WO2012096556A1 - Derivados de quinoxalina selectivos contra trypanosoma cruzi y que no causan efectos mutagénicos - Google Patents

Derivados de quinoxalina selectivos contra trypanosoma cruzi y que no causan efectos mutagénicos Download PDF

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WO2012096556A1
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dioxide
trifluoromethylquinoxaline
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Antonio Monge
Silvia PÉREZ
Ignacio ALDANA
Elsa MORENO
Enrique Torres
Hugo Cerecetto Meyer
María Mercedes GONZÁLEZ HORMAIZTEGUY
Jorge Fernando PANIAGUA SOLÍS
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Antonio Monge
Perez Silvia
Aldana Ignacio
Moreno Elsa
Enrique Torres
Hugo Cerecetto Meyer
Gonzalez Hormaizteguy Maria Mercedes
Paniagua Solis Jorge Fernando
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/36—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D241/50—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems with hetero atoms directly attached to ring nitrogen atoms
    • C07D241/52—Oxygen atoms

Definitions

  • This invention refers to 1, 4-trifluoromethylquinoxaline (QDO) derivatives with ester or amide functionality in position 2, with excellent selectivity on Trypanosoma cruzi, by a mechanism of action different from the drugs used in therapy and not It causes mutagenic effects in the patient with Chagas disease.
  • QDO 4-trifluoromethylquinoxaline
  • Parasitic diseases caused by protozoa are a serious health and economic problem in both developed and developing countries (http://www.who.int/). They can be classified into three groups according to their incidence on different human populations (Goodman, The Pharmacological Bases of Therapeutics, McGraw-Hill, 2003). In the first place are parasitosis that fundamentally affect underdeveloped countries such as Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Characteristic diseases of this group are Chagas disease (Trypanosoma cruzi) (De Souza, Curr. Pharm.
  • T. cruzi is the causative agent of this disease, which exists in several regions of Latin America and affects between 20 and 25 million people (http: A ⁇ vww.who.int/ctd/chagas) .
  • c IC 5 or T2 Concentration necessary to inhibit in 50% the growth of T. cruzi epimastigotes, in vitro, of the Tulahuen 2 strain.
  • d IC 50 is determined as indicated below in the examples section.
  • Electron-attractant clusters in positions 2, 3, and 5-8 of the quinoxaline ring For example: a trifluoromethyl group in position 3, an electron-attractant group in position 2, halogen substituents in positions 6 and
  • the amide has the value closest to reference compound 9 and complies with the Lipinski rules.
  • the lengthening of the ester group chain leads to an adequate improvement in lipophilicity (from 3.66 to 4.06, without breaking the Lipinski rules).
  • the leading compounds of the present invention derived from 1,4-trifluoromethylquinoxaline derivatives with ester or amide functionality in position 2, arise.
  • these compounds do not possess relevant toxicity on the mammalian cell lines studied, a novel mechanism of action, compared to the drugs used in clinical practice (Nfx and Bnz) and absence of mutagenicity.
  • T2 Concentration required to inhibit in 50% the growth of T. cruzi epimastigotes, in vitro, of the Tulahuen 2 strain.
  • the mechanism of action of these compounds is related to the inhibition of the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes of the parasite (Table III) and the increased excretion of certain metabolites, especially pyruvic acid (Table IV). While the drugs used in therapy, Nfx and Bnz, do not inhibit the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes of the parasite and the quinoxalines previously studied do so moderately (Benitez et al. XIII Jomadas of the convincedan Society of Biosciences.
  • the 1,4-quinoxaline dioxide herein are capable of initiating the death of the parasites by changing the activity of these key parasitic enzymes, which leads to the accumulation of pyruvic acid intraparasitically and their release into the environment.
  • the background compounds (derivative 18 and 22) as well as the compounds revindicated herein (for example derivatives 19, 21, etc.) are non-mutagenic, while Nfx and Bnz (commercial drugs) do. they are in identical conditions (Table V).
  • Table III Percentage of activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes when treated with the compounds under study. The percentage of dehydrogenase activity is expressed with respect to parasites without treatment (100% activity).
  • d M mutagenicity, according to Chu, .C .; Patel, K.M .; Lin, A.H .; Tarone, R.E .; Linhart, M.S .; Bis, V.C. Mutat Res. 1981, 85, 1 19.
  • FIGURE 1 shows a first series of derivatives of 1,4-quinoxaline dioxide (QDO)
  • FIGURE 2 shows examples of derivatives of QDO
  • FIGURE 3 shows examples of the QDO derivatives and theoretical parameters related to their theoretical behavior.
  • FIGURE 4 shows the different derivatives designed according to the electron-attractant groups that contribute to adequate lipophilicity.
  • FIGURE 5 shows the structures of the QDO derivatives 21 and 22
  • FIGURE 6 shows the claimed compounds, Formula I and II.
  • FIGURE 7 shows the reagents Formulas III and IV to obtain the QDO.
  • FIGURE 8 shows effectiveness of the compositions of the examples described above and those described herein.
  • the present invention relates to compounds derived from 1,4-trifluoromethyl-2-alkyl / aryloxycarbonylquinoxaline and 1,4-3-trifluoromethyl-2-carboxamidaquinoxaline dioxide. These compounds have proven to be very active in vitro against Trypanosoma cruzi. They have adequate indexes of selectivity, parasite / mammalian cells, and absence of mutagenicity. Therefore, the present invention relates to compounds and their use as trypanosomicidal agents.
  • R 9 is -C (1-6) acyclic or cyclic alkyl; benzyl; substituted benzyl; aryl (-Ar); - Ar substituted; where -N (R 1 ) R 2 is an aliphatic or aromatic cyclic amino substituent; a substituted aliphatic or aromatic cyclic amino substituent.
  • benzyl as indicated herein corresponds to the CH2-Ar group, where Ar (aryl) corresponds to the previous definition.
  • 1,4-3-trifluoromethyl-2-alkyl / aryloxycarbonylquinoxaline and 1,4-3-trifluoromethyl-2-carboxyamidaquinoxaline dioxide of the invention are:
  • the compounds of the present invention may be used in their base form or may be presented in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salts are hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, oxalates, citrates and mesylates.
  • Other examples may be sodium, potassium, calcium or organic base salts such as caffeine, ethylamine and lysine.
  • the compounds of the invention can be administered in warm-blooded animals, including man, in a variety of commonly acceptable pharmaceutical formulations.
  • oral administration it may be in the form of tablets, capsules, suspensions, syrups, or elixirs.
  • Parenteral administration can be formulated as a sterile solution, suspension or emulsion, to name a few.
  • Preferred pharmaceutical forms of the invention are the suspension for oral administration and the sterile suspension for intraperitoneal administration.
  • the general method to prepare the compounds has the following steps:
  • the reactor is vigorously stirred, e) optionally, the reaction is carried out in a microwave system, and is complemented in the follow-up with a thin layer chromatography system, f) the reaction is stopped and the solvent is removed, under reduced pressure;
  • the solvent is removed under reduced pressure in the rotary evaporator.
  • the solid obtained is dissolved in dichloromethane (150-200 ml_) and wash with water (150-200 mL) to remove K2CO3.
  • the organic phase is collected, dried with Na 2 S0 4 and the solvent is removed under reduced pressure.
  • the oil obtained (brown color) is purified by column chromatography, using dichloromethane as the mobile phase. The fractions of interest collected from the column are evaporated under reduced pressure and the solid obtained is filtered under vacuum and washed with diethyl ether (5-15 mL).
  • the microwave reaction is extracted and the product formation is checked by TLC.
  • the solution is then passed to a 50 mL flask and the solvent is removed in the rotary evaporator.
  • the solid obtained is purified by column chromatography using optionally dichloromethane or toluene / dioxane (9: 1) as the mobile phase.
  • the compounds derived from the compounds of formula I and II may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt, which is prepared by a method conventional, as is the reaction of the free form in a suitable solvent, for example diethyl ether, acetone or methanol, with a solution containing the corresponding equivalents of the desired acid or base in a suitable solvent, for example diethyl ether, acetone or methanol
  • a suitable solvent for example diethyl ether, acetone or methanol
  • salts are, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, acetate, oxalate, citrate, lactate, maleate, succinate, tartrate, cinnamate, benzoate, tosylate, mesylate, ascorbate, gluconate.
  • sodium, potassium, calcium salts or salts of organic bases such as caffeine, ethylamine, lysine.
