CN110699463A - 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法 - Google Patents

红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110699463A
CN110699463A CN201911089432.3A CN201911089432A CN110699463A CN 110699463 A CN110699463 A CN 110699463A CN 201911089432 A CN201911089432 A CN 201911089432A CN 110699463 A CN110699463 A CN 110699463A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pink bollworm
detection
primer
detected
pcr amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911089432.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王金涛
许冬
王玲
丛胜波
杨妮娜
李文静
万鹏
吴孔明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Original Assignee
Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science filed Critical Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority to CN201911089432.3A priority Critical patent/CN110699463A/zh
Publication of CN110699463A publication Critical patent/CN110699463A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组，所述检测引物组包括下述第一引物组：上游引物r17allF：5′‑CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG‑3′；下游引物r17R：5′‑GGGCTCGATACTAAGCCCTG‑3′和第二引物组：上游引物r17allF：5′‑CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG‑3′；下游引物notr17R：5′‑GCTCGATACTAAGCCTCCCATC‑3′。上述红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法，可用于田间红铃虫种群是否携带抗性基因r17的检测以及携带的抗性基因r17个体基因型的检测。

Description

红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法
技术领域
本发明属于农业检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法。
背景技术
转Bt基因抗虫棉花(Bt棉)的大规模应用对棉田主要靶标害虫棉铃虫和红铃虫等表现出很好的防治效果。但Bt棉的连续大规模种植对靶标害虫造成了持续的选择压，尤其是对田间寄主单一的红铃虫。连续数年的抗性监测结果表明，我国红铃虫田间种群曾出现了初期抗性，抗性风险尤为迫切。因此，应用高效准确的抗性检测手段对田间抗性进行持续监测是延长Bt棉使用寿命和抗性治理的重要前提。
目前主要的害虫抗性监测方法包括敏感性测定法、诊断剂量法、F1单对杂交法、F2检测法和分子检测法。前面四种方法都是基于传统的害虫对毒素的生物测定原理，需要从田间采集活的试虫后，在室内进行大量饲养1～2代，并对其大量后代进行生物测定，缺点是检测周期长、人力和物力成本高、检测结果灵敏度低，导致不能及时有效地发现田间的早期抗性。而分子检测法不需要饲养试虫，不受样本状态限制，只需对试虫样本的DNA进行检测，结果稳定、灵敏度高，可对田间低频率的抗性基因进行有效地监测。
已有的研究表明，钙粘蛋白基因突变是引起红铃虫对Bt蛋白Cry1Ac毒素蛋白产生抗性的主要机制。而如何监测新型红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因，及时掌握田间红铃虫种群对Bt棉花的抗性发展情况，是延长Bt棉使用寿命和抗性治理的重要前提。
发明内容
针对如何监测新型红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因，及时掌握田间红铃虫种群对Bt棉花的抗性发展情况的技术问题，本发明提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法。
本发明提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组，所述检测引物组包括下述第一引物组：
上游引物r17allF：5′-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3′；
下游引物r17R：5′-GGGCTCGATACTAAGCCCTG-3′。
进一步可选地，所述检测引物组还包括下述第二引物组：
上游引物r17allF：5'-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3'；
下游引物notr17R：5'-GCTCGATACTAAGCCTCCCATC-3'。
本发明还提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的检测引物组。
本发明还提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测方法，所述检测方法采用如上所述的检测引物组、或如上所述的检测试剂盒进行PCR扩增。
在其中的一个实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
提取待测红铃虫基因组DNA；
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第一引物组进行PCR扩增处理，获得第一PCR扩增产物；
