CN110687232A - 用高效液相色谱检测l-氯糖差向异构体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用高效液相色谱法检测L‑氯糖差向异构体的方法，该方法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为调料的色谱柱，用双流动相，即流动相A和流动相B进行梯度洗脱，分离效果好，操作简便易行；本发明采用特定稀释剂以保证L‑氯糖在检测过程中稳定的稳定性。试验结果证明本发明的色谱条件和试验方法能够有效分离L‑氯糖和其差向异构体，并且可以有效抑制L‑氯糖在分析过程中的降解，从而准确测定L‑氯糖及其差向异构体的含量。

Description

用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法。

背景技术

替比夫定片（Telbivudine）是由诺华制药于2006年10月25日在美国审批通过，商品名“TYZEKA”（素比伏），主要用于有病毒复制证据以及有血清转氨酶(ALT或AST)持续升高或肝组织活动性病变证据的慢性乙型肝炎成人患者。对核苷类似物逆转录酶抑制剂耐药的慢性乙型肝炎患者，尚无应用替比夫定的设计良好的对照研究，但估计其可能与拉米夫定存在交叉耐药。替比夫定属于美国FDA药物妊娠安全性分类的B类药物。临床前研究中替比夫定无致畸性，且显示其对胚胎和胎仔发育无不良作用。其原料药于2007年2月15日以化药1.1类批准上市销售。L-氯糖为合成替比夫定的起始物料。

L-氯糖有3个手性中心，其本身是一种α构型，其差向异构体为β构型（杂质A），其含量直接影响目标产物替比夫定的收率及质量，但目前并没有关于L-氯糖的差向异构体的分析文献报道。

发明内容

L-氯糖在合成的过程中可能引入的有关物质主要有4个，包括起始物料、中间体及副产物，其结构如下：

有关物质3

为了保证替比夫定原料的收率及质量，严格控制其异构体的限度，同时弥补现有技术缺乏对L-氯糖差向异构体分离分析技术的不足，本发明的发明人开发了一种利用高效液相色谱法分离L-氯糖差向异构体的方法，从而保证L-氯糖的收率，进而保证其作为起始物料的目标产物-替比夫定的收率及质量可控性。

在研究过程中，本发明的发明人发现，因为L-氯糖本身不够稳定，用甲醇或乙腈对其进行溶解的过程中，会和溶剂发生反应进而降解，产生新的杂质，严重干扰对其本身质量的评估，造成检测结果不准确，数据不可靠，不能反应L-氯糖的真实情况。

经过大量实验和研究对溶剂进行筛选，本发明的发明人最终获得一种最佳的溶剂配比，以及一种检测L-氯糖差向异构体的高效液相色谱检测方法，能够保证L-氯糖在检测期间的稳定性以及检测结果的准确度，能够实现L-氯糖和其差向异构体的有效分离，还能够准确测定此异构体的限度，专属性强，灵敏度高，该操作方法简单，具有简便、快速的优点。所述方法包括如下步骤：

1）配置L-氯糖的对照品溶液和供试品溶液；

2)用高效液相色谱检测系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，色谱条件：使用C18色谱柱;采用双流动相，即流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为缓冲盐溶液，所述流动相B为有机相溶液；

3) 根据供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，确定供试品溶液中有关物质的限度。

本发明用高效液相色谱法检测L-氯糖差向异构体，在对系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液配制的过程中，要用到特定的稀释剂。