  • the compounds of the present invention can be used in a variety of common pharmaceutical formulations.
  • the pharmaceutical compositions can be produced with at least one of the compounds of formula I and / or their derivatives and / or the compounds of formula II and / or their derivatives; in combination with pharmaceutically acceptable carriers, those that can be administered to a mammal with parasitic disease, for example with Chagas disease. That is, said compounds are used to prepare pharmaceutical formulations administered to a mammal with parasitic disease, specifically with Chagas disease.
  • the composition of these pharmaceutical formulations may be in a form adapted for oral administration, such as tablets, capsules, suspensions, syrups and elixirs, or for parenteral administration, as sterile solution, suspension and emulsion.
  • excipients suitable for pharmaceutical production processes and the preservation of the formulation will be used, such as lactose, microcrystalline cellulose, sodium lauryl sulfate, starch, magnesium stearate, talc, to name a few.
  • Liquid pharmaceutical forms will be prepared using aqueous, hydroalcoholic, or pharmaceutically suitable solvents containing or not stabilizers and preservatives.
  • sterility thereof must be guaranteed, by aseptic preparation or by a sterilization procedure after preparation, and may be by filtration or by heat (autoclave).
  • the dose to be administered, of the compounds of the present invention is dependent on the weight, age and health status of the warm-blooded animal to be treated, as well as the route of administration, the type and severity of the infection. by the parasite Typically the dose to be administered may be in the range of 1-500 mg / kg patient weight per unit dose.
  • the infrared spectra have been made in a Nicolet Nexus FTIR apparatus (Thermo, Madison, USA), with the OMNIC 6.0 software, using potassium bromide tablets for solid samples.
  • the wave numbers are expressed in cm "1 and the intensity of the bands is described as follows: mf (very strong signal), f (strong signal), m (medium signal) and d (weak signal).
  • Elemental analyzes they have been made in a LECO CHN-900 microanalyzer from samples dried with phosphorus pentoxide for 72 hours and vacuum (3-4 mmHg).
  • the melting points of the products described have been determined in a Mettler FP82 + FP80 equipment and they have not been corrected The melting temperature is shown in degrees Celsius (° C)
  • the Fine Layer Chromatography (CCF) is developed on 0.2 mm thick silica gel (ALLUGRAM SIL G / UV254, ref. 818133 , Macherey-Nagel), using dichloromethane as eluent Plates were developed with ultraviolet light of 254 and 365 nm. Column chromatographs have been developed on glass columns packed with silica gel (Merck-1.09385.2500; 0.040-0.063 mm particle size.) The mobile phase used was and dichloromethane.
  • the active ingredient any of those shown on pages 12 to 14, was prepared according to method 1 or 2, described on previous pages.
  • the pharmaceutical composition with which the examples were made is shown in the following table (this example is not intended to limit the invention in any way):
  • the active ingredient is mixed with lactose, microcrystalline cellulose, sodium lauryl sulfate and starch. It is screened through sieve No. 40. Magnesium stearate is added, mixed and compressed as desired in a tablet preparation machine.
  • Tripanosomicide activity assays in vitro activity, epimastigote form
  • the compounds were tested in vitro against Trypanosoma cruzi, on the epimastigote form of the Tulahuen 2, Y and Colombiana strains and against the CL Brener clone (from the strain collection of the Biological Physicochemical Laboratory, of the Institute of Biological Chemistry of the Faculty of Sciences, University of the Oriental Republic of Republic of Republic, Republic), which were grown at 28 ° C in an axenic medium (BHI-tryptosa), supplemented with 5% fetal bovine serum. It starts from cells of a culture of 5-7 days (exponential phase) which are inoculated with 50mL of fresh culture medium giving an initial concentration of 1x10 6 cells / mL. Growth The parasite is followed for 11 days by measures of absorbance of the culture at 600 nm, proportional to the number of cells present.
  • a preset amount of each derivative to be tested, dissolved in DMSO is incorporated into the medium.
  • the final concentration of DMSO in the culture medium never exceeds 0.4%, using a blank (absence of product) with 0.4% DMSO.
  • the compounds were incorporated into the culture medium at a final concentration of 25 ⁇ and for those that are more active the dose is progressively decreased to 1 nM.
  • the percentage of inhibition (Pl) of parasite growth is evaluated in comparison to the blank, using Nfx as a trypanosomicide reference drug.
  • the growth Pl is calculated as follows:
  • the Aeoonm taken at day 5 corresponds to the late exponential phase in the crop growth curve.
  • the determination of the IC 50 is carried out following the growth of the parasite in the absence (control) and presence of increasing concentrations of the corresponding products. Absorbance is measured at day 5 and is related to control.
  • the IC 50 is defined as the concentration of product required to give a Pl of 50%, the lower this value is, the greater the potency of the compounds.
  • Table III shows, as examples, those that do not limit the present invention, the IC 50 data of some of the trifluoromethylquinoxalines of the The present invention, for the epimastigote form of the Tulahuen 2 strain. Nfx and the corresponding derivatives previously described are included as a way of demonstrating the relevance of the structural motifs claimed herein.
  • the compounds have excellent trypanosomicidal activity in vitro. Being the potency, in all cases, superior to that of the reference drug and previous derivatives.
  • Cytotoxicity study in mammalian cells cytotoxicity in macrophages The toxicity of the products was evaluated in vitro on murine macrophages J774. 24-well microplates are used to which circular lamellae previously immersed in 3% nitric acid are placed. 100 ⁇ of the RPMI medium containing the macrophages (10 5 macrophages / mL) is placed in each well and incubated at 37 ° C, 5% C0 2 , for 3 hours.
  • the products to be tested are weighed and suspended in DMSO, RPMI is added to a concentration of 400 ⁇ . Dilutions are prepared to reach the concentrations to be studied. They are placed on the plate with the macrophages and incubated at 37 ° C, 5% C0 2 , for 48 hours.
  • the compounds have a low toxicity on the mammalian system studied and an excellent index of selectivity (IC 5 o, m acrophage / IC 5 o, T. cwz, higher than the derivatives previously studied.
  • the plate pre-incubation method (Marón, Mutat. Res. 113, 173-215, 1983) is used using Salmonella typhimur ⁇ um strain TA98 cultures. As a positive control, 4-nitro-o-phenylenediamine is used. The number of revealing colonies was counted manually and compared to spontaneous revertants. The compound is considered mutagenic when the number of revealing colonies is at least 2 times the spontaneous frequency in at least two consecutive doses (Chu, Mutat. Res. 85, 119-132, 1981).
  • the assay was performed in 24-well plates.
  • the cultures are incubated at 28 ° C. At different incubation times, the epimastigotes are they count and the colorimetric assay of MTT dye reduction was performed, where the tetrazolium salt is converted to purple form into living mitochondria of T. cruzi.
  • Fifty ⁇ _ of the solution containing 5 mg / mL of MTT in PBS is added to each well and incubated for 4 h.
  • the reaction is stopped by adding 500 ⁇ of isopropanol-acidic (0.4 mL 10 N HCI in 100 mL of isopropanol). The absorbance was measured at 570 nm. The compounds do not interfere with the reaction mixture. The percentage of mitochondrial dehydrogenase activity is determined using 100% activity of untreated parasites.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Esta invención hace referencia a derivados de 1,4-dióxido de 3- trifluorometilquinoxalina (QDO) con funcionalidad éster o amida en posición 2, con excelente selectividad sobre Trypanosoma cruzi, y que presentan un mecanismo de acción selectivo y diferente a los fármacos utilizados en terapia y que no causan mutagenicidad. Estos compuestos tienen una lipofilia adecuada para ser utilizados en cualquier formulación farmacéutica. La invención comprende los compuestos QDO de Fórmula I y Il (Figura 6), sus derivados, los métodos de preparación de dichos compuestos por reacción de un benzofuroxano y de un trifluorometilo. También abarca las formulaciones farmacéuticas para tratar a pacientes con enfermedad de Chagas y el uso de los compuestos reclamados.

Description

DERIVADOS DE QUINOXALINA SELECTIVOS CONTRA Trypanosoma cruzi Y QUE NO CAUSAN EFECTOS MUTAGÉNICOS
DESCRIPCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención hace referencia a derivados de 1 ,4-dióxido de 3- trifluorometilquinoxalina (QDO) con funcionalidad éster o amida en posición 2, con excelente selectividad sobre Trypanosoma cruzi, mediante un mecanismo de acción diferente a los fármacos utilizados en terapia y que no causa efectos mutagénicos en el paciente con enfermedad de Chagas.
