CN110734965A - Poct的pcr结果快速获得方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种POCT的PCR结果快速获得方法，将待检测样品平均分成N份，将各个平分后的样品于相同的条件下同时进行荧光定量PCR扩增，并实时监测各个平分后的样品的荧光值，N为不小于100的自然数，平分后的样品分别位于不同的反应容器内且均被放置于相同的空间内并处于同样的反应条件进行PCR扩增，各个反应容器的高宽比大于1。利用本发明的方法，能够将利用PCR进行POCT的检测时间缩短至15分钟以内，实现分子诊断真正的即时化，本发明采用分液扩增模式、多点背景对比寻找突破阈线、增加光路检测距离三个方面进行PCR扩增设计和检测模式实现快速扩增的目标，具备稳定、快速、准确的特点。

Description

POCT的PCR结果快速获得方法及装置

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种POCT的PCR结果快速获得方 法和装置。

背景技术

即时检验(point-of-care testing，POCT)，指在病人旁边进行的临床检 测及床边检测(bedside testing)，即时检验是在现场采样完毕后立刻进行检 测分析，省去了将标本带回实验室，并在实验室完成复杂的前处理程序的繁冗 的工作过程，其能够在现场快速得到检验结果，POCT可以不必要求由专业的检 验人员操作也能得到样品的检测结果，因而增加了检测的快捷性。

通过PCR(Polymerase ChainReaction)，聚合酶链式反应技术能够对多种 传染病、遗传性疾病及肿瘤等进行早期诊断，在进行POCT的过程中越来越多的 采用PCR技术来完成。PCR的过程是利用样本在两个或三个温区内的反复升降温 过程，实现对于核酸信号的指数级成倍放大，再通过特定的检测手段读取信号 进行分析判读，因而能够确保疾病检测的灵敏度与特异性。

然而，利用PCR技术获得检测结果必须经历多个循环周期才能得到，因此 其必然存在检测的时间较长的问题，通常PCR检测过程大约需要1-2小时，此 外，利用PCR技术对于样本的初始靶核酸序列的浓度要求较高，若初始的靶核 酸序列浓度较低的话，若想得到准确而可靠的检测结果，则需要更多的PCR循 环才能得到，这将会使检测时间更长。因而,将常规的PCR技术应用于POCT过 程也使得检测时间较长，这显然并不能满足POCT的应用需求。

为了提高PCR扩增靶序列的效率，通常的解决办法是提高PCR的控温模块 (Block)的变温速率，缩短单个循环的时间，从而使总的检测时间缩短到1小 时以内。另一个比较有效的思路是增加PCR的温度模块数量，使单一Block时 间上形成的循环变成多个并列模块在空间上的循环以完成PCR扩增，比如通过 在微流控芯片的流道内实现扩增，这种方式能将利用PCR技术检测的时间缩短 到40分钟以内。然而，这离真正意义上的POCT(将检测时间缩短至15分钟) 仍然还有不小的差距。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于POCT过程的快速获得PCR结 果的方法，利用本发明的方法能够将检测结果的获得时间控制在15分钟以内。

本发明的目的之一在于，提供一种POCT的PCR结果快速获得方法，将待检测 样品平均分成N份，将各个平分后的样品于相同的条件下同时进行荧光定量PCR 扩增，并实时监测各个平分后的样品的荧光值，所述N为不小于100的自然数。 因而，经过平分后的N个小样本体系中只要有一个具有阳性扩增，在经过有限次 循环后，即可快速判读出阳性判断结果；将样本平分为N份，在每一次循环，都 会提供N个数据点，有效消除系统噪声，因而提高检测灵敏度；经过均分后的样 本体系的体积变小，因而，对各个样本体系的升降温也更加迅速，从而有效缩 短PCR过程的时间。