所述缓冲盐溶液为磷酸铵缓冲液和醋酸铵缓冲液的一种，优选为醋酸铵缓冲液。

所述有机相为乙腈溶液和甲醇溶液的一种，优选为乙腈溶液。

所述特定的稀释剂为一定浓度的乙腈溶液，优选为50%乙腈溶液。

作为优选，所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.01N至0.02N，优选为0.01N。

在本发明的一些实施例中，步骤2）所述梯度洗脱的条件为：

0-20min，流动相A相所占的体积比为：（30%~50%）→10%，流动相B相所占的体积比为(50%~70%)→90%；

20-25min，流动相A相所占的体积比为：10%，流动相B相所占的体积比为90%；

25-26min，流动相A相所占的体积比为：10%→（30%~50%），流动相B相所占的体积比为90%→ (50%~70%)；

26-35min，流动相A相所占的体积比为：40%，流动相B相所占的体积比为：60%。

作为优选，高效液相色谱系统进行检测的进样体积为10~20μL，流动相流速为0.9~1.1ml/min，色谱柱的柱温为29~35℃，理论塔板数按L-氯糖色谱峰计算不低于5000。

作为优选，高效液相色谱系统的检测器为紫外检测器，检测波长为240nm。

作为优选，上述步骤1）每1ml所述系统适用性溶液含0.4mg的L-氯糖和12μg的差向异构体/0.4μg的有关物质3对照品，每1ml所述对照品溶液含12μg的差向异构体对照品和0.4μg的有关物质3对照品，每1ml所述供试品溶液含0.4mg的L-氯糖样品。

根据本发明提供的高效液相色谱条件，本领域技术人员可以选择适宜的计算方法计算L-氯糖含量和其差向异构体的含量，所述计算方法包括但不限于内标法、外标法。

本发明的一些实施例采用杂质对照品外标法确定差向异构体限度，具体方法如下：

1）配制流动相：分别配制流动相A和流动相B,以0.01N的醋酸铵缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B;

2)对照品溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用50%乙腈溶解，分别制成每1ml约含12μg的差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

3）系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖对照品、L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用50%乙腈溶解，制成每1ml约含0.4mg的L-氯糖和12μg的L-氯糖差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

4）供试品溶液的制备：取L-氯糖样品，精密称定，加50%乙腈溶解，制成每1ml约含0.4mg的样品溶液。

5）分别取步骤4）所述的供试品溶液、步骤3）所述的系统适用性溶液和步骤2）所述的对照品溶液10μL，注入分离检测系统中，完成L-氯糖的差向异构体及有关物质3的检测。

其中所述高效液相色谱条件如下：

使用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A、B进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10~20μL，流动相流速为0.9~1.1ml/min，色谱柱的柱温为29~35℃。

所述梯度程序如下：

根据步骤5检测的色谱结果，采用外标法计算方法计算L-氯糖差向异构体及有关物质3的含量。

试验结果证明本发明选用的色谱条件能较好地分离主成分及其差向异构体、有关物质3，方法简便易行；系统适用性好，准确度好，回收率高，L-氯糖差向异构体在4.8μg/ml至24μg/ml范围内具有良好的线性相关性，有关物质3在0.16μg/ml至0.8μg/ml范围内具有良好的线性相关性，筛选出的溶剂能有效防止L-氯糖的降解，稳定性好，从而准确检测出其差向异构体及有关物质3的含量，对替比夫定合成过程中的质量控制做出指导；为科技工作者分析方法开发过程中对溶剂的筛选提供参考，尤其是在L-氯糖类似结构药物的色谱分析工作中，对溶剂的选择具有一定指导意义。

附图说明

图1为本发明实施例中50%乙腈作溶剂的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图2为本发明实施例中50%乙腈作溶剂的对照品溶液的高效液相色谱图。

图3为本发明实施例中50%乙腈作溶剂的样品溶液的高效液相色谱图。

图4为本发明实施例中甲醇作溶剂样品溶液的高效液相色谱图。

图5为本发明实施例中乙腈作溶剂的样品溶液高效液相色谱图。

图6为本发明实施例中80%乙腈作溶剂的样品高效液相色谱图。

图7为本发明实施例中60%乙腈作溶剂的样品高效液相色谱图。

图8为本发明实施例中40%乙腈作溶剂的样品高效液相色谱图；图9为本发明有关物质3线性图；图10为L-氯糖差向异构体线性图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以本领域常规技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例检测的L-氯糖及其差向异构体结构为：