ANTECEDENTES
Las enfermedades parasitarias causadas por protozoarios constituyen un grave problema sanitario y económico tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo (http://www.who.int/). Las mismas pueden clasificarse en tres grupos de acuerdo a su incidencia sobre distintas poblaciones humanas (Goodman, Las bases Farmacológicas de la Terapéutica, McGraw-Hill, 2003). En primer lugar se encuentran las parasitosis que afectan fundamentalmente a países subdesarrollados tales como Tripanosomiasis y Leishmaniasis. Enfermedades características de este grupo son la enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi) (De Souza, Curr. Pharm. Pesian 4, 269-85, 2002) y la enfermedad de Kala-Azar o Leishmaniasis visceral (Leishmania ma^ (N ature Reviews, 2, 692, 2004). Entre los hechos determinantes para la permanencia de estas afecciones se pueden destacar, la inadecuada enseñanza para la prevención, el aumento de la pobreza, el aumento a la resistencia a los fármacos utilizados en la quimioterapia y las deficiencias sanitarias. En segundo y tercer lugar se encuentran las Amebiasis, Giardiasis, Tricomoniasis, Toxoplasmosis y la Criptosporodiosis.
En las Américas la enfermedad tropical que presenta mayor incidencia es la enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana (De Souza, Cuir. Pharm. Pesian 4, 269-85, 2002). El protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es el agente causante de esta enfermedad, la cual existe en varias regiones de América Latina y afecta entre 20 a 25 millones de personas (http:A<vww.who.int/ctd/chagas).
Debido a la falta de una vacuna efectiva, la quimioterapia sigue siendo el método de elección en el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Los fármacos disponibles en el mercado, con algunas dificultades de acceso, para el tratamiento de esta enfermedad son Nifurtimox® (Nfx) y Benznidazol® (Bnz). El T. cruzi, es especialmente vulnerable a fármacos que producen radicales libres en el interior de la célula (Stoppani y col., Free Radical in Latín America 48, 75-85, 1996), lo que explicaría la acción tripanosomicida de estos fármacos. Los cuales a través de un proceso de bio-reducción, por enzimas del parásito, desencadenan un estrés oxidativo dañino (Morello, Como. Biochem. Phvsiol. 90C, 1-12, 1988).
Estos fármacos presentan grandes inconvenientes, por un lado la toxicidad asociada hacia el mamífero (Gorla y col., Mut. Res. 224, 263-267, 1989) debida, posiblemente, a la falta de selectividad en la generación de especies radicálicas en el parásito y en el huésped. Esto conduce a que su uso esté restringido en muchas situaciones, tales como embarazo, insuficiencia hepática y renal. Además, claramente han sido evidenciados importantes efectos mutagénicos y genotóxicos (Cabrera y col., Toxicol. Letters. 190, 140-149, 2009) que los inhabilita en cualquier proceso de registro como medicamentos. Por otro lado, estos fármacos actúan eficientemente sobre aquellas formas del parásito que no son las que aparecen, principalmente, en la fase crónica de la enfermedad. Por último, cabe destacar que se han encontrado cepas de T. cruzi resistentes a estos compuestos (Murta y col., J. Mol. Biochem. Parásito!. 93, 203- 214, 1998).
Debido a las innumerables desventajas que presentan los productos comerciales (Nfx y Bnz), en las últimas décadas, se han investigado diversas aproximaciones químicas tratando de obtener nuevos compuestos activos, con menores efectos secundarios asociados a su uso. En este sentido se han planteado modificaciones que pudieran conducir a compuestos que sean capaces de inhibir enzimas claves del ciclo vital del parásito, como ser la tripanotiona reductasa (Schirmer y col., Anpew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 141-154, 1995), las cistein proteinasas (Engel y col., Bioorganic Med. Chem. 11 , 2759-2762, 2002), las enzimas glicosomales (Aronov y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96, 4273-4278, 1999), la dihidrofolato reductasa (Zuccotto y col., Eur. J. Med. Chem. 36, 395-405, 2001) y las enzimas involucradas en la biosíntesis de esteróles de membrana (Urbina y col., Molecular Biochem. Parasitol. 35, 35-45, 2002). Sin embargo, los productos generados en estas investigaciones aún no han llegado a las fases clínicas correspondientes y en muchos casos su eficacia terapéutica es cuestionada (Cerecetto y González, Pharmaceuticals 3, 810-838, 2010).
Por ello, los agentes que actúan en la célula del parásito a través de la producción de especies activas de oxígeno siguen siendo los compuestos que muestran mayores ventajas terapéuticas.
Dentro del grupo de los potenciales productores de radicales libres hemos identificado, (Aguirre y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 3835-3839, 2004), una primera serie de derivados de 1 ,4-dióxido de quinoxalina (QDO) (Figura 1) con prometedora actividad in vitro sobre la forma epimastigota de T. cruzi. De esta primera serie, los derivados de QDO que presentaron mejor actividad in vitro son los compuestos 1 y 2 (Figura 2 y Tabla I), y en menor medida los derivados 3 y 4. Además en este primer estudio se pudieron conocer los requerimientos estructurales para una adecuada actividad anti-T. cruzi (ecuaciones QSAR1 y QSAR2):
PIC25(lM,-n>= - 129.0 (+47.0) - 3.0 (±1.1) EWM0 + 1 -97 (±0.33) (CLogP)2
r= 0.821 , 0* = 0.638, n = 11
QSAR1
ΡΙ025ΜΜ,τ2 = - 228.7 (±67.8) - 3.8 (±1.1) ELUMO + 259.5 (±135.4) qN + 1.6 (±0.4) (CLogP)2 r=0.855, q = 0.685, n=11
QSAR2
Siendo: PIC: porcentaje de inhibición del crecimiento; ELUMO: energía del orbital molecular desocupado de menor energía (en eV); CLogP: lipofilicidad calculada por el método Villar; qN: carga Mulliken sobre el nitrógeno menos positivo. Estas ecuaciones dan cuenta, a través de los términos en ELUMO y qN que un mecanismo de bio-reducción (como el mostrado en la Figura 1) puede ser operativo en la actividad anti-T. cruzi de los QDO. Por otro lado, la lipofilicidad participa, como en muchos otros fármacos, en una forma cuadrática mostrando la relevancia de la lipofilia de los compuestos para la entrada al microorganismo estudiado (Aguirre y col., Bioora. Med. Chem. Lett. 14, 3835-3839, 2004).
Tabla I. Ensayos tripanosomicidas y actividad in vitro de los
ejemplos de derivados QDO de la figura 2
Figure imgf000007_0001
a Numeración según Figura 2.
b PIC: porcentaje de inhibición del crecimiento a 25 μΜ en la cepa Tulahuen 2.
c IC5o T2: Concentración necesaria para inhibir en un 50% el crecimiento de epimastigotes de T. cruzi, in vitro, de la cepa Tulahuen 2.
d La IC50 se determina según se indica más adelante en la sección de ejemplos.
e IC50 CLB: Concentración necesaria para inhibir en un 50% el crecimiento de epimastigotes de T. cruzi, in vitro, del clon CL Brener. f nd: no determinado.
Continuando con la búsqueda de derivados de QDO con mejorada actividad anti-T. cruzi, posteriormente se trabajó a dos niveles:
1) Por un lado, se desarrollaron retro-amidas derivadas de la QDO 4 y estructuralmente relacionadas con la QDO 3 (retro-amidas 3-ciano-sustituidas) (Ancizu y col., Molecules 14, 2256-2272, 2009). Lamentablemente, ninguna de estas retro-amidas mejoraron la actividad de las QDO 1 y 2, resultando uno de los más activos el derivado 5 (Figura 2, Tabla I).
