CN110551072A - 具有抑制dna拓扑异构酶活性的喹噁啉-n1,n4-二氧化物衍生物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉‑N1,N4‑二氧化物衍生物、制备方法及应用。该类化合物的合成是以4,5‑二氟‑2‑硝基苯胺为原料，在碱性催化剂氢氧化钠的催化下，与次氯酸钠发生反应，得到5,6‑二氟‑N‑氧化苯并呋咱；再与不同的底物发生Beirut反应和取代反应，即得到一系列喹噁啉‑N1,N4‑二氧化物衍生物。本发明所述的喹噁啉‑N1,N4‑二氧化物不仅对以前报道的革兰氏阴性菌具有良好的抑菌活性，对胸膜肺炎放线杆菌及革兰氏阳性菌如上述金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌也具有良好的抑菌活性。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物、制备方法及应用。
背景技术
喹噁啉-N1,N4-二氧化物是一类苯并哌嗪类杂环化合物，具有广谱抗菌活性，被普遍应用于医药和农业领域。对于该类药物研究最早的是其抗菌活性(Landquist et al.，1956；Silk，1956)，尤其对革兰氏阴性菌具有良好的抑制作用(王旭等，2009)，例如对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡沙门氏菌以及痢疾杆菌的抗菌效果显著(孔新刚，2008)。同时该类化合物还可以提高饲料转化率和促进动物生长发育的作用(Cihak et al.，1983；Cihaketal.， 1983；Cihak et al.，1985)。喹噁啉-N1,N4-二氧化物还有其抗肿瘤(Mielcke etal.，2012； Rajule et al.，2012)、抗病毒、抗真菌等作用。其中卡巴氧和喹乙醇是在20世纪60年代上市的兽用药物，作为饲料添加剂，对猪痢疾有良好的治疗效果，还可以治疗仔猪腹泻，提高饲料转化率。但近年来研究发现部分喹噁啉类化合物具有明显的致癌作用(Ferrando et al.，1978)、致畸作用(王树槐等，1991；王树槐，1993)、致突变作用(Fonshtein et al.， 1978；Voogd et al.，1980；Cihak et al.，1983)、光敏毒性(De etal.，1990；He et al.，2006) 等毒副作用，严重危害动物和人类的健康安全。针对喹噁啉类化合物的抗菌作用机制进行深入研究，有助于研发更加高效、低毒、廉价的新型喹噁啉类药物。
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP) 引起的一种急性致死性呼吸道传染病，是威胁各国养猪业的最重要的细菌病之一，其主要特征为出血性纤维素性胸膜肺炎和纤维素性坏死性胸膜肺炎。胸膜肺炎放线杆菌划分为巴氏杆菌科放线杆菌属，革兰氏阴性小杆菌。尽管喹噁啉类化合物具有广谱抗菌活性，但对于胸膜肺炎放线杆菌的活性尚未有过报道，因此测定该类化合物对APP的抗菌活性具有至关重要的作用，也为研发该类化合物的应用途径提供基础。
细菌DNA拓扑异构酶作为抗菌药物的靶点被广泛研究和应用(Yorgey et al.，1994)。 DNA拓扑异构酶控制着细菌或细胞内DNA双链的拓扑结构，并且对蛋白翻译和细胞复制起着至关重要的作用。在DNA复制期间，DNA拓扑异构酶结合在DNA双链上，通过切开DNA单链或双链来移除双螺旋DNA的拓扑结构，继而启动DNA复制过程(Sissi et al.，2010；Bush et al.，2015)。细菌DNA拓扑异构酶包括DNA拓扑异构酶I和DNA 拓扑异构酶II(DNATOP II)，其中DNA TOP II作为氟喹诺酮类药物的作用靶点被深入研究。DNA TOP II又包括DNA回旋酶(DNA Gyrase)和DNA拓扑异构酶IV(DNA TOP IV)，这两种酶在结构上具有高度的同源性，同源相似性高达99％，但在DNA复制过程中二者却起着不同的作用，DNA Gyrase在水解ATP的同时可促进松弛态环状DNA转变为负超螺旋DNA，而DNA TOP IV则在ATP提供能量的前提下促进负超螺旋DNA 解开拓扑状态，转变为松弛状态的DNA。
氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)是广谱抗菌药，广泛应用于各种微生物感染，其作用靶点是细菌的DNA拓扑异构酶II(DNA Gyrase和DNA TOP IV)，在DNA复制过程中，FQs结合到DNA-拓扑异构酶复合物上，形成不可逆的药物-酶-DNA三元共价复合物，研究表明该复合物能引起DNA的裂解，因此又称为“裂解复合物”，裂解复合物中酶的活性被FQs所抑制，阻止了DNA的复制、转录、翻译等过程，最终导致细菌死亡(Mustaev et al.，2014)。然而在大量使用FQs的同时，细菌逐渐对FQs产生了耐药性；因此，针对日益严峻的耐药性问题，急需研发新型、高效的抗菌药物。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物、制备方法及应用。
本发明是这样实现的，具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物，其特征在于，具有如下结构通式：
