CN110585172A - 一种双靶向纳米微囊的制备方法及抗肿瘤应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双靶向纳米微囊的制备方法及抗肿瘤应用，该方法包括如下步骤：(1)将活性成分、PLGA、Maleimido‑PEG2000‑N‑hydroxysuccinimide、靶向肽用有机溶剂溶解，得混合溶液；(2)调节结晶釜的温度和压力，待两者稳定后，打开CO2气体出口阀调节体积流量；(3)将混合溶液喷入高压结晶釜，注入完毕后，维持设定温度及压力并继续通入CO23h以上；(4)卸压即得。本方法具有安全、环保、高效等优点，所制备的双靶向纳米微囊具备高载药量以及高效靶向杀伤胶质瘤细胞的能力，同时具有良好的缓释性能，可作为长效注射制剂应用于靶向治疗肿瘤疾病。

Description

一种双靶向纳米微囊的制备方法及抗肿瘤应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种双靶向纳米微囊的制备方法及抗肿瘤应用。
背景技术
药物粒径是决定药物的给药途径的一个重要参数，尤其是治疗脑部肿瘤疾病。由于血脑屏障(BBB)的存在，导致98％以上药物无法穿透BBB从而到达有效病灶。当前治疗肿瘤的广谱药物如紫杉醇、多烯紫杉醇以及雷公藤红素等很难穿透BBB从而治疗脑部疾病。而采用超临界流体增强溶液分散技术制备靶向纳米制剂，可以通过控制工艺参数调节粒度范围在50-800nm，这就纳米制剂能够有效穿透BBB，同时通过修饰靶向多肽配体能够实现同时靶向神经毡蛋白-1(NRP1)及整合素(αvβ3)，从而高效跨越BBB并靶向杀伤脑肿瘤细胞。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇双靶向纳米微囊载药量低、多肽挂载率低、产品粒度分布不均匀、产品形貌不均一以及产率低的缺点，提供一种双靶向纳米微囊的制备方法及抗肿瘤应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种双靶向纳米微囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活性成分、PLGA、Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide、靶向肽用有机溶剂溶解至适宜浓度，得混合溶液；其中，所述活性成分为雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇中的任一种，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的混合溶剂，所述靶向肽序列为：RGDCGNKRTRRGD，序列中R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸，C为半胱甘酸，N为天冬酰胺，K为赖氨酸，T为苏氨酸；
(2)打开超临界高压结晶釜的气体进口阀，启动高压结晶釜加热套，待达到设定的温度，维持该温度1h以上，启动高压泵将二氧化碳钢瓶中的CO2泵入高压反应釜，待釜内温度和压力稳定后，打开二氧化碳气体出口阀，并调节至一定体积流量；
(3)通过恒流泵将上述制备的混合溶液经由同轴喷嘴喷入高压结晶釜，并按照步骤(2)中的体积流量继续通入CO2，待适量溶液注入完毕，关闭恒流泵，维持设定温度及压力并继续通入CO23h以上，将高压结晶釜内有机溶剂充分带走；
(4)最后缓慢卸压，打开高压结晶釜，纳米微囊最终均匀的分布在高压结晶釜釜底以及釜壁，得到双靶向纳米微囊。
进一步地，所述有机溶剂中二甲基亚砜的体积百分含量为0.1％-5％，丙酮的体积百分含量为1％-30％，乙醇的体积百分含量为1％-10％。
进一步地，所述有机溶剂中二氯甲烷、丙酮、乙醇、二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1或20:1:1:1或10:5:5:10或20:20:5:5。
进一步地，混合溶液的浓度为0.1mg/mL-20mg/mL。
进一步地，所述超临界高压结晶釜内的压力为7-18Mpa，超临界高压结晶釜内的温度为35-45℃。
进一步地，CO2体积流量为4-8L/min。
进一步地，所述同轴喷嘴的内轴内径为20-100μm，外轴内径为0.05-1cm。
上述任一所述制备方法制备的双靶向纳米微囊在抗脑肿瘤中的应用。
有益效果：
1、本发明以具有良好生物相容性的PLGA为包埋载体，包埋抗肿瘤药物雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇，通过超临界增强溶液分散技术制备纳米微囊，同时将靶向配体修饰于PLGA纳米微囊表面，具有安全、环保、高效，且有机溶剂残留低等优点。
2、本发明制备方法可以制备得到载药量高、多肽挂载率高、粒径分布均匀、形貌均一的雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇双靶向纳米微囊，且该制备方法的产率高，制备得到的双靶向纳米微囊具有良好的缓释性能，可以用于制备长效注射制剂应用于肿瘤靶向治疗，尤其是脑肿瘤。该制备方法的优异效果取决于方法参数尤其是有机溶剂的种类和配比。
附图说明
图1为实施例1制备的双靶向纳米微囊SEM图；
图2为实施例1制备的双靶向纳米微囊粒度分布图；
图3为实施例1制备的双靶向纳米微囊与雷公藤红素作用48h后胶质瘤细胞存活率；
图4为实施例1制备的双靶向纳米微囊体外溶出度。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料与设备
雷公藤红素、紫杉醇、多烯紫杉醇购买，纯度不低于95％；
Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide(实验室合成)；
PLGA、PLLA、PLLA-PEG(济南岱罡生物工程有限公司)；
靶向肽(实验室合成)；
二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)；丙酮(国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司)；
磁力搅拌装置(米函仪器科技有限公司，DF-101S)；扫描电镜(飞纳台式扫描电镜，Phenom-XL)；粒度仪(马尔文粒度仪，MS-3000)。