2) Por otro lado, se trabajó modificando la posición 3 del sistema QDO tomando como compuesto "padre" al derivado 1. Así, fue posible identificar derivados 3- trifluorometilo sustituidos, por ejemplo la QDO 6 (Figura 2, Tabla I), previamente preparado y evaluado como antimalárico (Zarranz y col., Braz. J. Pharm. Sci. 42, 357-361 , 2006), cuyo perfil de actividad fue similar (Boiani y col., J. Chem. Inf. Model. 48, 213-219, 2008) al de los compuestos 1 y 2 (Tabla I). Además de mantenerse la actividad anti-T. cruzi en estos derivados, por ejemplo en la QDO 6, la presencia del grupo 3-trifluorometilo mejora la solubilidad en medios acuosos. Esto llevó a indagar alguna otra modificación estructural como la sustitución del grupo fenilo -voluminoso y lipófilo- por un sustituyente menos voluminoso y lipofílico como el grupo etilo, en el derivado 7, previamente preparado y evaluado como antimalárico (Zarranz y col., Braz. J. Pharm. Sci. 42, 357-361, 2006) (Figura 2). Así se pudo comprobar que la actividad anti-7. cruzi se mantiene con este cambio (Boiani y col., J. Chem. Inf. Model. 48, 213- 219, 2008) (Tabla I).
Sin embargo, ninguno de los derivados de QDO mostrados en la Figura 2 posee mejor perfil de actividad anti-Γ. cruzi y de propiedades fisicoquímicas que los productos de la presente invención. Los productos reivindicados en la presente memoria surgen a partir de un diseño racional utilizando las exigencias estructurales evidenciadas en la ecuación QSAR1 y en el mecanismo propuesto en la Figura 1. A continuación se presentan las etapas de ese diseño racional.
La hipótesis de trabajo fue buscar nuevos derivados de QDO que condujesen a mayores valores de PIC (porcentaje de inhibición del crecimiento de T. cruzi a 25 μΜ) según la ecuación QSAR1.
O sea, compuestos con ELUMO más negativas y CLogP más altos y positivos; y por otro lado, según la ecuación QSAR2, que tuviesen cargas adecuadas a nivel de la funcionalidad /V-óxido para, de esta forma, ser adecuadamente susceptibles de bio- reducción (Figura 1).
Para ello se llevó a cabo el procedimiento que se describe a continuación:
1 ) Comenzando con el derivado inactivo 8 (Boiani y col., J. Chem. Inf. Model. 48, 213-219, 2008) (Figura 3), se calcularon los parámetros teóricos relacionados con el comportamiento biológico (Figura 3). Estos parámetros se compararon con los del compuesto activo 9 (Boiani y col., J. Chem. Inf. Model. 48, 213-219,
2008) (Figura 3) y claramente se observó que el derivado 3-trifluorometil- sustituido presenta adecuados valores de los descriptores teóricos descritos en la ecuación QSAR1 (ELU O más negativa y alta CLogP) y, además, carga Mulliken sobre el átomo de oxígeno (qO) menos negativa lo que lo convierte en un sistema más susceptible de recibir electrones (ser bio-reducible) y por ende generar radicales libres en el parásito (Figura 1). Las actividades biológicas in vitro, de ambos derivados, están completamente de acuerdo con estos descriptores teóricos. Sin embargo, ambos derivados poseen lipofilias muy altas y, considerando las reglas Lipinski (Lipinski y col., Adv. Drug. Del. Rev. 23, 3-25, 1997), esto puede ser un contratiempo en el momento de pensar en estos agentes para su uso in vivo como fármacos de administración oral.
) Al observar los derivados 8 y 9 parece ser clara la relevancia del sustituyente en posición 3 del sistema quinoxalina, que promueve cambios en las propiedades biológicas resultado de los cambios en las propiedades definidas en QSAR1. Para confirmar esta relevancia, se diseña el derivado 10, un derivado 3-difluorometilo, y se analiza teóricamente los descriptores de actividad (Figura 3). Los valores de los tres descriptores son más favorables que en el caso del compuesto 8, sin embargo, de acuerdo a la actividad biológica obtenida experimentalmente, ELUMO parece ser más importante que CLogP y qO ya que la actividad anti-7. cruzi es intermedia entre 8 y 9 (como lo es su valor de ELU O). Por otro lado, el derivado 10 también posee una inadecuada lipofilia según las reglas de Lipinski.
) Confirmada la importancia del sustituyente en posición 3, como siguiente objetivo se plantea analizar la relevancia del sustituyente en posición 2 del anillo de QDO. Para ello, se diseña una QDO carente de grupo electrón- atrayente en 2, derivado 11. Según los cálculos teóricos, el derivado 11 , además de ser extremadamente lipófilo -una desventaja para su uso por vía oral-, posee valores de los otros descriptores (ELUMO y qO) muy desfavorables. Por lo que, según QSAR1 su actividad debería ser baja, hecho que se confirma experimentalmente (Boiani y col., J. Chem. Inf. Model. 48, 213-219, 2008) (IC50 T2 y PIC, Figura 3).
4) Con toda esta información se diseña una nueva serie de compuestos, donde surgen las QDO anti-Γ. cruzi reivindicadas en la presente memoria. En la Figura 4 se muestran los diferentes derivados diseñados según los siguientes criterios:
4.1) Agrupamientos electrón-atrayentes en posiciones 2, 3, y 5-8 del anillo de quinoxalina. Por ejemplo: un grupo trifluorometilo en posición 3, un grupo electrón-atrayente en posición 2, sustituyentes halógenos en las posiciones 6 y
7 de la QDO.
4.2) Agrupamientos que contribuyan a una adecuada lipofilia. Un alto valor para cumplir adecuadamente la ecuación QSAR1 pero menor a 5 para cumplir Lipinski.
Según los descriptores electrónicos, calculados para los compuestos diseñados (Figura 4), los sustituyentes en posición 2 que mejor cumplen con QSAR1 son (en orden decreciente):
1. éster,
2. metilcetona,
3. carboxamida.
Claramente, dentro del grupo de las cetonas cualquier modificación que involucre un cambio de volumen respecto a un metilo (se diseñaron f-butil- y 2-naftil- cetonas, siendo el compuesto referencia, 9, una fenilcetona) conduce a peores descriptores electrónicos (en algunos casos peores que la carboxamida 17).
En referencia al término de lipofilia, dentro de los tres sustituyentes preferidos indicados anteriormente (éster, metilcetona y carboxamida), la amida posee el valor más próximo al compuesto de referencia 9 y cumple con las reglas de Lipinski. Los derivados 15 y 16, í-butil, previamente preparados y evaluados como antimaláricos (Zarranz y col., Braz. J. Pharm. Sci. 42, 357-361 , 2006) y 2-naftil-cetonas, poseen un valor que será prohibitivo para la regla de Lipinski, mientras que el éster 12 posee un valor un poco bajo para una adecuada actividad anti-T. cruzi por vía oral.
En referencia al grupo éster, el alargamiento de la cadena del grupo éster (transformación de 12 a 13) conduce a una adecuada mejoría en la lipofilicidad (de 3.66 a 4.06, sin incumplirse las reglas de Lipinski).
A partir de aquellos tres derivados que mejor se ajustan a los requerimientos estudiados, 12, 14 (previamente preparados y evaluados como antimalárico (Zarranz y col., Braz. J. Pharm. Sci. 42, 357-361, 2006) y 17, se plantean dos nuevas modificaciones:
- una tendiente a mejorar los descriptores electrónicos, derivados fluoro- sustituidos en el anillo benzo (derivados diseñados 18 y 19),
- y otra tendiente a mejorar el descriptor de lipofilicidad (cloro-derivado diseñado 20).
Ambas modificaciones conducen a mejores descriptores electrónicos y de lipofilicidad (comparar compuestos 13 y 19, compuestos 14 y 18 y compuestos 17 y 20, donde todos los descriptores conducirían a un mejor resultado de actividad según QSAR1, Figura 4).
Se decide, entonces, sintetizar estos compuestos y evaluarlos biológicamente frente al parásito T. cruz/ (Tabla II).
De la evaluación biológica in vitro de los mismos, frente a T. cruzi, surgen los compuestos líderes de la presente invención, derivados de 1 ,4-dióxido de 3- trifluorometilquinoxalina con funcionalidad éster o amida en posición 2. Estos compuestos, además, no poseen toxicidad relevante sobre las líneas celulares mamíferas estudiadas, un mecanismo de acción novedoso, comparado con los fármacos utilizados en clínica (Nfx y Bnz) y ausencia de mutagenicidad.
Tabla II. Ensayos tripanosomicidas y actividad in vitro de los
e em los de derivados QDO
Figure imgf000012_0001
3 Numeración según Figura 4.
b IC5o T2: Concentración necesaria para inhibir en un 50% el crecimiento de epimastigotes de T. cruzi, in vitro, de la cepa Tulahuen 2.
0 La IC50 se determina según se indica más adelante en la sección de ejemplos.
De aquí surgen como derivados destacados el éster 19 y la amida 17 (Figura 4).