式I中：
R1是烷基或羟基或烷氧基取代；R2是甲基或三氟甲基；R6是含氮杂环或氟原子取代，含氮杂环通过C-N键与喹噁啉母环相连；R7是氢，氯或者氟原子。
进一步，所述含氮杂环为哌嗪、吡咯、三氮唑、哌啶、咪唑或吗啉中的任一种。
一种具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：4,5-二氟-2-硝基苯胺溶解于四氢呋喃，以氢氧化钠做催化剂，与次氯酸钠在冰浴下发生反应，生成5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱；
步骤2：5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱与乙酰乙酸乙酯在室温下发生Beirut反应，得到 6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物；
步骤3：将步骤2中得到的产物与不同的含氮杂环底物发生取代反应，即可得到终产物，所述终产物的化学结构通式如式I所示。
进一步，步骤1中，喹噁啉环C7位为氯原子取代时则用4,5-二氯-2-硝基苯胺代替4,5-二氟-2-硝基苯胺。
进一步，步骤2中，喹噁啉环C2位为乙酰基取代时，则选取乙酰丙酮代替乙酰乙酸乙酯，得到6,7-2F-3-CH3-2-乙酰喹噁啉-N1,N4-二氧化物。
进一步，步骤2中，喹噁啉环C3位为三氟甲基取代，底物选择三氟乙酰乙酸乙酯代替乙酰乙酸乙酯，或三氟乙酰丙酮代替乙酰丙酮。
如上述的具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物在抑制结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或胸膜肺炎放线杆菌中的任一种或几种菌株活性中的应用。
如上述的具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物在制备用于治疗由结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或胸膜肺炎放线杆菌中的任一种或几种病菌引起的感染的药物中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本申请申请人研究发现喹噁啉类化合物具有DNA TOP IV抑制活性，基于FQs的结构对喹噁啉化合物母环的C2、C3、C6和C7位进行侧链修饰，合成了如本申请中所示的一系列喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物，并对新合成的化合物进行了DNA TOP IV抑制活性研究，结果显示该类化合物对大肠杆菌DNA TOP IV具有明显的抑制活性。进一步体外抑菌活性测试结果显示：对结核分枝杆菌(H37Rv)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肺炎链球菌(ATCC49619)、胸膜肺炎放线杆菌(ATCC27090)具有显著的抑菌活性。本发明所述的喹噁啉-N1,N4-二氧化物不仅对以前报道的革兰氏阴性菌具有良好的抑菌活性，对胸膜肺炎放线杆菌而且对革兰氏阳性菌如上述金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和肺炎链球菌(ATCC49619)也具有良好的抑菌活性。
附图说明
图1是化合物8对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果；
图2是化合物9对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果；
图3是化合物2对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果；
图4是化合物6对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果；
图5是本申请中的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的化学分子结构通式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物、制备方法及应用。本发明中所制备的具有抗菌活性和DNA TOP IV抑制活性的喹噁啉 -N1,N4-二氧化物衍生物的化学分子结构通式如下，同时见图5。
式I中：
R1是烷基、羟基或者烷氧基取代；R2是甲基或三氟甲基；R6是含氮杂环或氟原子取代，含氮杂环优先选取哌嗪、吡咯、三氮唑、哌啶、咪唑、吗啉等，含氮杂环通过 C-N键与喹噁啉环相连；R7是氢，氯或者氟原子。
实施例1
以喹噁啉环C3位甲基取代，C7位氟原子取代为例进行说明
本实施例中喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物合成的反应式如下所示：
具体制备步骤：
1、在50mL圆底反应瓶中加入25mL四氢呋喃，依次加入3克4,5-二氟-2-硝基苯胺，80mL次氯酸钠，和0.2g氢氧化钠，在0℃反应2小时，将反应液倒入分液漏斗中，以二氯甲烷萃取两次(25mL×2)，合并二氯甲烷层，减压蒸除溶剂后得到淡黄色固体，即为5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱；
