BR112019028054A2 - cubeta de medição para a contagem e/ou caracterização de células - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a uma cubeta de medição (1) para a contagem e/ou caracterização de células, a cubeta de medição (1) compreendendo uma base (11) e um invólucro lateral transparente (12) que se estende a partir da base (11) de modo a formar, com a última, uma câmara de medição óptica (13); a base (11) apresentando um orifício de passagem (111) com um diâmetro de 30 a 100 µm para que as células o atravessem, caracterizado pelo fato de a base (11) e o invólucro lateral transparente (12) formarem uma cubeta de única peça (1) adequada ambos para a medição de impedância e para a medição óptica. A invenção também se refere a um sistema para a caracterização de células, compreendendo a cubeta de medição (1).

Description

CUBETA DE MEDIÇÃO PARA A CONTAGEM E/OU CARACTERIZAÇÃO DE

CÉLULAS Campo técnico

[0001] A presente invenção se refere ao campo técnico da citometria de fluxo, em particular os acessórios para citometria de fluxo, tais como cubetas de medição e suportes para as cubetas de medição. Estado da técnica

[0002] Atualmente, a citometria de fluxo permite determinar as características e as propriedades das células, por exemplo, os tamanhos, conteúdos intracelulares, conteúdos de DNA do mesmo, etc. Ela também permite estudar a variação e distribuição dessas características dentro de uma população de células, resultando, por fim, na identificação de subpopulações dentre as células, como, por exemplo, a diferenciação de várias células que compõem o sangue.

[0003] Além disso, a citometria de fluxo é um método rápido. Tipicamente, vários milhares de células são caracterizadas por minuto. Assim, permite a enumeração e caracterização de subpopulações de células raras. A raridade destas subpopulações não permite, em geral, a sua observação e caracterização por microscopia, em particular devido à impossibilidade de obtenção de um número de medições efetuadas nestas subpopulações que é estatisticamente aceitável.

[0004] Além disso, devido à melhoria dos sensores ópticos nos últimos anos e, em particular, à sua capacidade de detectar sinais de intensidade cada vez mais baixos, é possível medir o volume de uma célula e obter informações sobre o seu conteúdo celular através, por um lado, de uma medição de impedância e, por outro, de uma medição óptica.

[0005] A citometria de fluxo consiste essencialmente na passagem de células individualmente em um fluxo de líquido de grande seção transversal em relação ao tamanho das células. Este fluxo de líquido termina em um bico com um orifício dimensionado para impedir a passagem simultânea ou muito próxima, ao longo do tempo, de duas ou uma pluralidade de células. Sendo a taxa de fluxo constante entre o fluxo de líquido e o orifício, a velocidade das células aumenta à medida que o diâmetro do fluxo de líquido diminui e, na saída do bico, as células atingem velocidades da ordem de vários milhares por segundo em um jato de líquido apresentando o diâmetro do bico.

[0006] A medição do volume de células é realizada pela medição da impedância em ambos os lados do orifício do bico. De fato, o volume de uma célula está correlacionado com uma variação da impedância induzida pela passagem da célula em um meio condutor (sistema Coulter), sendo a célula considerada como sendo eletricamente isolante. O volume é determinado de forma absoluta, independentemente da forma da célula.

[0007] Além disso, a passagem das células através do orifício do bico proporciona uma determinada centralização hidrodinâmica das células e também a sua orientação. Assim, é possível posicionar com precisão o jato que sai do bico e que contém as células em um feixe de luz emitido por uma fonte de excitação. Quando uma célula atravessa o feixe de luz, ela difunde um determinado número de sinais ópticos adequados para o uso pelo citômetro, a fim de determinar as propriedades da célula. Estes sinais ópticos compreendem: - a reflexão da luz sobre a célula, devido à diferença nos índices entre o líquido e a célula, mas também entre os diferentes componentes da célula, expressos pela reflexão de uma porção de um raio de luz incidente; - a refração da luz na célula, expressa por um desvio do raio de luz que entra na célula; e - a difração da luz na célula, essencialmente sob um ângulo sólido que varia de poucos graus a um ângulo sólido de 360°.

[0008] Todos estes sinais são coletados por um sistema de coleção óptica e então separados de acordo com seu comprimento de onda (largura médio-alta entre 20 e 50 nm, ou 30 a 40 nm) por um sistema de filtros ópticos e, por fim, alcançam diversos sensores de luz. Estes diversos sensores podem ser adequados para: - a medição da dispersão frontal da célula; - a medição da dispersão lateral da célula; - a medição da absorbância da célula; e - a medição da fluorescência da célula.

[0009] A dispersão frontal é devida à dispersão de uma porção da luz incidente que chega à superfície da membrana celular por esta última. A porção de luz dispersada apresenta o mesmo comprimento de onda que a luz incidente. Ele é sentido ao longo do eixo da luz incidente. Ele fornece informações acerca do tamanho e do índice refrativo médio da célula.

[00010] A dispersão lateral é devida à dispersão em todas as direções espaciais da porção da luz incidente que atravessou a membrana celular através das organelas intracelulares. Pode ser detectada por um fotomultiplicador ou por um fotodiodo de avalanche. Ao colocar em prática as propriedades de refração e reflexão, ela fornece informações acerca da heterogeneidade fina do conteúdo celular.

[00011] A absorbância requer uma fonte de excitação estável. Ela é proporcional ao diâmetro da célula e ao índice de absorção das organelas intracelulares.

