CN110779878A - 微生物分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品及试剂盒 - Google Patents
微生物分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种微生物分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品及试剂盒，涉及傅里叶变换红外光谱分型及溯源分析技术。本发明通过对多种大肠杆菌的组合与优化，提供一种依据多种大肠杆菌的吸光度图谱的红外光谱波数组合，以该红外光谱波数组合为基础构建适用于目前商业化傅里叶变换红外光谱仪微生物分型及溯源分析系统的校正标准品。本发明提供的标准品制备方法简单、成本低廉，利用其作为微生物分型及溯源分析的傅里叶变换红外光谱仪采样外标校正标准品，具有成本低、稳定性好、便于操作、校正时间短、重复性好的优点，且准确度高，能够解决目前微生物分析用傅里叶红外光谱仪校正标准品成本高的问题，具有良好的经济价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及傅里叶变换红外光谱微生物分析技术领域，具体地，涉及微生物分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品及试剂盒。
背景技术
微生物分型和同源性分析方法的研究对于从分子水平了解病原微生物的演化进程、耐药机制分析、流行病学研究、疫情监测和院内感染控制有重大意义。常用的分型方法包括分子分型、血清学分型、质谱分型等。病原微生物的分型方法应满足快速、结果判读简单可靠、经济、安全等多方面因素,新的分型方法的探索一直是研究热点。傅里叶变换红外光谱(Fourier-Transformed Infrared Spectra,FT-IR)分型技术是一种全新的技术体系，最早始于2007年，有研究者开始尝试用FT-IR进行微生物分型研究，经过10余年的发展，德国布鲁克公司于2017年在ASMMicrobe会议上率先推出商业化的FT-IR分型系统(IRBiotyper)。IR Biotyper通过红外光谱中的菌株特异性吸光度图来表征微生物样品中的多类生物分子，如脂质、蛋白质、核酸和多糖，使IR Biotyper成为快速且经济有效的分型的有效工具。FT-IR分型系统由硬、软两部分组成，红外光谱仪作为硬件部分完成前期谱图采集工作，软件是包括一系列统计算法的分型系统。FT-IR分型方法，在病原培养后仅需2小时即可完成96个样本的检测，每个样本检测试剂耗材成本为几元人民币，相对于目前使用的分子分型技术，极大地节省了检测时间及检测成本，是一种具有光明前景的技术体系。傅里叶变换红外光谱仪采集样本的准确性是微生物分型体系的关键因素，目前全球商业化的傅里叶变换红外光谱样本采集外标校正标准品只有布鲁克公司的产品。
基于傅里叶变换红外的微生物分型是新型技术体系，分型数据采集外标标准品目前只有布鲁克公司有，属于垄断产品。该产品价格高，且每个试剂盒只能采集2个样本靶，采集一块靶板的成本要400元，并且干燥时间不宜控制，干燥后起皮现象严重，在样本靶上的稳定性较差，只适合短时间内快速检测，无法重复检测。因此，开发我国自主知识产权的仪器校正标准品势在必行，有必要研制一种成本低廉、稳定性好、重复性好、便于操作的适用于傅里叶变换红外光谱仪的外标校正标准品，以推动我国傅里叶变换红外光谱在微生物分析领域的发展。
发明内容
本发明的目的是为了弥补目前微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品成本高、稳定性差、不宜控制操作等不足之处，提供一种成本低廉、校正谱图优质、校正效果稳定的国产化的微生物分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品。
本发明的另一目的是提供一种微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪样品校正试剂盒。
本发明提供的微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品，由标准品I和标准品II组成，所述标准品I含有的蛋白对应以下红外光谱波数：3287、3078、2960、2927、2875、2855、1654、1543、1452、1398、1240、1084、966、699、643、557cm-1。
所述标准品II含有的物质对应以下红外光谱波数：3287、3070、2960、2926、2875、2854、1654、1543、1452、1399、1241、1084、896、699、641cm-1。
