CN104593512A - 双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法。通过使用红色和绿色荧光蛋白对群体肿瘤细胞和肿瘤干细胞分别进行标记，利用高内涵成像系统即可评估药物分别对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向性。由于目前还没有很好的靶向肿瘤干细胞的药物筛选方法，本发明建立的肿瘤干细胞筛选方法可望用于针对肿瘤干细胞进行新型抗肿瘤药物的筛选，从而提高抗肿瘤药物的筛选效果。

Description

双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法。
背景技术
抗肿瘤新药的市场需求大、社会和经济效益大，国内外医药行业一直把抗肿瘤药物作为新药研发的重中之重。目前全球共有至少860种抗肿瘤药物正处于临床试验阶段。这一数字是处于临床试验阶段的心脏疾病和中风类药物总和的两倍，也是阿尔茨海默病和其他神经系统疾病类药物总和的两倍。然而目前药物的筛选均是以肿瘤细胞群体作为考察对象，而近年的研究指向肿瘤中肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在是肿瘤恶性表现的内在支撑，体现在：CSCs形成于肿瘤早期甚至癌前病变，始动肿瘤发生和演进；CSCs具有多向分化潜能，是肿瘤成分多样性和分化异质性的原因；CSCs具有高侵袭性，是上皮-间质转化的主要细胞，是转移的“源泉”；CSCs抵抗化疗和放疗，是肿瘤复发的根源；CSCs还能始动和促进血管生成，通过分泌血管生成因子、转分化为内皮以及形成血管拟态为肿瘤提供营养；通过免疫编辑，CSCs具有抑制免疫细胞(DC、T、NK细胞)并参与肿瘤免疫逃逸机制的形成。因此筛选靶向CSCs的治疗药物已被认为是未来肿瘤综合治疗很有希望的有效策略之一。
目前CSCs药物筛选方面存在很多限制，主要体现在一方面CSCs难以获得，另一方面CSCs获得以后，在药物筛选过程中会有部分细胞自发分化转变为非CSCs，因此如果此时以细胞群体作为对象则评价结果不可靠，而再次使用抗体等方法对CSCs进行标记区分则费事费力，不但无法大规模开展，也会增加系统误差，影响评价结果。
本实验前期研究表明Nanog可以作为肝癌干细胞的新标记物分子，也就是说，Nanog阴性细胞转变为Nanog阳性细胞即意味着肝癌细胞转变为肝癌干细胞(Hepatology.2012，56(3):1004-14)，本发明拟在上述研究的基础上，进一步建立肿瘤干细胞的药物筛选方法，为研究新型抗肿瘤药物提供新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双荧光报告系统，并提供了该报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用，通过此双荧光报告系统能够对肿瘤干细胞进行靶向性药物筛选；本发明同时还提供了药物筛选的具体方法。
本发明采用的技术方案具体如下：
1、用于肿瘤干细胞药物筛选的双荧光报告系统，所述双荧光报告系统包括荧光报告系统Ⅰ和荧光报告系统Ⅱ；所述荧光报告系统Ⅰ由肿瘤干细胞标记分子的基因启动子启动表达。
优选的，所述标记分子为Nanog。
优选的，所述荧光报告系统Ⅱ由组成型启动子启动表达。
优选的，所述荧光报告系统Ⅱ由持家基因的启动子启动表达。
优选的，所述荧光报告系统Ⅱ由细胞内持家基因磷酸甘油酸激酶的启动子启动表达。
优选的，所述双荧光报告系统为双荧光报告载体，其中，荧光报告系统Ⅰ和荧光报告系统Ⅱ位于同一载体；所述荧光报告系统Ⅰ为绿色荧光蛋白GFP基因的编码区，所述荧光报告系统Ⅱ为红色荧光蛋白FP635基因的编码区。
优选的，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞。
优选的，所述肝癌干细胞为Huh7细胞。
2、上述双荧光报告系统在肿瘤干细胞药物筛选中的应用。
