CN110568088A - 琥珀酰丙酮的检测方法 - Google Patents

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张婷
佘旭辉
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Abstract

本发明提供了一种琥珀酰丙酮的检测方法，包括以下步骤：获取干血斑样本；净化预处理：向所述干血斑样本中加入有机溶剂，静置后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；目标试样提取：采用提取工作液对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；采用串联质谱法检测目标试样。该检测方法有助于提高串联质谱检测干血斑琥珀酰丙酮的灵敏度，操作简单、快速，对样本的净化预处理还可更好的保护仪器，明显降低仪器的维护成本。

Description

琥珀酰丙酮的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种琥珀酰丙酮的检测方法。
背景技术
目前，传统方法中主要通过串联质谱技术检测尿液或血液中的琥珀酰丙酮(Succinylacetone，SUAC)，主要包括：①使用GC-MS(气相色谱串联质谱)检测尿液中的琥珀酰丙酮，该方法需要检测尿液中肌酐含量，并对待测物进行肟化反应、液液萃取、衍生化反应等一系列繁琐的操作，前处理耗时较长，且尿液样本容易长菌，不利于长期保存及运输。②使用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)联合检测干血斑中氨基酸、肉碱、琥珀酰丙酮衍生法，先提取血斑中氨基酸、肉碱后进行衍生化，再对残留血斑进行琥珀酰丙酮的提取，最后将两者所得处理液吹干，再使用复溶液将两者重组在一起上机，操作繁琐，耗时较长，经多次的转移、混合可能存在转移错误的风险。③使用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)联合检测干血斑中氨基酸、肉碱、琥珀酰丙酮非衍生法，先提取血斑中氨基酸、肉碱，再对残留血斑进行琥珀酰丙酮的提取，最后将两者所得处理液吹干，再使用复溶液将两者混合在一起上机，操作繁琐，经多次的转移、混合可能存在转移错误的风险。④使用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)检测干血斑中琥珀酰丙酮非衍生法(一步法)，使用萃取液直接萃取干血斑中的琥珀酰丙酮后，将部分萃取液转移至另一容器中进行稀释后上机，操作简单，但样本中杂质含量较高，对信号存在抑制作用，容易导致检测设备堵塞，增加设备维护频率和成本，需对样本进行稀释，降低样本的灵敏度。
可见，传统的检测干血斑琥珀酰丙酮的方法存在的操作繁琐、耗时、基质复杂、灵敏度低、设备维护成本高、手动转移出错风险高等问题。因此，有必要提供一种操作简单、快速、低成本的，且灵敏度高的检测琥珀酰丙酮的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、快速、低成本的，且灵敏度高的琥珀酰丙酮的检测方法。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种琥珀酰丙酮的检测方法，包括以下步骤：
获取干血斑样本；
净化预处理：向所述干血斑样本中加入有机溶剂，静置后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；
目标试样提取：采用提取工作液对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；
采用液相色谱串联质谱法检测目标试样。
在其中一些实施例中，所述净化预处理中，所述有机溶剂为C1-C3一元醇。
在其中一些实施例中，所述净化预处理中，所述有机溶剂为甲醇。
在其中一些实施例中，所述净化预处理中，向所述干血斑样本中加入干血斑样本30～50倍体积的有机溶剂，静置10～20min后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本。
在其中一些实施例中，所述目标试样提取，步骤包括：向净化后的干血斑样本中加入提取工作液，在37-45℃温度下反应40-80分钟；
所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质。
在其中一些实施例中，所述萃取剂为：乙腈与水的混合溶液；和/或
所述衍生化试剂为水合肼；和/或
所述酸性物质为可挥发性酸溶液。
在其中一些实施例中，以v/v计，所述乙腈与水的混合溶液中含水量≥5％；和/或
所述水合肼的浓度≥3mmol/L；和/或
所述可挥发性酸溶液为0.02％-1.00％的草酸溶液。
在其中一些实施例中，所述采用液相色谱串联质谱法检测目标试样中，流动相中的有机相为甲醇或乙腈。
在其中一些实施例中，所述的琥珀酰丙酮的检测方法，包括以下步骤：
获取干血斑样本，放入过滤板中；