Resultados previos, con otras quinoxalinas no fluorometil derivadas (Benitez y col. XIII Jomadas de la Sociedad Uruguaya de Biociencias, 28-30 mayo, 2010), indican que éstas pueden actuar por un mecanismo de acción particular. Por lo tanto, para los derivados de la presente memoria, se estudió este mecanismo y fue posible confirmar que éstos son capaces de actuar por un mecanismo de acción diferente al de los fármacos utilizados en terapia (Nfx y Bnz).
El mecanismo de acción de estos compuestos está relacionado con la inhibición de la actividad de enzimas deshidrogenasas mitocondriales del parásito (Tabla III) y la excreción aumentada de ciertos metabolitos, especialmente ácido pirúvico (Tabla IV). Mientras que los fármacos usados en terapia, Nfx y Bnz, no inhiben la actividad de enzimas deshidrogenasas mitocondriales del parásito y las quinoxalinas previamente estudiadas lo hacen moderadamente (Benitez y col. XIII Jomadas de la Sociedad Uruguaya de Biociencias. 28-30 mayo, 2010), los 1 ,4-dióxido de quinoxalinas de la presente memoria son capaces de iniciar la muerte de los parásitos por cambio en la actividad de estas enzimas parasitarias claves, que conlleva a la acumulación de ácido pirúvico intraparasitariamente y su liberación al medio.
Por otro lado, los compuestos antecedentes (derivado 18 y 22) así como los compuestos revindicados en la presente memoria (por ejemplo los derivados 19, 21, etc) resultan no mutagénicos, mientras que Nfx y Bnz (fármacos de uso comercial) si lo son en idénticas condiciones (Tabla V).
Tabla III. Porcentaje de actividad de las enzimas deshidrogenasas mitocondriales al ser tratadas con los compuestos en estudio. El porcentaje de actividad deshidrogenasa se expresa respecto a parásitos sin tratamiento (100 % de actividad).
Figure imgf000013_0001
Tabla IV. Variación en la excreción de metabolitos.
Figure imgf000013_0002
Leyendas: Ac. = acetato, Lac. = lactato, Pir. = piruvato, Succ. = succinato, Ala = alanina, EtOH = etanol, Gly = glicina.
Los valores se expresan respecto a parásitos sin tratamiento, un signo (+) significa incremento de metabolito respecto al control, un signo (-) significa depleción respecto al control. Tabla V. Número de reyertantes sobre TA98 S. typhimurium.
Antecedentes Medicamentos de referencia
18 Nfx
Da NRbc d Da NRbc Md
0,0 11 ±4 0,0 21 ±4
0,05 4±0.5 0,5 29±6
0,15 7±0.5 1 ,0 43±17
0,44 8±1 (-)e 3,0 62±2
1 ,33 13±2 10,0 144±11 ' 4,0 20±2 30,0 117±17
Figure imgf000014_0001
4-NPD 9
D NR
20,0 1223±237 (+)
Figure imgf000014_0002
3 D: dosis, en μο/ρΐβϋθ.
b NR: número de reyertantes.
c Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes.
d M: mutagenicidad, de acuerdo a Chu, .C.; Patel, K.M.; Lin, A.H.; Tarone, R.E.; Linhart, M.S.; Dunkel, V.C. Mutat. Res. 1981, 85, 1 19.
e (+): Es mutagénico cuando la segunda dosis consecutiva genera el doble de revertantes que la frecuencia espontánea. En caso contrario se considera no-mutagénico (-).
f Ver estructura en la Figura 5.
9 4-NPD: 4-nitro-o-fenilendiamina. Control positivo de mutagenicidad.
En cuanto a las descripciones previas sobre la síntesis de este tipo de derivados se refieren a compuestos utilizados principalmente como agentes antitumorales o anti- Plasmodium falciparum (Zarranz y col., Bioorp. Med. Chem. 12, 37 1-3721 , 2004;
Marin y col., Exp. Parasitol. 1 18. 25-31 , 2008). BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1 , muestra una primera serie de derivados de 1 ,4-dióxido de quinoxalina (QDO)
FIGURA 2, muestra ejemplos de derivados de QDO
FIGURA 3, muestra ejemplos de los derivados de QDO y los parámetros teóricos relacionados con su comportamiento teórico.
FIGURA 4, muestra los diferentes derivados diseñados según los agrupamientos electrón-atrayentes que contribuyen a una adecuada lipofilia.
FIGURA 5, muestra las estructuras de los derivados QDO 21 y 22
FIGURA 6, muestra los compuestos reivindicados, la Fórmula I y II.
FIGURA 7, muestra los reactivos Fórmulas III y IV para obtener los QDO.
FIGURA 8, muestra efectividades de las composiciones de los ejemplos descritos con anterioridad y de los descritos en el presente documento. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a los compuestos derivados de 1 ,4-dióxido de 3- trifluorometil-2-alquil/ariloxicarbonilquinoxalina y 1 ,4-dióxido de 3-trifluorometil-2- carboxamidaquinoxalina. Estos compuestos han demostrado ser muy activos in vitro frente a Trypanosoma cruzi. Presentan adecuados índices de selectividad, parásito/células mamíferas, y ausencia de mutagenicidad. Por lo que, la presente invención se refiere a compuestos y a la utilización de los mismos como agentes tripanosomicidas.
Los compuestos desarrollados presentan las Fórmulas I y II mostradas en la figura 6, en donde R5 - R8 es: -H, -N02; -CN; -SOAr; -S02Ar; halógeno; -CF3; -COXR, donde -X-= -O-, -NH-, -NR'-, y -R y -R'= C(1-6) alquilo acíclico o cíclico, -Ar, bencilo. donde R9 es -C(1-6) alquilo acíclico o cíclico; bencilo; bencilo sustituido; arilo (-Ar); - Ar sustituido; donde -N(R1)R2 es un sustituyente amino cíclico alifático o aromático; un sustituyente amino cíclico alifático o aromático sustituido. Sin incluir los compuestos descritos en Zarranz y col., Braz. J. Pharm. Sci. 42, 357-361 , 2006.
En este documento el término arilo (-Ar) tal y como aquí se indica representa:
1) anillos aromáticos de 5 ó 6 miembros, con o sin heteroátomos como N, O y S, independientemente o combinados;
2) anillos bicíclicos aromáticos sin heteroátomos o con 1 ó más heteroátomos, seleccionados entre N, O y S, independientemente o combinados.
Que pueden tener o no 1 a 4 sustituyentes como N02; halógeno; CF3; CN; sulfonilo; alquilo (1-6 C); alcoxilo (1-6 C); alquiltio (1-6 C); carboxilo; alcoxicarbonilo; carbamoilo; formilo; alquilamino (1-6 C) mono y disustituidos; CH=NNHC(=Z)NHRi, donde Z= O, S, NH, y R^ C(1-6)alquilo, fenilo, bencilo.
En este documento el término bencilo tal y como aquí se indica corresponde al grupo CH2-Ar, donde Ar (arilo) corresponde a la definición anterior.