[00012] No caso em que a célula é marcada com um ou uma pluralidade de fluorocromos, os fluorocromos emitem, durante sua excitação, luz fluorescente em um ou uma pluralidade de comprimentos de onda maior do que aquela da fonte de excitação em todas as direções espaciais. Os filtros de interferência permitem a separação dos diversos comprimentos de onda fluorescentes (geralmente em espectros de largura média de 20 a 50 nm, ou 30 a 40 nm), cada um enviado a um fotomultiplicador. A intensidade da fluorescência medida depende do número de moléculas de fluorocromo ligadas à célula. Por exemplo, no caso do uso do marcador DRACQ 5 que é um fluorocromo que atravessa passivamente a membrana citoplasmática das células e se liga especificamente ao DNA, é possível extrair informações sobre as células nucleadas. O marcador DRACQ 5 apresenta dois picos de absorção a 622 nm e 676 nm e outros dois na faixa ultravioleta a 240 nm e 314 nm. Ele emite fluorescência na faixa vermelha com comprimentos de onda entre 665 nm e 800 nm. O filtro geralmente utilizado é um filtro do tipo dicroico que reflete a 90° do feixe incidente todos os componentes espectrais inferiores a 650 nm e transmite os componentes espectrais superiores a 650 nm. Dada a definição da fonte de luz, o primeiro filtro é naturalmente centralizado no comprimento de onda da fonte de luz com uma largura de banda da ordem de 50 nm. Assim, nesta configuração, é possível medir, para cada partícula, três grandezas físicas: uma medição elétrica representativa do volume da partícula, uma medição de extinção associada à refringência da célula e, finalmente, uma medição de fluorescência associada ao teor de ácido nucleico da célula analisada.

[00013] A citometria de fluxo é vantajosamente usada para estudos hematológicos que permitem a diagnose e o monitoramento terapêutico de diversos vírus, infecções e parasitas, bem como o estudo funcional de células saudáveis. Graças à citometria de fluxo, é possível contar e caracterizar os diferentes tipos de células sanguíneas.

[00014] Por exemplo, a citometria de fluxo aplicada a leucócitos torna possível garantir seu número total e diferenciá-los de acordo com sua morfologia e classificá- los em três diferentes tipos por meio de uma medição de impedância do volume celular e uma medição de absorção.

[00015] Um primeiro tipo é aquele dos monócitos, os quais são células grandes (20 a 40 µm em diâmetro). O formato do seu núcleo pode ser arredondado, oval, reniforme ou totalmente irregular; o caso mais frequente sendo o formato reniforme. Sua cromatina é baixa em densidade, não luminosa e de estrutura regular. O tempo de residência dos monócitos no sangue é de 2 dias antes da sua passagem para o tecido e o tempo de trânsito medular é de 1 a 2 dias. Quando eles são ativados, eles se tornam macrófagos. Eles são capazes de fagocitar bactérias, células inteiras bem como diversas partículas denominadas poluentes, tais como, por exemplo, poeira.

[00016] Um segundo tipo é aquele dos linfócitos, os quais atuam em um papel principal no sistema imune. Eles podem ser separados em dois grupos de diferentes tamanhos: - linfócitos de tamanho pequeno (7 a 9 µm em diâmetro), os quais apresentam um núcleo de formato arredondado ou oval, algumas vezes reniforme com um citoplasma não extensivo, leve ou ligeiramente basofílico, que se estende, em geral, para um único lado do núcleo; e - linfócitos de tamanho grande (9 a 15 µm em diâmetro) os quais apresentam um núcleo centralizado ou levemente fora do centro com um citoplasma mais extensivo do que aquele dos linfócitos de tamanho pequeno e completamente em torno do núcleo.

[00017] Um terceiro tipo, aquele dos granulócitos, também conhecidos como células poli nucleares, em que a principal função dos mesmos é a proteção contra infecções, pode ser diferenciado em três subcategorias.

[00018] Em primeiro lugar, os neutrófilos são os granulócitos mais abundantes (cerca de 96 %). Eles são de formato arredondado e apresentam um diâmetro de 12 a 14 µm. Eles são caracterizados pelo formato multilobado de seu núcleo (de 3 a 5 lobos). Eles apresentam um tempo de residência no sangue de 2 dias antes da sua passagem para o tecido e um tempo de trânsito medular de precursores granulares de 10 a 14 dias. Existe um compartimento de reserva medular de neutrófilos. Eles são muito eficazes na morte de bactérias e são predominantes durante inflamações de tipo agudo. Seu papel essencial é defender o organismo contra micro-organismos estranhos, tais como bactérias e leveduras. As suas funções excretoras promovem reações inflamatórias locais no tecido e contribuem para a sua defesa.

[00019] Em seguida, os basófilos são muito escassos e constituem cerca de apenas 0,5 % dos leucócitos. Eles apresentam um diâmetro de 10 a 14 µm. O seu núcleo bilobado é mascarado por granulações específicas as quais são relativamente numerosas e dispersas por toda a célula. O seu tempo de residência no sangue é de 12 a 24 horas, sem passagem para o tecido conhecida. O tempo de trânsito medular seria idêntico ao dos neutrófilos. Uma função importante dos basófilos é atrair os eosinófilos.

[00020] Por fim, os eosinófilos constituem cerca de 2 a 5 % dos leucócitos circulantes (350 elementos por milímetro cúbico, aproximadamente). Estas são células de 12 a 14 µm em diâmetro caracterizadas por um núcleo bilobado e, sobretudo, pelo aparecimento das granulações que são esféricas (0,5 a 1,5 µm em diâmetro). Eles contêm grânulos azurofílicos. As células poli nucleares eosinofílicas são células chave na inflamação alérgica e na defesa antiparasitária. A sua distribuição é, acima de tudo,

tissular, sendo a fração circulante apenas 1 % do número total de eosinófilos. O seu tempo de trânsito no sangue é de 3 a 8 horas após a saída da medula óssea e até a sua deposição nos tecidos (em particular nos intestinos, pulmões, pele e útero) onde terão uma vida útil de cerca de dez dias.

[00021] Em um exemplo adicional, é possível determinar o número total de eritrócitos e plaquetas, diferenciá-los de acordo com sua morfologia e classificá- los por meio de uma medição de impedância do volume celular e uma medição de absorção.