净化预处理：向过滤板中的干血斑样本中加入有机溶剂，静置后通过离心去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；
目标试样提取：向过滤板中加入提取工作液，对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；
采用液相色谱串联质谱法检测目标试样。
在其中一些实施例中，所述过滤板为96孔过滤板。
在其中一些实施例中，所述干血斑样本的直径为3-3.5mm。
在其中一些实施例中，所述干血斑样本的制备方法为：使用自动化打孔设备打冲直径为3-3.5mm的干血斑。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的琥珀酰丙酮的检测方法，采用串联质谱检测干血斑琥珀酰丙酮的方法，通过在获取干血斑样本和在干血斑样本中提取目标试样的步骤之间，增加对干血斑样本净化预处理的步骤，具体为向干血斑样本中加入有机溶剂，并在静置后去除有机溶剂，这样对干血斑样品进行净化预处理后，再采用提取工作液对所述净化后的干血斑样本进行提取，得到的目标试样的背景更加洁净，有助于提高串联质谱检测干血斑琥珀酰丙酮的灵敏度，操作简单、快速，对样本的净化预处理还可更好的保护仪器，明显降低仪器的维护成本。
附图说明
图1为本发明检测干血斑琥珀酰丙酮的原理示意图；
图2-3为未使用有机溶剂预处理组与使用有机溶剂预处理组的离子流图对比；
图4为流动相为乙腈时的色谱图基线；
图5为流动相为甲醇时的色谱图基线对比；
图6为提取液中不同浓度水合肼的琥珀酰丙酮内标响应；
图7为样品预处理净化中使用不同一元醇的琥珀酰丙酮的响应。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一种琥珀酰丙酮的检测方法，包括以下步骤：获取干血斑样本；净化预处理：向所述干血斑样本中加入有机溶剂，静置后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；目标试样提取：采用提取工作液对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；采用液相色谱串联质谱法检测目标试样。
可选地，所述净化预处理中，所述有机溶剂选自：一元醇及其他易挥发且琥珀酰丙酮不溶于的有机试剂。
优选地，所述有机溶剂为C1-C3一元醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇。
更优选地，所述有机溶剂为甲醇。
优选地，所述净化预处理中，向所述干血斑样本中加入干血斑样本30～50倍体积的有机溶剂，静置10～20min后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本。
更优选地，向所述干血斑样本中加入干血斑样本35倍体积的有机溶剂，静置10min后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本。向干血斑样本中加入35倍体积的有机溶剂，静置时间设置为10min，可以在维持净化效果的同时，最大化节约试剂和时间，保证检测效率。
优选地，所述目标试样提取，步骤包括：向净化后的干血斑样本中加入提取工作液，在37-45℃温度下反应40-80分钟；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质。
其中，优选地，所述萃取剂为：乙腈与水的混合溶液。更优选地，以v/v计，所述乙腈与水的混合溶液中含水量≥5％。
优选地，所述衍生化试剂为水合肼。更优选地，所述水合肼在提取工作液中的浓度不小于3mmmol/L。可选地，其可以为3.0mmol/L，5.0mmol/L，10.0mmol/L，15.0mmol/L或20.0mmol/L，或可以选自3.0mmol/L，5.0mmol/L，10.0mmol/L，15.0mmol/L或20.0mmol/L任意两个浓度之间的浓度范围。
优选地，所述酸性物质为可挥发性酸溶液。更优选地，所述可挥发性酸溶液为草酸溶液。进一步优选地，所述可挥发性酸溶液为体积百分比0.02％-1.00％的草酸溶液。
在其中一些实施例中，所述采用液相色谱串联质谱法检测目标试样，包括以下步骤：
将前处理后的样本以液相色谱进行分析，所述分析条件为：
流动相：为有机溶剂与水的混合溶液，以v/v计，所述有机溶剂与水的混合溶液中含水量≥5％，加入0.02％-1.00％的草酸；优选地，有机溶剂为乙腈或甲醇。更优选地，有机相为乙腈。
流动相的流速为0.02～1.0mL/min。
液相洗脱时的进样量为10～30μL。
质谱方法：使用三重四级杆进行检测，条件如下
更优选地，质谱方法：使用三重四级杆进行检测，条件如下
在其中一些实施例中，本发明所述的琥珀酰丙酮的检测方法，获取干血斑样本，放入96孔过滤板中；然后再进行净化预处理、目标试样提取，以及采用串联质谱法检测目标试样。其中，通过使用96孔过滤板进行样本制备可明显减少样品制备的时间，同时可减少移液、装卸吸嘴等操作，减少耗材的使用，简化操作步骤，降低移液错误风险，节约样本制备的时间。同时还能更好的保护仪器，明显降低仪器的维护成本。在其他一些实施方式中，还可以采用96孔承接板进行样本制备，与96孔过滤板达到相同的效果。