Algunos de 1 ,4-dióxido de 3-trifluorometil-2-alquil/ariloxicarbonilquinoxalina y 1 ,4- dióxido de 3-trifluorometil-2-carboxamidaquinoxalina preferidos de la invención, sin limitarla, son:
- 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dibromo-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dibromo-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-cloro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina; - 1 ,4-Dióxido de 7-cloro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dicloro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-cloro-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-cloro-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dicloro-2-etiloxicarbonil-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-fluoro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-fluoro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-difluoro-3-trifluorometil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-6-fluoro-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-7-fIuoro-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-6,7-difluoro-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 3-trifluorometil-6-met¡l-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-3-trifluorometil-6-metilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 3-trifluorometil-6,7-dimetil-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-3-trifluorometil-6,7-dimetilquinoxalina¡
- 1 ,4-Dióxido de 3,6-bis(trifluorometil)-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 3,7-bis(trifluorometil)-2-metiloxicarbonilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-3,6-bis(trifluorometil)quinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-3,7-bis(trifluorometil)quinoxalina¡
- 1 ,4-Dióxido de 2-[(4-fenilpiperazin-1 -il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina¡
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dibromo-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1 -il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina¡ - 1 ,4-Dióxido de 6,7-dicloro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-fluoro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-fluoro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina; - 1 ,4-Dióxido de 6,7-difluoro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3- trífluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-7-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-6-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-7-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-6-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1 -il)carbonil]-7-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-cloro-2-[(4-fenilpiperazin-1-il)carbonil]-7-fIuoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina; - 1 ,4-Dióxido de 6-bromo-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trífluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 6,7-dibromo-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina; - 1,4-Dióxido de 6-cloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 7-cloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6,7-dicloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6-fluoro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 7-fluoro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6,7-difluoro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6-bromo-7-cloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1 ,4-Dióxido de 7-bromo-6-cloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6-bromo-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-7-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 7-bromo-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-6-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 6-cloro-2-[(4-(4-clorofen¡l)piperazin-1-il)carbonil]-7-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina;
- 1,4-Dióxido de 7-cloro-2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-7-fluoro-3- trifluorometilquinoxalina
Los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados en su forma base o se pueden presentar en forma de alguna sal farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables los clorhidratos, bromhidratos, sulfatas, oxalatos, citratos y mesilatos. Otros ejemplos, pueden ser sales sódicas, potásicas, calcicas o sales de bases orgánicas como cafeína, etilamina y lisina.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados en animales de sangre caliente, incluido el hombre, en una variedad de formulaciones farmacéuticas comúnmente aceptables. Para la administración oral puede encontrarse en forma de comprimidos, cápsulas, suspensiones, jarabes, o elixires. La administración parenteral puede formularse en forma de disolución, suspensión o emulsión estéril, por mencionar algunas.
Las formas farmacéuticas preferidas de la invención son la suspensión para administración oral y la suspensión estéril para administración intraperitoneal.
Métodos para obtener los derivados de Quinoxalina (QDO)
Un procedimiento general para la obtención de derivados de trifluorometilquinoxalina se presenta a continuación.
Los compuestos se preparan a partir de los benzofuroxanos de Fórmula III, mostrado en la figura 7, donde R5 - R8 son como se ha definido para los compuestos de Fórmula I y Fórmula II (Figura 6)
Donde los compuestos de Fórmula III se hacen reaccionar con reactivos carbaniónicos generados a partir de derivados de trifluorometilo de Fórmula IV (Figura 7), donde "A" es, en general, un sustituyente atrayente de electrones.
El método general para preparar los compuestos, tiene las siguientes etapas:
a) disolución del benzofuroxano (Fórmula lll)en un disolvente orgánico, en frío; b) adición del derivado de trifluorometilo (Fórmula IV), gota a gota;
c) se adiciona un catalizador,
e) opcionalmente, el reactor se agita vigorosamente, e) opcionalmente, se realiza la reacción en un sistema de microondas, y se complementa en el seguimiento con un sistema de cromatografía de capa fina, f) se detiene la reacción y se elimina el disolvente, a presión reducida;
g) se monitorea la reacción mediante cromatografía en capa fina utilizando diclorometano como fase móvil,
h) se elimina el catalizador,
i) se purifica el compuesto mediante cromatografía líquida utilizando diclorometano como fase móvil,
j) concentración del compuesto, reuniendo las fracciones obtenidas por la cromatografía y que contienen el compuesto, las que se evaporan a presión reducida y el sólido obtenido se filtra con vacío y se lava con éter dietílico.
Los métodos para la producción de los derivados QDO, fueron preferentemente dos, los cuales se presentan a continuación
Método 1 de obtención de derivados QDO En un matraz de 250 mL se disuelve el benzofuroxano de Fórmula III (Figura 7) en 25 mL de acetona a una concentración 10 mM y se coloca sobre hielo para que la disolución se enfríe. Una vez fría se añaden gota a gota 15 mM del reactivo de Fórmula IV (Figura 7). Después se añade el catalizador, K2C03 (20 mM) sobre la mezcla de reacción. Se deja la mezcla bajo agitación magnética vigorosa y a temperatura ambiente durante 1-7 días. El seguimiento de la reacción se realiza mediante cromatografía en capa fina utilizando diclorometano como fase móvil. La reacción a medida que avanza va tomando una coloración naranja-rojiza. Transcurridos 1-7 días, dependiendo de los sustituyentes que presente el benzofuroxano de partida (R5-R8), se elimina el disolvente a presión reducida, en el rotavapor. El sólido obtenido se disuelve en diclorometano (150-200 ml_) y se lava con agua (150-200 mL) para eliminar el K2CO3. Se recoge la fase orgánica, se seca con Na2S04 y se elimina el disolvente a presión reducida. El aceite obtenido (color marrón) se purifica mediante cromatografía en columna, utilizando diclorometano como fase móvil. Las fracciones de interés recogidas de la columna se evaporan a presión reducida y el sólido obtenido se filtra a vacío y se lava con éter dietílico (5-15 mL).
Método 2 de obtención de derivados QDO. En un tubo especial de microondas de 35 mL se disuelve el benzofuroxano de Fórmula III (Figura 7) 10 mM en 15 mL de tolueno. Una vez disuelto, se coloca el tubo sobre hielo y se añaden gota a gota 15 mL del reactivo de Fórmula IV (Figura 7) opcionalmente disuelto en 8-10 mL de tolueno. Después se añaden 1.5 mL de trietilamina, también gota a gota, y se coloca el tapón al tubo. Se coloca el tubo en el microondas y es sometido al método optimizado que presenta las siguientes condiciones:
- Potencia: 50 a 70 W, preferentemente 60 W
- Temperatura: 60 a 80 °C, preferentemente 70°C
- Tiempo: 40 a 60 minutos
- Método: dynamic
La reacción se sigue por cromatografía en capa fina.
Una vez completado el tiempo (40 - 60 minutos) se extrae la reacción del microondas y se comprueba por TLC la formación de producto. Después se pasa la disolución a un matraz de 50 mL y se elimina el disolvente en el rotavapor. El sólido obtenido se purifica por cromatografía en columna utilizando opcionalmente diclorometano o tolueno/dioxano (9:1) como fase móvil.
Los compuestos derivados de los compuestos de fórmula I y II, pueden estar en forma de alguna sal farmacéuticamente aceptable, que es preparada por un método convencional, como es por reacción de la forma libre en un disolvente adecuado, por ejemplo dietil éter, acetona o metanol, con una disolución que contiene los equivalentes correspondientes del ácido o la base deseados en un disolvente adecuado, por ejemplo dietil éter, acetona o metanol. La sal precipita en la disolución o es recuperada por evaporación del disolvente. Sales farmacéuticamente aceptables son por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, acetato, oxalato, citrato, lactato, maleato, succinato, tartrato, cinamato, benzoato, tosilato, mesilato, ascorbato, gluconato. También sales sódicas, potásicas, cálcicas o sales de bases orgánicas tales como cafeína, etilamina, lisina.
Los compuestos de la presente invención pueden ser utilizados en una variedad de formulaciones farmacéuticas comunes. Las composiciones farmacéuticas se pueden producir con al menos uno de los compuestos de fórmula I y/o sus derivados y/o los compuestos de fórmula II y/o sus derivados; en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables, los que pueden administrarse a un mamífero con enfermedad parasitaria, por ejemplo con enfermedad de Chagas. Es decir, se usan dichos compuestos para preparar formulaciones farmacéuticas administradas a un mamífero con enfermedad parasitaria, específicamente con enfermedad de Chagas. La composición de estas formulaciones farmacéuticas puede estar en una forma adaptada para su administración oral, tal como comprimidos, cápsulas, suspensiones, jarabes y elixires, o para administración parenteral, como disolución, suspensión y emulsión estéril.
Así para los comprimidos y cápsulas se utilizarán excipientes adecuados para los procedimientos de producción farmacéutica y la conservación de la formulación, como por ejemplo lactosa, celulosa microcristalina, laurilsulfato de sodio, almidón, estereato de magnesio, talco, por mencionar algunos. Los que serán mezclados junto con los compuestos de la invención en las proporciones adecuadas, tamizados, granulados y según corresponda comprimidos o encapsulados en dos piezas de cápsulas de gelatina, o en cápsulas de gelatina blanda.
Las formas farmacéuticas líquidas se prepararán utilizando soluciones acuosas, hidroalcohólicas, o disolventes farmacéuticamente adecuados que contengan o no estabilizantes y conservantes. En el caso de formas farmacéuticas líquidas para administración parenteral se deberá garantizar la esterilidad de la misma, por preparación en forma aséptica o por un procedimiento de esterilización posterior a la preparación, pudiendo ser por filtración o por calor (autoclave).
