CN110755368B - 盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了盐酸小檗碱‑苦参碱‑羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明以盐酸小檗碱和苦参碱为模型药物，使用羧甲基壳聚糖和泊洛沙姆为基质材料，制备得到具有缓释功能和相变特性的温敏型复合水凝胶。体外抑菌作用研究结果发现，本发明所提供的盐酸小檗碱‑苦参碱‑羧甲基壳聚糖复合水凝胶对于金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌性能，有潜力成为针对金黄色葡萄球菌感染的预防或治疗药物，为奶牛乳房炎提供一种新的防治方法。

Description

盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及预防或治疗奶牛乳房炎的复合水凝胶，本发明进一步涉及治疗由金黄色葡萄球菌所导致的奶牛乳房炎的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备方法，属于奶牛乳房炎的预防或治疗领域。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛规模化养殖的常见病之一，该病会干扰奶牛生产活动，降低产奶量以及乳品质量，对奶牛养殖业危害较大。奶牛乳房炎的发病原因有很多，主要是病原菌通过乳腺导管造成上行性感染，其中金黄色葡萄球菌是最主要的致病菌之一。
金黄色葡萄球菌(通常简称为金葡菌)，是人们生产生活以及生命科学研究中常见菌种之一。金葡菌革兰氏染色为阳性，显微镜下观察呈现均匀球形，并呈葡萄串状排列，菌体大小比较一致，排列较为整齐，因克隆会显金黄色而得名。金葡菌最先发现于苏格兰，1880年由Alexander Ogston在病患脓疮中首次发现。金葡菌无鞭毛、无芽胞，且多数情况下没有荚膜。其营养要求不高，适应能力极强，在普通培养基上就可良好地生长。金葡菌属于需氧菌或兼性厌氧，37℃、pH＝7.4是最适合金葡菌的生长的温度及酸碱度。但是，金葡菌的生命力极其顽强，能在多种极端环境中生存，如耐高盐：可在添有10-15％NaCl的培养基中生长，耐干燥，比较干燥的情况下也仍能存活数月；除此之外还耐热、耐低温等。
除致病力强，生命力顽强外，金葡菌分布的广泛性也是值得重视这个独特菌种的一大原因。金葡菌广泛存在于自然界中，水、空气、尘埃中到处都有它的身影，还能生存于人和动物的身体表面以及呼吸道黏膜上，动物粪便中也能找到它的踪影，严重威胁到了人类和动物的健康以及公共卫生的安全。根据美国疾控中心的相关统计可知：金黄色葡萄球菌所引起的感染率在全世界排第二名，仅次于大肠杆菌。且食物极易遭到到污染，爆发食品安全问题，给人们生活带来极大的伤害。
金葡菌是能同时感染动物和人的条件性致病菌，致病力极强，在目前已知的细菌中，金黄色葡萄球菌位列化脓作用最强细菌之一。对于人类而言，当人体免疫力下降，皮肤或者黏膜出现破损时，金葡菌会抓住机会大量繁殖，引起破损部位的发炎化脓，甚至有可能由此进入人体体内造成一系列的感染，比如尿路感染、肺部感染，骨髓或其他关节感染等，严重者还会引发血液感染、神经感染等。更有甚者会引发全身性的败血症、脓毒症等全身性感染疾病。艾滋病等免疫功能缺失者也极容易感染金葡菌。在养殖业中，金黄色葡萄球菌是导致奶牛乳房炎的主要致病菌之一(Lowy FD.Staphylococcus aureus infections[J].The New England Journal of Medicine,1998,339(8):520-532.)，会使乳品质量下降，严重损害了奶牛养殖的经济效益。
金葡菌还极易产生耐药性，在青霉素刚刚应用不久就发现了耐青霉素的菌株。近些年，随着抗生素的普遍使用，具有耐药性的金葡菌数量明显增加。1961年，在甲氧西林仅仅应用临床后的一年，Jevons就已经分离得到了耐甲氧西林的金葡菌菌株(Jevons M.P."Celbenin"-resistant staphylococci[J].BMJ.1961,1:124-126.)。细菌变异速度比科学家研究速度更加迅速。因此在很多专家学者倡导少用抗生素，以免产生超级细菌等无法想象的恶劣后果。
奶牛乳腺炎是由于机械摩擦、病原菌感染或其他原因造成的，是奶牛多发病的一种。发病的奶牛乳液质量、产奶量都会受到很大的影响，严重时甚至无法泌乳，会造成极大的经济损失，严重制约了奶牛养殖业的发展。而中国奶牛乳腺炎的发病率一直居高不下，虽然对于奶牛乳腺炎的科学研究已经开展了很多年，但直到目前为止仍然没有非常理想的防治乳腺炎的手段和措施。为了避免耐药菌的产生，也为了人类和动物的健康生存的长远考量，大量使用抗生素是不被建议的，滥用抗生素的后果就是无药可用。考虑到乳房炎成因复杂，所以还是应坚持预防为主，防治结合的原则。造成奶牛乳房炎的致病菌有很多，金黄色葡萄球菌是其中之一，约占25-30％(Sutra L,Poutrel B.Virulence factors involvedin the pathogenesis of bovine intramammary infections due to Staphylococcusaureus[J].Journal of Medical Microbiology,1994,40(2):79-89)。
