CN102579373B

CN102579373B - 一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂及其制备方法

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Publication number: CN102579373B
Application number: CN 201210081939
Authority: CN
Inventors: 张典瑞; 郝蕾蕾; 张连茹; 徐庆妍; 胡志钰; 王飞虎; 李彩云; 郭和坚
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN102579373A

Abstract

本发明涉及一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂及其制备方法，包括原料药Amoitone B、稳定剂及冻干保护剂，稳定剂为表面活性剂和高分子助悬剂。其制备方法为高压微射流法。本发明制备的Amoitone B纳米结晶制剂可显著提高Amoitone B的溶解度及溶出速率，通过控制处方比例及微射流均质参数，实现粒径在200-1000nm之间均匀可控，具有生物相容性好、易降解、稳定性好、高效低毒、被动靶向传输等优点。因其处方中不含载体和有机溶剂，用于静脉注射给药安全性高，亦可将其开发为口服制剂，提高生物利用度。高压微射流法制备工艺简单，具有很好的重现性和稳定性，便于工业化规模生产。

Description

一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂及其制备方法，特别涉及一种阿霉酮衍生物Amoitone B纳米结晶制剂及其制备方法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

人体细胞核内存在一类具有基因调控作用的核受体(nuclear receptor)，由于长期以来未发现其生理性配体而被称为孤儿受体(orphan receptor)，核受体作为配体激活转录因子，调节靶基因的表达，影响机体的许多生理功能。Nur77(NR4A1，也称TR3，NGFI-B)作为孤儿核受体亚家族NR4A的成员之一，是一种立刻早期基因的产物，可被血清及表皮生长因子、神经生长因子、血小板生长因子等诱导表达，具有复杂的生物学功能，涉及细胞增殖、分化发育和凋亡等过程。近年来的研究发现，Nur77受体可能是介导动脉粥样硬化发病的重要基因，此外Nur77在抑制肿瘤细胞生长和平衡血糖水平方面发挥重要调控作用，可作为一个潜在的靶点用于相关疾病的治疗。

壳囊孢菌素cytosporone B(Csn-B)是从小穴壳菌属(Dothiorella sp.)真菌HTF3中分离得到的一种天然产物，是一种天然的Nur77受体激动剂，有较好的抗真菌和细胞毒活性，为了找到与Csn-B有相似的功能，但具有更强的Nur77结合及激活特性，一系列的Csn-B类似物被合成。其中阿霉酮衍生物Amoitone B由厦门大学化学系合成，和Csn-B一样是一种天然的Nur77受体激动剂，能够特异地结合到Nur77配体结合区域，通过诱导Nur77蛋白构象改变，激活其活性，从而调节糖异生过程使血糖浓度增高，同时介导Nur77抑制抗细胞凋亡蛋白BRE的转录活性，转移Nur77到线粒体中引起细胞色素C的释放来诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长。可见Amoitone B可作为一种有前途的药物用于癌症和低血糖症的治疗。

Amoitone B即2-壬酰基-3，5-二羟基苯乙酸戊酯，分子式：C₂₂H₃₄O₅，分子量：378.50，结构式如图1所示。是一种类白色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇，丙酮，DMSO等，不溶于水。Amoitone B由于其难溶性，制成口服制剂体外溶出差，生物利用度低；采用有机溶剂溶解制成注射剂，毒性大、易导致全身过敏反应，疗效不佳，限制了临床应用。Amoitone B作为一种抗癌药物主要用于胃癌、结肠癌的治疗；对肺癌、肝癌的治疗还在研究探索中，临床需要一种给药次数少、生物利用度高、稳定性好、制备简单且有利于患者使用的制剂。