二、纳米微囊的制备
实施例1：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLGA浓度为20mg/mL，Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide浓度为5mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的双靶向纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例2：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜体积比为20:1:1:1，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLGA浓度为20mg/mL，Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide浓度为5mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节至体积流量5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的双靶向纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例3：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜体积比为10:5:5:10，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLGA浓度为20mg/mL，Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide浓度为5mg/mL，RGDCGNKRTR靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至40℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至8Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节至体积流量5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳0.5h。
(3)打开高压结晶釜既能够得到粒度均一的载药纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例4：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1，雷公藤红素样品浓度5mg/mL，PLGA浓度为10mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例5：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:5，紫杉醇样品浓度为5mg/mL，PLGA浓度为10mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例6：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:5，多烯紫杉醇样品浓度为5mg/mL，PLLA-PEG浓度为10mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例7：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLLA-PEG浓度为10mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例8：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLLA浓度为10mg/mL，RGDCGNKRTRRGD靶向配体浓度为0.1mg/mL，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例9：
应用超临界流体增强溶液分散技术制备双靶向纳米微囊的方法包括如下步骤：
(1)二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的体积比为20:1:1:1，雷公藤红素样品浓度为5mg/mL，PLLA-PEG浓度为20mg/mL,不添加靶向配体，将溶液置于磁力搅拌装置中，以100r/min的转速搅拌2h，得药品混合溶液。
(2)调节高压结晶釜温度至35℃，打开高压结晶釜二氧化碳进气阀门，调节压力至16Mpa，同时打开高压结晶釜二氧化碳出口阀调节CO2体积流量至5L/min，待压力、温度以及二氧化碳流量稳定20min后，以1mL/min的速率通过同轴喷嘴喷入药品混合溶液，并继续按5L/min体积流量通入CO2，待药品混合溶液通入完毕，以1L/min的速率继续通入二氧化碳3h从而充分将高压结晶釜中的二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜等有机溶剂排走。
(3)打开高压结晶釜得到粒度均一的纳米微囊，产品均一的分布于高压结晶釜釜壁以及釜底，取出产品计算产率开展粒度分析、形貌分析、载药量分析以及溶出度等分析综合评价产品性能。
实施例10：对比实施例
下表为采用不同溶剂制得的产品的性能比较，基本都存在收率低、溶剂残留、粒径大或者团聚等现象。下表中，使用每种溶剂所得到的最高收率(％)、最低残留(ppm)以及颗粒粒径均指通过调节样品溶液浓度、喷嘴大小、样品溶液喷入流速、高压反应釜釜内温度和压力等工艺参数所得到的最优值，这是本领域技术人员的常规本领。同时，本领域技术人员应当知道，每种溶剂最高收率、最低残留以及颗粒粒径的工艺参数通常不同。这些最优值体现了不同类型溶剂在该指标方面的最大优化潜能，也只有这样，不同类型溶剂应用价值的比较才有意义。各最优值对应的工艺参数未列出。
三、性能分析
1、电子显微镜(SEM)表征微粒形貌