在兽医临床上，预防和治疗奶牛乳房炎最常用的方法是直接将药物灌注进乳房内，但是药液极易流动，很难持续发挥药效。所以药物的释放方式也成为了考量用药的一个标准之一，既需要流动性弱又能易于灌注，还需要有不错的抑菌效果。
因此，亟待需要研制一种流动性弱且易于灌注的对奶牛乳房炎具有良好预防或治疗效果的药物制剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶；
本发明的目的之二是提供一种制备所述盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的方法；
本发明的目的之三是将所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶应用于预防或治疗由金黄色葡萄球菌所导致的奶牛乳房炎。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了一种盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，由盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖组成的混合水溶液1以及由泊洛沙姆407和泊洛沙姆188组成的混合水溶液2组成。
其中，所述的混合水溶液1和混合水溶液2的体积比为(1-5)：(0.5-2)；优选的，所述的混合水溶液1和混合水溶液2的体积比为2：1。
所述混合水溶液1中，按照质量比计，盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖的比例为(0.05-0.5)：(0.5-4)：(2-20)；优选的，盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖的比例为(0.1)：(0.8)：(5)。
所述的混合水溶液1的制备方法包括：将盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖溶解于水中，即得。
所述混合水溶液2中，按照质量比计，泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的比例为(10-30)：(2-15)；优选的，泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的比例为22:6。
所述的混合水溶液2的制备方法包括：将泊洛沙姆407和泊洛沙姆407溶于预冷的纯水中，磁力搅拌器搅匀，即得。
本发明进一步提供了一种制备所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的方法，包括：将混合水溶液1和混合水溶液2在平皿中混合均匀后，恒温加热后静置凝固后灭菌，即得。
优选的，将混合水溶液1和混合水溶液2在平皿中进行混合时用磁力搅拌器进行搅拌；所述的恒温加热的温度为37℃，所述的静置时间为10-15min；所述的灭菌方式是经Co60辐照灭菌。
其中，所述的羧甲基壳聚糖优选为取代度95.4％，黏度78mpa.s的羧甲基壳聚糖；所述的盐酸小檗碱的纯度≥98％。
盐酸小檗碱，是一类提取自黄连等植物根茎中具有生物活性的异喹啉类生物碱，可以说黄连的有效成分即为盐酸小檗碱。盐酸小檗碱虽然来源于中药，但具有明确的化学结构，熔点为145℃，微溶于水，易溶于70-80℃的热水，难溶于乙醇、乙醚氯仿等有机溶剂。黄色针状结晶、不臭，味苦。盐酸小檗碱相比抗生素具有低毒、不易产生耐药性等优点。
本发明首先测定了盐酸小檗碱、苦参碱、二氢杨梅素、黄芩苷和黄芩素五种中药单体对金葡菌的MIC和MBC值；在此基础上，本发明将这5种单体药物进行两两组合得到了8种药物组合，采用棋盘法测定了这8种组合药物对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果，根据抑菌的试验结果可见，盐酸小檗碱和苦参碱配伍在一起对于金葡菌具有协同增效的抑制功效，其它的7种组合对于金葡菌的抑制呈现出无关或拮抗的效果。
本发明以导致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌YZ20108为目标菌种，研究盐酸小檗碱与苦参碱复合形成的水凝胶的抑菌性能以及对金葡菌毒力基因转录量的影响；本发明进一步利用在平板上贴附凝胶片测抑菌圈直径的方法进行药敏试验观察复合凝胶的抑菌性能；结果表明抑菌圈的直径和加药浓度呈正相关，浓度越高，抑菌圈直径越大。0.1％的盐酸小檗碱壳聚糖抑菌圈直径约为22mm左右，判断为敏感。该试验再次佐证了复合水凝胶的抑菌性能优良。通过测定复合凝胶作用下金葡菌的生长曲线得知，相比空白组而言，随着药物浓度的增加，金葡菌的生长趋势受到明显地抑制。