La dosis a ser administrada, de los compuestos de la presente invención, es dependiente del peso, la edad y el estado sanitario del animal de sangre caliente que será tratado, así como de la vía de administración, el tipo y la severidad de la infección por el parásito. Típicamente la dosis a administrar puede estar en el rango de 1-500 mg/kg peso del paciente por unidad de dosis. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran los métodos para sintetizar los compuestos de la invención, los métodos para caracterizarlos y las formulaciones farmacéuticas en las que se probaron. Estos ejemplos no pretenden limitar la invención de manera alguna.
La síntesis de varios de los compuestos ha sido realizada en el aparato Discover SP System (CEM Corporation), con el software Synergy™. Las reacciones se llevaron a cabo en envases especiales de 35 mL (compañía CEM) con un sistema especial (IntelliVent Technology) para poder realizarlas a alta presión bajo radiación microondas.
Los espectros de RMN-1H han sido obtenidos en un aparato Brucker 400 UltrashieldTM (400MHz) utilizando como referencia interna tetrametilsilano (TMS). El disolvente empleado en la preparación de las muestras fue cloroformo deuterado (CDCl3-c6) a una concentración aproximada de 10mg/ml_. Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en partes por millón (ppm) y el valor de las constantes de acoplamiento se expresa en Herzios (Hz). La multiplicidad de las señales se representa mediante las siguientes abreviaturas: s (singlete), sa (singlete ancho), d (doblete), dd (doble doblete), ddd (doble doblete desdoblado), t (triplete), m (multiplete). Los espectros de infrarrojo han sido realizados en un aparato Nicolet Nexus FTIR (Thermo, Madison, EE.UU.), con el programa informático OMNIC 6.0, utilizando pastillas de bromuro potásico para las muestras sólidas. Los números de onda se expresan en cm"1 y la intensidad de las bandas se describe de la siguiente manera: mf (señal muy intensa), f (señal intensa), m (señal media) y d (señal débil). Los análisis elementales se han realizado en un microanalizador LECO CHN-900 a partir de muestras secadas con pentóxido de fósforo durante 72 horas y vacío (3-4 mmHg). Los puntos de fusión de los productos descritos han sido determinados en un equipo Mettler FP82 + FP80 y no han sido corregidos. La temperatura de fusión se muestra en grados centígrados (°C). Las Cromatografía en Capa Fina (CCF) se desarrollan sobre gel de sílice de 0,2 mm de espesor (ALLUGRAM SIL G/UV254, ref. 818133, Macherey-Nagel), usando como eluyente diclorometano. Las placas se revelaron con luz ultravioleta de 254 y 365 nm. Las cromatografías en columna se han desarrollado en columnas de vidrio empaquetadas con gel de sílice (Merck- 1.09385.2500; 0.040-0.063 mm de tamaño de partícula). La fase móvil empleada fue diclorometano. EJEMPLO 1
1 ,4-Dióxido de 2-[(4-fenilpiperazin-1 -il)carbonil]-3-trifluorometilquinoxalina (Compuesto 17 de la Figura 4)
Fórmula molecular: C2oH17F3N203
P. .: 418,1 g/mol
Aspecto: Sólido amarillo.
Método sintético: 2
Rendimiento: 7%
IR (KBr): 3453 (w, vC-H Ar), 1655 (s, vC=0), 1444 (m, vC-N amida), 1356 (s, v/V-óxido), 1284 s, vC-O), 1236 ( m, vC-N Ar-amina), 1153 (m, vC-F) cm"1.
.63 (dd, 1 H, Hz); 7.31 (d,
Figure imgf000026_0001
.
Análisis elemental:
Figure imgf000026_0003
EJEMPLO 2
1 ,4-Dióxido de 2-etiloxicarbonil-6,7-difluoro-3-trifluorometilquinoxalina (Compuesto 19 de la Figura 4)
Fórmula molecular: C12H7F5N204
P.M.: 338,1 g/mol
Punto de fusión: 162-163 °C
Aspecto: Sólido amarillo.
Método sintético: 1
Rendimiento: 10,2%
IR (KBrt: 3048 cm-1 (d, VC-ΗΛΓ), 1745 cm 1 (f, vc=o), 1354 cm 1 (f, vNV), 1253 cm"1 (m, vC-o), 1182 cm"1 (m, var^F3).
1H-RMN ÍCDC . 400 ΜΗζΐ: δ:
Figure imgf000026_0002
Hz); 8,43 (dd, 1 H, H5, 6.3 Hz).
Análisis elemental:
Figure imgf000027_0002
EJEMPLO 3
1,4-Dióxido de 2-[(4-(4-clorofenil)piperazin-1-il)carbonil]-3- trifluorometilquinoxalina (Compuesto 20 de la Figura 4)
Fórmula molecular: C2oH16CIF3N203
P.M.: 452,1 g/mol
Aspecto: Sólido amarillo.
Método sintético: 2
Rendimiento: 6%
IR (KBr): 3440 (w, vC-H Ar), 1654 (s, vC=0), 1498 (m, vC-N amida), 1357 (s, v/V-óxido), 1284 s, vC-O), 1236 ( m, vC-N Ar-amina), 1157(m, vC-F) cm"1.
Figure imgf000027_0001
Análisis elemental:
Figure imgf000027_0003
EJEMPLO DE FORMULACIÓN DE COMPRIMIDO PARA VÍA ORAL
El ingrediente activo, cualquiera de los mostrados en las páginas 12 a 14, se preparó según el método 1 ó 2, descritos en páginas previas. La composición farmacéutica con la que se realizaron los ejemplos, se muestra en la siguiente tabla (este ejemplo no pretende limitar la invención de manera alguna):
Figure imgf000028_0001
Se mezcla el ingrediente activo con lactosa, celulosa microcristalina, laurilsulfato de sodio y almidón. Se tamiza a través de tamiz No. 40. Se adiciona el estearato de magnesio, se mezcla y se comprime en la forma deseada en una máquina de preparación de comprimidos.
Los siguientes métodos desarrollados son utilizados en orden de describir la actividad biológica y la potencialidad terapéutica de los compuestos de la presente invención, no pretendiéndose limitar la invención de ninguna forma.
Ensayos de actividad tripanosomicida: actividad in vitro, forma epimastigota
Los compuestos fueron ensayados in vitro contra Trypanosoma cruzi, sobre la forma epimastigota de las cepas Tulahuen 2, Y y Colombiana y frente al clon CL Brener (de la colección de cepas del Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, del Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental del Uruguay, Uruguay), las que se cultivaron a 28°C en un medio axénico (BHI- triptosa), complementado con 5% de suero fetal bovino. Se parte de células de un cultivo de 5-7 días (fase exponencial) las que se inoculan con 50mL de medio de cultivo fresco dando una concentración inicial de 1x106 células/mL. El crecimiento del parásito es seguido durante 1 1 días por medidas de absorbancia del cultivo a 600 nm, proporcional al número de células presentes.
Previo a la inoculación, se incorpora al medio una cantidad preestablecida de cada derivado a ensayar, disuelto en DMSO. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo nunca excede el 0.4%, utilizando un blanco (ausencia de producto) con 0.4% de DMSO. Los compuestos se incorporaron al medio de cultivo a una concentración final de 25μΜ y para aquellos que resultan más activos se disminuye la dosis progresivamente hasta 1 nM. El porcentaje de inhibición (Pl) de crecimiento del parásito se evalúa en comparación con el blanco, utilizando Nfx como fármaco de referencia tripanosomicida. El Pl de crecimiento se calcula de la siguiente manera:
Pl= {1- [( Ap-Aop )/ ( Ac-Aoc )]}x100
donde: 5.
después de la adición al
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
del blanco al día 0.
La Aeoonm tomada al día 5 corresponde a la fase exponencial tardía en la curva de crecimiento del cultivo.
La determinación de la IC50 (concentración inhibitoria del 50%) se realiza siguiendo el crecimiento del parásito en ausencia (control) y presencia de concentraciones crecientes de los correspondientes productos. Se mide la absorbancia al día 5 y se relaciona con el control. La IC50 se define como la concentración de producto requerida para dar un Pl del 50%, cuanto más bajo es este valor, mayor es la potencia de los compuestos.
En la Tabla III se presentan, como ejemplos, los que no limitan la presente invención, los datos de IC50 de algunos de las trifluorometilquinoxalinas de la presente invención, para la forma epimastigota de la cepa Tulahuen 2. Se incluye Nfx y los correspondientes derivados previamente descritos como forma de evidenciar la relevancia de los motivos estructurales reivindicados en la presente memoria.