Amoitone B作为一种新化合物，目前相关专利及文献只报道了其合成方法和活性(1、Zhan YY，Du XP，Chen HZ，et al.Cytosporone B is an agonist for nuclear orphan receptor Nur77[J].Nature Chemical Biology，2008，4(9)：548-556.2、曾惠妮.抗肿瘤活性天然产物cytosporone B及其系列衍生物的合成[D].厦门：厦门大学有机化学专业，2008.3、厦门大学.双羟基-2-酰基苯乙酸酯及其制备方法与应用[P].中国，CN 101402573A.2009-04-08.4、Liu JJ，Zeng HN，Zhang LR，et al.A unique pharmacophore for activation of the nuclear orphan receptor Nur77 invivo and in vitro[J].Cancer Res，2010，70(9)：3628-3637.)，还未出现任何制剂方面的文献报道及专利。

通过组合化学合成的和新发现的化合物实体中，40％的候选药物为水不溶性或微溶。这些化合物的难溶性加大了新药研发难度，并导致现阶段新药研发的成本剧增、周期延长、风险增大，此外，药物溶解性差也会导致药效不理想、生物利用度低、稳定性差，不良反应严重等而限制其应用。一些新的制剂技术被用来解决这一问题，如成盐化、环糊精包合物、固体分散体、微乳、微球、微粉化技术等，但应用前提是药物必须具备某些性质。直到1994年由Müller等首次报道的纳米结晶避免了上述方法的弊端，存在明显优势。

纳米结晶是利用少量表面活性剂或聚合物的稳定作用，将药物颗粒分散在水中，通过自组装技术或者破碎技术形成稳定的纳米胶态分散体。体系中纳米级粒径的纯药物颗粒依靠表面活性剂的电荷效应或/和立体效应稳定地混悬在溶液中，其中药物的平均粒径一般在100～1000nm之间。纳米结晶可以进一步制备成注射剂、片剂、胶囊、喷雾剂或贴剂等，经多种途径给药，从而提高药物的吸收和生物利用度。纳米结晶能显著提高难溶性药物的饱和溶解度和溶出速率，且制剂中含药量大可以减少用药剂量及次数，降低不良反应，特别适合大剂量口服和注射给药。此外，由于处方中不含载体和共溶剂，注射给药的安全性显著提高。

纳米结晶的制备方法主要有沉淀法、研磨法、高压匀质法、溶剂法及反溶剂法等，近年来还有一些联用方法包括沉淀-均质、研磨-均质、喷雾干燥-均质法等。其中使用最多的为高压均质法，操作简便、可规模化生产。近年国外研制出一种高压微射流均质技术，制备出的产品粒径小，分散均匀、重现性、稳定性好。微射流技术的均质原理是高压泵使流体产品被加速至极高的流速，流体经由陶瓷和人造金刚石复合材料制成的微管通道而进入冲击区，形成一个强劲而均匀的反应场，全部液流都通过反应场并由此产生空化作用，同时伴随而来的强剪切和冲击力使颗粒外径减缩而得到纳米级大小一致的超细颗粒。

专利号为201010572011.9的中国专利公开了一种联苯双酯纳米结晶制剂，包括原料和辅料，原料为联苯双酯，辅料为稳定剂，原料与辅料的重量份如下：联苯双酯200份，稳定剂20～400份；制备过程中，使用了有机溶剂，易残留。

发明内容

本发明的目的是克服Amoitone B的难溶性及吸收差，不能直接注射或口服给药等问题，而提供一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂及其制备方法，该制剂可以显著提高Amoitone B的溶解度及溶出速率，提高生物利用度，高效低毒、稳定性好。制备方法可采用高压微射流均质设备，适合工业大规模高效益生产。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂，包括Amoitone B和稳定剂，稳定剂为表面活性剂和高分子助悬剂，Amoitone B与表面活性剂、高分子助悬剂的重量份比为：0.05～2.0∶0.01～5.0∶0.005～2.0。

所述的Amoitone B与表面活性剂、高分子助悬剂的重量份比优选0.1～1.0∶0.05～3.0∶0.02～1.0。

上述的表面活性剂选自脂肪酸甘油酯、多元醇型非离子表面活性剂、聚氧乙烯型非离子表面活性剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、泊洛沙姆、卵磷脂中的一种或多种。

所述的表面活性剂优选泊洛沙姆F68或卵磷脂。

所述泊洛沙姆F68为非离子型的环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物，通常被认为无毒、无刺激性，体内不被代谢，常被作为乳化剂和增溶剂用于口服、注射和局部用药物制剂中，是目前使用在静脉乳剂中唯一合成的乳化剂。