葡萄球菌属的密度感应系统主要为agr系统和lux系统，agr系统功能主要靠其转录产物RNAⅢ来实现，而hld是RNAⅢ的编码基因。sarA对金葡菌生物膜形成以及感染有关，抑制其表达量就可能减少细菌的感染。hla参与编码α毒素，而α毒素能够破坏宿主防御功能、抵抗巨噬细胞吞噬。本发明通过荧光定量PCR检测实验结果得知，经过复合凝胶处理后，金葡菌这三个基因表达量均明显下调。
综合上述实验可见，本发明提供的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶对于金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌性能，有潜力成为未来针对金黄色葡萄球菌感染的预防或治疗药物，也希望能为奶牛乳房炎这一困扰奶牛养殖业的难题提供一种新的治疗思路。
本发明在总结国内外有关防治金黄色葡萄球菌引起疾病的研究资料基础上，以盐酸小檗碱和苦参碱为模型药物，使用羧甲基壳聚糖和泊洛沙姆为基本材料，制备具有缓释功能和质地可变的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，并对其体外抑菌活性和体外抗金葡菌感染的作用进行研究，为临床提供了一种具有一定抑菌、抗炎、抗感染功效的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖温敏型复合水凝胶，为奶牛乳房炎防治提供了一种新的方法。
附图说明
图1制备好的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶片。
图2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶抑菌圈结果。
图3盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶抑菌曲线。
图4毒力基因表达量柱状图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶制备
(1)称取0.1g盐酸小檗碱和0.8g苦参碱于94ml纯水中，水浴加热，充分溶解后向其中加入5g羧甲基壳聚糖粉末，磁力搅拌器搅拌均匀，放置过夜，充分吸水溶解后得到混合溶液1冷藏备用。
(2)称取22g泊洛沙姆407和6g泊洛沙姆188溶于72ml预冷的纯水中，磁力搅拌器搅匀得到混合溶液2，冰箱冷藏备用。
(3)将混合溶液1和混合溶液2按照2:1的比例混匀于一次性平皿中，磁力搅拌器混匀，防止气泡产生，于37℃恒温加热台上静置10-15min，待其凝固后经Co60辐照灭菌，冰箱冷藏备用。
实施例2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶制备
(1)称取0.05g盐酸小檗碱和0.5g苦参碱于94ml纯水中，水浴加热，充分溶解后向其中加入6g羧甲基壳聚糖粉末，磁力搅拌器搅拌均匀，放置过夜，充分吸水溶解后得到混合溶液1冷藏备用。
(2)称取10g泊洛沙姆407和2g泊洛沙姆407溶于88ml预冷的纯水中，磁力搅拌器搅匀得到混合溶液2，冰箱冷藏备用。
(3)将混合溶液1和混合溶液2按照3:1的比例混匀于一次性平皿中，磁力搅拌器混匀，防止气泡产生，于37℃恒温加热台上静置10-15min，待其凝固后经Co60辐照灭菌，冰箱冷藏备用。
实施例3盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶制备
(1)称取0.5g盐酸小檗碱和3g苦参碱于94ml纯水中，水浴加热，充分溶解后向其中加入2g羧甲基壳聚糖粉末，磁力搅拌器搅拌均匀，放置过夜，充分吸水溶解后得到混合溶液1冷藏备用。
(2)称取30g泊洛沙姆407和10g泊洛沙姆407溶于70ml预冷的纯水中，磁力搅拌器搅匀得到混合溶液2，冰箱冷藏备用。
(3)将混合溶液1和混合溶液2按照5:3的比例混匀于一次性平皿中，磁力搅拌器混匀，防止气泡产生，于37℃恒温加热台上静置10-15min，待其凝固后经Co60辐照灭菌，冰箱冷藏备用。
试验例1五种中药单体MIC和MBC测定以及联合抑菌试验
一、五种中药单体对金葡菌的MIC和MBC值测定
本试验测定了盐酸小檗碱、苦参碱、二氢杨梅素、黄芩苷和黄芩素五种中药单体对金葡菌的MIC和MBC值，具体方法如下：
①从-80℃冰箱种取出菌株，用无菌接种棒将其复苏于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板，37℃，24h培养。
②挑取其中一个菌落接种于5ml或20ml MHB培养基中，37℃，250r/min，培养4h。
③用分光光度计测OD600值，MHB稀释至OD600为0.1(相当于1.5×108CFU/ml)，然后用MHB进一步稀释至浓度为1.5×106CFU/ml。
④96孔板中加入100ul无菌MHB培养基，向第一孔加入100ul中药单体贮存液，混匀数次后依次做倍比稀释至第十孔，吸出100ul弃去。
⑤每孔加入稀释好的菌液100ul，未加菌液的MHB培养基(200ul)为阴性对照，不加药物的细菌悬液(100ul MHB+100ul细菌悬液)为阳性对照，试验重复三次，颜色深的中药单体应做颜色对照。
⑥混匀后将96孔板置于37℃培养24h，之后观测清亮孔，药物最大稀释度的清亮孔为最低抑菌浓度(MIC)。
