CN110546258A - 人体组织干细胞及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将靶基因导入到干细胞标记物基因的基因座而得的人体组织干细胞。

Description

人体组织干细胞及其使用
技术领域
本发明涉及人体组织干细胞及其使用。更具体而言，涉及人体组织干细胞、将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法、试验人体组织干细胞是否为干细胞的方法、对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法、以及试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法。本申请基于2017年3月28日在日本申请的特愿2017-063171号要求优先权，并将其内容援引到本文中。
背景技术
癌干细胞理论是关注于支持肿瘤生长且自我复制的癌细胞亚群的理论(例如参照非专利文献1)。根据癌干细胞理论，认为从癌发生的早期在肿瘤组织中存在少量的癌干细胞，且通过癌干细胞重复自我复制和分化而形成肿瘤组织。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kreso A.and Dick J.E.,Evolution of the cancer stem cellmodel.Cell Stem Cell,4(14),275-291,2014。
发明内容
发明所要解决的课题
然而，尚未建立对癌干细胞等干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。因此，特别是通过细胞谱系性地分析人体的组织干细胞，难以确认单个细胞具有自我复制能力和分化能力。因此，本发明的目的在于，提供对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。
用于解决课题的手段
本发明包含以下的方案。
[1]人体组织干细胞，其是将靶基因导入到干细胞标记物基因的基因座而得的人体组织干细胞。
[2][1]所述的人体组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Leucine Rich Repeat Containing GProtein-Coupled Receptor5,LGR5)基因。
[3][2]所述的人体组织干细胞，其中，将靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。
[4][1]或[2]所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。
[5][1]～[4]中任一项所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。
[6][1]～[5]中任一项所述的人体组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。
[7]将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法，所述方法具备：通过基因组编辑将上述靶基因导入至包含人体组织干细胞的培养类器官的上述干细胞标记物基因的基因座的步骤。
[8][7]所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。
[9][7]或[8]所述的方法，其中，上述干细胞标记物基因的基因座为Lgr5基因座。
[10][9]所述的方法，其中，将上述靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。
[11][7]～[10]中任一项所述的方法，其中，上述靶基因为编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。
[12]试验通过[11]所述的方法制作的人体组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述人体组织干细胞的细胞谱系分析检测上述人体组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述人体组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述人体组织干细胞为干细胞。
[13][7]～[12]中任一项所述的方法，其中，上述人体组织干细胞为来自癌组织的干细胞。
[14]对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。
[15]试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。
本发明也可以包含以下的方案。
[P1]组织干细胞，其是将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。