所述卵磷脂是一种生物相容性的两性离子表面活性剂，常用作分散剂、乳化剂和增溶剂，具有良好的安全性基础。可用于肌内注射剂、静脉注射剂和非胃肠道营养制剂，是制备脂质体和全静脉注射脂肪乳的主要成分之一。

所述十二烷基硫酸钠(SDS)，是一种典型的阴离子表面活性剂，乳化性很强，毒性和刺激性较低，主要用作外用乳膏的乳化剂，也可用于片剂等固体制剂的润湿剂和增溶剂，使用中要严格控制用量以确保安全性。

所述高分子助悬剂选自阿拉伯胶、海藻酸钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素(HPMC)、卡波普、聚维酮(PVP)、葡聚糖中的一种或多种；优选聚维酮PVP K30或羟丙甲基纤维素HPMC。

所述聚维酮(PVP)为国际倡导的三大药用新辅料之一，具有粘合、增稠、分散、成膜、络合等特性，安全稳定，可用作颗粒剂、片剂的粘结剂，液体制剂的增稠剂、助悬剂。

所述羟丙甲基纤维素(HPMC)具有增稠能力，pH稳定性、尺寸稳定性、优良的成膜性以及广泛的耐酶性、分散性和粘结性等特点，广泛用作片剂黏合剂及液体制剂的稳定剂，助悬剂。

所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将Amoitone B加入到含表面活性剂和高分子助悬剂的注射用水中，超声使AmoitoneB溶解，得粗混悬剂A；

(2)将粗混悬剂A在高速剪切机18000～20000rpm作用下粗分散3～5min，分散2～4次，得混悬剂B；

(3)将混悬剂B在高压微射流均质机作用下进一步分散均匀，首先在500bar和1000bar压力下各均质3～5次作为预分散，然后在1800bar压力下均质10～20次，即得Amoitone B纳米结晶混悬液；

(4)将步骤(3)制得的Amoitone B纳米结晶混悬液加入冻干保护剂后冷冻干燥，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

上述制备方法中：

步骤(1)中的表面活性剂和高分子助悬剂分散在注射用水中时，每100ml水中含有表面活性剂及助悬剂总量为0.01～3.0g。

步骤(4)中添加的冻干保护剂选自甘露醇、乳糖、半乳糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、β-环糊精中的任一种或多种任意比例组合。

步骤(4)中冻干保护剂的加入量为Amoitone B纳米结晶混悬液的2％～10％(g/ml)，优选5％。

步骤(4)中冻干干燥的具体方法是：向制得的Amoitone B纳米结晶混悬液中加入冻干保护剂，震荡溶解后分装置西林瓶中，2～4mL/支，放入低温冰箱-80℃预冻24～48h，再在-50℃下真空冷冻干燥48～72h。

制备的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂应用时可以制成注射剂，毒副作用小，体系稳定；也可以制成口服制剂，生物利用度高，如片剂、胶囊剂等。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过工艺优化和处方筛选，选择适当的均质压力、循环次数和稳定剂浓度及组成，可制备出粒径大小可控、稳定性较好的Amoitone B纳米结晶；本发明制备的AmoitoneB纳米结晶混悬液在透射电镜下观察，可见其为类球形的实体粒子，粒径在200～1000nm之间；另外将冻干后Amoitone B纳米结晶粉末复溶后再进行粒径测量，粒径在200～1000nm之间，证实了纳米结晶制剂的形成，如图2、图3，同时产品粒径均一，分散性良好。

(2)本发明克服了Amoitone B难溶于水的缺陷，制备的纳米结晶可以显著提高AmoitoneB的溶解度及溶出速率；通过HPLC法测得Amoitone B纳米结晶制剂37℃下在生理盐水中的饱和溶解度为48.35μg/ml，而原料药的饱和溶解度未检测到；37℃下在0.05％吐温80的水溶液中Amoitone B纳米结晶制剂的饱和溶解度为388.2μg/ml，而原料药是72.1μg/ml，提高了近5.4倍；为保证药物的释放在漏槽状态下进行，本发明采用小杯浆法对Amoitone B纳米结晶制剂及原料药粉末的体外释放特性进行了研究，对所得的溶出数据做累计释放溶出量-时间曲线，可见Amoitone B制成纳米结晶制剂后，与原料药相比明显提高了其溶出速率，如附图4。