⑦结合眼观及OD600结果，选取清亮的试验孔，吸取100ul均匀涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，置于37℃恒温培养箱中培养24h。
⑧观察涂板结果，以完全不长菌的最低稀释倍数为该中药单体的最低有效杀菌浓度(MBC)。
五种中药单体MIC和MBC测定结果见表1。
表1五种中药单体MIC和MBC测定结果
MIC MBC
盐酸小檗碱 62.5ug/ml 125ug/ml
苦参碱 20mg/ml 40mg/ml
二氢杨梅素 800ug/ml 1600ug/ml
黄芩苷 1024ug/ml 2048ug/ml
黄芩素 256ug/ml 512ug/ml
二、棋盘法联合抑菌试验
本试验分别测定5种中药单体的联合抑菌效果。
抗菌药物浓度设置为(1/16-4)×MIC，调整菌液浓度为1×106CFU/ml，37℃培养24h，以肉眼未见菌株生长的两药最低浓度组合读取各药的单用及联合的MIC。药物相互作用效应通过计算最小部分抑菌浓度指数(FIC)来判断：FIC＝FIC A+FIC B＝(A药联合应用时的MIC/A单药应用时的MIC A)+(B药联合应用时的MIC/B单药应用时的MIC B)；FIC≤0.5为协同效应，0.5＜FIC≤1为相加效应，1＜FIC≤4为无关作用，FIC＞4为拮抗效应(Mitchell G,Lafrance M,Boulanger S,Séguin DL,Guay I,Gattuso M,Marsault E,Bouarab K,Malouin F.Tomatidine acts in synergy with aminoglycosideantibiotics against multiresistant Staphylococcus aureus and preventsvirulence gene expression[J].J Antimicrob Chemother,2012,67(3):559-68.)。
联合抑菌的试验结果见表2。根据表2的试验结果可见，盐酸小檗碱和苦参碱配伍在一起对于金葡菌具有协同增效的抑制功效，其它的7种组合对于金葡菌的抑制呈现出无关或拮抗的效果。
表2棋盘法联合抑菌试验结果
FIC 联合抗菌作用
盐酸小檗碱+苦参碱 0.45 协同
盐酸小檗碱+二氢杨梅素 2 无关
盐酸小檗碱+黄芩苷 3 无关
盐酸小檗碱+黄芩素 2.5 无关
苦参碱+二氢杨梅素 4.5 拮抗
苦参碱+黄芩苷 2.5 无关
苦参碱+黄芩素 2 无关
黄芩苷+黄芩素 3 无关
试验例2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶抑菌以及抑制金葡菌三个基因表达量的试验
1材料与方法
1.1材料
表3材料及来源
Figure BDA0002236554960000101
1.2试验方法
1.2.1菌悬液和药液的制备
1.2.1.1金黄色葡萄球菌悬液的制备
按照培养基使用说明，使用电子天平称取适量培养基粉末于锥形瓶中，加入相应比例的纯水，玻璃棒搅拌溶解，必要时水浴加热，塞好瓶塞并用报纸包好瓶口，放入灭菌锅内灭菌(121℃、20min)。MH(A)培养基灭菌后冷却至50℃左右时，在超净台内将培养液倒在一次性培养皿中，并静置冷却待其凝固备用。细菌操作均在超净工作台内进行，所用到的枪头、EP管、涂菌棒等物品使用前都要经过高温灭菌。
将保存于-80℃的金黄色葡萄球菌ATCC29213、YZ20108分别取100μl于准备好的MH(A)平板上，用涂菌棒涂布均匀后，37℃温箱培养24小时。之后挑取单个菌落于100ml MH(B)培养液中并放置于摇床(37℃，160r/min)培养24小时。之后将菌液用灭过菌的PBS进行倍比稀释，进行6个梯度，后三个梯度分别取100μl置于MH(A)平板上，用涂菌棒涂匀，重复三次，37℃温箱培养24h后取出用活菌计数法计数。计数时平板上菌落数在30-300内有效。计数后的菌液封置于4℃冰箱保存备用。
1.2.1.2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备
采用实施例1所制备的盐酸小檗碱-苦参碱-壳聚糖复合水凝胶作为供试材料进行试验。
1.2.2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的药敏实验
将盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶片贴附于已涂布菌液的培养基上，不含药的水凝胶片作为对照。将培养基置于37℃温箱培养24h后观察有无抑菌圈，并通过抑菌环直径来判断抑菌性能(Noel S P,Courtney H S,Bumgardner J D,etal.Chitosan sponges to locally deliver amikacin and vancomycin:a pilot invitro evaluation[J].Clinical Orthopaedics and Related Research,2010,468(8):2074-2080；Kumar A,Jaiswal M.Design and in vitro investigation ofnanocomposite hydrogel based in situ spray dressing for chronic wounds andsynthesis of silver nanoparticles using green chemistry[J].Journal of AppliedPolymer Science,2016,133(14).)。重复三次。