优选地，所述干血斑样本的直径为3-3.5mm，以适应96孔过滤板的大小。更优选地，所述干血斑样本的直径为3.2mm。进一步优选的，所述干血斑样本的制备方法如下：采用国际903滤纸片上滴加血液样本70-100μL，风干，即得。
本发明具体实施例中所使用的耗材，90管滤盘为：密理博96管滤盘。
实施例1
使用4个不同浓度水平的加标样本，每个样本平行处理3个，分别处理两组数据：
一组经有机溶剂预处理操作进行样本制备，使用有机溶剂对样本进行预处理净化的步骤如下：
1)干血斑样本获取，放入96管滤盘中；
干血斑样本由常规方法获取得到，本实施例中使用自动化打孔设备得直径为3.2mm的干血斑。
2)在过滤板中加入35倍样本体积甲醇对样本进行预处理净化，静置10min后通过离心去除有机溶剂，得到净化后的干血斑样本。
3)在96孔过滤板中加入提取工作液，对净化后的干血斑样本进行提取孵育，待样本充分提取后，离心获得试样后上机检测(液相色谱串联质谱检测)。
将血斑与提取液在45℃温度下反应60分钟，得到目标试样。在该步骤中，以含水量不小于5％的乙腈、水混合溶液作为萃取剂，不小于3mmol/L的水合肼作为衍生化试剂，以0.02％-1.00％的草酸作为酸性物质。
另一组不经过有机溶剂预处理操作进行样本制备，步骤与上述步骤相比，未进行步骤(2)的处理，其余步骤相同。
在两组数据中，经有机溶剂预处理的样本信号响应(SUAC：2.8*e4，5C13-SUAC：6.2*e4)(图3)明显高于未经预处理样本(SUAC：1.6*e4，5C13-SUAC：2.6*e4)(图2)，而检测结果偏差在0～13％之间，结果无明显差异(见表1)。说明样本经有机溶剂预处理，对样本的检测结果无影响，净化样本基质，减少背景干扰，可明显提高方法的灵敏度。
表1不同样品预处理方式比对数据
实施例2
采用如实施例1所述的方法(使用96管滤盘进行样本制备)，与传统的试剂转移方法制备样本进行比较，分别采用两种方法处理一批次样品(96例)，传统方法具体为：将血斑打冲至96孔承接板中，加入内标提取液，震荡后，使用移液器将一定量的提取液转移至另一洁净的96孔承接板。在两种处理方法中，采用传统方法操作上十分繁琐，且未能获取全部的提取液，需要增加移液的过程及耗材的消耗，存在转移错误的风险，耗时较长，而采用如实施例1所述的方法进行样本制备可明显减少样品制备的时间(如表2)，同时可减少96次移液、装卸吸嘴的操作，减少耗材的使用，简化操作步骤，降低移液错误风险，节约样本制备的时间。
表2不同样本制备方法时间
方法 实施例1方法 传统移液方法
时间/min 75 110
实施例3
采用如实施例1所述的方法(使用96管滤盘进行样本制备)，与传统的试剂转移方法制备样本进行比较，仪器的维护成本明显下降，由于通过过滤板过滤可去除粒径较大的杂质，在仪器连续检测20天，每天180个样本的情况下，仪器压力未见明显变化，而传统的试剂转移方法制备样本，仪器在第12天的时候可见压力明显上升，需对部分仪器耗材进行更换。(见表3)
表3设备压力变化和耗材更换频率
实施例4检测方法精密度测定
(1)批内精密度：取低(L)、高(H)两水平的加标样本，每个浓度水平的样本平行处理12个，标准偏差(RSD)在3％～6％间(见表4)。
表4批内精密度
level L H
Average 1.44 2.75
RSD(％) 5.11 4.89
(2)批间精密度：取低(L)、高(H)两水平的加标样本，每个浓度水平的样本每批次平行处理4个，连续测定5天，标准偏差(RSD)在5％～11％间(见表5)。
表5批间精密度
level L H
Average 1.28 2.95
RSD(％) 10.21 10.41
实验数据表明，本发明方法精密度良好。
实施例5
实施例1步骤(3)所述的上机检测为：采用液相色谱串联质谱检测，其中液相色谱中，流动相中有机相的选择：比较不同的有机溶剂(甲醇、乙腈)作为流动相有机相时，对琥珀酰丙酮离子化效率的影响。分别处理两组数据，一组使用95％甲醇作为流动相中的有机相，一组使用95％乙腈作为流动相中的有机相，使用标准溶液在每个条件下分别进样12针，比较两组数据中琥珀酰丙酮离子化效率的变化。
具体色谱条件如下：
流动相：
一组为乙腈与水的混合溶液，以v/v计，所述乙腈与水的混合溶液中含水量≥5％，加入0.02％-1.00％的草酸；
另一组为甲醇与水的混合溶液，以v/v计，所述乙腈与水的混合溶液中含水量≥5％，加入0.02％-1.00％的草酸；
流动相的流速为0.02～1.0mL/min。
液相洗脱时的进样量为10～30μL。
质谱方法：使用三重四级杆进行检测，条件如下表6。
表6
数据表明，使用乙腈作为流动相中的有机相，离子化效率明显高于甲醇作为流动相中的有机相，且所获得的色谱图乙腈(图4)的基线比甲醇(图5)的更低。
实施例6