(3)本发明的Amoitone B纳米结晶制剂的制备工艺易于放大，处方简单，制备过程中没有添加任何有机溶剂，不需要后处理过程，安全性显著提高，粒径均匀可控，可被动靶向到所需器官。将其冷冻干燥后可以提高药物的稳定性，减小给药体积，若做成口服纳米结晶混悬剂则有利于儿童和老人等吞服困难的人群使用，增加生物利用度，减小给药剂量，降低毒副作用。

(4)与联苯双酯纳米结晶制剂比其优势在于：在整个制备过程中，没有使用任何有机溶剂，不需要后处理，制剂安全性更高，且直接通过研磨剪切及高压微射流法进行均质，操作步骤更加简单；应用时，只需加入生理盐水溶解Amoitone B冻干粉末即可进行注射，没有任何过敏反应，毒性大大降低，可实现长期大剂量给药；此外，由于Amoitone B属于抗肿瘤药物，对于各种实体瘤的疗效还在进一步研究中，我们可以通过控制高压微射流的均质参数来调节粒径的大小，从而被动靶向到所需器官。

附图说明

图1：Amoitone B化学结构式。

图2：Amoitone B与稳定剂形成的纳米结晶制剂透射电镜照片。

图3：Amoitone B纳米结晶制剂的粒径分布图(标题：粒径分布(Size distribution(s))，横坐标：粒径(diameter)，纵坐标：百分率(％intensity)。

图4：Amoitone B纳米结晶制剂及原料药的体外溶出曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于这些具体记载的实施例。

实施例1：

称取0.2g Amoitone B、0.2g泊洛沙姆、0.2g卵磷脂溶于80ml注射用水(注射用水就是药典规定的重蒸馏水)中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次，即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

取上述混悬液按照5％(w/v，g/ml)比例加入甘露醇，搅拌溶解后按照2～4mL/瓶分装至西林瓶，超低温冰箱-80℃下冷冻24小时，迅速取出在-50℃下真空冷冻干燥48h。冻干结束后取出加压铝盖包装，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

取上述Amoitone B纳米结晶冻干粉末复溶后稀释到一定倍数，透射电镜下观察，如图2所示，粒径分布如图3所示。由图可以看出，形成的纳米结晶的粒径在200～400nm之间，所得产品粒径均一，分散性良好。

取上述Amoitone B纳米结晶冻干粉末和Amoitone B原料药采用小杯桨法进行体外溶出试验，结果如图4，可见将Amoitone B制成纳米结晶后，与原料药相比其溶出速率明显提高。

实施例2：

称取02g Amoitone B、0.1g卵磷脂、0.1gHPMC溶于80ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次，即可得AmoitoneB纳米结晶混悬液。

实施例3：

称取0.2g Amoitone B、0.2g泊洛沙姆、0.1g HPMC溶于80ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次，即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

实施例4：

称取0.5g Amoitone B、0.5g泊洛沙姆、0.5g卵磷脂溶于100ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次，即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

取上述混悬液按照5％(w/v，g/ml)比例加入右旋糖酐，搅拌溶解后按照2～4mL/瓶分装至西林瓶，超低温冰箱-80℃下冷冻24小时，迅速取出在-50℃下真空冷冻干燥48h。冻干结束后取出加压铝盖包装，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

实施例5：

称取0.5g Amoitone B、0.5g卵磷脂、0.2g PVP K₃₀溶于100ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

实施例6：

称取0.5g Amoitone B、0.5g泊洛沙姆、0.2g PVPK₃₀溶于100ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