[P2][P1]所述的组织干细胞，其中，上述靶基因座为干细胞标记物基因的基因座。
[P3][P2]所述的组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(LGR5)基因。
[P4][P3]所述的组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。
[P5][P1]～[P4]中任一项所述的组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。
[P6][P1]～[P5]中任一项所述的组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。
[P7]将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法，所述方法具备：将上述靶基因导入至包含组织干细胞的培养类器官的上述靶基因座的步骤。
[P8][P7]所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。
[P9][7]或[8]所述的方法，其中，上述靶基因座为干细胞标记物的基因座。
[P10][P9]所述的方法，其中，上述靶基因为编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。
[P11]试验通过[P10]所述的方法制作的组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述组织干细胞的细胞谱系分析检测上述组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明组织干细胞为干细胞。
[P12][P7]～[P11]中任一项所述的方法，其中，上述组织干细胞为来自癌组织的干细胞。
[P13]对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。
[P14]试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。
发明效果
根据本发明，可以提供对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。
附图说明
[图1](a)是人LGR5基因座的示意图。(b)是显示实验例1中制作的靶向构建体的结构的示意图。(c)是显示实验例1中制作的类器官的LGR5基因座的结构的示意图。
[图2](a)～(c)是实验例2中来自移植到小鼠的类器官的肿瘤组织的组织切片的荧光显微镜照片。(d)～(f)是观察实验例2中来自建立类器官克隆的原患者的大肠癌组织切片的荧光显微镜照片。
[图3](a)～(c)是说明通过细胞谱系标记物的标记的图。
[图4]是说明实验例4中制作的类器官的LGR5基因座的结构和药物诱导型自杀基因的行为的图。
[图5](a)是显示观察实验例4中对照小鼠的肿瘤组织切片的结果的荧光显微镜照片。(b)是显示观察实验例4中给予AP20187的小鼠的肿瘤组织切片的结果的荧光显微镜照片。
[图6]是显示经时性地测定实验例4中给予AP20187的小鼠(Dimerizer，二聚体)和对照小鼠(Vehicle，媒介物)的肿瘤尺寸(大小)的结果的图表。
[图7](a)和(b)是显示经时性地测定实验例5中来自类器官的肿瘤组织的尺寸的结果的图表。
[图8]是显示实验例6的代表性结果的类器官的显微镜照片。
具体实施方式
[组织干细胞]
一个实施方案中，本发明提供将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。
本实施方案中，组织干细胞可为人体细胞，也可为非人动物细胞。干细胞是具有自我复制能力和分化能力的细胞。组织干细胞也称为成体干细胞，是存在于组织中的干细胞，与胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)不同。本说明书中，组织干细胞包含癌干细胞。另外，本实施方案的组织干细胞包含由于细胞的可塑性而可以去分化成干细胞的细胞。
以往，难以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。相对于此，如后面实施例中所述，发明人明确了：通过对包含组织干细胞的培养类器官进行基因座特异性的基因操作，可以制作将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。