3、采用上述双荧光报告系统进行肿瘤干细胞药物筛选的方法，先用包含双荧光报告系统的病毒感染肿瘤细胞并进行细胞培养；待细胞生长汇合度达到40-80％后加入药物继续培养；培养完毕后，加入细胞核染料对细胞核进行标记；根据单独分布的散在细胞确定检测细胞的直径范围；用高内涵成像系统检测绿色荧光和红色荧光蛋白的表达情况，通过统计单位面积内红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达情况评估药物对肿瘤干细胞的杀伤效果。
本发明的有益效果在于：通过使用红色和绿色荧光蛋白对群体肿瘤细胞和肿瘤干细胞分别进行标记，利用高内涵成像系统即可评估药物分别对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向性。由图3可知，本发明所述方法能够分别将肿瘤细胞和肿瘤干细胞标记为红色和绿色荧光，提示本发明所述方法能够用于药物筛选，而实施例3所述实验证实本发明确实能够用于肿瘤药物的筛选。由于目前还没有很好的靶向肿瘤干细胞的药物筛选方法，本发明建立的肿瘤干细胞筛选方法可望用于针对肿瘤干细胞进行新型抗肿瘤药物的筛选，从而提高抗肿瘤药物的筛选效果。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为Lv-PhPGK-FP635载体的结构及关键限制性酶切位点的分布示意图，该载体中hPGK启动子以及红色荧光蛋白FP635基因开放阅读框顺序相连，可将病毒感染的细胞标记上红色荧光。
图2为Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635载体的结构及关键限制性酶切位点的分布示意图，该载体中Nanog启动子、绿色荧光蛋白GFP基因开放阅读框、hPGK启动子以及红色荧光蛋白FP635基因开放阅读框顺序相连。
图3为将Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635载体包装成慢病毒，并感染人肝癌细胞Huh7，感染后72h拍摄的荧光照片；其中A图表示细胞中红色荧光的表达情况；B图表示绿色荧光蛋白的表达情况；C图表示相应明场的图片；D图红色荧光、绿色荧光以及明场的叠合图。图片放大倍数为100倍。
图4为感染有Lv-PNanog-GFP慢病毒的人肝癌细胞Huh7，分别用不同浓度的药物Sorafinib和Verapamil，以及两种联合处理的情况下，用MD的高内涵成像系统对每个处理组拍摄3×3总计9个视野，图片为系统自动拼合的图片。其中A图表示不同处理情况下GFP的表达情况；B图表示用DAPI染色的细胞核情况；C图为A和B的叠合图。
图5为MD的高内涵成像系统依据细胞GFP的荧光强度自动分析处理结果。其中A图为拍摄的原始图片；B图为细胞核着色情况；C图为系统依据设定的GFP表达阈值将处在阈值以上的细胞核标记出来；D图为系统自动处理后，能准确识别出GFP阳性细胞。
图6为依据高内涵系统分析结果，分别得到的Sorafinib和Verapamil药物处理情况下，细胞中GFP平均荧光强度的时间变化曲线，可以据此判断药物对细胞GFP表达的改变情况，从而评估药物对GFP所表示的肿瘤干细胞特性的影响能力。
具体实施方式
本发明以肝癌细胞为例，进一步阐述发明的具体实施方式，然而需要指出的是，本发明所述技术方案不仅仅局限于肝癌细胞，亦可稍加改变而用于其它肿瘤细胞。
本实验前期通过感染Lv-PNanog-GFP慢病毒的方式对肝癌细胞进行标记，从而可以用感染Lv-PNanog-GFP慢病毒后表现为GFP(绿色荧光蛋白)不表达的肝癌细胞表示Nanog阴性细胞，而用GFP表达的肝癌细胞表示Nanog阳性细胞(Hepatology.2012，56(3):1004-14)。
本发明所用肝癌细胞系为Huh7细胞，Huh7细胞来源于本课题组库存。
本发明所用分选型和分析型流式细胞仪均购自BD公司；光学显微镜、倒置显微镜和倒置荧光显微镜均购自Olympus公司；高内涵成像系统购自MD公司。