本发明提供的微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品中，所述标准品I是通过将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比1：(1-4)：1：(1-4)将四者混合、灭活后得到，优选质量比为1:1:1:2。前述四种BNCC编号的大肠杆菌均购自北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)，本领域技术人员可从该研究院购买获得上述四种大肠杆菌。
所述标准品II是通过将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比(1-4)：(1-4)：1：4将四者混合、灭活后得到，优选质量比为4：1：1：4。
进一步地，本发明提供了上述校正标准品在制备微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正试剂盒中的应用。
本发明提供一种微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪样品校正试剂盒，含有本发明上述的校正标准品。
进一步地，所述校正标准品为冻干品，还含有标准品溶液A、标准品溶液B，所述标准品溶液A为超纯水，所述标准品溶液B为无水乙醇。更进一步地，所述冻干品置于带有磁性短棒或珠子的管中。
本发明提供了上述校正标准品或含有该校正标准品的试剂盒在微生物分型及溯源分析中的应用。
本发明提供了上述校正标准品或含有该校正标准品的试剂盒在应用傅里叶变换红外光谱仪对微生物进行分型及溯源分析中的应用。
本发明提供的校正标准品在实际应用时，是取出标准品I、标准品II，用标准品溶液A分别溶解标准品I、标准品II，震荡混匀，室温静置45-75min，再分别加入标准品溶液B，震荡混匀标准品I、标准品II；取配制好的标准品I和II分别加到傅里叶变换红外光谱仪的样本靶的校正检测孔中，室温静置20-30分钟，待充分干燥后将样品靶置于光谱仪靶托中，进行数据采集及仪器校正；所述标准品溶液A为超纯水，所述标准品溶液B为无水乙醇。
在本发明的一个实施例中，具体操作是取出标准品I、标准品II，分别用50ul标准品溶液A溶解标准品I及标准品II，震荡混匀，室温静置1小时，再分别加入50ul标准品溶液B，震荡混匀。用移液器分别取标准品I、标准品II各12ul配制好的标准校正液加到样本靶的校正检测孔中，室温静置20-30分钟，待充分干燥后将样品靶置于光谱仪靶托中，进行数据采集及仪器校正。
用本发明的校正标准品进行校正，采用布鲁克公司的IR Biotyper软件进行数据采集。参数选择仪器的默认参数。
本发明还提供了微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品的制备方法，所述标准品由标准品I和标准品II组成，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比1：(1-4)：1：(1-4)将四者混合、溶液灭活后得到标准品I；优选的质量比为：1:1:1:2；
(2)将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比(1-4)：(1-4)：1：4将四者混合、溶液灭活后得到标准品II；优选的质量比为4：1：1：4。
本发明基于傅里叶变换红外光谱分型及溯源分析技术，通过对108株大肠杆菌红外光谱波数的数据采集和比对、对多种大肠杆菌的组合与优化，提供一种依据多种大肠杆菌的吸光度图谱的红外光谱波数组合，以该红外光谱波数组合为基础构建适用于目前商业化傅里叶变换红外光谱仪微生物分析系统的校正标准品。本发明优化筛选出了4株大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004，经过配比优化确定了标准品母株组合及其最佳配比，获得标准品I和II，该标准品可用于国际上商业化的傅里叶变换红外光谱仪，能获得优质的校正谱图，校正效果、稳定性均优于目前唯一的商业化试剂盒；本发明的标准品试剂盒价格低廉，每个校正点成本3元人民币，价格远远低于每个校正点80元人民币的市面上唯一的进口商业化试剂盒，稳定性高，可多次数据采集，适合商业化推广使用。
本发明提供的标准品制备方法简单、成本低廉，利用其作为微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪采样外标校正标准品，具有成本低、稳定性好、便于操作、校正时间短、重复性好的优点，且准确度高，能够解决目前微生物分析用光谱仪校正标准品成本高、稳定性低的问题，具有良好的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为10株目标菌株的光谱图。