进一步的，平分后的样品分别位于不同的反应容器内，各个所述反应容器 均被放置于相同的空间内并处于同样的反应条件。

更进一步的，将各个所述反应容器内的样品的PCR循环过程的第n个循环以 内的相邻循环所监测到的信号变化为基准荧光变化值Δa，以各个所述反应容器 中的任意一个内的样品在连续两个循环中所检测的相邻循环的荧光增加值Δb 均超过基准荧光变化值Δa时，即可判定待检测样品的目标靶标为阳性；当各个 所述反应容器内的反应物的PCR循环次数达到预定值m时，仍然未检测到阳性扩 增，则判定该样本检测的目标靶标为阴性，m为不超过50的自然数，n为不超过 10的自然数。因而，各个反应容器中的反应物均以其各自的循环初期的(5-10 个循环)内的荧光值作为基准，并可分别进行PCR扩增，通过实时监测荧光增加 值，当Δb大于Δa时，即可判断出对应的反应容器中出现了阳性扩增，并进一 步确定初始样本具有靶标，因而得到阳性判断结果；当PCR循环数达到预定值m 时，若仍未有任何反应容器内的样品出现阳性扩增，即可判断初始样本中不包 含靶标。

更进一步的，在进行荧光检测时的检测光路沿着与各个所述反应容器的高 度方向相平行的方向射入所述反应容器内，各个所述反应容器的高宽比不小于1。 因而，反应容器为细长型，能够增加光路检测距离，从而增加检测时的荧光强 度，使得信号更容易被监测，避免分液小体系的信号减弱问题。

更进一步的，各个所述反应容器的体积不超过1μl。

进一步的，所述N不超过5000。

进一步的，在进行检测时，当所述待检测样品中靶标的初始拷贝总数不超 过1000拷贝时，对所述待检测样品的PCR循环数不超过30。按照本发明的方法， 对于低初始拷贝数(小于1.0E3)的样本也能在不超过30个循环内快速得到检测 结果。

本发明的目的之二在于，提供一种用于POCT的PCR结果快速获得的装置，其 具有N个反应腔室，所述N小于等于5000，大于等于100。

进一步的，包括分液芯片，各个所述反应腔室均设置在所述分液芯片上， 所述反应腔室为柱状的反应孔，各个所述反应腔室的中心轴线相互平行，所述 反应孔的高宽比大于1。

更进一步的，荧光检测单元的检测光路与反应腔室的长度方向相平行。

本发明具有如下有益效果：

①利用本发明的方法，通过将初始样本分成多个小样本，并分别进行PCR扩 增，将单次扩增的体系分解成多个独立的小体系，同步完成扩增，并分别监测 荧光变化值，对于低浓度模板而言，将阳性模板分解到小体系中，增加阳性扩 增体系的集中度，使得扩增能够提前进行，缩短检测时间；此外，由于分液后 反应体积从微升级下降到纳升级，配合良好的热传导模块，各反应体系在热循 环时达到热平衡，即设定温度时的所需时间大为缩短。

②按照本发明的方法，能够提供大量基准数据，所有的反应容器中的独立 扩增小体系数量即为每次扩增循环的基准数据量，在每次扩增时产生多个背景 信号，能够更好地消除噪声，使得有效的信号增长很容易被监测到，从而提前 判定阳性扩增；本发明采用多点背景对比寻找突破阈线，在PCR循环早期(例如 5-10个周期)相邻循环所监测到的信号变化即可作为基准荧光变化值，当某个 独立小体系信号增速在连续2个循环中所检测的相邻循环荧光增长值均超过基 准荧光变化值时，即可判定该扩增小体系发生阳性扩增，即可判定样本检测的 目标靶标为阳性，反应结束。当所有PCR扩增循环结束时，仍然未检测到阳性扩 增，则判定该样本检测的目标靶标为阴性。分解为小体系后，阳性扩增可因三 个主要原因得以更为容易判断：(a)纳升级小体系时PCR反应的抗抑制性抗干扰 性得以提高；(b)小体系时各体系的扩增靶序列浓度遵从泊松分布，尤其当靶 序列浓度较低时，个别小体系中的靶序列相对浓度较平均浓度明显提高，相对 更易扩增；(c)小体系时本底荧光值较低，绝对测量偏差较小，因靶标扩增而 提升的荧光强度更易于和本底荧光相区分。