[00022] Aplicações adicionais da citometria de fluxo exibem um interesse diagnóstico óbvio devido à caracterização e / ou enumeração dos diferentes tipos de células sanguíneas, tais como reticulócitos, eritroblastos, células imaturas e células precursoras de leucócitos, linfócitos ativados ou plaquetas ainda reticuladas.

[00023] A medição de impedância do volume de uma célula utiliza um dispositivo compreendendo uma cubeta em que a base apresenta um orifício, o diâmetro de cerca de 50 µm o qual permite a passagem individual de uma célula em um fluxo de líquido. À montante do orifício, o fluxo de líquido é formado a partir de um jato de amostra compreendendo as células a serem caracterizadas e um jato de revestimento (em geral, água salina) em torno do jato de amostra, assim, permitindo a hidrofocalização do jato de amostra. Os terminais de um voltímetro são conectados eletricamente aos eletrodos, um dos quais é disposto à montante do orifício e o outro, à jusante, anéis em forma de O sendo requeridos para garantir tensão nestes níveis. A variação da voltagem observada no momento da passagem de uma célula é representativa do seu volume.

[00024] A base da cubeta é, em geral, fabricada a partir de um disco de poucos milímetros em diâmetro e poucos mícrons em espessura feita de pedras preciosas tais como rubi sintético de alto custo. O orifício de passagem é usinado neste disco, então, o disco é frisado manualmente na extremidade de um bico. A operação de frisagem não ocorre sem riscos, uma vez que micro fissuras podem surgir criando, assim, uma modificação da resistividade entre os eletrodos positivo e negativo, distorcendo, assim, a medição de impedância.

[00025] Com relação às medições ópticas, a última utiliza um dispositivo adicional compreendendo uma cubeta formada por uma base plana apresentando, em seu centro, um orifício, o diâmetro de 80 µm o qual permite a passagem individual de uma célula em um fluxo de líquido e de um invólucro transparente pressionado contra a base. Entre o invólucro e a base, uma vedação garante o ajuste entre estas duas partes. Uma entrada de revestimento secundário na parte mais baixa do invólucro na proximidade imediata da base permite a chegada de um jato de revestimento para revestir o fluxo de amostra a fim de acompanhá-lo por um comprimento de 400 µm em que o fluxo de amostra intersecta um feixe de luz emitido pela fonte de excitação. Uma segunda vedação é requerida para garantir o ajuste na parte superior da cubeta.

[00026] A fim de realizar a medição de volume e medição óptica ao mesmo tempo, é possível combinar os dois dispositivos em um único dispositivo usando a base do dispositivo de medição de volume como uma base para o dispositivo de medição óptica. No entanto, tal disposição requer o uso de quatro vedações. Além disso, a falta de vazamento entre os diversos elementos não pode ser garantida. Sumário da invenção

[00027] Um objetivo da presente invenção é remediar pelo menos um dos inconvenientes do estado da técnica.

[00028] Para este objetivo, a invenção fornece uma cubeta de medição para a enumeração e / ou caracterização de células, em particular células sanguíneas, a cubeta de medição compreendendo uma base e um invólucro lateral transparente que se estende a partir da base de modo a formar, com a mesma, uma câmara de medição óptica; a base apresentando um orifício de passagem de 30 a 100 µm em diâmetro para que as células o atravessem, caracterizado pelo fato de a base e o invólucro lateral transparente formarem uma cubeta de única peça adequada ambos para a medição de impedância e para a medição óptica.

[00029] Por meio desta cubeta de medição de única peça, é possível proceder sem três das quatro vedações anteriormente requeridas para uma cubeta de medição para ambas a medição de volume e medição óptica. De fato, devido à sua natureza de única peça, a cubeta de medição não precisa mais de vedações entre o orifício de passagem e a câmara de medição óptica e entre o eletrodo positivo e a parte que serve para a descarga dos diversos líquidos

(líquido de revestimento, Lise, etc.). Além disso, esta cubeta de medição permite uma medição de impedância de volume e medição óptica na mesma célula em intervalos de poucos microssegundos.

[00030] Características opcionais e não limitativas adicionais estão descritas aqui em seguida.

[00031] A base pode apresentar uma superfície superior a qual é a combinação de uma superfície lateral e uma superfície de raio inferior de um tronco, o orifício de passagem atravessando a base em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior da superfície superior.

[00032] A base pode apresentar uma superfície inferior a qual é a combinação de uma superfície lateral e uma superfície de raio inferior de um tronco, o orifício de passagem atravessando a base em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior da superfície inferior.

[00033] A base pode apresentar, na porção que corresponde à superfície de raio inferior, uma espessura entre 40 e 100 µm.

[00034] A cubeta pode ainda compreender uma entrada de fluido com uma abertura do orifício de entrada na câmara de medição, o orifício de entrada sendo mais baixo do que o orifício de passagem.

[00035] O invólucro pode apresentar uma superfície externa esférica, o centro do qual se encontra na saída e na proximidade do orifício de passagem. O centro da superfície externa esférica pode estar localizado entre 200 e 600 µm da saída do orifício de passagem.

[00036] A cubeta pode ainda compreender uma caixa de vedação em uma superfície superior do invólucro.

[00037] A cubeta pode ainda compreender uma sub-base sob a base, a sub-base formando, com a base e o invólucro, a cubeta de única peça; em que a sub-base apresenta uma superfície lateral compreendendo elementos de centralização em forma de V.

[00038] A presente invenção também fornece um sistema para a caracterização de células, em particular células sanguíneas, compreendendo a cubeta de medição tal como descrita acima e um suporte de cubeta.

