测量和吸光度测量将它们分为三种不同的类型。

第一种是大型的单核细胞(直径20到40μm)。它们的核形状可为圆形、椭圆形、肾形或完全不规则的；最常见的情况是肾形。它们的染色质密度低、无块状、结构规则。单核细胞在血液中的停留时间为其组织通过前2天，髓质过境时间为1～2天。当它们被激活时，它们变成巨噬细胞。它们能够吞噬细菌、整个细胞以及各种所谓的污染物颗粒，例如灰尘。

第二种是在免疫系统中起主要作用的淋巴细胞。它们可以分为不同大小的两组:

-小型淋巴细胞(直径7-9μm)，其核为圆形或椭圆形，有时为肾形，具有非广泛的、轻度或稍微嗜碱性细胞质，一般在核的单侧上延伸；和

-大型淋巴细胞(直径9到15μm)，具有中心或稍微偏离中心的核，具有比小型淋巴细胞更加广泛的细胞质并完全围绕核。

第三种是粒细胞，也称为多核细胞，其主要功能是防止感染，可分为三个子类。

首先，中性粒细胞是最丰富的粒细胞(约96％)。它们是圆形并具有12到14μm的直径。它们的特征是细胞核的多叶形状(3至5个叶)。它们在其组织通过前在血液中具有2天的停留时间和10至14天的粒状前体的髓质过境时间。中性粒细胞存在髓质储备室。它们对于杀死细菌非常有效，在急性炎症中占主导地位。它们的主要作用是使身体抵御外来微生物，如细菌和酵母。它们的排泄功能促进局部炎症组织反应，并有助于防御。

其次，嗜碱性细胞非常少，仅占白细胞的0.5％。它们的直径为10到14μm。它们的双叶核被相对较多并遍布整个细胞的特殊颗粒所掩盖。它们在血液中的停留时间为12至24小时，没有已知的组织通路。髓质过境时间与中性粒细胞相同。嗜碱性细胞的重要功能是吸引嗜酸性细胞。

最后，嗜酸性粒细胞约占循环中的白细胞的2-5％(大约每立方毫米350个元素)。这些细胞的直径从12到14μm，特征是二裂片核，最重要的特征是球形的粒外观(直径0.5-1.5μm)。它们含有嗜苯胺蓝颗粒。嗜酸性多核细胞是过敏性炎症和抗寄生虫防御的关键细胞。它们分布在所有的组织上，循环部分仅占总嗜酸性粒细胞数量的1％。它们在血液中的过境时间是在离开骨髓后3至8小时，直到它们在组织(特别是肠、肺、皮肤和子宫)中沉积，在那里它们将具有大约为10天的寿命。

在另一个例子中，可以确定红细胞和血小板的总数，根据它们的形态对它们进行区分，并通过细胞体积的阻抗测量和吸光度测量对它们进行分类。

由于对不同类型的血细胞，如网状细胞、成红细胞、未成熟细胞和白细胞前体细胞、活化的淋巴细胞或仍然交联的血小板的表征和/或计数，流式细胞术的进一步应用显示出明显的诊断兴趣。

细胞体积的阻抗测量使用包括试管的设备，试管的基部具有孔，其大约50μm的直径使细胞能够在液流中单独通过。在孔上游，液流由包括待表征细胞的样品射流和环绕样品射流的鞘射流(通常为盐水)形成，从而使样品射流能够水力聚焦。电压表的端子与电极电连接，其中一个电极位于孔的上游，另一个位于孔的下游，需要o形环来确保这些水平处的紧密性。在细胞通过时观察到的电压变化代表了它的体积。

试管的基部通常由直径几毫米、厚度几微米、由宝石如非常昂贵的人造红宝石制成的盘制造。在这个盘中加工出通孔，然后在喷嘴的末端上对盘进行手工折边。折边操作并非没有风险，因为微裂纹可能会出现，由此产生正电极和负电极之间电阻率的修改，从而扭曲阻抗测量。

至于光学测量，后者使用另一设备，其包括由平基部和压靠基部的透明外壳形成的试管，平基部在其中心具有孔，其80μm的直径使细胞能够在液流中单独通过。在外壳和基部之间，密封件保证了这两个部分之间的紧密性。在外壳的下部处在基部附近中的二次鞘输入使用于使样品流入鞘的鞘射流能够到达以便在样品流与激发源发出的光束相交处的400μm的长度上伴随它。需要第二密封件来确保试管上部的密封性。