③利用本发明的方法，将各个反应容器设置为细长型，增加了光路检测距 离，监测信号光路从与孔长度方向平行采集，这样进一步提高各体系的荧光相 对强度，更有利于监测荧光强度的变化。

附图说明

图1为不同拷贝数的荧光定量扩增曲线图；

图2为本发明较佳实施例的反应容器与光束的设置关系示意图；

图3为按照本发明方法对HBV病毒进行30次循环后的荧光图，图中圆圈为 随机选择的一个阳性扩增小体系；

图4为本发明方法在图3中圆圈内的单个阳性扩增小体系经校正后的荧光 扩增曲线；

图5为按照常规荧光定量扩增方法进行30个循环后的检测结果。

图中，

1-分液芯片，2-反应孔，3-光束。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施方式进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能 更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的 界定。

采用常规的荧光定量PCR技术进行荧光定量扩增的扩增曲线：

不同初始拷贝数(1.0E8拷贝、1.0E7拷贝、1.0E6拷贝、1.0E5拷贝、1.0E4 拷贝、1.0E3拷贝)的靶核酸按照常规的荧光定量PCR技术进行扩增，荧光定量 扩增曲线如附图1所示，各拷贝数扩增的阈值突破的循环数分别是1.0E8的Ct 值为13.7，1.0E7的Ct值为17.2，1.0E6的Ct值为20.5，1.0E5的Ct值为23.7， 1.0E4的Ct值为27.0，1.0E3的Ct值为30.3。可以清楚的看到，当扩增模板 的拷贝数高于1.0E4时，Ct值均小于30个循环，即对于高浓度样本，30个循 环内可完成检测。而当扩增模板的拷贝数低于1.0E3时，则突破扩增的阈值多 于30个循环，无法满足POCT的快速检测需求。

按本发明的方法对PCR扩增结果进行判断

本发明以样品中的靶核酸的初始拷贝数为1.0E3、5E2和1.0E2为例进行说 明，初始扩增体系的体积为50μl，将待测样品平均分为1000份，并分别放置 于1000个反应容器中。参见图2所示，本实施例的反应容器为均匀设置于分液 芯片1上的1000个反应孔2，各个反应孔2为圆柱状，在进行荧光检测时，光 束3呈与反应孔2的高度方向相平行的方向射入反应孔2。每个反应孔2中的初 始拷贝数分别为1拷贝/孔、0.5拷贝/孔和0.1拷贝/孔，以每个反应孔2中的 初始拷贝数定义为λ，根据泊松分布表，以各个反应孔2的实际拷贝数为0-5时，各个反应孔2的数量为x，由此可得表1：

表1对应于不同拷贝数的反应孔的数量分布

由此，可见，在初始拷贝数为1.0E3时，将待测样品平分成1000份并于各 个反应孔2中单独反应后，能够保证至少有732个反应孔2中存在1-5个有效 模板。在初始拷贝数为0.5E3时，能够保证至少有393个反应孔2中存在1-5 个有效模板。在初始总拷贝数为1.0E2时，能够保证至少有95个反应孔2中存 在1-5个有效模板，并能得到阳性扩增结果，由此，即使PCR扩增前靶核酸的 初始拷贝数为1.0E2时，仍能在30个循环内得到阳性检测结果。

不同初始拷贝数情况下按照常规方法与本发明的方法在反应孔中的有效模 板浓度

以样品中的靶核酸的初始拷贝数为1.0E5、1.0E4、1.0E3、5E2、1.0E2和 10为例进行说明，初始扩增体系的体积为50μl，将待测样品平均分为1000份， 并分别放置于1000个反应孔2中。不同初始拷贝数情况下按照常规方法与本发 明的方法在反应孔2中的有效模板浓度如下表2所示：