[00039] O suporte de cubeta pode apresentar duas ranhuras que se intersectam em uma intersecção e em que o perfil transversal é um V, a intersecção formando um local para a cubeta de medição. Figuras

[00040] Objetivos, características e vantagens adicionais serão evidenciadas pela leitura da descrição a seguir dada a título ilustrativo e não limitativo, com referência aos desenhos anexos, em que:

[00041] A figura 1 é uma vista de três quartos de uma cubeta de medição de acordo com a invenção;

[00042] A figura 2 é uma vista seccional ao longo do plano P da cubeta de medição da figura 1;

[00043] A figura 3 é uma vista alargada do orifício de passagem ilustrado na figura 2;

[00044] A figura 4 é uma visão seccional ao longo do plano P de uma pré-forma que leva à cubeta de medição na figura 2;

[00045] A figura 5 é uma vista de três quartos da cubeta de medição da figura 1 em seu suporte de cubeta;

[00046] A figura 6 é uma vista de três quartos de um sistema de medição compreendendo a cubeta de medição e o suporte de cubeta da figura 5, bem como as diversas ópticas requeridas para as medições ópticas; e

[00047] A figura 7 é uma vista seccional ao longo do plano P mostrada na figura 6 e que passa através do centro óptico do sistema de medição;

[00048] A figura 8 é um fluxograma que mostra as etapas de um método de produção da cubeta de medição da figura 1. Descrição Detalhada

[00049] Ao longo da presente divulgação, os termos espaciais são determinados em relação a uma cubeta de medição em sua posição operacional normal. Cubeta de medição.

[00050] Uma cubeta de medição 1 para a enumeração e/ou caracterização de células de acordo com a presente invenção será descrita a seguir com referência às figuras 1 a 4.

[00051] A cubeta de medição 1 compreende uma base 11 e um invólucro lateral transparente 12 que se estende a partir da base 11 de modo a formar, com a mesma, uma câmara de medição óptica 13; a base apresentando um orifício de passagem 111 de 30 a 100 µm em diâmetro para que as células o atravessem. A base 11 e o invólucro 12 formam uma cubeta de única peça adequada ambos para a medição de impedância e para a medição óptica.

[00052] O orifício de passagem 111 apresenta vantajosamente um diâmetro médio de 40 a 80 µm, ou de 50 a 60 µm. O orifício de passagem 111 é vantajosamente cilíndrico com uma base circular. Este último formato apresenta a vantagem de não perturbar as medições. De fato, os orifícios obtidos por micro usinagem usando laser comercial apresentam uma conicidade natural devido ao perfil energético gaussiano do feixe emitido pelo laser. No entanto, um orifício cônico modifica, por vezes de forma considerável, a forma dos pulsos criados por uma célula quando a célula passa através do orifício cônico, modificando, em particular, a largura do pulso.

[00053] A base 11 pode, ainda, apresentar uma superfície superior 112 a qual é a combinação de uma superfície lateral 1121 e de uma superfície de raio inferior 1122 de um tronco, preferencialmente de um tronco de revolução, também conhecido como um cone circular direito. O ângulo do vértice do cone correspondente está, preferencialmente, entre 20° e 60°. O raio menor pode estar entre 0.5 e 1.5 mm, preferencialmente cerca de 1 mm. O orifício de passagem 111 se estende, então, através da base 11 em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior 1122 da superfície superior 112. Então, a superfície superior 112 da base 11 penetra a câmara de medição óptica 13. A penetração da superfície superior 112 da base 11 na câmara de medição óptica 13 permite que a medição seja realizada em um espaço aberto diferente de cubetas, nas quais as medições são feitas em um espaço confinado que corresponde à seção transversal do orifício de passagem. A realização das medições em um espaço aberto apresenta a vantagem de facilitar a limpeza da zona de medição por rinsagem. O declive do tronco permite a adaptação à abertura óptica enquanto traz a saída do orifício de passagem 111 o mais próxima possível de um ponto focal dos raios de luz emitidos por uma fonte de excitação (vide abaixo).

[00054] Adicionalmente ou alternativamente, a base 11 pode, além disso, apresentar uma superfície inferior 113 a qual é a combinação de uma superfície lateral 1131 e uma superfície de raio inferior 1132 de um tronco, preferencialmente de um tronco de revolução. O ângulo do vértice do cone correspondente é preferencialmente entre 20° e 60°. O orifício de passagem 111 neste caso, então, se estende através da base 11 em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior 1131 da superfície inferior 113. Logo, a superfície inferior 113 da base 11 define uma câmara convergente 114 a partir de uma entrada representada pela base de raio maior do tronco até o orifício de passagem 111. Tal configuração permite o revestimento de um fluxo de amostra contendo células a serem enumeradas e/ou caracterizadas e direcionadas centralmente em direção ao orifício de passagem 111 por um fluxo de revestimento injetado lateralmente em direção a superfície de raio inferior 1132 garantindo, assim, a centralização hidrodinâmica precisa do jato de amostra. Esta configuração é conhecida como “hidrofocalização”.

[00055] Quando a base 11 apresenta ambas uma superfície superior 112 e uma superfície inferior 113 tal como descritas acima, estas estão centralizadas em relação uma a outra de modo que a entrada do orifício de passagem 111 na superfície inferior 113 e a saída do orifício de passagem 111 na superfície superior 112 estejam situadas em seu eixo longitudinal comum.

[00056] Preferencialmente, a base 11 apresenta, na proximidade do orifício de passagem 111, uma espessura entre 40 e 100 µm, em particular na porção que corresponde às superfícies de raio menor 1122, 1132 da superfície superior 112 e superfície inferior 113 da mesma. Vantajosamente, esta espessura é de entre 50 e 80 µm, entre 55 e 70 µm, ou de cerca de 60 µm.

[00057] O invólucro 12 pode apresentar uma superfície interna 121, o formato da mesma é aquele da superfície lateral de um cilindro direito de base quadrada. O lado do quadrado que forma a base da superfície lateral é preferencialmente escolhido entre 3 e 7 mm, ou entre 4 e 6 mm, ou entre 4.5 e 5.5 mm, preferencialmente cerca de 5 mm. Formatos adicionais para a base podem ser escolhidos, tais como circular, triangular, etc. Preferencialmente, o formato da base é uma figura geométrica regular, isto é, apresentando pelo menos um elemento de simetria, preferencialmente um centro de simetria ou um eixo de simetria.