为了同时进行体积测量和光学测量，可以将两个设备组合成单个设备，使用体积测量设备的基部作为光学测量设备的基部。然而，这种布置需要使用四个密封件。而且，不能保证各个元件之间没有泄漏。

发明内容

本发明的一个目的是弥补现有技术的至少一个缺陷。

为此，本发明提供用于计数和/表征细胞、特别是血细胞的测量试管，测量试管包括基部和从基部延伸以与基部一起形成光学测量室的透明侧向外壳；基部具有直径为30至100μm的通孔以便细胞通过，其特征在于，基部和透明侧向外壳形成既适合阻抗测量又适合光学测量的一件式试管。

通过该一件式测量试管，可以不需要用于细胞体积测量和光学测量的测量试管之前所需的4个密封件中的3个。事实上，由于其一件式本质，测量试管在通孔和光学测量室之间以及在正电极和用来排放各种液体(鞘液、Lysis等)的部件之间不再需要密封件。而且，该测量试管能够在相同细胞上以几微秒的间隔进行体积阻抗测量和光学测量。

下面描述进一步可选和非限制性的特征。

基部可具有上表面，上表面是截锥的侧表面和较小半径表面的组合，通孔在基部的对应于上表面的较小半径表面的部分处穿过基部。

基部可具有下表面，下表面是截锥的侧表面和较小半径表面的组合，通孔在基部的对应于下表面的较小半径表面的部分处穿过基部。

基部在对应于较小半径表面的部分处具有在40和100μm之间的厚度。

试管还可包括流体入口，流体入口具有通往测量室的入口孔，入口孔低于通孔。

外壳可具有球形外表面，球形外表面的中心在通孔的出口处并且在通孔附近。球形外表面的中心可位于距通孔的出口200至600μm之间处。

试管还可包括位于外壳的上表面上的密封件壳体。

试管还可包括在基部下面的子基部，子基部与基部和外壳一起形成一件式试管；其中子基部具有包括V形定心元件的侧表面。

本发明还提供一种用于表征细胞、特别是血细胞的系统，包括如上面所述的测量试管和试管支撑件。试管支撑件可具有在交叉部交叉的两个凹槽并且其中横剖面轮廓为V，交叉部形成测量试管的座。

附图说明

进一步的目的、特征和优点将通过阅读参照附图以示意性而非限制性的方式在下面给出的说明变得明白，其中：

图1是根据本发明的测量试管的四分之三侧视图；

图2是沿着图1的测量试管的平面P的截面图；

图3是图2所示的通孔的放大图；

图4是沿着导致图2的测量试管的预制件的平面P的截面图；

图5是图1的测量试管在其试管支撑件上的四分之三侧视图；

图6是包括图5的测量试管和试管支撑件以及光学测量所需的各种光学器件的测量系统的四分之三侧视图；

图7是沿着图6所示的平面P并经过测量系统的光学中心的截面图；

图8是示出用于生产图1的测量试管的方法的步骤的流程图。

具体实施方式

在本发明中，空间术语是根据在其正常操作位置的测量试管来确定的。

测量试管。根据本发明的用于计数和/或表征细胞的测量试管1将在下文参照图1至图4进行描述。

测量试管1包括基部11和从基部11延伸的透明侧向外壳12，以与基部一起形成光学测量室13；基部具有直径为30到100μm的通孔111，以便细胞通过。基部11和外壳12形成既适合阻抗测量也适合光学测量的一件式试管。

通孔111有利地具有40到80μm或50到60μm的平均直径。通孔111有利地是具有圆基部的圆柱形。后一形状的优点是不会干扰测量。事实上，由于激光发射的束的高斯能量分布，用商用激光微加工得到的孔具有自然的锥形。然而，当细胞通过锥形孔时，通过特别改变脉冲宽度，锥形孔改变细胞产生的脉冲形状，有时是显著地改变。

此外，基部11还可具有上表面112，该上表面是截锥的侧表面1121和较小半径表面1122的组合，截锥优选为旋转截锥，也称为正圆锥。相应的锥顶角优选在20°到60°之间。较小的半径可在0.5至1.5mm之间，优选为约1mm。通孔111在其与上表面112的较小半径表面1122相对应的部分处延伸通过基部11。因此，基部11的上表面112穿透光学测量室13。使基部11的上表面112穿透到光学测量室13中使得测量能够在开放空间中进行，而不像其中测量在与通孔横截面相对应的密闭空间中进行的试管。在开放空间进行测量的优点是可以通过冲洗来促进测量区域的清洁。截锥的斜面使其能够适应光学孔径，同时使通孔111的出口尽可能接近激发源发出的光线的焦点(见下文)。