图2为标准品作为检测标品图中：C8、D8为本发明的标准品I，E8、F8为本发明的标准品II；C1、C2，D1、D2为商品化的标准品。
图3为本发明标准品作为外标校正实际样本检测图，A1、A2为本发明的标准品I，B1、B2为本发明的标准品II；其余样本为实测肺炎支原体菌株样本。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的生物材料、试剂为市售。
实施例1标准品母株的优化与确定
选择108株大肠杆菌菌株，包括标准菌株及野生株。采用IR Biotyper软件对108株大肠杆菌进行数据采集，筛选其中含有光谱波数3287，3070，3078，2960，2926，2927，2875，2854，2855，1654，1543，1452，1399，1398，1240，1241，1084，966，896，699，643，641，557cm-1中至少10个波数的菌株，确定了10株菌(见图1)。对待选的10株菌配对组合，与商业化的标准品I、II(购自德国bruker公司)的谱图进行比对分析，留下符合率大于90％的菌株组合，确定了4株菌，分别是BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004(均购自北京北纳创联生物技术研究院)，并优化4株菌的配比(见表1)，使标准品I、II的校正通过率达到100％。
所述标准品I含有的物质对应以下红外光谱波数：3287、3078、2960、2927、2875、2855、1654、1543、1452、1398、1240、1084、966、699、643、557cm-1；所述标准品II含有的物质对应以下红外光谱波数：3287、3070、2960、2926、2875、2854、1654、1543、1452、1399、1241、1084、896、699、641cm-1。
表1.菌株比例优化及其结果
最终确定4株菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004为标准品母株。标准品母株对数生长期后收集菌株，标准品I的最优比例为前述的四种菌的质量比1：1：1：2，标准品II的最优比例是质量比4:1:1:4。
实施例2标准品校正采集次数及放置时长评价
用50ul标准品溶液A溶解本发明实施例1制备的标准品I及标准品II，震荡混匀，室温静置1小时，再分别加入50ul标准品溶液B，震荡混匀。用移液器分别取12ul配制好的标准品I及标准品II标准校正液加到样本靶的校正检测孔中，每个校正品点48个样本孔(2个样本孔用于评价采集次数、46个样本孔用于评价放置时长)。
采用布鲁克公司的校正试剂盒(Bruker IR Biotyper Kit,Bruker PartNo.1851760)中的标准品IRTS1、IRTS2用户试剂盒的方法制备后点样，每个校正品点48个样本孔(2个样本孔用于评价采集次数、46个样本孔用于评价放置时长)。室温静置20-30分钟，待充分干燥后将样品靶置于光谱仪靶托中，进行数据采集。
采用布鲁克公司的IR Biotyper软件进行数据采集，参数选择仪器的默认参数。采集次数设定为全部样本点的最大通过次数再多采集3次；样本放置时长设定为：每隔4小时测定一次，共测定23次，共96小时。
结果显示，本发明的标准品I、标准品II最大采集并通过的次数为8次，布鲁克商业化试剂盒中的校正品最大采集并通过的次数为3次，超过2次采集，无法通过校正；本发明的标准品I、标准品II点样后允许室温放置大最长时间为76小时，布鲁克商业化试剂盒中的校正品点样后允许室温放置的最大时长为44小时，超过44小时样本在样本靶上起皮，无法正常检测通过(表2)。
表2.标准品的最大允许采集次数及最长放置时长测定
| 标准品 | 校正最大通过次数 | 样本点样后允许室温放置的最长时间(小时) |
| 标准品I | 8 | 76 |
| 标准品II | 8 | 76 |
| IRTS1 | 3 | 44 |
| IRTS2 | 3 | 44 |
实施例3标准品校正效果评价
用50ul标准品溶液A分别溶解实施例1制备得到的标准品I及标准品II，震荡混匀，室温静置1小时，再分别加入50ul标准品溶液B，震荡混匀。用移液器分别取12ul配制好的标准品I及标准品II标准校正液加到样本靶的校正检测孔中，室温静置20-30分钟，待充分干燥后将样品靶置于光谱仪靶托中，进行数据采集及仪器校正。