1.2.3盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶作用下金葡菌生长曲线的测定
称量适量MH(B)粉末，按比例加入纯水中配成培养液，分装于试管并灭菌备用。每管加入100μl菌液，涡旋震荡器摇匀，然后加入1g的盐酸小檗碱-苦参碱复合水凝胶，摇床培养(37℃，150r/min)。在培养1、3、6、24小时后取出计数，方法仍然使用活菌计数法，取100μl均匀涂布在MH(A)平板上，37℃温箱培养24h后取出计数。重复三次。以时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制时间金葡菌生长曲线。
1.2.4盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶对金黄色葡萄球菌的毒力因子转录的影响
向制备好的菌悬液中加入1g(5片)的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，摇床培养16小时后，提取细菌RNA，具体根据RNeasy Mini Kit试剂盒说明书进行操作，然后用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒反转录成cDNA，再用TBGreenTM Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行荧光定量PCR，引物以16SrRNA为内参基因，分别检测hld、sarA、hla、三个基因的表达量。具体的引物序列见表4。
最后用2-ΔΔct进行相对定量计算毒力基因的表达量(Moisan H,Brouillette E,Jacob C L,et al.Transcription of virulence factors in Staphylococcus aureussmall-colony variants isolated from cystic fibrosis patients is influenced bySigB[J].Journal of bacteriology,2006,188(1):64-76；Chen Y,Liu T,Wang K,etal.Baicalein inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation and the quorumsensing system in vitro[J].PLoS One,2016,11(4):e0153468.)。
表4荧光定量PCR用到的引物序列
Figure BDA0002236554960000131
2结果与分析
2.1盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶抑菌环实验结果
抑菌圈是指药片周围透明的一圈，抑菌环直径越大证明抑菌效果越好，根据国际标准大于等于20mm为敏感；在15-19mm范围内为中等敏感；小于等于14mm为无效。阴性孔周围无抑菌圈的出现，菌落正常生长，加药孔周围均有抑菌圈产生，且随着盐酸小檗碱浓度升高抑菌环的直径明显增加，具体数据见表5。
表5抑菌圈测定结果(单位mm)
Figure BDA0002236554960000132
注：增稠剂为泊洛沙姆。
2.2盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的时间抑菌曲线
图3反映了不同浓度药物对金葡菌不同时间点的作用效果。对照组金葡菌数量随时间推移始终呈上升趋势；单纯壳聚糖凝胶组虽然整体趋势还是上升，但是比起对照组有明显减缓的趋势；盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的减缓趋势更明显，0.025％复合凝胶在6小时内能抑制金葡菌的生长，但6小时后菌落数有上升趋势，0.1％的复合水凝胶作用下，金葡菌的生长被明显抑制，菌落数量整体呈下降的趋势。
2.3盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶对金黄色葡萄球菌毒力基因表达量的影响
盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶对金黄色葡萄球菌毒力基因的表达量的影响结果如表6所示，可以看出经复合水凝胶处理后金葡菌hld、hla、sarA三个毒力基因的表达量相比对照组显著性下调，且hld基因表达量最少，可以得出相比其它基因而言，hld表达量受盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的影响更明显。