[00058] Adicionalmente ou alternativamente, o invólucro 12 apresenta uma superfície externa esférica 122 em que o centro da esfera correspondente está situado na saída e na proximidade do orifício de passagem 111.

[00059] A combinação de uma superfície externa esférica 122 e de uma superfície interna cilíndrica direita de base quadrada 121 forma três ou quatro lentes de convergência 123, cada uma correspondendo a uma face da superfície interna 121 e o ponto focal da mesma é o centro da esfera que corresponde à superfície externa esférica 122. Logo, a cubeta de medição 1 incorpora estas lentes em sua estrutura, a qual ajuda a diminuir o custo total do sistema de medição isentando o utilizador de ter à sua disposição lentes de convergência entre a cubeta de medição, por um lado, e as fontes de excitação e os sensores, por outro lado, e de ter que realizar os ajustes correspondentes. Além disso, tal estrutura reduz, de forma significativa, a aberração esférica do sistema de medição, garantindo força máxima no ponto de medição. Além disso, uma abertura numérica da ordem de 0.5 pode ser obtida sem utilizar lentes, diferente dos dispositivos comerciais.

[00060] Além disso, a disposição do ponto focal das lentes 123 na saída e na proximidade do orifício de passagem 111 permite as medições ópticas na célula quando ela acabou de sair do orifício de passagem 111 e a centralização do fluxo de amostra é ótima. De fato, quanto mais a célula se afasta da saída do orifício de passagem, mais incerta é a posição da célula e maior é o risco de estar fora do centro em relação ao jato da amostra.

[00061] Logo, o centro da superfície externa esférica 122 está preferencialmente localizado entre 200 e 600 µm, ou 300 e 500 µm, ou 350 e 450 µm, preferencialmente a cerca de 400 µm, a partir da saída do orifício de passagem 111 na direção do fluxo de amostra, em particular paralelo com o eixo longitudinal da superfície superior 112 e a superfície inferior 113 da base 11 quando estas correspondem às combinações de superfícies laterais e superfícies de raio menor de um tronco de revolução.

[00062] Além disso, o invólucro 12 pode compreender em uma superfície superior 124 do mesmo uma caixa de vedação 15 para receber uma vedação, preferencialmente um anel em forma de O.

[00063] A cubeta de medição 11 pode ainda compreender uma entrada de fluido 16 apresentando uma abertura do orifício de entrada na câmara de medição 13. O orifício de entrada está disposto mais baixo do que o orifício de passagem 111. Esta entrada de fluido permite um segundo revestimento do fluxo de amostra na saída do orifício de passagem 111. Além disso, esta entrada de fluido torna possível evitar a formação do volume de recirculação ao varrer a área, impedindo que uma célula saia do jato de amostra à jusante e a uma distância da saída do orifício de passagem 111 no qual o revestimento é menos eficaz, recirculando em um ciclo e, assim, impedindo as medições ópticas feitas nas células subsequentes. Além disso, a combinação entre a entrada de fluido 16 e uma superfície superior 112 da base 11 correspondente à combinação da superfície lateral 1121 e superfície de raio inferior 1122 de um tronco apresenta a vantagem de guiar o segundo fluido de revestimento em direção à saída do orifício de passagem 111.

[00064] A cubeta de medição 1 pode ainda compreender uma sub-base 14 sob a base 11. A sub-base 14 forma, com a base 11 e o invólucro 12, a cubeta de única peça. A sub- base 14 apresenta um orifício 143 o qual abre para a câmara de convergência 114. Pelo lado externo 1431 do orifício, um ombro 142 pode ser fornecido para receber um anel em forma de O.

[00065] O diâmetro do orifício 143 em seu lado externo 1431 pode ser maior do que o diâmetro do círculo que forma a base do tronco da superfície inferior 113 da base 11, por exemplo, ele pode estar entre 400 e 700 µm, entre 450 e 650 µm, entre 500 e 600 µm, preferencialmente cerca de 550 µm. O diâmetro do orifício 143 diminui, então, progressivamente até que ele se iguale àquele do círculo que forma a base do tronco da superfície inferior 113 da base 11.

[00066] Além disso, a sub-base 14 apresenta uma superfície lateral compreendendo elementos de centralização em forma de V 141. Estes elementos de centralização em forma de V 141 encaixam com ranhuras de um suporte de cubeta aqui descritos a seguir. Preferencialmente, a superfície lateral da sub-base compreende dois elementos de centralização em forma de V 141 os planos médios em que intersectam um ao outro, preferencialmente de forma perpendicular. Vantajosamente, a superfície lateral da sub- base compreende dois pares de elementos de centralização em forma de V 141. Os planos médios de dois elementos de centralização em forma de V do mesmo par estão paralelos enquanto os planos médios dos dois elementos de centralização em forma de V de diferentes pares intersectam um ao outro, preferencialmente de forma perpendicular. Vantajosamente, os planos médios de um par de elementos de centralização em forma de V 141 estão paralelos com duas faces opostas da superfície interna cilíndrica direita de base quadrada 121.

[00067] Estes elementos de centralização em forma de V 141 são elementos de protrusão nos quais a ponta do V está virada para baixo, isto é, na direção orientada a partir do invólucro em direção à sub-base. Preferencialmente, a ponta do V está aplainada para baixo. O aplainamento da ponta do V para baixo torna possível evitar o posicionamento ruim da cubeta de medição 1 devido à rebarba potencial na ponta durante a fabricação da cubeta de medição 1.

[00068] Vantajosamente, a cubeta de única peça preferencialmente apresenta um índice de refração entre 1.4 e 1.6. Além disso, o plástico é preferencialmente escolhido de modo a apresentar uma transmissão do comprimento de onda operacional maior do que 90 %, preferencialmente de baixa birrefringência e de baixa distorção térmica.