本实施方案的组织干细胞中，靶基因座可为待关注的任意的基因座，例如可为干细胞标记物基因的基因座。更详细而言，本实施方案的组织干细胞为癌干细胞，靶基因座可为癌干细胞标记物基因的基因座。作为癌干细胞标记物基因，例如可举出：LGR5、SPARC相关模块化钙结合蛋白2(SPARC Related Modular Calcium Binding 2,SMOC2)、排斥性导向分子家族成员B(Repulsive Guidance Molecule Family Member B,RGMB)、AXIN2、嗅介蛋白4(Olfactomedin 4,OLFM4)、细胞分裂周期相关蛋白7(Cell Division Cycle Associated7,CDCA7)、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1(Leucine Rich Repeats AndImmunoglobulin Like Domains 1,LRIG1)、环指蛋白43(Ring Finger Protein 43,RNF43)、Achaete-Scute家族BHLH转录因子2(Achaete-ScuteFamily BHLH TranscriptionFactor 2,ASCL2)等，但不限于这些。
另外，对癌干细胞来源的癌没有特别限定，例如可为大肠癌、胃癌、胰腺癌的癌干细胞。发明人确认：这些癌干细胞中，LGR5基因可以用作癌干细胞标记物。
发明人还明确：通过对来自正常细胞的培养类器官进行基因座特异性的基因操作，可以将靶基因导入至正常细胞的组织干细胞的靶基因座。
在此，无论是来自正常细胞的培养类器官还是来自癌细胞的培养类器官，均可以通过类器官培养所需的增殖因子的需求性、通过测序确认基因突变、确认染色体异常等来判断。
另外，本实施方案的干细胞中，靶基因可为任意的基因。例如靶基因可为报道基因。另外，报道基因可导入至位于靶基因座的基因的第1外显子以外的区域。例如，报道基因可导入至LGR5基因的第18外显子。在此，作为报道基因，没有特别限定，例如可举出：各种的荧光蛋白、酶等。
在通过基因组编辑等的基因座特异性的基因操作中，往往将靶基因导入至对象基因的第1外显子。首先，发明人尝试了将报道基因导入至大肠癌干细胞的LGR5基因的第1外显子。然而，该基因导入并没有成功。相对于此，如后面实施例中所述，在将报道基因导入到LG5基因的第18外显子时，可以有效地进行所期望的基因导入。
导入靶基因座的靶基因可不具有启动子序列。即，靶基因可构成为通过靶基因座的启动子表达。
例如，通过将内部核糖体进入位点(Internal Rebosomal Entry Site，IRES)、T2A或P2A等的核糖体跳跃位点(ribosomal skip site)等连接至靶基因的5’侧，靶基因可以由靶基因座的启动子表达。
本实施方案的组织干细胞可以是：将由该标记物基因的启动子驱动的第1报道基因导入到癌干细胞标记物基因的基因座、除此之外还导入有由强制表达用启动子驱动的第2报道基因的癌干细胞。在此，第2报道基因也可以不进行基因座特异性地导入。另外，作为强制表达用启动子，可以使用通常用于在动物细胞中强制表达基因的启动子，例如可举出：CMV启动子、EF1α启动子等，但不限于这些。
在此，优选第1报道基因和第2报道基应为彼此可识别的基因。例如，第1报道基因和第2报道基因可为编码发出彼此波长不同的荧光的荧光蛋白的基因。
在此，第1报道基因在癌干细胞标记物基因表达时、即细胞维持癌干细胞性时表达。另一方面，无论癌干细胞标记物基因的表达如何、即无论是在癌干细胞维持癌干细胞性的情况下还是在丧失癌干细胞性的情况下均表达第2报道基因。因此，第1报道基因的表达则表明存在癌干细胞，第2报道基因的表达则表明存在癌干细胞或存在癌细胞的两者。在此，癌细胞是指不表达癌干细胞标记物基因的癌细胞。
如后面实施例中所述，将这样的癌干细胞在受试物质的存在下培养，分别测定第1报道和第2报道基因的表达量，由此可以区分并评价对癌干细胞和癌细胞的影响。因此，这样的癌干细胞可以用于筛选对癌干细胞有效的抗癌剂等。
[将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法]
一个实施方案中，本发明提供将靶基因导入至组织干细胞的靶基因座的方法，所述方法具备：将上述靶基因导入至包含组织干细胞的培养类器官的上述靶基因座的步骤。本实施方案的方法可以称为是具备将靶基因导入至构成培养类器官的细胞的靶基因座的步骤的方法。
本实施方案的方法中，作为干细胞，与上述的干细胞同样，可举出：癌干细胞、成体干细胞等。
以往，难以对癌干细胞或组织干细胞等的干细胞进行基因操作。特别是，难以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。相对于此，如后面实施例中所述，发明人明确了：通过修饰包含组织干细胞的培养类器官的基因，可以制作导入有靶基因的培养类器官。
另外，如后面实施例中所述，根据本实施方案的方法，也可以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。由此，可以制作将靶基因导入到靶基因座而得的组织干细胞。
本说明书中，类器官是指通过对细胞进行三维培养而得的器官样组织。另外，本说明书中，细胞团也包含在类器官中。作为三维培养的方法，没有特别限定，例如可举出：使用基质胶的方法、使用胶原蛋白的方法、使用层粘连蛋白的方法等。
本实施方案的方法中，作为培养类器官，如果是包含组织干细胞的类器官则没有特别限定，例如可举出：上皮细胞的类器官、上皮肿瘤细胞的类器官等。另外，作为上皮细胞，可举出：胃、小肠、大肠、胆管、胰管上皮等的消化道上皮细胞，乳腺、前列腺等的消化道以外的组织的上皮细胞等。