此外或可选地，基部11还可具有下表面113，其是截锥、优选旋转截锥的侧表面1131和较小半径表面1132的组合。相应的锥顶角优选在20°到60°之间。在这种情况下，通孔111然后在其与下表面113的较小半径表面1131相对应的部分处延伸通过基部11。因此，基部11的下表面113从截锥的较大半径的基部所代表的输入直到通孔111限定会聚室114。这样的配置使得包含细胞的样品流的鞘(sheathing)能够被计数和/或表征，并通过向较小半径表面1132侧向注入的鞘流朝着通孔111中心地指向，从而确保样品射流的精确水动力定心。这种配置被称为“水力聚焦”。

当基部11如上所述具有上表面112和下表面113时，这些都关于彼此对中，从而通孔111在下表面113上的输入和通孔111在上表面112上的离开位于它们共同的纵轴线上。

优选地，基部11在通孔111附近具有在40和100μm之间的厚度，特别是在与其上表面112和下表面113的较小半径表面1122、1132相对应的部分处。有利地，这个厚度在50到80μm之间，在55和70μm之间，或为大约60μm。

外壳12可具有内表面121，其形状为方基部正圆柱形的侧表面的形状。构成侧表面的基部的正方形的边长优选选择为在3至7mm之间，或4至6mm之间，或4.5至5.5mm之间，或优选选择为约5mm。可以选择基部的其他形状，如圆形、三角形等。优选地，基部形状为规则的几何图形，即具有至少一个对称元素，优选地为对称中心或对称轴。

另外或可选地，外壳12具有球形外表面122，其中相应球体的中心位于通孔111的出口处和通孔111附近。

球形外表面122与方基部正圆柱形内表面121的组合形成三个或四个会聚透镜123，每一个对应于内表面121的面，且其焦点是对应于球形外表面122的球体的中心。因此，测量试管1将这些透镜包含在其结构中，这通过以下方式帮助降低测量系统的总成本，即一方面免除了用户不得不一方面在测量试管和激发源之间另一方面在测量试管和传感器之间使用会聚透镜，并且免除了他们进行相应的调整。而且，该结构大大降低了测量系统的球面像差，保证了测量点处的最大功率。此外，与商业设备不同，可以在不使用透镜的情况下获得0.5量级的数值孔径。

此外，将透镜123的焦点布置在出口处并在通孔111附近能够在细胞刚从通孔111出来时对细胞进行光学测量并且样品流的对中是最优的。事实上，离通孔出口越远，细胞的位置越不确定，其相对于样品射流偏离中心的风险就越大。

因此，球形外表面122的中心优选在样品流的方向上，特别是在基部11的上表面112和下表面113对应于旋转截锥的侧表面和较小半径表面的组合时与其纵轴线平行，位于距通孔111的出口200至600μm、或300至500μm、或350至45μm、优选大约400μm处。

此外，外壳12可在其上表面124上包括用于接收密封件、优选为o形环的密封件外壳15。

测量试管11还可以包括具有通向测量室13的入口孔的流体入口16。入口孔布置得比通孔111低。该流体入口在通孔111的出口处实现样品流的第二鞘。此外，该流体入口可以通过横扫该区域防止形成再循环体积，从而防止在下游和在距通孔111的出口一距离处(此处鞘不那么有效)从样品射流流出的细胞在循环中再循环并由此妨碍在随后的细胞上进行的光学测量。此外，流体入口16和基部11的对应于截锥的侧表面1121和较小半径表面1122的组合的上表面112之间的组合的优势为将第二鞘流向通孔111的出口引导。

测量试管1可进一步包括基部11下面的子基部14。子基部14与基部11和外壳12形成一件式试管。子基部14具有洞143，其通往会聚室114。在洞的外侧1431，可设置用于接收o形环的肩部142。

洞143在其外侧1431上的直径可大于形成基部11的下表面113的截锥的基部的圆的直径，例如它可在400到700μm之间、450和650μm之间、500至600μm之间、最好是约550μm。从而，洞143的直径逐渐减小，直到它等于形成基部11的下表面113的截锥的基部的圆的直径。