取上述混悬液按照5％(w/v，g/ml)比例加入β-环糊精，搅拌溶解后按照2～4mL/瓶分装至西林瓶，超低温冰箱-80℃下冷冻24小时，迅速取出在-50℃下真空冷冻干燥48h。冻干结束后取出加压铝盖包装，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

实施例7：

称取0.2g Amoitone B、0.1g泊洛沙姆、0.2g HPMC、0.1gPVPK₃₀溶于80ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

实施例8：

称取0.2g Amoitone B、0.1g卵磷脂、0.2g HPMC、0.1g PVPK₃₀溶于80ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

实施例9：

称取0.5g Amoitone B、0.2g泊洛沙姆、0.5g卵磷脂、0.1g PVPK₃₀溶于100ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

取上述混悬液按照5％(w/v，g/ml)比例加入β-环糊精，搅拌溶解后按照2～4mL/瓶分装至西林瓶，超低温冰箱-80℃下冷冻24小时，迅速取出在-50℃下真空冷冻干燥48h。冻干结束取出后加压铝盖包装，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

实施例10：

称取0.5g Amoitone B、0.5g泊洛沙姆、0.2g卵磷脂、0.1g HPMC溶于100ml注射用水中，超声15min后，在高速剪切机20000rpm作用下粗分散3～5min，分散3次，再经高压微射流均质机，先在500bar和1000bar压力下各均质3次作为预分散，然后在1800bar压力下均质15次即可得Amoitone B纳米结晶混悬液。

Claims

1.一种阿霉酮衍生物纳米结晶制剂，其特征是，包括原料药Amoitone B和稳定剂，稳定剂为表面活性剂和高分子助悬剂，Amoitone B与表面活性剂、高分子助悬剂的重量份比为：0.05～2.0：0.01～5.0：0.005～2.0；所述的表面活性剂选自脂肪酸甘油酯、多元醇型非离子表面活性剂、聚氧乙烯型非离子表面活性剂、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆、卵磷脂中的一种或多种；所述的高分子助悬剂选自阿拉伯胶、海藻酸钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、卡波普、聚维酮、葡聚糖中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂，其特征是，所述的Amoitone B与表面活性剂、高分子助悬剂的重量份比为0.1～1.0：0.05～3.0：0.02～1.0。

3.根据权利要求1所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂，其特征是，所述的表面活性剂为泊洛沙姆F68或卵磷脂。

4.根据权利要求1所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂，其特征是，所述的高分子助悬剂为聚维酮PVP K30或羟丙甲基纤维素HPMC。

5.权利要求1-4任一项所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）将Amoitone B加入到含表面活性剂和高分子助悬剂的注射用水中，超声使Amoitone B溶解，得粗混悬剂A；

（2）将粗混悬剂A在高速剪切机18000～20000rpm作用下粗分散3～5min，分散2～4次，得混悬剂B；

（3）将混悬剂B在高压微射流均质机作用下进一步分散均匀，首先在500bar和1000bar压力下各均质3～5次作为预分散，然后在1800bar压力下均质10～20次，即得Amoitone B纳米结晶混悬液；

（4）将步骤（3）制得的Amoitone B纳米结晶混悬液加入冻干保护剂后冷冻干燥，即得Amoitone B纳米结晶制剂。

6.根据权利要求5所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂的制备方法，其特征是，步骤（1）中的表面活性剂和高分子助悬剂分散在注射用水中时，每100ml水中含有表面活性剂及助悬剂总量为0.01～3.0g。

7.根据权利要求5所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂的制备方法，其特征是，步骤（4）中添加的冻干保护剂选自甘露醇、乳糖、半乳糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、β-环糊精中的任一种或多种任意比例组合；冻干保护剂的加入量为Amoitone B纳米结晶混悬液的2%～10%，g/ml。

8.根据权利要求5所述的阿霉酮衍生物纳米结晶制剂的制备方法，其特征是，步骤（4）中冻干干燥的具体方法是：向制得的Amoitone B纳米结晶混悬液中加入冻干保护剂，震荡溶解后分装至西林瓶中，2～4mL/支，放入低温冰箱-80℃预冻24～48h，再在-50℃下真空冷冻干燥48～72h。