作为类器官的培养方法，可以使用公知的培养方法。特别是，在来自癌组织的干细胞的培养方法中，可以选择由癌组织单独优化的培养方法(例如参照Fujii M.,等人,Nature Protocols,10卷,1474-1485,2015；Mihara E.,等人,eLIFE,5卷,E11621,2016；Fujii M.,等人,Cell Stem Cell,18卷,827-838,2016等)。
本实施方案的方法中，将靶基因导入至培养类器官的步骤可以使用公知的基因导入方法。特别是，如实施例中所示，优选通过电穿孔来进行。而且，优选具备在电穿孔后将培养类器官在30℃下培养2天的步骤。发明人明确了：通过具备上述的步骤，可以显著提高向类器官的基因导入效率。
[试验组织干细胞是否为干细胞的方法]
一个实施方案中，本发明提供试验用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记的组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述组织干细胞的细胞谱系分析检测上述组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明组织干细胞为干细胞。关于细胞谱系标记物如后所述。
本实施方案的方法也可以称为是证明被认为是组织干细胞的细胞为干细胞的方法。另外，本实施方案的方法也可以称为是试验对象基因是否为干细胞标记物的方法。即，本实施方案的方法也可以称为是试验对象基因是否为干细胞标记物的方法，所述方法具备：培养上述用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记的细胞的步骤；和通过上述细胞的细胞谱系分析检测上述细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述对象基因为干细胞标记物。
干细胞为具有自我复制能力和分化能力的细胞。因此，为了证明对象细胞为干细胞，有必要显示单个对象细胞进行自我复制和分化的两者。或者，为了证明对象基因为干细胞标记物，有必要显示表达对象基因的单个细胞进行自我复制和分化的两者。
为了显示单个细胞进行自我复制和分化的两者，有必要通过追踪并观察来自单个细胞的细胞的细胞谱系分析，显示来自单个细胞的细胞进行自我复制和分化的两者。细胞谱系分析是指，无论对象的单个细胞是否重复细胞分裂、或分化而改变性质，均可鉴定并追踪作为对象的单个细胞的后代的细胞的分析方法。
本说明书中，细胞谱系标记物是指，无论对象的单个细胞是否重复细胞分裂、或分化而改变性质，均可鉴定作为对象的单个细胞的后代的细胞的标记。
本实施方案的方法中，用由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记物标记表达有对象基因的细胞。其结果，可以鉴定并观察表达有对象基因的细胞及其后代。其结果，在确认到所标记的细胞进行自我复制和分化的两者的情况下，可以证明对象基因为干细胞标记物。细胞谱系标记物优选由对象基因座中的对象基因的启动子驱动。
对细胞谱系标记物没有特别限定，只要可追踪地标记细胞及其后代即可，例如，可以使用将由对象基因的启动子表达的细胞谱系标记诱导蛋白与另外导入到细胞的细胞谱系标记构建体组合而得者。在此，细胞谱系标记诱导蛋白作用于细胞谱系标记构建体，而细胞谱系性地标记细胞。
作为更具体的细胞谱系标记物，例如可举出：利用Cre-LoxP体系、和VCre-VLoxP体系、SCre-SloxP体系等Cre-loxP体系的变体而得者；使用来自芽殖酵母的重组酶的利用Flp-Frt体系而得者；将这些组合而得者等。
作为细胞谱系标记诱导蛋白，例如可举出：Cre重组酶、VCre重组酶、SCre重组酶、Flp重组酶等。
作为细胞谱系标记构建体，例如可以使用：可以通过所使用的细胞谱系标记诱导蛋白进行细胞谱系标记而得者。例如，在细胞谱系标记诱导蛋白为Cre重组酶的情况下，可举出在具有loxP序列且发生基因重组的情况下可检测的构建体。细胞谱系标记构建体可构成为例如在发生基因重组的情况下表达荧光蛋白。
根据这样的体系，在对象基因表达的情况下产生基因重组，使细胞表达例如荧光蛋白。由于该细胞即使分裂也表达荧光蛋白，因此可以进行细胞谱系分析。
本实施方案的方法中，导入有由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记诱导蛋白的组织干细胞，可以通过上述的方法制作。另一方面，细胞谱系标记构建体也可以不进行基因座特异性地导入。
以往，难以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。因此，难以将由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记诱导蛋白导入至组织干细胞。然而，如上所述、发明人明确了：通过基因导入至培养类器官的方法，可以对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作。