2、喹噁啉环C2位为甲酸乙酯，C3位为甲基取代时：
取5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.5g置于50mL圆底反应瓶中，加入25mL丙酮溶解，随后加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱的物质的量1.5倍的乙酰乙酸乙酯(3.9g)，和2.5g碳酸钾，在25℃下搅拌反应4小时后将反应液过滤，固体以冰水洗涤，得到的固体即为 6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物；
喹噁啉环C2位为乙酰基，C3位为甲基取代时：
取5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.5g置于50mL圆底反应瓶中，加入三乙胺溶解，随后加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱的物质的量1.5倍的乙酰丙酮(3.0g)，在25℃下搅拌反应1小时后将反应液过滤，固体以冰乙醇洗涤，得到的固体即为6,7-2F-3-CH3-2-乙酰喹噁啉-N1,N4-二氧化物；
喹噁啉环C2位为甲酸乙酯，C3位为三氟甲基取代时：
取5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.5g置于50mL圆底反应瓶中，加入25mL丙酮溶解，随后加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱的物质的量1.5倍的三氟乙酰乙酸乙酯(5.5g)，和3.5g碳酸钾，在25℃下搅拌反应8小时，将反应液倒入分液漏斗中，以二氯甲烷萃取三次 (100mL×3)，合并二氯甲烷层，减压蒸除大部分溶剂，向未蒸干的溶液中加入石油醚，可降低产物的溶解性从而析出土黄色固体，即为6,7-2F-3-CF3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4- 二氧化物；
喹噁啉环C2位为乙酰基，C3位为三氟甲基取代时：
取5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.5g置于50mL圆底反应瓶中，加入25mL丙酮溶解，随后加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱的物质的量1.5倍的三氟乙酰丙酮(4.7g)，和3.5g碳酸钾，在25℃下搅拌反应8小时，将反应液倒入分液漏斗中，以二氯甲烷萃取三次(100mL ×3)，合并二氯甲烷层，减压蒸除溶剂后得到黄色固体，即为6,7-2F-3-CF3-2-乙酰喹噁啉-N1,N4-二氧化物
3、取步骤2得到的产物(以6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物为例) 置于圆底反应瓶中，加入无水乙醇/二氯甲烷溶解，随后加入6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物的物质的量2～4倍的含氮杂环(此时底物即作为原料参与反应，也作为反应的催化剂)，在55℃搅拌反应8小时，将反应液用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，收集有机相并减压蒸馏去除溶剂，经硅胶柱层析进行纯化，即得到终产物。
4、喹噁啉环C2位为甲酸取代时：
取步骤3得到的喹噁啉环C2位为甲酸乙酯的产物(以7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物为例)置于圆底反应瓶中，加入四氢呋喃/水溶解，加入氢氧化钠在室温(25℃)下进行水解反应，反应结束后，加入稀盐酸调节反应液pH值至5～6，-20℃冷冻析出固体，过滤后冰乙醇洗涤，得到的固体即为7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸 -N1,N4-二氧化物。
实施例2
7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物的合成反应式如下：
制备步骤如下：
(1)向500mL三口烧瓶中加入8.7g(0.05mol)4,5-二氟-2-硝基苯胺，加入75mL四氢呋喃使其充分溶解，而后加入0.6g(0.015mol)氢氧化钠做催化剂，在冰浴(0℃)下滴加240mL次氯酸钠，搅拌反应2小时，反应完全后将反应液用二氯甲烷萃取两次(400mL ×2)，收集有机相并减压蒸馏去除溶剂得到淡黄色固体7.0g，即为5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱，产率81.4％。
(2)向50mL单口烧瓶中加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.44g(0.02mol)，加入25mL丙酮溶解，随后加入乙酰乙酸乙酯3.9g(0.03mol)，和2.5g碳酸钾，在25℃下搅拌反应 4小时后将反应液过滤，固体以冰水洗涤，得到的固体即为6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物，产率81％。