本发明所用Hoechst33342购自碧云天公司；B27 Supplement购自Gibco公司；pTurboFP635-N质粒购自Evrogen公司(CAT:FP722)；rTaq酶购自TaKaRa公司；pMD-19-T-Simple载体购自TaKaRa公司(CAT:D104A)；pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒购自Addgene公司(CAT:12252，完整序列见SEQ ID No.4)；pT-copGFP质粒为南京金斯瑞公司合成后本研究室保存，该克隆载体含有GFP编码基因，合成后即连接在克隆载体T载体上；CutSmartTMBuffer为NEB公司生产；Sorafinib购自Santa Cruz公司；Verapamil购自SantaCruz公司。
本发明主要细胞培养试剂及溶液配制如下：
(1).DMEM培养基：将DMEM粉末溶于超纯水中，每升加入青霉素0.0625g、链霉素0.11g、NaHCO33.73g和HEPES 5.96g，搅拌至完全溶解，用10mol/L NaOH将pH调至7.2-7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。使用时每瓶按10％体积加入FBS，即为完全培养基。
(2).磷酸盐缓冲液(0.01mol/L PBS)：取PBS袋装粉剂(2L装)，用约1L超纯水溶解，充分搅拌至完全溶解，定容至2L，调PH值至7.4，分装，高压灭菌后4℃保存备用。
(3).2×HEPES溶液：281mM NaCl，100mM HEPES，1.5mM Na2HPO4用pH计精确调至PH 7.05，过滤灭菌，少量分装后，-20℃保存，一年内有效。
实施例1Lv-PhPGK-FP635载体的构建
为了实现对所有实验细胞进行标记，首先构建持家基因PGK(磷酸甘油酸激酶)的启动子表达红色荧光FP635的慢病毒载体Lv-PhPGK-FP635，结构图见图1。构建过程如下：
1.中间载体pMD-19-T-pTurboFP635的构建：分别设计引物以pTurboFP635-N质粒为模板，扩增其中所示红色荧光蛋白FP635的编码区(SEQ ID No.1)。引物如下：
5’上游引物：5’-ccaccggtcg ccaccatggt gggtgaggat agcgtgctga tc-3’，(SEQ ID No.2)；
3’下游引物：5’-ttgtcgacgc ggccgcttta cttgtacgtc agctgtgccc cagtttgc-3’，(SEQ ID No.3)。
在5’上游引物引入AgeI酶切位点，在3’下游引物加入SalI酶切位点，用PCR进行扩增，扩增体系为：pTurboFP635-N质粒0.5μL，5’上游引物0.5μL，3’下游引物0.5μL，dNTP mix2μL，2×KOD buffer 2.5μL，去离子水14μL；扩增条件如下：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，68℃，1min，共30个循环。
扩增产物中继续补加rTaq酶1μL，72℃孵育10min，进行加A处理；最终产物进行胶回收，并与克隆载体pMD-19-T-Simple载体进行连接，连接体系如下：PCR扩增产物3μL，pMD-19-T-Simple载体0.5μL，2×连接Buffer 5μL，去离子水1.5μL；将以上混合连接体系于16℃孵育30min，随后转化Top10感受态细菌，培养物涂平板37℃培养过夜，挑选4个单克隆，继续转接至5mL含100μg/mL氨苄西林的LB培养基中37℃震荡培养10h。对培养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆，进一步进行PCR鉴定，鉴定所用引物和条件同上述扩增方法；鉴定正确的克隆，经南京金斯瑞公司测序正确，得到中间载体pMD-19-T-pTurboFP635。