对所述第一PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第一DNA电泳图谱，根据所述第一DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17。
在其中的一个实施例中，所述检测方法还包括以下步骤：
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第二引物组进行PCR扩增处理，获得第二PCR扩增产物；
对所述第二PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第二DNA电泳图谱，根据所述第二DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型。
在其中的一个实施例中，所述PCR扩增处理的反应体系如下：
Figure BDA0002266419670000031
在其中的一个实施例中，所述PCR扩增处理的条件如下：
94℃预变性2min；然后为35个循环：94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃充分延伸10min后，4℃保存。
在其中的一个实施例中，所述待测红铃虫包括红铃虫幼虫、红铃虫蛹以及红铃虫成虫中的任意一种。
在其中的一个实施例中，所述检测方法还包括以下步骤：根据所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17的检测结果以及所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型检测结果判断所述待测红铃虫种群内抗性基因频率。
上述红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法，可用于田间红铃虫种群是否携带抗性基因r17的检测以及携带的抗性基因r17个体基因型的检测。该检测方法相较于传统的基于生物测定的抗性检测方法，具有不需要饲养试虫、不受虫态限制、检测周期短、检测结果灵敏度高等优点。本方法的检测结果能够为棉田红铃虫的抗性水平监测和制定抗性治理策略提供依据。
附图说明
图1抗性等位基因r17的突变位点及蛋白结构示意图。其中，A：组成钙粘蛋白等位基因的34个外显子，黑色三角符号表示突变位点所在位置；B：r17的突变位点及推测的钙粘蛋白结构域示意图，黑色下划线部分为变异序列，黑色三角符号表示变异位点。
图2抗性等位基因r17与敏感基因BtR-s partial gDNA序列比对图。黑色方框内为与r17的cDNA突变区域对应的外显子6区域变异部分。
图3抗性等位基因r17的检测与基因型鉴定电泳图。利用第一引物组可扩增出1187bp的DNA条带，说明该样品携带抗性等位基因r17；利用第二引物组合不能扩增出1187bp的DNA条带，则说明该个体的基因型为抗性纯合子(r17r17)。M表示DL2000 DNAmarker，从上至下依次为2000，1000，750，500，250，100bp。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。
钙粘蛋白基因突变是引起红铃虫对Bt蛋白Cry1Ac毒素蛋白产生抗性的主要机制。目前已报道的红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因共有16个，其GenBank登录号如表1所示。这些抗性等位基因的突变类型包括DNA插入、缺失突变以及mRNA可变剪接等。
表1已报道的红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因
Figure BDA0002266419670000051
Figure BDA0002266419670000061
Figure BDA0002266419670000071
本发明从长江流域棉区筛选了一个新的红铃虫Cry1Ac抗性品系TM6，具有280倍的Cry1Ac抗性。通过克隆测序对其突变位点和抗性机制进行了鉴定，结果表明该品系红铃虫的钙粘蛋白基因发生了缺失突变，从而对Cry1Ac蛋白不敏感，其突变位点具体如下：与红铃虫敏感品系AS的钙粘蛋白等位基因(登录号：AY198374.1)相比，抗性品系TM6的钙粘蛋白基因cDNA第627-628bp发生了碱基替换(TG-CA)，第631-632bp缺失2个碱基“AG”(位于外显子6)。由于非3倍数的DNA缺失导致开放阅读框发生移码，并在第634-636bp产生终止密码子“TAG”，从而导致后续的氨基酸翻译提前终止。敏感品系红铃虫钙粘蛋白氨基酸序列全长1735AA，而TM6品系由于氨基酸翻译提前终止而只有211AA，缺失了钙粘蛋白重复序列CR2之后包括近膜区、跨膜区及胞质区在内的所有结构，TM6品系与红铃虫敏感品系相比，区别如图1所示。其中，A为组成钙粘蛋白等位基因的34个外显子，黑色三角符号表示突变位点所在位置；B为r17的突变位点及推测的钙粘蛋白结构域示意图，黑色下划线部分为变异序列，黑色三角符号表示变异位点。
在基因组DNA序列上，TM6品系红铃虫与敏感品系红铃虫相比，gDNA上的突变情况与其cDNA突变一致，突变情况如图2所示。基因序列比对结果表明，该等位基因与已报道的16个红铃虫钙粘蛋白抗性等位基因均不相同，是一种新的抗性等位基因，将其命名为r17(cDNA登录号：MK650130.1，partial gDNA登录号：MK650132.1)。
为检测田间红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17并鉴定其基因型，发明人开发了基于gDNA的抗性等位基因r17的PCR检测技术。根据抗性品系TM6与敏感品系AS在钙粘蛋白gDNA序列的差异，设计了基因特异性引物，通过组合，分别用于检测一个红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17以及其所携带r17个体的基因型是纯合子还是杂合子。
正是基于上述发现和原理，如表2所示，本发明提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组，该检测引物组包括下述第一引物组：
上游引物r17allF：5′-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3′；
下游引物r17R：5′-GGGCTCGATACTAAGCCCTG-3′。