本发明标准品I光谱波数包括：3287、3078、2960、2927、2875、2855、1654、1543、1452、1398、1240、1084、966、699、643、557；标准品II光谱波数包括：3287、3070、2960、2926、2875、2854、1654、1543、1452、1399、1241、1084、896、699、641。
采用布鲁克公司的IR Biotyper软件进行数据采集。参数选择仪器的默认参数。布鲁克公司的校正试剂盒(Bruker IR Biotyper Kit,Bruker Part No.1851760)作为比对。将本发明的标准品I、II代替布鲁克公司商业化试剂盒中的IRTS1和IRTS2，并将IRTS1及IRTS2作为样本进行检测，进行30次重复(因商业化的标准品不能重复采集30次，因此每采集3次换一块样本靶，共重复进样10次)。结果显示，本发明的标准品I及标准品II在30次重复中作为校正品100％通过，目前市场是唯一的商业化试剂盒校正通过率为93.3％(图2)，实际样本检测效果与用商品化试剂盒检测结果没有显著差别(图3)。
实施例4试剂盒稳定性评价
将制备的校正标准品试剂，真空冻干后保存于-80℃冰箱内。每月定时抽取，用标准品溶液A、标准品溶液B按要求悬浮，时长为6个月；配制好的标准品试剂保存在4℃冰箱，每天进行检测。结果显示，在6个月的时长内，标准品光谱没有显著变化，校正效果稳定；溶解后的标准品在4℃存放可使用1周。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品，其特征在于，由标准品I和标准品II组成，所述标准品I含有的物质对应以下红外光谱波数：3287、3078、2960、2927、2875、2855、1654、1543、1452、1398、1240、1084、966、699、643、557cm-1；
所述标准品II含有的物质对应以下红外光谱波数：3287、3070、2960、2926、2875、2854、1654、1543、1452、1399、1241、1084、896、699、641cm-1。
2.如权利要求1所述的校正标准品，其特征在于，所述标准品I是通过将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比1：(1-4)：1：(1-4)将四者混合、灭活后得到；优选质量比1:1:1:2。
3.如权利要求1所述的校正标准品，其特征在于，所述标准品II是通过将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比(1-4)：(1-4)：1：4将四者混合、灭活后得到，优选质量比4:1:1:4。
4.权利要求1-3任一所述的校正标准品在制备微生物分型、溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正试剂盒中的应用。
5.一种微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-3任一所述的校正标准品。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为冻干品，还含有标准品溶液A、标准品溶液B，所述标准品溶液A为超纯水，所述标准品溶液B为无水乙醇。
7.权利要求1-3任一所述的校正标准品或权利要求4-5任一所述的试剂盒在微生物分型、溯源分析中的应用。
8.权利要求1-3任一所述的校正标准品或权利要求4-5任一所述的试剂盒在应用傅里叶变换红外光谱仪对微生物进行分型、溯源分析中的应用。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，使用时，取出标准品I、标准品II，用标准品溶液A分别溶解标准品I、标准品II，震荡混匀，室温静置45-75min，再将标准品溶液B分别加入标准品I、标准品II，震荡混匀取配制好的标准品I、标准品II分别加到傅里叶变换红外光谱仪的样本靶的校正检测孔中，室温静置20-30分钟，待充分干燥后将样品靶置于光谱仪靶托中，进行数据采集及仪器校正；所述标准品溶液A为超纯水，所述标准品溶液B为无水乙醇。
10.微生物分型及溯源分析用傅里叶变换红外光谱仪校正标准品的制备方法，所述标准品由标准品I和标准品II组成，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比1：(1-4)：1：(1-4)将四者混合均匀、灭活后真空旋干得到标准品I；
(2)将大肠杆菌BNCC118966、BNCC336641、BNCC164703、BNCC337004这四株菌培养至对数生长期后，收集菌株，按照质量比(1-4)：(1-4)：1：4将四者混合均匀、灭活后真空旋干得到标准品II。
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