[00069] Além disso, o material da cubeta de única peça é vantajosamente escolhido de modo a apresentar uma baixa resistência de absorção de água (por exemplo, menor do que 0.01 %). Além disso, o material preferencialmente apresenta uma baixa constante dielétrica (por exemplo, no máximo 3 F/m) em frequências menores do que 3 MHz, ou menor do que 1 MHz, a fim de garantir isolamento elétrico satisfatório entre os eletrodos em cada lado do orifício de passagem.

[00070] O material da cubeta de única peça é vantajosamente plástico. Logo, a cubeta de única peça é obtida por moldagem, tornando possível reduzir drasticamente o custo da cubeta de medição em comparação com as cubetas de medição do estado da técnica. O material da cubeta de única peça pode compreender essencialmente uma resina poli ciclo olefina, em particular, mais do que 95 % em peso desta resina, ou mais do que 99.5 % em peso desta resina. Um exemplo de tal resina é Zeonex E48R (2015) de Zeon®. Tal resina é muito líquida em forma fundida para ser injetada em uma pressão muito alta, com um afundamento muito baixo dos tubos, e adequada para o controle preciso das dimensões da cubeta de única peça e uma rugosidade superficial de qualidade óptica. Sistema de medição.

[00071] Um sistema de medição para a enumeração e/ou caracterização de células de acordo com a invenção é descrito aqui em seguida com referência às figuras 5 a 7.

[00072] O sistema de medição 10 compreende o tanque de medição 1 tal como descrito acima.

[00073] Além disso, o sistema de medição 10 compreende um suporte de cubeta 2 para receber a cubeta de medição 1 e assegurar a mesma durante as medições. O suporte de cubeta 2 pode, vantajosamente, apresentar, quando a cubeta de medição 1 apresenta elementos de centralização em forma de V 141, duas ranhuras 21, 22 que intersectam uma a outra, preferencialmente de forma perpendicular, em uma intersecção e em que o perfil transversal é um V que corresponde a forma dos elementos de centralização em forma de V 141 da cubeta de medição 1. A intersecção forma um local para a cubeta de medição 1. O ângulo de intersecção entre as duas ranhuras 21, 22 corresponde ao ângulo de intersecção dos planos médios dos elementos de centralização em forma de V 141.

[00074] Além disso, o suporte de cubeta 2 apresenta na intersecção um orifício 23 para receber o jato de revestimento e o jato de amostra. Este orifício 23 é adequado para estar em comunicação fluídica com a câmara de convergência 114 quando a cubeta de medição 1 está posicionada no suporte de cubeta 2. Além disso, o sistema de medição 10 pode compreender um anel em forma de O 3 para estar disposto entre a cubeta de medição 1 e o suporte de cubeta 2.

[00075] O sistema de medição 10 pode ainda compreender um conjunto de medição de impedância incluindo um eletrodo positivo e um eletrodo negativo para a medição de impedância.

[00076] O sistema de medição 10 pode ainda compreender um conjunto de medição óptica incluindo uma fonte de excitação 4 para a emissão de luz em direção a cubeta de medição 1. Um eixo óptico A é definido a partir da fonte de excitação 4 como a direção média dos raios de luz 41 emitidos pelo mesmo. A disposição da fonte de excitação 4 é escolhida de modo que o eixo óptico A passa através do centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12 quando a cubeta de medição 1 está posicionada.

[00077] A fonte de excitação 4 é preferencialmente uma fonte incoerente. Logo, o formato dos raios de luz 41 é facilitado e por menor custo se comparado com sistemas que requerem lasers anteriores. De fato, o fluxo de amostra apresenta uma largura de poucos micrômetros. A célula de diâmetro menor do que a largura do fluxo de amostra pode estar situada em qualquer lugar ao longo deste comprimento. O uso de uma fonte de excitação de baixa coerência 4 permite a formação de uma zona homogeneamente iluminada no ponto de medição, o qual é o centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12, compreendendo a largura do fluxo de amostra. Logo, o sinal óptico que chega ao sensor será o mesmo independente da posição da célula no fluxo de amostra.

[00078] A fonte de excitação 4 pode ser escolhida a partir de: um diodo de emissão de luz e bulbo incandescente. A fonte de excitação apresenta um espectro de emissão centralizado em um comprimento de onda entre 620 e 680 nm, 635 e 665 nm, vantajosamente de cerca de 650 nm.

[00079] O conjunto de medição óptica pode ainda compreender óptica de moldagem de entrada 5 no eixo óptico A. Estas ópticas de moldagem de entrada 5 deve estar disposta entre a fonte de excitação 4 e a cubeta de medição

1. As ópticas de moldagem 5 torna possível converter os raios de luz 41 emitidos radialmente em relação à fonte de excitação 4 e chegar à primeiras ópticas de moldagem 5 nos raios de luz paralelos com o eixo óptico A. Para isto, ela compreende um primeiro grupo óptico 51 que atua como uma lente de convergência. A fim de melhorar o foco dos raios de luz no centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12, um segundo grupo óptico 52 que atua como uma lente de convergência pode também ser fornecido a fim de realizar uma primeira convergência dos raios de luz em direção ao centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12. A combinação do segundo grupo óptico 52 e as lentes de convergência 123 da cubeta 1 tornam possível garantir ambos uma aberração esférica mínima no centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12, potência máxima neste ponto O e uma abertura numérica máxima. A integração da lente 123 na cubeta de medição 1 ajuda a poupar nos custos; sem esta lente123, seria necessário integrar a mesma nas ópticas de moldagem. O primeiro grupo óptico 51 e, se aplicável também o segundo grupo óptico 52, está preferencialmente contido em um invólucro 53 de formato cilíndrico geral com uma base circular para altura e posicionamento angular facilitado na ranhura 21 do suporte de cubeta 2.