表6盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合凝胶对毒力基因表达量的影响
Figure BDA0002236554960000141
序列表
<110> 北京农学院
<120> 盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备方法和应用
<130> BJ-1004-190714A
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
ccataaagtt gttctcagtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
catgtcgatc tacgattact 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
gaatttgttc actgtgtcga taatccattt 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
gaaggagtga tttcaatggc acaagatat 29
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
gctgtattga catacatcag cgaaa 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
cgttgttgct tcatgattcg t 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
aatgaatcct gtcgctaatg ccgc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
ctgaaggcca ggctaaacca cttt 24

Claims (10)

1.一种抑制金黄色葡萄球菌的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，由盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖组成的混合水溶液1以及由泊洛沙姆407和泊洛沙姆188组成的混合水溶液2组成；
所述的混合水溶液1和混合水溶液2的体积比为(1-5)：(0.5-2)；
所述混合水溶液1中，按照质量比计，盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖的比例为(0.05-0.5)：(0.5-4)：(2-20)；
所述混合水溶液2中，按照质量比计，泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的比例为(10-30)：(2-15)。
2.按照权利要求1所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述的混合水溶液1和混合水溶液2的体积比为2：1。
3.按照权利要求1所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖的比例为0.1：0.8：5。
4.按照权利要求1所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的比例为22:6。
5.按照权利要求1所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述的混合水溶液1的制备方法包括：将盐酸小檗碱、苦参碱和羧甲基壳聚糖溶解于水中，即得。
6.按照权利要求1所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶，其特征在于，所述的混合水溶液2的制备方法包括：将泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶于预冷的纯水中，磁力搅拌器搅匀，即得。
7.一种制备权利要求1-6任何一项所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的方法，其特征在于，将混合水溶液1和混合水溶液2在平皿中混合均匀后，恒温加热后静置凝固后灭菌，即得。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，将混合水溶液1和混合水溶液2在平皿中进行混合时用磁力搅拌器进行搅拌；所述的恒温加热的温度为37℃，所述的静置时间为10-15min；所述的灭菌方式是经Co60辐照灭菌。
9.权利要求1-6任何一项所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶在制备抑制金黄色葡萄球菌药物中的用途。
10.权利要求1-6任何一项所述的盐酸小檗碱-苦参碱-羧甲基壳聚糖复合水凝胶在制备预防或治疗由金黄色葡萄球菌所导致的奶牛乳房炎药物中的用途。
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