采用如实施例1所述的方法，实施例1步骤(3)中所述的提取工作液中，提取液中水合肼浓度的选择：配制0.75mmol/L，1.5mmol/L，2.5mmol/L，3.0mmol/L，5.0mmol/L，10.0mmol/L，15.0mmol/L和20.0mmol/L浓度水合肼的内标萃取液，分别处理3个不同水平加标样本，每个样本平行处理3个，数据表明，随着水合肼浓度增加，在浓度3.0mmol/L后对琥珀酰丙酮响应信号存在一定的抑制作用(图6)，琥珀酰丙酮回收率随着水合肼浓度的升高而升高(表7)，主要通过抑制内标的响应使回收率升高，优选水合肼浓度不小于3mmol/L加入内标提取液中。
表7不同浓度水合肼样本检测结果数据
实施例7
采用如实施例1所述的方法，实施例1步骤(2)中，在过滤板中分别加入35倍样本体积甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇对样本进行预处理净化，静置后通过离心去除有机溶剂，得到净化后的干血斑样本。
其余步骤与实施例1一致，结果如图7所示。有图中可以看出，甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇对样本进行预处理净，均可获得的较高的样本信号响应。其中经过甲醇处理的样本信号响应(SUAC：4.4*e4)，乙醇处理的样本信号响应(SUAC：2.6*e4)、异丙醇处理的样本信号响应(SUAC：2.2*e4)，正丁醇处理的样本信号响应(SUAC：2.1*e4)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取干血斑样本；
净化预处理：向所述干血斑样本中加入有机溶剂，静置后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；
目标试样提取：采用提取工作液对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；
采用液相色谱串联质谱法检测目标试样。
2.根据权利要求1所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述净化预处理中，所述有机溶剂为C1-C3一元醇。
3.根据权利要求2所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述净化预处理中，所述有机溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述净化预处理中，向所述干血斑样本中加入干血斑样本30～50倍体积的有机溶剂，静置10min～20min后去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本。
5.根据权利要求1所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述目标试样提取，步骤包括：向净化后的干血斑样本中加入提取工作液，在37℃-45℃温度下反应40min～80min；
所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质。
6.根据权利要求5所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述萃取剂为：乙腈与水的混合溶液；和/或
所述衍生化试剂为水合肼；和/或
所述酸性物质为可挥发性酸溶液。
7.根据权利要求6所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，以v/v计，所述乙腈与水的混合溶液中含水量≥5％；和/或
所述水合肼的浓度≥3mmol/L；和/或
所述可挥发性酸溶液为0.02％-1.00％的草酸溶液。
8.根据权利要求1所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述采用液相色谱串联质谱法检测目标试样中液相色谱条件为：
流动相：为有机溶剂与水的混合溶液，以v/v计，所述有机溶剂与水的混合溶液中含水量≥5％，加入0.02％-1.00％的草酸；
流动相的流速为0.02～1.0mL/min；
液相洗脱时的进样量为10～30μL；
质谱方法为：使用三重四级杆进行检测。
9.根据权利要求8所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈或甲醇。
10.根据权利要求1-9任一项所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取干血斑样本，放入过滤板中；
净化预处理：向过滤板中的干血斑样本中加入有机溶剂，静置后通过离心去除有机溶剂，得净化后的干血斑样本；
目标试样提取：向过滤板中加入提取工作液，对所述净化后的干血斑样本进行提取，即得目标试样；所述提取工作液中包含有萃取剂、衍生化试剂和酸性物质；
采用液相色谱串联质谱法检测目标试样。
11.根据权利要求10所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述过滤板为96管滤盘。
12.根据权利要求11所述的琥珀酰丙酮的检测方法，其特征在于，所述干血斑样本的直径为3-3.5mm。
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