其结果，将由对象基因的启动子驱动的细胞谱系标记诱导蛋白导入到组织干细胞，除此之外导入细胞谱系标记构建体，用细胞谱系标记物来标记组织干细胞，可试验对象基因是否为干细胞标记物。
[对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法]
一个实施方案中，本发明提供对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。
本实施方案的筛选方法中，癌干细胞可以以包含癌干细胞的类器官的形态进行培养。另外，癌干细胞优选通过上述的方法证明是癌干细胞的细胞。即，癌干细胞标记物基因优选通过上述的方法证明是癌干细胞标记物的基因。
另外，作为报道基因，没有特别限定，例如可举出：各种的荧光蛋白、酶等。报道基因优选由癌干细胞标记物基因的基因座中的启动子驱动。
如后面实施例中所述，通过本实施方案的筛选方法，可以测定受试物质对癌干细胞的影响。其结果，可以筛选对癌干细胞有效的抗癌剂。作为受试物质，没有特别限定，例如可为化合物库，也可为包含抗体药物的现有药的库等。
另外的实施方案中，本发明提供试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。
本实施方案的方法也可以称为是抗癌剂的筛选方法。作为强制表达用启动子，可以使用通常用于在动物细胞中强制表达基因的启动子，例如可举出：CMV启动子、EF1α启动子等，但不限于这些。
本实施方案的方法中，第1报道基因优选由癌干细胞标记物基因的基因座中的启动子驱动。另外，优选第1报道基因和第2报道基因为彼此可识别的基因。例如，第1报道基因和第2报道基因可为编码发出彼此波长不同的荧光的荧光蛋白的基因。
如后面实施例中所述，通过本实施方案的方法，可以分别评价对象的抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的影响。因此，可以将本实施方案的方法用于对癌干细胞有效的抗癌剂等的筛选等。
实施例
接下来，显示实验例进一步详细地说明本发明，但本发明不限于以下的实验例。
[实验例1]
(向大肠癌干细胞的LGR5基因座导入报道基因)
《构建体的制作》
通过常规方法制作了以LGR5基因的第18外显子为靶向的CRISPR-Cas9质粒。图1(a)是人LGR5基因座的示意图。另外，制作了将报道基因导入至LGR5基因的第18外显子的靶向构建体。作为报道基因，使用了编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。图1(b)是显示所制作的靶向构建体的结构的示意图。
靶向构建体是将分别具有1kbp长度的5’臂和3’臂与IRES-GFP-loxP-EF1-RFP-T2A-Puro-loxP质粒(型号“HR180PA-1”、SystemBioscience公司)连接而制作。
《类器官培养》
实验是在得到庆应义塾大学医学部的伦理委员会的批准下进行的。将从患者摘出的大肠癌组织切成小片段，用冰冷的磷酸缓冲液(PBS)至少洗涤了10次。接着，添加释放酶(Liberase)(型号“TH”、Roche Life Sciences公司)，一边每15分钟进行剧烈移液一边在37℃下消化了60分钟。接着，将残留的片段使用酶(型号“TrypLE Express”、Invitrogen公司)在37℃下进一步消化了20分钟。
接着，回收上清液，在4℃、200×g下离心了3分钟。接着，将沉淀悬浮在基质胶(BDBioscience公司)中，并以25μL/孔分注到24孔板中。接着，在使基质胶聚合之后添加了培养基。
作为培养基，将在Dulbecco改良Eagle/F12培养基中添加青霉素、链霉素、10mMHEPES、2mM GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、1×B27(Life Technologies公司)、10nM胃泌素I(Sigma公司)、1mM N-乙酰基半胱氨酸(和光纯药)而得的培养基用作基本培养基。另外，根据情况，在培养基中添加了50ng/mL小鼠重组EGF、100ng/mL小鼠重组Noggin、500nM A83-01(Tocris公司)。
发明人先前已经明确：通过上述的培养方法，可以长期培养大肠癌类器官，且大肠癌类器官包含大肠癌干细胞。
《基因导入》
通过电穿孔法，将基因导入到上述的培养类器官。基因导入之后，将培养类器官在30℃下培养了2天。接着，在自基因导入起3天后，在2μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)的存在下进行了3天的选择培养。
接着，选择抗药性类器官克隆，并单独地进行了增殖。从各类器官克隆提取基因组DNA，通过PCR和DNA印迹法确认到：导入了靶基因。
接着，通过瞬时感染表达Cre重组酶的腺病毒，去除了由loxP序列夹持的RFP-T2A-Puro选择盒。接着，选择并克隆了RFP阴性的类器官。接着，通过PCR确认到：去除了RFP-T2A-Puro选择盒。