[00080] As ópticas de moldagem de entrada 5 é também adequada para a formação da imagem de um retículo na proximidade da saída do orifício de passagem 111 quando a cubeta de medição 1 está posicionada. Se aplicável, a imagem do retículo é formada em um plano compreendendo o centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12. Para este objetivo, o conjunto de medição óptica ainda compreende um retículo retangular entre a fonte de excitação 41 e as ópticas de moldagem de entrada 5. Preferencialmente, o fator aspecto (relação do comprimento sobre a largura) é inferior ou igual a 3. As ópticas de moldagem de entrada é adequada, por exemplo, para a formação de um retículo retangular de cerca de 100 µm em comprimento e aproximadamente 30 µm em largura.

[00081] Preferencialmente, as ópticas de moldagem de entrada 5 está adaptada de modo que os raios de luz convergentes 41 formam um grande ângulo sólido, por exemplo entre 30° e 50°. Graças a esta grande abertura, em particular pelo formato de tronco da superfície superior 112 da base da cubeta de medição 1, é possível coletar o máximo de luz na saída.

[00082] O conjunto de medição óptica pode compreender um módulo de medição de absorbância incluindo um sensor adequado para a medição da absorbância da célula e primeira óptica de recepção de saída 6 de modo a convergir os raios de luz que passam através da cubeta de medição 1 e chegar à primeira óptica de recepção 6 em direção ao sensor. Preferencialmente, o sensor e a primeira óptica de recepção 6 estão dispostos no eixo óptico A do lado oposto da fonte de excitação 41 em relação à cubeta de medição 1, a primeira óptica de recepção 6 deve estar disposta entre a cubeta de medição 1 e o sensor. Em alguns casos, o sensor e a primeira óptica de recepção 6 podem estar dispostos do lado de fora do eixo óptico A, no qual um defletor está disposto no eixo óptico A e no caminho dos raios de luz 41 entre a cubeta de medição 1 e a primeira óptica de recepção 6. O sensor é preferencialmente um fotodiodo.

[00083] Embora não seja necessário, preferencialmente, a primeira óptica de recepção 6 apresenta a mesma abertura das ópticas de moldagem de entrada 5 a fim de minimizar os custos através da simetria do sistema.

[00084] O conjunto de medição óptica pode compreender um módulo de medida de dispersão incluindo um sensor adequado para a medição da dispersão lateral da célula e segunda óptica de recepção de saída 7 a fim de convergir os raios de luz 41 dispersos pela cubeta e chegar à segunda óptica de recepção 7, em direção ao sensor. Preferencialmente, o sensor e a segunda óptica de recepção 7 estão dispostos em um eixo perpendicular ao eixo óptico A, paralelo com o suporte de cubeta e que passa através do centro O da superfície externa esférica 122 do invólucro 12 quando a cubeta de medição 1 está posicionada. Em alguns casos, o sensor e a segunda óptica de recepção 7 pode estar disposta do lado de fora do eixo perpendicular ao eixo óptico, no qual um defletor está disposto no eixo perpendicular para o eixo óptico A e no caminho dos raios de luz 41 entre a cubeta de medição 1 e a segunda óptica de recepção 7. O sensor é preferencialmente um fotodiodo de avalanche.

[00085] O conjunto de medição óptica pode compreender um módulo de medição de fluorescência incluindo um sensor adequado para a medição da fluorescência da célula e terceira óptica de recepção de saída (não mostrada) a fim de convergir os raios de luz dispersos pela cubeta e chegar à terceira óptica de recepção, em direção ao sensor. Preferencialmente, o sensor e a terceira óptica de recepção estão dispostos em um eixo perpendicular ao eixo óptico, paralelo com o suporte de cubeta e que passa através do centro da superfície externa esférica do invólucro quando a cubeta de medição está posicionada. Em alguns casos, o sensor e a terceira óptica de recepção podem estar dispostos para fora do eixo perpendicular para o eixo óptico, no qual um defletor está disposto no eixo perpendicular ao eixo óptico e no caminho dos raios de luz entre o suporte de cubeta e a terceira óptica de recepção. O sensor é preferencialmente um fotodiodo de avalanche.

[00086] No caso em que o conjunto de medição óptica compreende tanto um módulo de medição de dispersão lateral como um módulo de medição de fluorescência, um pode estar no eixo perpendicular ao eixo óptico e o outro no exterior. Neste caso, o defletor correspondente é um espelho dicroico.

[00087] Alternativamente, os dois módulos podem estar fora do eixo perpendicular ao eixo óptico. Neste caso, o defletor mais próximo do suporte de cubeta é um espelho dicroico. O defletor mais distante pode ser um espelho semi reflexo ou um espelho verdadeiro.

[00088] Também alternativamente, um espelho dicroico pode ser adicionado ao módulo de medição de dispersão lateral para permitir a medição de uma ou uma pluralidade de fluorescências enquanto usa os mesmos componentes do sistema de medição 10. O espelho dicroico está disposto entre o suporte de cubeta e a segunda óptica de recepção. Além disso, podem ser fornecidos filtros ópticos dicroicos para separar os sinais de fluorescência óptica de diferentes comprimentos de onda, geralmente em espectros de largura média-alta de 20 a 50 nm, ou 30 a 40 nm. Neste caso, eles estão dispostos entre o espelho dicroico e o sensor de fluorescência.

[00089] Ao longo da presente divulgação, os termos “óptica de moldagem” e “óptica de recepção” devem ser entendidos como denotando uma lente ou um conjunto de lentes para mudar a direção dos raios de luz. Preferencialmente, todas as ópticas de moldagem e recepção são idênticas. Ou seja, todas elas compreendem um primeiro grupo óptico e um segundo grupo óptico; este último deve ser disposto o mais próximo da cubeta de medição 1 do que o primeiro grupo óptico.