此外，子基部14具有包含V形定心元件141的侧表面。这些V形定心元件141与下面描述的试管支撑件的凹槽接合。优选地，子基部的侧表面包括两个V形定心元件141，其平均平面彼此相交，优选垂直相交。有利地，子基部的侧表面包括两对V形定心元件141。同一对的两个V形定心元件的平均平面是平行的，而不同对的两个V形定心单元的平均平面彼此相交，优选垂直相交。有利地，一对V形定心元件141的平均平面与方基部正圆柱形内表面121的两个相对的面平行。

这些V形定心元件141是突出元件，其中V的尖端是面向下的，即在从外壳朝向子基部取向的方向上。优选地，V的尖端被刨平是向下的。将V的尖端刨平可以防止由于在制造测量试管1的过程中在尖端上的可能毛刺而导致测量试管1的不良定位。

有利的是，一件式试管优选具有在1.4和1.6之间的折射率。此外，塑料被优先选择，以使工作波长的传输大于90％，最好是低双折射和低热失真。

此外，一件式试管的材料有利地被选择成具有较低的吸水阻力(例如小于0.01％)。此外，材料优选在频率小于3MHz或小于1MHz时具有低的介电常数(例如最高为3F/m)，以确保通孔两侧上的电极之间具有令人满意的电绝缘性。

一件式试管的材料有利地是塑料。因此，一件式试管通过成型获得，这使得与现有技术的测量试管相比，可以大幅度降低测量试管的成本。一件式试管的材料本质上可以包括聚环烯烃树脂，特别是多于95％重量的该树脂，或多于99.5％重量的该树脂。来自的Zeonex E48R(2015)就是这种树脂的一个例子。这种树脂在熔融状态下是非常液态的，适合在非常高的压力下以非常低的管下沉注入，适合精确控制一件式试管的尺寸和光学质量的表面粗糙度。

测量系统。下面参照图5-7描述根据本发明的用于计数和/或表征细胞的测量系统。

测量系统10如上所述包括测量试管1。

此外，测量系统10包括用于接收测量试管1并在测量期间固定该测量试管1的试管支撑件2。在测量试管1具有V形定心元件141时，试管支撑件2可有利地具有在交叉部彼此交叉、优选是垂直交叉的两个凹槽21、22，其中横向剖面是与测量试管1的V形定心元件141的形状对应的V。交叉部形成测量试管1的座。两个凹槽21、22的交角对应于V形定心元件141的平均平面的交角。

此外，试管支撑件2在交叉部具有用于接收鞘射流和样品射流的孔23。当测量试管1放置在试管支撑件2上时，该孔23适用于与会聚室114流体连通。此外，测量系统10可以包括o形环3，该o形环3布置在测量试管1和试管支撑件2之间。

测量系统10还可以包括阻抗测量组件，其包括用于阻抗测量的正电极和负电极。

测量系统10还可以包括光学测量组件，其包括用于向着测量试管1发射光的激发源4。光轴A从激发源定义为由此发出的光线41的平均方向。激发源4的布置被选择为使光轴A在测量试管1就位时经过外壳12的球形外表面122的中心O。

激发源4优选为非相干源。因此，与需要激光的现有系统相比，光线41的成形更加便利，成本也更低。事实上，样品流的宽度只有几微米。直径小于样品流宽度的细胞可以位于沿该宽度的任何位置。利用低相干激发源4使得在测量点能够形成均匀照明区，测量点是外壳12的球形外表面122的中心O，包括样品流的宽度。因此，到达传感器的光信号将是相同的，不管细胞在样品流中的位置如何。

激发源4可选自：发光二极管和白炽灯泡。激发源的发射光谱集中在620-680nm之间、635-665nm之间，有利地约为650nm的波长上。

光学测量组件还可包括在光轴A上的输入成形光学器件5。这些输入成形光学器件5要布置在激发源4和测量试管1之间。成形光学器件5可以把相对于激发源41径向发出和到达第一成形光学器件5的光线41转换成与光轴A平行的光线。为此，它包括第一光学组51，充当会聚透镜。为了改善光线在外壳12的球形外表面122的中心O的聚焦，还提供作为会聚透镜的第二光学组52，以进行光线朝向外壳12的球形外表面122的中心O的第一次会聚。第二光学组52和试管1的会聚透镜123的组合可以确保在外壳12的球形外表面122的中心O处的最小球面像差和最大数值孔径。透镜123整合在测量试管1中有助于节省成本；如果没有这个透镜123，就有必要将其集成在成形光学器件中。第一光学组51，如果适用的话，还有第二光学组52优选包含在具有圆基部的大体圆柱形的套管53中，以便于在试管支撑件2的凹槽21上的高度和角度定位。