通过以上的方法，得到了分别命名为CRC7、CRC12、CRC28的3个克隆的类器官。图1(c)是显示所得的类器官的LGR5基因座的结构的示意图。以下，有时将这些类器官称为“LGR5-GFP类器官”。
[实验例2]
(干细胞层次结构的确认)
《类器官的异种移植》
动物实验是在得到庆应义塾大学医学部的动物实验委员会的批准下进行的。将实验例1中制作的3个克隆的LGR5-GFP类器官分别异种移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下。作为免疫缺陷小鼠，使用了NOD/Shi-scid IL-2Rγnull(NOG)小鼠(7～12周龄、雄性)。
《癌干细胞和分化的癌细胞的检测》
从各小鼠摘出所形成的肿瘤，立即用4％多聚甲醛进行固定，制作了冷冻组织切片。接着，在所制作的组织切片中，检测了显示癌干细胞存在的GFP的荧光。另外，通过免疫染色检测了作为分化标记物的Keratin 20(KRT20)。
图2(a)～(c)是来自移植的类器官的肿瘤组织的组织切片的荧光显微镜照片。图2中，“异种移植物(Xenograft)”显示来自异种移植的类器官的肿瘤组织，“病人(Patient)”显示来自后述的患者的肿瘤组织。另外，比例尺表示100μm。图2(a)是来自LGR5-GFP类器官的克隆CRC7的肿瘤组织的结果，图2(b)是来自克隆CRC12的肿瘤组织的结果，图2(c)是来自克隆CRC28的肿瘤组织的结果。
其结果，明确了：GFP阳性细胞(癌干细胞)存在于肿瘤的最外侧的区域，KRT20(分化的细胞)存在于肿瘤的内部。
另外，图2(d)～(f)是显示：在来自建立各类器官克隆的患者的大肠癌组织切片中，通过原位杂交检测LGR5mRNA，且通过免疫染色检测KRT20的结果的荧光显微镜照片。
图2(d)是用于建立克隆CRC7的患者的肿瘤组织的结果，图2(e)是用于建立克隆CRC12的患者的肿瘤组织的结果，图2(f)是用于建立克隆CRC28的患者的肿瘤组织的结果。
其结果，明确了：即使在患者的肿瘤组织中，LGR5表达细胞(癌干细胞)也存在于肿瘤的最外侧的区域，KRT20(分化的细胞)存在于肿瘤的内部。
根据以上的结果确认到：患者的肿瘤组织中的干细胞层次结构在来自类器官的肿瘤组织中再现。
[实验例3]
(证明LGR5基因表达细胞为癌干细胞)
将癌干细胞用细胞谱系标记物标记，进行细胞谱系分析，由此研究了单个细胞是否进行自我复制和分化的两者。
《通过细胞谱系标记物的标记》
首先，将癌干细胞用由LGR5基因的启动子驱动的细胞谱系标记物进行了标记。图3(a)～(c)是说明通过细胞谱系标记物的标记的图。
首先，通过与实验例1同样的方法，将IRES-CreER构建体导入到来自大肠癌的培养类器官的LGR5基因座。需说明的是，CreER蛋白是重组酶，通常存在于细胞质中，但通过与他莫昔芬结合而移行至核内，并与loxP序列发生重组。图3(a)是显示完成的LGR5基因座的示意图的图。
另外，通过与实验例1同样的方法，将报道盒进一步导入到导入有IRES-CreER的类器官。作为报道盒，使用了从CMV-Brainbow-2.1R质粒(型号“#18723”、Adgene公司)切出的彩虹盒(Rainbow cassette)。图3(b)是显示彩虹盒的示意图的图。
在此，针对用图3(a)和(b)所示的细胞谱系标记物标记的类器官进行说明。存在于用上述的细胞谱系标记物标记的类器官中的癌干细胞表达LGR5基因，因此表达CreER蛋白。在不存在他莫昔芬的情况下，由于CreER存在于细胞质中，因此不发生彩虹盒的重组。因此，核GFP(nGFP)表达，并在核内观察到GFP荧光。
在此，若对细胞给予他莫昔芬，则CreER移行至核内，在存在于彩虹盒的多个loxP序列中，以随机组合的方式发生重组。其结果，例如，形成图3(c)所示的基因序列。其结果，根据情况，形成表达黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(mCFP)的任一种的细胞。
一旦发生表达任一种荧光蛋白的重组的细胞及其后代继续表达相同的荧光蛋白。因此，可以追踪并分析来自单个细胞的细胞。以下，有时将用上述的细胞谱系标记物标记的类器官称为“LGR5-CreER/彩虹类器官”。
《癌干细胞的细胞谱系分析》
癌干细胞表达LGR5基因。因此，LGR5-CreER/彩虹类器官所含的癌干细胞表达CreER，在存在他莫昔芬的情况下，从发出nGFP的荧光的细胞改变为发出YFP、RFP、mCFP的荧光的细胞。
使用该体系，进行了癌干细胞的细胞谱系分析。具体而言，首先，通过与实验例2同样的方法，将LGR5-CreER/彩虹类器官异种移植到NOG小鼠(7～12周龄、雄性)的肾包膜下。接着，在自移植起1个月后，对小鼠给予了他莫昔芬。接着，在自给予他莫昔芬起3天后和28天后，从小鼠摘出肿瘤，并立即用4％多聚甲醛进行固定，制作了冷冻组织切片。
接着，进行所制作的组织切片的荧光观察、LGR5mRNA的原位杂交、KRT20的免疫染色，观察了癌干细胞的行为。
其结果，确认到：在刚刚给予他莫昔芬之后，癌干细胞存在于肿瘤组织的最外侧的区域。然后，确认到：通过细胞谱系标记的细胞克隆，持续地形成肿瘤组织。