进一步可选地，该检测引物组还包括下述第二引物组：
上游引物r17allF：5'-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3'；
下游引物notr17R：5'-GCTCGATACTAAGCCTCCCATC-3'。
表2抗性等位基因r17的检测引物组
Figure BDA0002266419670000091
上述红铃虫抗性等位基因r17检测引物组，可用于田间红铃虫种群是否携带抗性基因r17的检测以及携带的抗性基因r17个体基因型的检测。该检测方法相较于传统的基于生物测定的抗性检测方法，具有不需要饲养试虫、不受虫态限制、检测周期短、检测结果灵敏度高等优点。
本发明的第二大方面提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的检测引物组。
可选地，该检测试剂盒还可包括DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板以及阴性质控标准品。
本发明的第三大方面提供了一种红铃虫抗性等位基因r17检测方法，该检测方法采用上述的检测引物组、或如上所述的检测试剂盒进行PCR扩增。
具体可选地，该检测方法包括以下步骤：
提取待测红铃虫基因组DNA；
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第一引物组进行PCR扩增处理，获得第一PCR扩增产物；
对所述第一PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第一DNA电泳图谱，根据所述第一DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17。
可选地，所述检测方法还包括以下步骤：
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第二引物组进行PCR扩增处理，获得第二PCR扩增产物；
对所述第二PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第二DNA电泳图谱，根据所述第二DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型。
作为一种可选实施方式，所述PCR扩增处理的反应体系如下：
Figure BDA0002266419670000101
作为一种可选实施方式，所述PCR扩增处理的条件如下：
94℃预变性2min；然后为35个循环：94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃充分延伸10min后，4℃保存。
作为一种可选实施方式，所述待测红铃虫包括红铃虫幼虫、红铃虫蛹以及红铃虫成虫中的任意一种。
作为一种可选实施方式，所述检测方法还包括以下步骤：根据所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17的检测结果以及所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型检测结果判断所述待测红铃虫种群内抗性基因频率。
1.实验仪器与试剂
实验试剂：基因组DNA提取试剂盒购于北京天根生物科技有限公司。LA Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA marker均购于宝生物工程(TaKaRa)大连有限公司。
实验仪器：普通PCR仪购于东胜创新科技有限公司，凝胶成像仪购于美国伯乐Bio-Rad公司，电泳仪购于北京六一仪器厂。
2.检测引物组
第一引物组：用于检测红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17(包含抗性纯合子和抗性杂合子个体)。
上游引物r17allF：5'-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3'
下游引物r17R：5'-GGGCTCGATACTAAGCCCTG-3'
第二引物组：用于鉴定携带r17个体的基因型是纯合子还是杂合子。
上游引物r17allF：5'-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3'
下游引物notr17R：5'-GCTCGATACTAAGCCTCCCATC-3'
3.检测方法
步骤一，提取待测红铃虫基因组DNA；
利用血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(#DP304-03，北京天根生物科技有限公司)，采用单头提取基因组DNA的方法，提取待测红铃虫样本(幼虫、蛹或成虫)的基因组DNA。实验操作按照试剂盒说明书进行。
步骤二，以提取的待测红铃虫基因组DNA为模板，分别使用第一引物组以及第二引物组进行PCR扩增处理，获得第一PCR扩增产物以及第二引物产物。
第一引物组以及第二引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，PCR反应体系为25μL，组分配比如表3所示。
以提取的待测红铃虫基因组DNA为模板，用第一引物组以及第二引物组分别进行PCR反应，其扩增的参数如下：94℃预变性2min；然后为35个循环：94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃充分延伸10min后，4℃保存。
表3 PCR反应体系组分配比
Figure BDA0002266419670000121
Figure BDA0002266419670000131
步骤三，对第一PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第一DNA电泳图谱，根据所述第一DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17。
对第二PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第二DNA电泳图谱，根据所述第二DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型。