2.Lv-PhPGK-FP635载体的构建：分别将pMD-19-T-pTurboFP635和pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒用AgeI-HF和SalI-HF进行双酶切，酶切反应体系为：pMD-19-T-pTurboFP635或pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE 3μL，AgeI-HF 1μL，SalI-HF 1μL，CutSmartTMBuffer 2μL，去离子水14μL。经37℃酶切1h后，进行琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收包含pTurboFP635基因的751bp片段以及6642bp左右载体片段，然后将两个片段分别按照下列比例配制DNA连接体系：pTurboFP635(751bp)3μL，载体片段(6642bp)1μL，T4连接酶Buffer 1μL，T4连接酶1μL，去离子水4μL；以上混合连接体系于16℃孵育3h，随后转化Top10感受态细菌，培养物涂平板30℃培养20h后，分别挑选6个分散的单克隆，接入含100μg/mL氨苄西林的LB培养基中继续30℃震荡培养过夜；对培养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆，进一步进行HindIII和BsrGI双酶切鉴定，鉴定体系如下：质粒2μL，HindIII 1μL，BsrGI 0.5μL，NEBuffer 2.12μL，去离子水14.5μL；将上述酶切反应体系置于37℃水浴2h后，继续进行琼脂糖凝胶电泳。
经酶切得到正确片段(条带分别为313bp；499bp；553bp；584bp；603bp；1490bp和3341bp)的克隆-20℃保存，载体命名为Lv-PhPGK-FP635。该载体使用细胞内持家基因PGK(磷酸甘油酸激酶)的启动子表达红色荧光蛋白FP635，从而可以将所有感染该病毒的细胞标记上红色荧光。
3.病毒包装、纯化及感染：
病毒包装实验：用含10％FBS的DMEM培养基培养293FT细胞，然后取状态较佳的细胞于转染前24h铺于10cm2培养板中，细胞铺板浓度保证转染时细胞汇合度为70-80％；转染前2小时用2％FBS的DMEM培养基换液；每个培养板转染15μg Lv-PhPGK-FP635载体质粒、4μg pMDLg/pRRE、3μg pRSV-Rev和6μg pMD2.G包装质粒，总计28μg质粒DNA；转染时先将上述4个质粒混匀，加入50mL，2.5M CaCl2，并用水补齐至500mL，再逐滴加到500mL2×HEPES中，充分混匀后，室温静置20min，逐滴加入培养板并培养12-16h，然后用含10％FBS的DMEM培养基更换培液，继续培养，最后在转染48h和72h后分别收集细胞上清用于病毒纯化。
病毒纯化实验：将收集的病毒上清3000rpm离心5-10min后用0.45μm过滤器过滤，然后根据病毒上清量，按每204mL病毒上清加入21.7mL，4mol/L NaCl，51mL PEG6000和23.3mLPBS；4℃，4700rpm离心30min后弃上清，沉淀用适量的PBS重悬，最后进行病毒滴度测定，分装，-80℃保存。
慢病毒的感染及滴定实验：感染前24h铺5×104个293FT细胞于24孔板中，细胞计数后，换成新鲜培养基，加入终浓度为8μg/mL的Polybrene；以表达EGFP的慢病毒pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE作为对照病毒，按梯度加1μL、2μL和5μL纯化的对照病毒，培养10-16h后换成新鲜培养基；感染后72h，用流式细胞仪检测EGFP阳性的细胞比例。用下列公式计算病毒的滴度(单位TU/mL)：
将包装好的含有Lv-PhPGK-FP635质粒的慢病毒感染已经感染有Lv-PNanog-GFP病毒的细胞，从而在同一个细胞中表达两种表达载体，该病毒载体和已构建的Lv-PNanog-GFP病毒载体联合使用即可得到红色荧光标记群体细胞、绿色荧光标记肿瘤干细胞的的细胞模型，从而可以通过检测荧光表达细胞的比例来判定细胞群体以及其中肿瘤干细胞的数量。
实施例2Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635载体的构建
由于实施例1所述系统需要进行两次复感染，相对繁琐，因此我们进一步将Lv-PNanog-GFP和Lv-PhPGK-FP635两个病毒载体的有效元件框融合到一个载体中(载体结构见图2)，从而简化操作流程。构建流程如下：