另外，明确了：最初表达LGR5基因的细胞，形成包含LGR5阳性细胞和LGR5阴性细胞的克隆结构。另外，确认到：虽然表达LGR5基因的细胞，最初不表达KRT20，但在给予他莫昔芬的1周后，分化成KRT20阳性细胞。
根据以上的结果证明了：在人体中，LGR5阳性细胞为癌干细胞，具备长期的自我复制能力和分化能力。即，证明了在人体中LGR5基因为癌干细胞标记物。
[实验例4]
(研究以癌干细胞为靶向的癌治疗的有效性)
将药物诱导型自杀基因掺入至癌干细胞，研究了以癌干细胞为靶向的癌治疗的有效性。
《导入有药物诱导型自杀基因的癌干细胞的制作》
首先，通过与实验例1同样的方法，将IRES-iCaspase9-T2A-tdTomato构建体导入到来自大肠癌的培养类器官的LGR5基因座。以下，有时将该类器官称为“LGR5-iCT类器官”。
需说明的是，iCaspase9为药物诱导型自杀基因。iCaspase9在单体情况下不具有活性，但在AP20187(dimerizer、APExBIO公司)的存在下形成二聚体而诱导细胞凋亡。另外，tdTomato是一种红色荧光蛋白(RFP)。
图4是说明完成的LGR5基因座的结构和药物诱导型自杀基因的行为的图。该体系中，通过LGR5基因的启动子表达iCaspase和tdTomato荧光蛋白。因此，通过观察tdTomato的荧光，可以确认LGR5阳性细胞的存在。而且，在AP20187的存在下，LGR5阳性细胞诱导细胞凋亡而死亡。其结果，观察不到tdTomato的荧光。
《确认LGR5-iCT类器官的行为》
通过与实验例2同样的方法，将LGR5-iCT类器官异种移植到NOG小鼠(7～12周龄、雄性)的肾包膜下。接着，在形成肿瘤之后，对小鼠每天给予AP20187，持续5天。另外，对照小鼠每天仅给予溶剂，持续5天。然后，经时性地测定各小鼠的肿瘤尺寸。
图5(a)和(b)是显示：在从开始给予AP20187起第5天，摘出各小鼠的肿瘤并制作组织切片，通过免疫染色检测tdTomato的荧光和作为分化标记物的KRT20的结果的荧光显微镜照片。
图5(a)中，“+Vehicle”显示仅给予溶剂的对照小鼠的结果。另外，图5(b)中，“+Dimerizer”显示给予了AP20187的小鼠的结果。图5(a)和(b)中，比例尺表示100μm。
其结果，如图5(b)所示，明确了：通过给予AP20187而诱导细胞凋亡，LGR5阳性的癌干细胞完全死亡。另一方面，LGR5阴性的细胞则完好无损。
另外，图6是显示经时性地测定给予了AP20187的小鼠(Dimerizer)和对照小鼠(Vehicle)的肿瘤尺寸的结果的图表。其结果，确认到通过给予AP20187而使肿瘤尺寸的减小。然而，明确了最终肿瘤尺寸再度增大。
另外，发明人研究了给予AP20187后的肿瘤组织中的LGR5基因的表达。其结果，明确了一度消失的LGR5基因的表达被再次识别。另外，明确了肿瘤尺寸的再次增大与LGR5基因的再表达相对应。
根据以上的结果明确了：LGR5阳性癌干细胞与肿瘤的增大相关，而LGR5阴性癌细胞具有去分化成LGR5阳性癌干细胞的能力。根据本实验例的、使用了AP20187的癌干细胞治疗模型明确了：在仅以癌干细胞为靶向的、使用单一药物的短期治疗中，引起肿瘤复发。而且，明确了通过持续性的癌干细胞治疗，虽然不能治愈肿瘤，但可抑制肿瘤增大。
[实验例5]
(研究癌干细胞特异性抗癌剂与抗癌剂的并用模型)
在通过实验例4中制作的LGR5-iCT类器官的异种移植而制作的肿瘤中，AP20187可称为是假想的癌干细胞特异性抗癌剂。然后，研究了AP20187与现有的抗癌剂的组合的癌治疗的效果。
具体而言，通过与实验例2同样的方法，将实验例4中制作的LGR5-iCT类器官异种移植到NOG小鼠(7～12周龄、雄性)的肾包膜下。作为LGR5-iCT类器官，使用了克隆CCO7和克隆CCO25这2个克隆。
接着，在形成肿瘤之后，对小鼠给予了现有的抗癌剂。作为现有的抗癌剂，使用了作为抗EGF受体抗体的西妥昔单抗(CTX)。西妥昔单抗的给予进行了给药开始时(第0天)和第7天的2次。另外，关于对照小鼠，代替西妥昔单抗仅给予了溶剂。
然后，对给予了西妥昔单抗的小鼠，在给药开始后第8～12天的5天，每天给予了AP20187。另外，为了比较，对给予了西妥昔单抗的小鼠，在给药开始后第8～12天的5天，使用了每天仅给予溶剂的小鼠。
接着，经时性地测定了各小鼠的肿瘤尺寸。图7(a)和(b)是显示经时性地测定肿瘤尺寸的结果的图表。图7(a)是来自LGR5-iCT类器官克隆CCO7的肿瘤的结果，图7(b)是来自LGR5-iCT类器官克隆CCO25的肿瘤的结果。
图7(a)和(b)中，“V”显示对照小鼠的结果，“CTX”显示给予了西妥昔单抗和溶剂的小鼠的结果，“CTX+D”显示给予了西妥昔单抗和AP20187的结果。
其结果，明确了：在使用任何类器官克隆的情况下，通过并用西妥昔单抗和AP20187进行给予，肿瘤尺寸均显著地缩小。另外，在并用西妥昔单抗和AP20187进行给予的、移植有CCO7克隆的小鼠的6只中，有5只中观察到95％以上的肿瘤缩小，在移植有CCO25克隆的小鼠的14只中，有5只中观察到癌组织的完全消失。