将第一PCR扩增产物以及第二PCR扩增产物分别经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像系统进行成像，根据扩增的目的DNA条带判断是否含有抗性等位基因r17以及含有的抗性等位基因r17类型。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002266419670000141
步骤四，结果判定
第一引物组(r17allF+r17R)可检测出红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17：携带r17的个体可扩增出1187bp的DNA条带，而未携带r17的个体不能扩增出DNA条带；第二引物组(r17allF+notr17R)可鉴定出携带r17的抗性个体的基因型：对上一步结果中携带r17抗性等位基因的个体进行PCR扩增，杂合子个体能扩增出1187bp的DNA条带，而抗性纯合个体不能扩增出DNA条带。
首先，用第一引物组(r17allF+r17R)可检测出红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17：如图3中的左半部分所示，可扩增出1187bp目的DNA条带的视为携带r17的个体(r17r17/r17s)，而不能扩增出相应的DNA条带的视为未携带r17的个体(ss)。
其次，在携带r17抗性等位基因的个体中，利用第二引物组(r17allF+notr17R)进行PCR扩增：如图3中右半部分所示，如能扩增出1187bp的DNA条带，则该抗性个体的基因型为抗性杂合子(r17s)；若不能扩增出对应的DNA条带，则该个体的基因型为抗性纯合子(r17r17)。
通过上述结果可以得出，本发明的第一引物组以及第二引物组可检测一个红铃虫个体是否携带抗性等位基因r17及鉴定携带r17个体的基因型是纯合子还是杂合子。
进一步可选地，本发明可用于抗性等位基因r17的鉴定及红铃虫田间种群抗性等位基因r17的基因频率检测。
步骤五，红铃虫田间种群r17抗性基因频率的计算
r17抗性基因频率的计算方式为：Fr17＝(抗性杂合子个体数+抗性纯合子个体数×2)/(红铃虫检测个体总数×2)。
例如，在检测的1000个田间红铃虫个体中，抗性杂合子r17s的个数为10，抗性纯合子r17r17的个数为2，那么r17的抗性基因频率为Fr17＝(10+2×2)/(1000×2)＝0.007。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种红铃虫抗性等位基因r17检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包括下述第一引物组：
上游引物r17allF：5′-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3′；
下游引物r17R：5′-GGGCTCGATACTAAGCCCTG-3′。
2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组还包括下述第二引物组：
上游引物r17allF：5'-CTAAGTCCAGAGATCCGGAATG-3'；
下游引物notr17R：5'-GCTCGATACTAAGCCTCCCATC-3'。
3.一种红铃虫抗性等位基因r17检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1或2所述的检测引物组。
4.一种红铃虫抗性等位基因r17检测方法，其特征在于，所述检测方法采用如权利按要求1或2所述的检测引物组、或如权利要求3所述的检测试剂盒进行PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
提取待测红铃虫基因组DNA；
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第一引物组进行PCR扩增处理，获得第一PCR扩增产物；
对所述第一PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第一DNA电泳图谱，根据所述第一DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括以下步骤：
以所述待测红铃虫基因组DNA为模板，使用所述第二引物组进行PCR扩增处理，获得第二PCR扩增产物；
对所述第二PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，获得第二DNA电泳图谱，根据所述第二DNA电泳图谱判断所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增处理的反应体系如下：
Figure FDA0002266419660000021
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增处理的条件如下：
94℃预变性2min；然后为35个循环：94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃充分延伸10min后，4℃保存。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述待测红铃虫包括红铃虫幼虫、红铃虫蛹以及红铃虫成虫中的任意一种。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括以下步骤：
根据所述待测红铃虫基因组DNA是否携带红铃虫抗性等位基因r17的检测结果以及所述待测红铃虫基因组DNA携带的抗性等位基因r17类型检测结果判断所述待测红铃虫种群内抗性基因频率。
CN201911089432.3A 2019-11-08 2019-11-08 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法 Pending CN110699463A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911089432.3A CN110699463A (zh) 2019-11-08 2019-11-08 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911089432.3A CN110699463A (zh) 2019-11-08 2019-11-08 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110699463A true CN110699463A (zh) 2020-01-17