Los compuestos presentan una excelente actividad tripanosomicida in vitro. Siendo la potencia, en todos los casos, superior a la del fármaco de referencia y a derivados previos.
Estudio de citotoxicidad en células mamíferas: citotoxicidad en macrofagos La toxicidad de los productos fue evaluada in vitro sobre macrofagos murinos J774. Se utilizan microplacas de 24 pocilios a las cuales se le colocan laminillas de forma circular previamente sumergidas en ácido nítrico al 3%. Se colocan 100 μί del medio RPMI conteniendo los macrofagos (105 macrófagos/mL) en cada pocilio y se incuba a 37°C, 5% C02, durante 3 horas.
Se pesan los productos a ensayar y se suspenden en DMSO, se agrega RPMI hasta una concentración de 400 μΜ. Se preparan diluciones para llegar a las concentraciones a estudiar. Se colocan en la placa con los macrofagos y se incuban a 37°C, 5% C02, durante 48 horas.
Para la evaluación de la toxicidad se utiliza el método del MTT-formazan.
Los compuestos presentan una baja toxicidad sobre el sistema mamífero estudiado y un excelente índice de selectividad (IC5o,macrófago/IC5o,T. cwz , superior al de los derivados previamente estudiados.
En la Figura 8 se muestran ejemplos de los datos sobre macrofagos murinos, los cuales no pretenden limitar la presente invención. Estudio de mutagenicidad: Test de Ames
Se utiliza el método de pre-incubación en placa (Marón, Mutat. Res. 113, 173- 215, 1983) usando cultivos de Salmonella typhimuríum cepa TA98. Como control positivo se utiliza 4-nitro-o-fenilendiamina. El número de colonias revertantes fue contado manualmente y comparado con los revertantes espontáneos. El compuesto se considera mutagénico cuando el número de colonias revertantes es al menos 2 veces la frecuencia espontánea en al menos dos dosis consecutivas (Chu, Mutat. Res. 85, 119-132, 1981).
Se utilizaron cultivos de S. typhimuríum, cepa TA98, mantenidos en medio líquido agar mínimo- glucosa, Vogel Bonner E(VB) 50x, y solución al 40% glucosa. Primero, se determina la toxicidad directa de los compuestos estudiados contra la bacteria. Así soluciones en DMSO, de los compuestos estudiados, a diferentes dosis (empezando por la mayor dosis sin efectos tóxicos) fueron estudiadas por la mutagenicidad por triplicado. El control positivo, 4-nitro-o-fenilendiamina a 20.0 μg/placa, y el control negativo (sólo DMSO) fueron incluidos en cada experimento. Ejemplos de los resultados obtenidos se muestran en la Tabla V. Donde se pueden observar que los fármacos de referencia, Nfx y Bnz, son mutagénicos, mientras que los productos reivindicados en la presente memoria no lo son. Estudios del mecanismo de acción: Actividad de deshidrogenasas mitocondríales.
El ensayo se realizó en placas de 24-pocillos. Un millón de epimastigotes de T. cruzi (cepa Y), en 500 μΙ_ del medio de cultivo previamente descrito, se siembran en cada pocilio y 20 μΜ de los compuestos estudiados se adicionan. Dos pocilios con parásitos no-tratados se mantienen como controles de 100% de actividad. Los cultivos se incuban a 28°C. A diferentes tiempos de incubación, los epimastigotes se cuentan y el ensayo colorimétrico de la reducción del colorante MTT fue realizado, donde la sal de tetrazolio se convierte a formazan púrpura en mitocondrias de T. cruzi vivas. Cincuenta μΙ_ de la solución conteniendo 5 mg/mL de MTT en PBS se adiciona a cada pocilio y se incuban durante 4 h. La reacción se detiene por adición de 500 μί de isopropanol-acídico (0.4 mL HCI 10 N en 100 mL de isopropanol). La absorbancia fue medida a 570 nm. Los compuestos no interfieren con la mezcla de reacción. El porcentaje de actividad de deshidrogenasas mitocondriales se determina usando como actividad 100% la de los parásitos no-tratados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuestos de Fórmula I
Figure imgf000033_0001
en donde R5 - R8 es: -H -N02; -CN; -SOAr; -S02Ar; halógeno; -CF3; -COXR, donde - X-= -O-, -NH-, -NR'-, y -R y -R'= C(1-6) alquilo acíclico o cíclico, -Ar, bencilo;
en donde R9 es: -C(1-6) alquilo acíclico o cíclico; bencilo; bencilo sustituido; arilo (- Ar); -Ar sustituido, y las sales derivadas del compuesto que incluye a las sales farmacéuticamente aceptables derivadas de él.
2.- Compuestos de Fórmula II
Figure imgf000033_0002
en donde R5 - R8 es: -H -N02; -CN; -SOAr; -S02Ar; halógeno; -CF3; -COXR, donde - X-= -O-, -NH-, -NR'-, y -R y -R'= C(1-6)alquilo acíclico o cíclico, -Ar, bencilo;
en donde -N(R1)R2 es un sustituyente amino cíclico alifático o aromático; un sustituyente amino cíclico alifático o aromático sustituido.
3.- Compuestos derivados de los reivindicados en la cláusula 1 , que sean sales farmacéuticamente aceptables.
4.- Compuestos derivados de los reivindicados en la cláusula 2, que sean sales farmacéuticamente aceptables.
5. Método para preparar los compuestos como se reclaman de 1 a 4 que comprende la reacción de un compuesto benzofuroxano de Fórmula III y de un compuesto trifluorometilo de Fórmula IV, con las siguientes etapas:
a) disolución del benzofuroxano en un solvente orgánico, en frío;
b) adición del derivado de trifluorometilo, gota a gota;
c) se adiciona un catalizador,
d) opcionalmente, el reactor se agita vigorosamente,
e) opcionalmente, se realiza la reacción en un sistema de microondas, y se complementa en el seguimiento con un sistema de cromatografía de capa fina, f) se detiene la reacción y se elimina el disolvente, a presión reducida;
g) se monitorea la reacción mediante cromatografía en capa fina utilizando diclorometano como fase móvil,
h) se elimina el catalizador,
i) se purifica el compuesto mediante cromatografía líquida utilizando diclorometano como fase móvil,
j) concentración del compuesto, reuniendo las fracciones obtenidas por la cromatografía y que contienen el compuesto, las que se evaporan a presión reducida y el sólido obtenido se filtra con vacío y se lava con éter dietílico.
6.- Método para preparar los compuestos según la cláusula 5, que utiliza como catalizador el K2C03, cuya mezcla de reacción es agitada magnética y vigorosamente a temperatura ambiente, se detiene la reacción a presión reducida, se elimina el catalizador lavando con diclorometano y con agua; la fase orgánica, se seca con Na2S04 y se elimina el disolvente a presión reducida; el compuesto se purifica y se concentra.
7. - Método para preparar los compuestos según la cláusula 5, que utiliza como catalizador trietilamina, y la reacción se lleva a cabo en un sistema de microondas con las condiciones de potencia de 50 a 70 W, temperatura de 60 a 80°C, tiempo de 40 a 60 minutos, por el método dynamic; la reacción se continúa en la cromatografía en capa fina y se detiene; el compuesto obtenido se purifica y se concentra.
8. - Composición farmacéutica para producir un medicamento que comprende al menos un compuesto reivindicado en las cláusulas 1 a 4 y vehículos farmacéuticamente aceptables, para ser administrada a un mamífero con enfermedad parasitaria.
9. - Composición farmacéutica para producir un medicamento como se reivindica en 8, administrada a pacientes con enfermedad de Chagas.
10.- El uso de un compuesto como el reclamado en las cláusulas 1 a 4, para preparar formulaciones farmacéuticas administradas a un mamífero con enfermedad parasitaria.
11.- El uso de un compuesto reivindicado en la cláusula 10, administrado a pacientes con enfermedad de Chagas.
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CN105601575A (zh) * 2016-01-29 2016-05-25 华中农业大学 具有抗菌活性的喹噁啉-n1,n4-二氧化物衍生物
CN110551072A (zh) * 2019-10-18 2019-12-10 华中农业大学 具有抑制dna拓扑异构酶活性的喹噁啉-n1,n4-二氧化物衍生物、制备方法及应用

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