氯朝下为L-氯糖，氯朝下为其差向异构体

实施例1

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Thermo Hypercarb（150*4.6mm，5μm）；色谱柱柱温30℃；以0.01N醋酸铵缓冲盐溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为240nm；

用甲醇作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖对照品、L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用甲醇溶解，制成每1ml约含0.4mg的L-氯糖和12μg的L-氯糖差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

对照品溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用甲醇溶解，分别制成每1ml约含12μg的差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

供试品溶液的制备：取L-氯糖样品，精密成定，加甲醇溶解，制成每1ml约含0.4mg的样品溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、样品溶液各10μL,分别于0h/12h进样测定，记录色谱图，代表图见图4。

试验结果表明，用甲醇作溶剂测得的0h：L-氯糖含量为95.03%；其差向异构体（杂质A）含量为4.30%；未知杂质Rt8.978min的含量为0.13%；12h：L-氯糖含量为94.11%；其差向异构体（杂质A）含量为4.42%；未知杂质Rt8.978min的含量为0.94%，即在此分析方法下，L-氯糖不稳定，降解成了未知杂质Rt8.978min。

实施例2

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Thermo Hypercarb（150*4.6mm，5μm）；色谱柱柱温30℃；以0.01N醋酸铵缓冲盐溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为240nm；

用乙腈作稀释剂，洗脱程序同上。

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖对照品、L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用乙腈溶解，制成每1ml约含0.4mg的L-氯糖和12μg的L-氯糖差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

对照品溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用乙腈溶解，分别制成每1ml约含12μg的差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

供试品溶液的制备：取L-氯糖样品，精密成定，加乙腈溶解，制成每1ml约含0.4mg的样品溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图5。

试验结果表明，用乙腈作溶剂测得的L-氯糖含量为64.99%；其差向异构体（杂质A）含量为1.02%；未知杂质Rt2.12min的含量为10.89%；未知杂质Rt7.125min的含量为0.1%；未知杂质Rt8.735min的含量为0.225%；未知杂质Rt14.903min的含量为0.28%即在此分析方法下，L-氯糖及其不稳定，降解成了未知杂质Rt2.12min等。

试验结果表明，用纯乙腈作溶剂，L-氯糖显著降解，检测纯度只有64.99%，方法不能反应L-氯糖及其差向异构体的真实情况。

实施例3

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Thermo Hypercarb（150*4.6mm，5μm）；色谱柱柱温30℃；以0.01N醋酸铵缓冲盐溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为240nm；

分别用80%乙腈、60%乙腈、50%乙腈、40%乙腈作稀释剂，洗脱程序同上：

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖对照品、L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用上述溶剂溶解，制成每1ml约含0.4mg的L-氯糖和12μg的L-氯糖差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

对照品溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用上述溶剂溶解，分别制成每1ml约含12μg的差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

供试品溶液的制备：取L-氯糖样品，精密成定，加溶剂溶解，制成每1ml约含0.4mg的样品溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图6/7/8。

用80%乙腈、60%乙腈、40%乙腈作溶剂测得的L-氯糖含量分别为98.74%、98.66%、98.62%；其差向异构体（杂质A）含量分别为1.0%、0.99%、1.0%；未知杂质Rt7.125min的含量分别为0.15%/0.15%/0.15%、；未知杂质Rt14.903min的含量为0.11%、0.11%、0.11%%。

试验结果表明，采用乙腈与水不同比例的混合液作溶剂测得的结果一致，证明采用乙腈与水的混合液作溶剂可以有效的抑制L-氯糖的降解。

实施例4

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Thermo Hypercarb（150*4.6mm，5μm）；色谱柱柱温30℃；以0.01N醋酸铵缓冲盐溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为240nm；

用50%乙腈作稀释剂。洗脱程序同上：

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖对照品、L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用50%溶解，制成每1ml约含0.4mg的L-氯糖和12μg的L-氯糖差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

对照品溶液的制备：精密称定一定量的L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品，用50%乙腈溶解，分别制成每1ml约含12μg的差向异构体以及0.4μg的有关物质3对照品溶液。