Family

ID=69205563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911089432.3A Pending CN110699463A (zh) 2019-11-08 2019-11-08 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110699463A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178578A (zh) * 2014-09-09 2014-12-03 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒
CN105671193A (zh) * 2016-04-13 2016-06-15 湖北省农业科学院植保土肥研究所 一种红铃虫抗性基因aq65检测引物组、试剂盒及使用方法
CN105671194A (zh) * 2016-04-13 2016-06-15 湖北省农业科学院植保土肥研究所 一种红铃虫抗性基因aq47检测引物组、试剂盒及使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178578A (zh) * 2014-09-09 2014-12-03 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒
CN105671193A (zh) * 2016-04-13 2016-06-15 湖北省农业科学院植保土肥研究所 一种红铃虫抗性基因aq65检测引物组、试剂盒及使用方法
CN105671194A (zh) * 2016-04-13 2016-06-15 湖北省农业科学院植保土肥研究所 一种红铃虫抗性基因aq47检测引物组、试剂盒及使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEFFREY A. FABRICK等: "Reduced cadherin expression associated with resistance to Bt toxin Cry1Ac in pink bollworm", 《PEST MANAGEMENT SCIENCE》 *
JINTAO,W.等: "Pectinophora gossypiella strain TM6 cadherin (Cad1) mRNA, complete cds", 《GENBANK》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109468315B (zh) 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
CN110257510A (zh) 一种检测apoe基因多态性的引物和探针及试剂盒
CN111926100B (zh) 一种水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用
AU2004204182A1 (en) Selecting animals for desired genotypic or potential phenotypic properties based on a single nucleotide polymorphism (SNP) in intron 3 of the IGF2 gene
CN107365850A (zh) 一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法
CN108456743B (zh) 与大豆开花期和成熟期相关的snp标记及其检测引物、方法与应用
CN111455066B (zh) 一种与猪肉质电导率性状相关的遗传分子标记
CN110144412B (zh) 一种与南阳牛生长相关的cnv标记的检测方法及其应用
CN113981126B (zh) 与控制辣椒果实Vc含量基因连锁的SNP分子标记KQ8-4472及应用和专用引物
CN113881802B (zh) 与控制辣椒果实Vc含量基因连锁的SNP分子标记KQ8-3918及应用和专用引物
Hu et al. Fine mapping of a major quantitative trait locus, qgnp7 (t), controlling grain number per panicle in African rice (Oryza glaberrima S.)
CN110699463A (zh) 红铃虫抗性等位基因r17检测引物组、试剂盒以及检测方法
CN108251419B (zh) 与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P23、试剂盒及其应用
CN114875157B (zh) 与黄颡鱼个体生长性状相关的snp标记及应用
CN106434875A (zh) 一种水稻表皮毛调控基因gl1的分子标记及其应用
CN110468226B (zh) 杨树抗叶锈病的分子标记及其应用
CN112210607B (zh) 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用
CN108546778B (zh) 一种用于检测黄瓜抗白粉病性状的snp分子标记及其应用
CN110819701A (zh) 用于荧光定量pcr检测cyp2d6基因多态性的方法
CN116622862B (zh) 棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的方法
JP2021052714A (ja) バラタナゴ類の判別方法及び判別キット
CN104726577A (zh) 一种与二花脸母猪产仔性状相关的snp标记及其检测方法
CN107099591B (zh) 水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其应用
CN113801946B (zh) 一种影响母猪繁殖性能的分子标记、检测方法及其应用
CN107099590A (zh) 水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel2及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200117