取少量样品分散于导电胶并粘于电子显微镜SEM样品台表面，在真空状态下喷金2min，然后进行测试。图1为实施例1制备的双靶向纳米微囊SEM图，其粒径为183.28nm且粒度分布较窄(如图2所示)，从图1可以看出双靶向纳米微囊呈球形或椭球形，粒度较为均一且表面较光滑。
2、粒度测定
采用马尔文粒度仪(MS-3000)干法测定双靶向纳米微囊粒径，结果见表1，其中实施例1-5制备的纳米微囊粒径在100～600nm之间。
3、包封率及收率测定
包封率是指被包裹物质(如某药物)在脂质体悬液中占药物总量的百分量。它是脂质体和纳米粒质量控制的一个重要的指标，反映了药物被载体包封的程度。用最终收集的纳米微囊总质量除以投入高压反应釜中所有原料的总质量计算得到收率。如表1所示，实施例1-5的收率均在95％以上，收率非常高。
表1
4、溶剂残留量测定
取少量实施例1-5制备的双靶向纳米微囊，测定溶剂残留量，检测结果表明，实施例1-5制备的双靶向纳米微囊有机溶剂残留量均低于1ppm。
5、MTT实验
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide。该方法是常用的检测细胞存活和生长的方法之一，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，甲瓒结晶形成的量与细胞数成正比，通过490nm波长处的吸光值间接反映活细胞数量。该方法广泛应用于细胞毒性实验。具体步骤：向96孔板每孔加入定量胶质瘤细胞培养过夜，加入药物作用48h，向孔板中加入MTT溶液，孵育4h。最后去除MTT，加入二甲基亚砜溶解，酶标仪读取在吸光度波长在490时的吸光值，计算存活率。
图3为实施例1制备的双靶向纳米微囊与雷公藤红素原料药作用48h后胶质瘤细胞存活率，随着雷公藤红素纳浓度增加胶质瘤细胞存活率显著下。当雷公藤红素原料药浓度为100μg/mL时，胶质瘤细胞存活率为43.1％，而双靶向纳米微囊浓度为100μg/mL时，胶质瘤细胞存活率仅为23.2％，说明雷公藤红素双靶向纳米微囊具有显著的抗肿瘤活性。
6、双靶向纳米微囊体外溶出度试验
溶出度实验步骤：纳米微囊体外释放度实验参考《中国药典》溶出度测定法所述的方法加以适当改良，以pH＝7.4的PBS缓冲溶液200ml作为溶出介质，设定温度为37℃±0.5℃，搅拌转速为50r/min。精密称取适量纳米微囊均匀分散于5ml的PBS溶液，转入透析袋内。将透析袋两端扎紧，置入溶出杯内，将溶出杯上端盖上，避免溶出介质挥发。分别在设定时间点取样5ml透析液，并且补充同温度的溶出介质。采用紫外分光光度法测量紫外吸收值，计算累计释放度。
图4为实施例1制备的双靶向纳米微囊在pH7.4的PBS缓冲溶液中溶出度曲线，双靶向纳米微囊能够缓慢释放药物，在前5h雷公藤红素释放不到20％，直至48h后雷公藤红素释放接近80％，说明超临界流体增强溶液分散技术制备的雷公藤红素纳米微囊具有良好的缓释作用，可应用于缓控释注射制剂治疗脑肿瘤。
本发明以具有良好生物相容性的PLGA为包埋载体，包埋抗肿瘤药物雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇，通过超临界增强溶液分散技术制备纳米微囊，同时将靶向配体修饰于PLGA纳米微囊表面，具有安全、环保、高效，且有机溶剂残留低等优点。
本发明通过调节有机溶剂比例可有效改善溶液过饱和度，从而有效改善产品粒度以及形貌，提高产品收率，并可高效负载药物以及靶向多肽。所制备得到的双靶向纳米微囊具备高载药量以及高效靶向杀伤胶质瘤细胞的能力，同时具有良好的缓释性能，可作为长效注射制剂应用于靶向治疗肿瘤疾病。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (8)

1.一种双靶向纳米微囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将活性成分、PLGA、Maleimido-PEG2000-N-hydroxysuccinimide、靶向肽用有机溶剂溶解至适宜浓度，得混合溶液；其中，所述活性成分为雷公藤红素、紫杉醇或多烯紫杉醇中的任一种，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、乙醇以及二甲基亚砜的混合溶剂；
(2)打开超临界高压结晶釜的气体进口阀，启动高压结晶釜加热套，待达到设定的温度，维持该温度1h以上，启动高压泵将CO2泵入高压反应釜，待釜内温度和压力稳定后，打开二氧化碳气体出口阀，并调节至一定体积流量；
(3)通过恒流泵将上述制备的混合溶液经由同轴喷嘴喷入高压结晶釜，并按照步骤(2)中的体积流量继续通入CO2，待适量溶液注入完毕，关闭恒流泵，维持设定温度及压力并继续通入CO23h以上，将高压结晶釜内有机溶剂充分带走；
(4)最后缓慢卸压，打开高压结晶釜，纳米微囊最终均匀的分布在高压结晶釜釜底以及釜壁，得到双靶向纳米微囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂中二甲基亚砜的体积百分含量为0.1％-5％，丙酮的体积百分含量为1％-30％，乙醇的体积百分含量为1％-10％。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂中二氯甲烷、丙酮、乙醇、二甲基亚砜的体积比为20:20:5:1或20:1:1:1或10:5:5:10或20:20:5:5。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：混合溶液的浓度为0.1mg/mL-20mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述超临界高压结晶釜内的压力为7-18Mpa，超临界高压结晶釜内的温度为35-45℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)CO2体积流量为4-8L/min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述同轴喷嘴的内轴内径为20-100μm，外轴内径为0.05-1cm。
8.权利要求1-7任一所述制备方法制备的双靶向纳米微囊在抗脑肿瘤中的应用。
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