供试品溶液的制备：取L-氯糖样品，精密成定，加50%乙腈溶解，制成每1ml约含0.4mg的样品溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图1/2/3。

用50%乙腈作溶剂测得的L-氯糖含量为98.77%；其差向异构体（杂质A）的含量为0.98%；未知杂质Rt7.125min的含量分别为0.14%；未知杂质Rt14.903min的含量为0.11%。

试验结果表明，采用50%乙腈作溶剂配制后14h与0h测得的结果一致，证明采用50%乙腈作溶剂不仅可以有效的抑制L-氯糖的降解，而且在此条件下L-氯糖在14h内稳定。

本实施例中，技术方法论证如下：

一、该方法的系统适用性

从表中可以看出，重复进样对照品溶液中，杂质3峰面积RSD%为0.46，L-氯糖差向异构体峰面积RSD%为0.33，符合标准RSD%(不大于2.0)；系统适用性溶液中，L-氯糖和各杂质间的最小分离度为4.15（不小于1.5）；由此可见，结果符合系统适用性要求。

二、该方法的检测限、定量限

从表中可以看出，L-氯糖差向异构体及有关物质3的检测限浓度分别为0.02μg/ml、0.6μg/ml；定量限浓度分别为0.04μg/ml、1.2μg/ml；二者定量限RSD%分别为3.31和3.71。标准RSD%(小于5.0%)，由此可见，检测限定量限验证符合要求。

三、该方法的线性

由附图9、附图10可以看出L-氯糖差向异构体在4.8μg/ml至24μg/ml范围内具有良好的线性相关性，有关物质3在0.16μg/ml至0.8μg/ml范围内，线性良好，相关系数R² >0.99。

四、该方法的回收率和精密度

取L-氯糖差向异构体对照品及有关物质3对照品配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表2。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.2%〜101.0 %，相对标准偏差为0.93%〜 1.53%，结果见表2。

五、该方法的对照品溶液稳定性

从表中可以看出，对照品溶液中L-氯糖差向异构体及有关物质3在24h内峰面积的RSD%符合标准（小于2.0），对照品溶液在24h内稳定。

综合上述验证试验，本实施例的系统适用性、检测限，定量限、线性、溶液稳定性、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测L-氯糖中的差向异构体及有关物质3，重现性良好。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式作出各种改变、替换和变更。

Claims (8)

1.一种用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，包括如下步骤：

1）配制系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液；

2）用高效液相色谱检测系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，色谱条件：使用C18色谱柱;采用双流动相，即流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为缓冲盐溶液，所述流动相B为有机相溶液；

3）根据供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，确定供试品溶液中有关物质的限度。

2.根据权利要求1所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液的配制要用特定的稀释剂。

3.根据权利要求1所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于所述缓冲盐溶液为磷酸铵缓冲液和醋酸铵缓冲液的一种，优选为醋酸铵缓冲液。

4.根据权利要求1所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于所述有机相为乙腈溶液和甲醇溶液的一种，优选为乙腈溶液。

5.根据权利要求2所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于所述特定的稀释剂为一定浓度的乙腈溶液，优选为50%乙腈溶液。

6.根据权利要求3所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.01N至0.02N，优选为0.01N。

7.根据权利要求1所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于：步骤2）所述梯度洗脱的条件为：

0-20min，流动相A相所占的体积比为：（30%~50%）→10%，流动相B相所占的体积比为(50%~70%)→90%；

20-25min，流动相A相所占的体积比为：10%，流动相B相所占的体积比为90%；

25-26min，流动相A相所占的体积比为：10%→（30%~50%），流动相B相所占的体积比为90%→ (50%~70%)；

26-35min，流动相A相所占的体积比为：40%，流动相B相所占的体积比为：60%。

8.根据权利要求1所述的用高效液相色谱检测L-氯糖差向异构体的方法，其特征在于：

所述异构体的结构为：

。

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