表2不同初始拷贝数情况下按照常规方法与本发明的方法在反应孔中的有效模板浓度对比

由表2可见，对于初始拷贝数低于1.0E3的条件时，采用分液扩增后的单 个阳性小体系最高浓度均远超过了常规模式下的1.0E3水准，因此，均能够在30个循环内判定检测的结果。

采用常规单个反应体系的模式进行PCR扩增时，基线的判断只能参考突破 阈值前的若干循环数的数据作为背景，比如对于1.0E4的Ct值为27.0，则相当 于仅仅存在27个数据进行背景校正；而对于按照本发明的方法，通过采用分液 扩增的模式，将各个所述反应孔2内的样品的PCR循环过程的早期(例如5-10 个周期)的相邻循环所监测到的信号变化为基准荧光变化值Δa，当各个所述反 应孔2中的任意一个内的样品在连续两个循环中所检测的相邻循环的荧光增加 值Δb均超过基准荧光变化值Δa时，即可判定待检测样品的目标靶标为阳性。 因而，本实施例中，在将初始样本体系分为1000个反应体系后，每次循环都有 1000个背景数据，10个循环就有10000个背景数据用于校正。因而使得数据量 增大，因此能够更加准确的校正背景信号，从而更加灵敏的判断阳性扩增小体 系，进而判断检测结果。

对于循环数超过30个时，仍然没有阳性信号，相当于没有任何一个扩增小 体系中存在阳性扩增，因此可以判断为阴性。

利用ThermoFisher的芯片式数字PCR按照常规方法与按照本发明的方法在 达到检出水平时所需的循环数对比

初始样本体系为15μl，其中靶标的拷贝数为1000拷贝，将原来的15μl 体系分隔为20000个小体系。根据图1的荧光定量扩增曲线图，荧光曲线检出 的Ct值在30左右，此时，体系中的靶标为1万亿拷贝。因而，在达到检出水 平时，每个小体系中的靶标为5000万拷贝。

按照本发明的方法，若初始样本体系中存在靶标，则在将初始样本均分成N 份(以N＝1000为例)，则最终形成阳性扩增的反应体系在初始时至少存在至少1 个拷贝，因而，理论上只需要25.6个循环就可以达到5000万拷贝，从而达到 检出水平。理论上，还有一些反应体系中在初始时具有更多的靶标拷贝数，因 而，能够通过更少的循环即可达到检出水平，因而在样本中存在靶标时，能够 将判断结果提前数个循环，有效缩短了对样本的检测时间。按照本发明的方法， 每次循环都有N个背景数据，背景数据量大，因此能够更加准确的校正背景信 号，从而更加灵敏的判断阳性扩增小体系，进而判断检测结果。

因而，对于高浓度样本(初始拷贝数大于1.0E3)、低浓度样本(初始拷贝数 不超过1.0E3)和阴性样本，均能够在30个循环内判定检测结果。根据本申请人 所公开的PCR扩增模式(CN110029045A和CN109295183A)，每次PCR循环能够 控制在30秒以内，因此总的检测时长能够控制在900秒，即15分钟内完成。

作为本发明的一种优选的实施方式，本发明的各个反应孔2的高度大于其 直径，优选为高度是直径的2倍以上，因而能够有效的增加信号的集中度，从 而更容易被荧光监测设备检测到，有效提高了灵敏度。

实施例1：按照本发明方法和常规荧光定量方法对HBV病毒的靶标基因进行30 个PCR循环后的检测结果对比

分液芯片的参数为：孔的数量1000个，单个孔的直径为0.36mm，孔深为 0.5mm，单个孔的容积为50nl。

利用NCBI在线查找并设计HBV病毒特异性区域的引物/探针如下：

上游引物：5′-ATGTGTCTGCGGCGTTTTATC-3′(如SEQ ID No.1所示)

下游引物：5′-ACAMACGGGCAACATACCTT-3′(如SEQ ID No.2所示)

探针：FAM-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCT-HBQ1(如SEQ ID No.3所示)