以上的结果显示：癌干细胞特异性抗癌剂与现有抗癌剂的并用对癌治疗有效。需说明的是，认为具有并用效果的药物根据癌症而不同，认为可以根据LGR5的表达量来预测药物的并用效果。
[实验例6]
(研究抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性)
将CMV-GFP构建体进一步导入到实验例4中制作的LGR5-iCT类器官。CMV-GFP构建体中，GFP基因连接于作为强制表达用启动子的CMV启动子的下游。因此，无论是否表达LGR5基因，GFP基因都在所有细胞中表达，并发出GFP蛋白的荧光。以下，有时将该类器官称为“LGR5-iCT/CMV-GFP类器官”。
LGR5-iCT/CMV-GFP类器官中，可以通过GFP的荧光观察癌细胞的存活活性，且可以通过tdTomato的荧光观察癌干细胞的存活活性。
使用LGR5-iCT/CMV-GFP类器官，高通量筛选用于大肠癌治疗的现有抗癌剂，并研究了对癌细胞和癌干细胞的影响。
图8是显示代表性结果的类器官的显微镜照片。图8中，“明视野”显示为明视野观察图像，“CMV-GFP”显示为观察GFP荧光的荧光显微镜照片，“LGR5-tdTomato”显示为观察tdTomato荧光的荧光显微镜照片，“Merge(合并)”显示为合成了明视野观察图像、GFP的荧光显微镜照片、和tdTomato的荧光显微镜照片的结果。另外，伊立替康、西妥昔单抗、奥沙利铂为现有的抗癌剂。各抗癌剂以图8所示的终浓度添加到类器官的培养基中。另外，“DMSO”是指，作为对照的代替抗癌剂而添加到培养基中的二甲亚砜。
其结果，虽然伊立替康显示出癌细胞的增殖抑制效果，但未观察到对癌干细胞的有效性。另外，明确了作为抗EGFR抗体的西妥昔单抗使癌干细胞的存活活性显著地提高。另外，明确了奥沙利铂杀伤癌干细胞和癌细胞的两者。
该结果证实了：可以将本实验例的方法用于对癌干细胞有效的抗癌剂等的筛选。
工业实用性
根据本发明，可以提供对组织干细胞进行基因座特异性的基因操作的技术。

Claims (15)

1.人体组织干细胞，其是将靶基因导入到干细胞标记物基因的基因座而得的人体组织干细胞。
2.权利要求1所述的人体组织干细胞，其中，上述干细胞标记物基因为富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5即LGR5基因。
3.权利要求2所述的人体组织干细胞，其中，将靶基因导入到Lgr5基因座的第18外显子。
4.权利要求1或2所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为报道基因。
5.权利要求1～4中任一项所述的人体组织干细胞，其中，上述靶基因为第1报道基因，且进一步导入了由强制表达用启动子驱动的第2报道基因。
6.权利要求1～5中任一项所述的人体组织干细胞，其为来自癌组织的干细胞。
7.将靶基因导入至人体组织干细胞的干细胞标记物基因的基因座的方法，所述方法具备：通过基因组编辑将上述靶基因导入至包含人体组织干细胞的培养类器官的上述干细胞标记物基因的基因座的步骤。
8.权利要求7所述的方法，其中，上述导入靶基因的上述步骤通过电穿孔来进行，且进一步具备在导入上述靶基因之后将上述培养类器官在30℃下培养2天的步骤。
9.权利要求7或8所述的方法，其中，上述干细胞标记物基因的基因座为Lgr5基因座。
10.权利要求9所述的方法，其中，将上述靶基因导入至Lgr5基因座的第18外显子。
11.权利要求7～10中任一项所述的方法，其中，上述靶基因是编码细胞谱系标记诱导蛋白的基因。
12.试验通过权利要求11所述的方法制作的人体组织干细胞是否为干细胞的方法，所述方法具备：通过上述人体组织干细胞的细胞谱系分析检测上述人体组织干细胞的自我复制和分化的步骤，其中，上述人体组织干细胞的自我复制和分化的两者被检测出，则表明上述人体组织干细胞为干细胞。
13.权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，上述人体组织干细胞为来自癌组织的干细胞。
14.对癌干细胞有效的抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法具备：在受试物质的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的报道基因；和测定上述报道基因的表达量的步骤，其中，上述报道基因的表达量降低，则表明上述受试物质为对癌干细胞有效的抗癌剂。
15.试验抗癌剂对癌干细胞和癌细胞的有效性的方法，所述方法具备：在上述抗癌剂的存在下，培养癌干细胞的步骤，所述癌干细胞导入有由癌干细胞标记物基因的启动子驱动的第1报道基因和由强制表达用启动子驱动的第2报道基因；和测定上述第1和上述第2报道基因的表达量的步骤，其中，上述第1报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞有效的抗癌剂，上述第2报道基因的表达量降低，则表明上述抗癌剂为对癌干细胞和癌细胞有效的抗癌剂。
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