当测量试管1就位时，输入成形光学器件5还适用于在通孔111的出口附近形成十字线的图像。如适用，该十字线的图像形成于包含外壳12的球形外表面122的中心O的平面上。为此，光学测量组件进一步包括位于激发源41和输入成形光学器件5之间的矩形十字线。优选地，长宽比(长度与宽度的比)小于或等于3。例如，输入成形光学器件适于形成长度大约100μm和宽度大约30μm的矩形十字线。

优选地，输入成形光学器件5被调适为使会聚光线41形成大的立体角，例如在30°到50°之间。由于特别是通过测量试管1的基部的上表面112的截锥形状成为可能的这种大口径，可以在输出处收集最多的光。

光学测量组件可包括吸光度测量模块，其包括适用于测量细胞的吸光度的传感器和第一输出接收光学器件6，以将经过测量试管1并到达第一接收光学器件6的光线朝着传感器会聚。优选地，传感器和第一接收光学器件6在测量试管1关于激发源41的相对侧上设置光轴A上，第一接收光学器件6设置在测量试管1和传感器之间。在某些情况下，第一接收光学器件6和传感器可设置在光轴A外，在这种情况下，挡板设置在光轴A和第一接收光学器件6和测量试管1之间的光线41的路径上。传感器优选为光电二极管。

虽然不是必须的，但优选地，第一接收光学器件6具有与输入成形光学器件5相同的孔径，以便通过使系统对称来最小化成本。

光学测量组件可包括散射测量模块，其包括适用于测量细胞的侧向散射的传感器和第二输出接收光学器件7，以使由试管散射并到达第二接收光学器件7的光线41朝着传感器会聚。优选地，传感器和第二接收光学器件7设置在垂直于光轴A的轴线上，与试管支撑件平行，并在测量试管1就位时经过外壳12的球形外表面122的中心O。在某些情况下，传感器和第二接收光学器件7可设置在与光轴垂直的轴线外，在这种情况下，挡板设置在与光轴垂直的轴线上并且在测量试管1和第二接收光学器件7之间的光线41的路径上。传感器优选为雪崩光电二极管。

光学测量组件可包括荧光测量模块，荧光测量模块包括适于测量细胞的荧光的传感器和第三输出接收光学器件(未显示)，以便将试管散射并到达第三接收光学器件的光线向传感器会聚。优选地，传感器和第三接收光学器件设置在垂直于光轴的轴线上，与试管支撑件平行，并在测量试管就位时经过外壳的球形外表面的中心。在某些情况下，传感器和第三接收光学器件可设置在垂直于光轴的轴线外，在这种情况下，挡板设置在与光轴垂直的轴线上并且在试管支撑件和第三接收光学器件之间的光线的路径上。传感器优选为雪崩光电二极管。

在光学测量组件包括侧向散射测量模块和荧光测量模块的情况下，一个可以位于垂直于光轴的轴线上，另一个位于该轴线外。在这种情况下，相应的挡板是双色镜。

替代地，两个模块可以位于垂直于光轴的轴线外。在这种情况下，最靠近试管支撑件的挡板是双色镜。最远的挡板可以是半反射镜，也可以是真的镜。

替代地，还可以将双色镜添加到侧向散射测量模块中，以便在使用测量系统10的相同部件时能够测量一个或多个荧光。双色镜设置在试管支撑件和第二接收光学器件之间。此外，还可以提供双色光学过滤器来分离不同波长的光荧光信号，一般在20-50nm或30-40nm的中-高宽光谱中。在这种情况下，它们被布置在双色镜和荧光传感器之间。

在本发明中，术语“成形光学器件”和“接收光学器件”应该被理解为表示用于改变光线方向的一个透镜或一组透镜。优选地，所有成形和接收光学器件都是相同的。也就是说，它们都包括第一光学组和第二光学组，后者被布置得比第一光学组更接近测量试管1。

优选地，与成形光学器件5类似，接收光学器件6、7均具有带圆基部的圆柱形的套管，用于其在试管支撑件2上的高度和角度定位。V形定心元件可设想与试管支撑件2的相应凹槽21、22接合，这些凹槽可与用于定位测量试管1的凹槽相同。