初始扩增体系为50μl，以该区段的质粒为模板将靶标的浓度稀释为200拷 贝/μl(实际加入总的拷贝数为1000拷贝)，扩增体系如下：

相同的扩增体系共2份，一份按照本发明方法所述方法进行PCR扩增和荧 光变化检测，另一份按照常规荧光定量PCR方法在ABI7500扩增仪上进行检测， 两种方法均进行30个循环的扩增，PCR循环均按照以下温度循环进行。

实验结果为：按照本发明所述方法在检测终点时的荧光检测结果如附图3 所示，其中画圈处为随机挑选的阳性扩增小体系，经过前10个循环的荧光值校 正后，该小体系的扩增曲线如附图4所示。

利用ABI7500扩增仪按照常规荧光定量检测的扩增曲线如附图5所示。

两种检测方法检测到的实际扩增时间如表3所示。

表3利用本发明方法与常规的荧光定量PCR对HBV病毒扩增30个循环所用时间 对比

表中，t＝(T/30)-60-25,也即总的检测时长去除PCR循环过程的有效时间后， 均摊到每次循环的时间。

由此可证明按照本发明的扩增模式，在HBV病毒的靶标的初始拷贝数为1000 拷贝时，在30个循环内即可成功检测到阳性扩增结果，而按照常规荧光定量模 式，则在30个循环内无法得到检测结果。而且，完成30个PCR循环的用时， 本发明仅需要14min30s，而按照常规模式则需要33min30s。因此，按照本发明 的方法，无论在检测性能上，还是在检测时间上均具有明显的检测优势，符合 POCT的发展方向。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项 技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围， 凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围 内。

序列表

<110> 上海千履基因科技有限公司

<120> POCT的PCR结果快速获得方法及装置

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgtctgc ggcgttttat c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acamacgggc aacatacctt 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catcctgctg ctatgcctca tcttct 26

Claims (10)

1.一种POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，将待检测样品平均分成N份，将各个平分后的样品于相同的条件下同时进行荧光定量PCR扩增，并实时监测各个平分后的样品的荧光值，所述N为不小于100的自然数。

2.根据权利要求1所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，平分后的样品分别位于不同的反应容器内，各个所述反应容器均被放置于相同的空间内并处于同样的反应条件。

3.根据权利要求2所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，以各个所述反应容器内的样品的PCR循环过程的第n个循环以内的相邻循环所监测到的信号变化为基准荧光变化值Δa，当各个所述反应容器中的任意一个内的样品在连续两个循环中所检测的相邻循环的荧光增加值Δb均超过基准荧光变化值Δa时，即可判定待检测样品的目标靶标为阳性；当各个所述反应容器内的反应物的PCR循环次数达到预定值m时，仍然未检测到阳性扩增，则判定该样本检测的目标靶标为阴性，m为不超过50的自然数，n为不超过10的自然数。

4.根据权利要求2所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，在进行荧光检测时的检测光路沿着与各个所述反应容器的高度方向相平行的方向射入所述反应容器内，各个所述反应容器的高宽比不小于1。

5.根据权利要求2所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，各个所述反应容器的体积不超过1μl。

6.根据权利要求1所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，所述N不超过5000。

7.根据权利要求1所述的POCT的PCR结果快速获得方法，其特征在于，在进行检测时，当所述待检测样品中靶标的初始拷贝总数不超过1000拷贝时，对所述待检测样品的PCR循环数不超过30。

8.一种用于POCT的PCR结果快速获得的装置，其特征在于，具有N个反应腔室，所述N小于等于5000，大于等于100。

9.根据权利要求8所述的用于POCT的PCR结果快速获得的装置，其特征在于，包括分液芯片，各个所述反应腔室均设置在所述分液芯片上，所述反应腔室为柱状的反应孔，各个所述反应腔室的中心轴线相互平行，所述反应孔的高宽比大于1。

10.根据权利要求9所述的用于POCT的PCR结果快速获得的装置，其特征在于，荧光检测单元的检测光路与反应腔室的长度方向相平行。

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