[00090] Preferencialmente, cada uma das ópticas de recepção 6, 7 apresentam um invólucro de formato cilíndrico com uma base circular, como as ópticas de moldagem 5, para a altura e posicionamento angular do mesmo no suporte de cubeta 2. Elementos de centralização em forma de V podem ser visualizados para encaixar nas ranhuras 21, 22 correspondentes do suporte de cubeta 2, as quais podem ser as mesmas utilizadas para o posicionamento da cubeta de medição 1.

[00091] A cubeta de medição 1 e/ou o suporte de cubeta 2 estão vantajosamente adaptados de modo que uma face da superfície interna cilíndrica direita de base quadrada do invólucro é normal ao eixo óptico. Neste caso, as ópticas de moldagem estão dispostas tanto no eixo óptico, ou em um eixo perpendicular do mesmo e passam através do centro da superfície externa esférica do invólucro quando a cubeta de medição está posicionada. Método para a fabricação da cubeta de medição.

[00092] Um método para a fabricação da cubeta de medição é descrito aqui em seguida, com referência às figuras 2, 4 e 8.

[00093] O método compreende a moldagem de uma pré- forma, a forma da qual é, em geral, aquela da cubeta de medição com a exceção da base (vide figura 4). Notavelmente, o orifício de passagem ainda não está formado e a espessura da zona da base próxima ao primeiro orifício de passagem ainda não alcançou a finura desejada. A espessura próxima está entre 400 e 600 µm, ou entre 450 e 550 µm, ou 475 e 525 µm, preferencialmente cerca de 500 µm.

[00094] O método também compreende a ablação da zona da base próxima ao futuro orifício de passagem sobre uma profundidade suficiente para deixar uma espessura entre 40 e 100 µm, entre 50 e 80 µm, entre 55 e 70 µm, ou cerca de 60 µm, a ablação sendo realizada usando pulsos ultracurtos. Vantajosamente, a ablação da zona da base próxima ao futuro orifício de passagem é realizada usando um laser, o feixe do qual está preferencialmente direcionado à superfície inferior da base. Preferencialmente, a ablação resulta em um círculo de ablação de diâmetro entre 0.6 e 1.4 mm. O controle da espessura desta área (a qual é a espessura próxima ao orifício de passagem) é importante a partir de um ponto de vista dimensional a fim de garantir uma medição qualitativa da resistividade. De fato, a espessura do orifício de passagem está diretamente ligada às larguras dos pulsos criados por uma célula quando a referida célula passa através do orifício de passagem. Se a espessura é excessiva e descontrolada, existe um risco de uma pluralidade de células passarem através do orifício de passagem ao mesmo tempo e, dessa forma, gerarem um artefato de medição nas linearidades.

[00095] O método, então, compreende a formação do orifício de passagem com micro usinagem a laser, por exemplo, de acordo com o método descrito no WO 2017/029210, tornando possível obter um orifício perfeitamente cilíndrico para a medição de impedância.

[00096] O método pode opcionalmente compreender o posicionamento da pré-forma em uma ferramenta de posicionamento entre as etapas de moldagem e ablação, assim, tornando possível assegurar a pré-forma durante a ablação e a formação da ablação do orifício de passagem. A ferramenta de posicionamento pode, em particular, compreender um suporte de posicionamento apresentando um recesso em sua superfície superior, a forma do qual é complementar àquela da cubeta.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Cubeta de medição (1) para a enumeração e/ou caracterização de células, em particular células sanguíneas, a cubeta de medição (1) compreendendo uma base (11) e um invólucro lateral transparente (12) que se estende a partir da base (11) de modo a formar, com a mesma, uma câmara de medição óptica (13); a base (11) apresentando um orifício de passagem (111) de 30 a 100 µm em diâmetro para que as células o atravessem, caracterizada pelo fato de a base (11) e o invólucro lateral transparente (12) formarem uma cubeta de única peça (1) adequada ambos para a medição de impedância e para a medição óptica.

2. Cubeta de medição (1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a base (11) apresentar uma superfície superior (112) a qual é a combinação de uma superfície lateral (1121) e uma superfície de raio inferior (1122) de um tronco, o orifício de passagem (111) atravessando a base (11) em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior (1122) da superfície superior (112).

3. Cubeta de medição (1), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de a base (11) apresentar uma superfície inferior (113) a qual é a combinação de uma superfície lateral (1131) e uma superfície de raio inferior (1132) de um tronco, o orifício de passagem (111) atravessando a base (11) em uma porção da mesma que corresponde à superfície de raio inferior (1132) da superfície inferior (113).

4. Cubeta de medição (1), de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de a base (11) apresentar, na porção que corresponde à superfície de raio inferior (1122, 1132), uma espessura entre 40 e 100 µm.

5. Cubeta de medição (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma entrada de fluido (16) apresentando uma abertura do orifício de entrada na câmara de medição (13), o orifício de entrada sendo mais baixo do que o orifício de passagem (111).

6. Cubeta de medição (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de o invólucro (12) apresentar uma superfície externa esférica (122), o centro do qual se encontra na saída e na proximidade do orifício de passagem (111).

7. Cubeta de medição (1), de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de o centro da superfície externa esférica (122) estar situado entre 200 e 600 µm da saída do orifício de passagem (111).

8. Cubeta de medição (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma caixa de vedação (15) em uma superfície superior (124) do invólucro.

9. Cubeta de medição (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ainda compreender uma sub-base (14) sob a base (11), a sub-base (14) formando, com a base (11) e o invólucro (12), a cubeta de única peça (1); em que a sub-base (14) apresenta uma superfície lateral compreendendo elementos de centralização em forma de V (141).

10. Sistema (10) para a caracterização de células, caracterizado pelo fato de compreender a cubeta de medição (1) conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um suporte de cubeta (2).

11. Sistema (10), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a cubeta de medição (1) ser conforme definida na reivindicação 9, em que o suporte de cubeta (2) apresenta duas ranhuras (21, 22) que se intersectam em uma intersecção e em que o perfil transversal é um V, a intersecção formando uma local para a cubeta de medição (1).