(3)向50mL单口烧瓶中加入6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物2.84g (0.01mol)，加入无水乙醇溶解，随后加入哌嗪3.44g(0.04mol)(此时哌嗪即作为原料参与反应，也作为反应的催化剂，加大其使用量可以催化反应完全，提高产率)，在50℃搅拌反应8小时，期间有沉淀析出，待反应完全后将反应液进行过滤，冰乙醇洗涤，得到浅黄色固体粉末2.9g，即为7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物，产率82.9％。熔点198.2-200.5℃；MS:[M+H]+351.1390；1H NMR(600MHz,D2O)δ8.08 (d,J＝12.3Hz,1H),7.79(d,J＝7.9Hz,1H),4.54(q,J＝7.2Hz,2H),3.64–3.59(m,4H), 3.47–3.42(m,4H),2.50(s,3H),1.36(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例3
7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸-N1,N4-二氧化物的合成反应式如下：
制备步骤如下：
向50mL单口烧瓶中加入实施例2中得到的7-F-6-哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物3.5g(0.01mol)，溶解于四氢呋喃/水(v:v＝2:1)中，加入1mol/L氢氧化钠24.5mL，在50℃下进行水解反应，反应结束后，加入稀盐酸(1mol/L)调节反应液pH值至5～6，-20℃冷冻析出固体，过滤后冰乙醇洗涤，得到土黄色固体粉末1.4g，即为7-F-6- 哌嗪-3-CH3-2-喹噁啉甲酸-N1,N4-二氧化物，产率43.8％。熔点218.2-220.5℃；MS:[M+H]+323.1077；1H NMR(600MHz,D2O)δ8.08(d,J＝12.4Hz,1H),7.82(d,J＝7.9Hz,1H), 3.61–3.50(m,4H),3.48–3.39(m,4H),2.53(s,3H)。
实施例4
7-F-6-咪唑-3-CF3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物的合成反应式如下所述：
制备步骤如下：
(1)向500mL三口烧瓶中加入8.7g(0.05mol)4,5-二氟-2-硝基苯胺，加入75mL四氢呋喃使其充分溶解，而后加入0.6g(0.015mol)氢氧化钠做催化剂，在冰浴(0℃)下滴加240mL次氯酸钠，搅拌反应2小时，反应完全后将反应液用二氯甲烷萃取两次(400mL×2)，收集有机相并减压蒸馏去除溶剂得到淡黄色固体7.0g，即为5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱，产率81.4％。
(2)向50mL单口烧瓶中加入5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱3.44g(0.02mol)，加入25mL丙酮溶解，随后加入三氟乙酰乙酸乙酯5.5g(0.03mol)，和3.5g碳酸钾，在25℃下搅拌反应8小时，将反应液倒入分液漏斗中，以二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并二氯甲烷层，减压蒸除大部分溶剂，向未蒸干的溶液中加入石油醚，可降低产物的溶解性从而析出土黄色固体4.6g，即为6,7-2F-3-CF3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物，产率67.6％。
(3)向50mL单口烧瓶中加入6,7-2F-3-CF3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物3.4g (0.01mol)，二氯甲烷进行溶解，而后加入咪唑2.7g(0.04mol)(此时咪唑即作为原料参与反应，也作为反应的催化剂，加大其使用量可以催化反应完全，提高产率)，于50℃搅拌反应8小时，反应完全后将反应液以二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，收集有机相并减压蒸馏去除溶剂，经硅胶柱层析进行纯化，得到7-F-6-咪唑-3-CF3-2-喹噁啉甲酸乙酯 -N1,N4-二氧化物2.2g，产率57％。熔点195.2-198.5℃；MS:[M+H]+387.0638；1H NMR (600MHz,DMSO)δ8.65(dd,J＝35.5,8.9Hz,2H),8.39(s,1H),7.93(s,1H),7.25(s,1H), 4.50(d,J＝7.1Hz,2H),1.35(dd,J＝8.6,5.6Hz,3H)。
本发明中其余取代的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的合成及后处理过程与实施例1-4相同，在此不再一一给出，但将部分化合物化学结构式给出，本发明中分别简称为化合物1-9，结构式如下：