测量试管1和/或试管支撑件2有利地适于使外壳的方基部正圆柱形内表面的面垂直于光轴。在这种情况下，当测量试管就位时，成形光学器件要么布置在光轴上，要么布置在与光轴垂直的轴线上并经过外壳的球形外表面的中心。

制造测量试管的方法。下面参照图2、图4和图8描述制造测量试管的方法。

该方法包括成型预制件，预制件的形式通常是测量试管除了基部的形式(参见图4)。值得注意的是，通孔尚未形成，第一通孔附近的基部区域的厚度尚未达到理想的薄度。附近的厚度在400和600μm之间，或在450至550μm之间，或在475和525μm之间，优选为约500μm。

该方法还包括在足够的深度上消融第一通孔附近的基部区域，以留下在40和100μm之间、在50到80μm之间、在55和70μm之间或约为60μm的厚度，消融使用超短脉冲来进行。有利地，消融第一通孔附近的基部区域使用激光进行，激光束优选指向基部的下表面。优选地，消融得到直径在0.6到1.4mm之间的消融圈。从尺寸角度看，控制该区域的厚度(即通孔附近的厚度)对于保证定性电阻率测量非常重要。实际上，通孔的厚度与细胞通过通孔时所产生的脉冲宽度直接相关。如果厚度过大且无法控制，则有多个细胞同时通过通孔并因此产生关于线性度的测量假象的风险。

然后，该方法包括用激光微加工形成通孔，例如根据WO2017/029210中描述的方法，使得可以获得用于阻抗测量的完美圆柱形孔。

该方法可选地在成型和消融步骤之间包括将预制件定位在定位工具上，从而使得在消融和形成通孔消融的过程中可以固定预制件。定位工具可特别包括在其上表面包括凹部的定位支撑件，凹部的形状与试管的形状互补。

Claims (9)

1.用于计数和/或表征细胞的测量试管(1)，所述测量试管(1)包括基部(11)和从基部(11)延伸以与基部一起形成光学测量室(13)的透明侧向外壳(12)；所述基部(11)具有直径为30至100μm的通孔(111)以便细胞通过，

其中，所述基部(11)和所述透明侧向外壳(12)形成既适合阻抗测量又适合光学测量的一件式试管(1)，

其中，所述基部(11)具有上表面(112)，所述上表面是截锥的侧表面(1121)和较小半径表面(1122)的组合，所述通孔(111)在所述基部的对应于所述上表面(112)的所述较小半径表面(1122)的部分处穿过所述基部(11)，使得所述基部(11)的上表面(112)穿透所述光学测量室(13)内侧，

其中，所述基部(11)具有下表面(113)，所述下表面是截锥的侧表面(1131)和较小半径表面(1132)的组合，所述通孔(111)在所述基部的对应于所述下表面(113)的所述较小半径表面(1132)的部分处穿过所述基部(11)。

2.根据权利要求1所述的测量试管(1)，其中，所述基部(11)在对应于所述较小半径表面(1122,1132)的所述部分处具有在40和100μm之间的厚度。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的测量试管(1)，还包括流体入口(16)，流体入口具有通往所述测量室(13)的入口孔，所述入口孔低于所述通孔(111)。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的测量试管(1)，其中，所述外壳(12)具有球形外表面(122)，球形外表面的中心位于通孔(111)的出口处并且在所述通孔(111)附近。

5.根据权利要求4所述的测量试管(1)，其中，所述球形外表面(122)的中心位于距所述通孔(111)的出口200至600μm之间处。

6.根据权利要求1至2中任一项所述的测量试管(1)，还包括位于所述外壳的上表面(124)上的密封件壳体(15)。

7.根据权利要求1至2中任一项所述的测量试管(1)，还包括位于基部(11)下面的子基部(14)，子基部(14)与基部(11)和外壳(12)一起形成所述一件式试管(1)；其中子基部(14)具有包括V形定心元件(141)的侧表面。

8.用于表征细胞的系统(10)，包括根据权利要求1至2中任一项所述的测量试管(1)和试管支撑件(2)。

9.根据权利要求8所述的系统(10)，其中，所述试管支撑件(2)具有在交叉部交叉的两个凹槽(21,22)并且其中横剖面轮廓为V，交叉部形成所述测量试管(1)的座。