实施例5
采用琼脂糖凝胶电泳法对本发明制备的化合物进行酶活性抑制实验测定，选取其中抗菌活性较好6个化合物测定对大肠杆菌DNA TOP IV的抑制活性，方法如下：
DNA TOP IV的活性抑制实验(1U的DNA Topo IV在37℃条件下，30min可将0.5μg超螺旋质粒pBR322 DNA全部转化为松弛的质粒DNA)选取超螺旋质粒pBR322 DNA作为酶的底物进行实验，将反应体系(表1)中的试剂根据体积大小依次加入到PCR小管中，并将反应液轻轻吹打均匀后，置于37℃条件下反应40min，反应结束后加入STEB终止反应，加入氯仿/异戊醇(v:v＝24:1)进行萃取后离心2min，取上清20μL进行电泳；电泳条件为80V，80mA，2h，凝胶浓度为1％，电泳结束后凝胶用EB(1μg/mL)染色25min，水洗脱色5min，最后进行紫外成像。
表1 DNA Topoisomerase IV反应体系
测定化合物对大肠杆菌DNA TOP IV抑制活性时，在上述反应体系中加入不同浓度的药物以及阳性对照，测定结果如表2，其中有4个化合物的IC50低于100μM，化合物 8的IC50低至48.2μM。
表2化合物对大肠杆菌DNA TOP IV的抑制活性
对大肠杆菌DNA TOP IV的抑制活性(IC50)低于100μM的4个化合物的电泳结果如图1所示，其中泳道1为超螺旋质粒，2-6为超螺旋质粒加Topo IV加化合物8(浓度分别为64μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、1μg/mL)，7为超螺旋质粒加DNA Topo IV。
图2为化合物9对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果，其中泳道1为超螺旋质粒，2-6为超螺旋质粒加Topo IV加化合物9(浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32 μg/mL、16μg/mL、4μg/mL)，7为超螺旋质粒加DNA Topo IV。
图3为化合物2对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果，其中泳道1为超螺旋质粒，2-6为超螺旋质粒加Topo IV加化合物2(浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32 μg/mL、16μg/mL、4μg/mL)，7为超螺旋质粒加DNA Topo IV。
图4是化合物6对DNA拓扑异构酶IV的酶活性抑制结果，其中泳道1为超螺旋质粒，2-6为超螺旋质粒加Topo IV加化合物6(浓度分别为128μg/mL、64μg/mL、32 μg/mL、16μg/mL、4μg/mL)，7为超螺旋质粒加DNA Topo IV。
采用琼脂糖凝胶电泳法对本发明中所述的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物对大肠杆菌DNA TOP IV活性的抑制作用进行测试，所述靶蛋白为大肠杆菌DNA TOP IV(购自Inspiralis公司)，结果表明该类化合物可以明显抑制大肠杆菌DNA TOP IV活性，IC50低至48.2μM。
实施例6
采用肉汤稀释法对本发明制备的一系列化合物进行体外抑菌的活性测定。选取菌种包括金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，肺炎链球菌(ATCC49619)，胸膜肺炎放线杆菌(ATCC27090)。该项测试在国家兽药残留基准实验室(华中农业大学)进行。方法如下：以上菌种培养达到生长对数期后将原菌液与0.5麦氏比浊管(McFarland)进行目测比浊，配置成浊度为1～2×108CFU/mL的细菌悬液，再用无菌MH肉汤或者含有胎牛血清的无菌MH肉汤按1:100进一步稀释成1×106CFU/mL的工作菌液备用。各化合物首先配置成1280μg/mL的母液，用MH肉汤稀释到128μg/mL的浓度，然后按照倍比稀释的方法依次稀释成所需浓度，浓度依次为：64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。质控药环丙沙星母液(1280μg/mL)用MH肉汤稀释至2μg/mL，再将质控药环丙沙星用 MH肉汤培养基倍比稀释至所需浓度，依次为1、0.5、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、 0.007813、0.003906、0.001953μg/mL。将以上稀释好的不同浓度的工作液分别吸取100μL 加入96孔板的第1-10号孔中。将上述备用的细菌悬液，加入对应含有等量药液的96 孔的第1-10号孔内。同时设置阳性对照和阴性对照。每个药物的同一浓度对同一株菌做三次平行，重复三次，测定最小抑菌浓度，部分化合物抗菌活性结果见表3。
表3化合物1-9对3种细菌的MIC测定结果
采用肉汤稀释法对本发明中所述的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物对金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，肺炎链球菌(ATCC49619)，胸膜肺炎放线杆菌(ATCC27090)的抑菌活性进行测试，结果表明该类化合物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具有显著的抑制作用，抗菌活性低至0.25μg/mL。
实施例7
采用Alamar blue方法(MABA法)对本发明中制备的一系列化合物进行人型结核分支杆菌(H37Rv，ATCC27294)的体外抑菌活性试验，该项测试在华中农业大学动物生物安全三级实验室(ABSL-3)内进行。具体步骤如下：取待测结核分枝杆菌以5％(v/v)接菌量，接入20mL Middlebrook 7H9(含0.2％甘油和10％OADC)，37℃培养15d至对数生长期。用7H9培养基按照倍比稀释法将用DMSO配制的药液(1280μg/mL)稀释成所需浓度(μg/mL)，依次为：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25等11个不同浓度的工作液，吸取100μL加入96孔板，同时，取一空白板，设3孔不含药的生长对照孔。取生长至对数期的菌液与1号标准麦氏(McFarland)比浊管比浊，用适量7H9液体培养基调至终浓度为106CFU/mL的工作菌液。于制备好的96孔板的含药孔及对照孔中各加 100μL工作菌液，药物终浓度(μg/mL)依次为：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125。96孔板于37℃孵育5d，然后，向生长对照孔加入20μLAlamar blue指示剂和 10％Tween-80 12μL混合液，37℃孵育24h，观察对照孔颜色，如果由蓝色变为粉红色，则在各实验药物孔内加入上述的Alamar blue和Tween-80混合液，37℃孵育24h，粉红色孔定义为阳性生长。最小抑菌浓度(MIC)为阻止颜色变为粉红色的最低药物浓度。试验设计3次平行和3次重复，结果见表4。
表4化合物1-9对结核分支杆菌的MIC测定结果
结果表明化合物1-9均对人型结核分枝杆菌有显著的抑制活性(TAACF机构规定抗结核分支杆菌的MIC<6.25μg/mL具有活性)，抗菌活性低至0.125μg/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物，其特征在于，具有如下结构通式：
式I中：
R1是烷基或羟基或烷氧基取代；R2是甲基或三氟甲基；R6是含氮杂环或氟原子取代，含氮杂环通过C-N键与喹噁啉母环相连；R7是氢，氯或者氟原子。
2.根据权利要求1所述的具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物，其特征在于：所述含氮杂环为哌嗪、吡咯、三氮唑、哌啶、咪唑或吗啉中的任一种。
3.一种具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：4,5-二氟-2-硝基苯胺溶解于四氢呋喃，以氢氧化钠做催化剂，与次氯酸钠在冰浴下发生反应，生成5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱；
步骤2：5,6-二氟-N-氧化苯并呋咱与乙酰乙酸乙酯在室温下发生Beirut反应，得到6,7-2F-3-CH3-2-喹噁啉甲酸乙酯-N1,N4-二氧化物；
步骤3：将步骤2中得到的产物与不同的含氮杂环底物发生取代反应，即可得到终产物，所述终产物的化学结构通式如权利要求1或2所示。
4.根据权利要求3所述的一种具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的制备方法，其特征在于：步骤1中，喹噁啉环C7位为氯原子取代时则用4,5-二氯-2-硝基苯胺代替4,5-二氟-2-硝基苯胺。
5.根据权利要求4所述的一种具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的制备方法，其特征在于：步骤2中，喹噁啉环C2位为乙酰基取代时，则选取乙酰丙酮代替乙酰乙酸乙酯，得到6,7-2F-3-CH3-2-乙酰喹噁啉-N1,N4-二氧化物。
6.根据权利要求5所述的一种具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物的制备方法，其特征在于：步骤2中，喹噁啉环C3位为三氟甲基取代，底物选择三氟乙酰乙酸乙酯代替乙酰乙酸乙酯，或三氟乙酰丙酮代替乙酰丙酮。
7.如权利要求1或2所述的具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物在抑制结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或胸膜肺炎放线杆菌中的任一种或几种菌株活性中的应用。
8.如权利要求1或2所述的具有抑制DNA拓扑异构酶活性的喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物在制备用于治疗由结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或胸膜肺炎放线杆菌中的任一种或几种病菌引起的感染的药物中的应用。
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