1.pMD-19-T-GFP中间载体的构建：分别设计引物以pT-copGFP质粒为模板，扩增其中所示绿色荧光蛋白GFP的编码区(SEQ ID No.5)，引物如下：
5’上游引物：5’-atcgattcta gacgccacca tgcccgccat g-3’，(SEQ ID No.6)；
3’下游引物5’-ctcgagttat caggcgaagg cgatg-3’，(SEQ ID No.7)。
在5’上游引物引入ClaI和XbaI酶切位点，在3’下游引物加入XhoI酶切位点，用PCR进行扩增，扩增体系如下：pT-copGFP质粒0.5μL，5’上游引物0.5μL，3’下游引物0.5μL，dNTP mix 2μL，2×KOD buffer 2.5μL，去离子水14μL。扩增条件为95℃，30s；95℃，5s，55℃，30s，68℃，1min，共30个循环。
扩增产物中继续补加rTaq酶1μL，72℃孵育10min，进行加A处理。最终产物进行胶回收，并按如下体系与克隆载体pMD-19-T-Simple载体进行连接：PCR扩增产物3μL，pMD-19-T-Simple载体0.5μL，2×连接Buffer 5μL，去离子水1.5μL；16℃孵育30min。扩增产物连接克隆载体pMD-19-T-Simple载体(细菌转化及克隆挑选方法同实施例1)，并经南京金斯瑞公司测序正确，得到中间载体pMD-19-T-GFP。
2.Lv-GFP-PhPGK-FP635中间载体的构建：将上述pMD-19-T-GFP和实施例1构建的Lv-PhPGK-FP635质粒分别用ClaI和XhoI双酶切，酶切反应体系为：pMD-19-T-GFP或Lv-PhPGK-FP6353μL，ClaI 1μL，XhoI 1μL，CutSmartTMBuffer 2μL，去离子水14μL；37℃酶切1h后，经琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收包含GFP基因的693bp片段以及7366bp左右载体片段；两个片段分别按照下列比例配制DNA连接体系：GFP基因(693bp)3μL，载体片段(7366bp)1μL，T4连接酶Buffer 1μL，T4连接酶1μL，去离子水4μL；以上混合连接体系16℃孵育3h，随后转化Top10感受态细菌，培养物涂平板30℃培养20h，分别挑选6个分散的单克隆，接入含100μg/mL氨苄西林的LB培养基中继续30℃震荡培养过夜。培养完毕后，对培养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆，进一步进行HindIII酶切鉴定，鉴定体系如下：质粒2μL，HindIII-HF 1μL，CutSmartTMBuffer 2μL，去离子水15μL；37℃水浴2h，继续进行琼脂糖凝胶电泳。经酶切得到正确片段(条带分别为313bp；553bp；584bp；1172bp；2093bp和3341bp)的克隆-20℃保存，载体命名为Lv-GFP-PhPGK-FP635。
3.Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635目标载体的构建：将上述Lv-GFP-PhPGK-FP635和实施例1构建的Lv-PhPGK-FP635质粒分别用ScaI和XbaI双酶切，酶切反应体系为：Lv-GFP-PhPGK-FP635或Lv-PhPGK-FP6353μL，ScaI 1μL，XbaI 1μL，NEBuffer 3.12μL，去离子水14μL；37℃酶切1h后，经琼脂糖凝胶电泳并分别在Lv-GFP-PhPGK-FP635酶切产物中回收4351bp的片段，在Lv-PhPGK-FP635酶切产物中回收包含Nanog启动子区的6028bp片段；两个片段分别按照下列比例配制DNA连接体系：Lv-GFP-PhPGK-FP635酶切产物(4351bp)5μL，Lv-PhPGK-FP635酶切产物(6028bp)3μL，T4连接酶Buffer 1μL，T4连接酶1μL；以上混合连接体系先于16℃孵育3h，随后转化Top10感受态细菌，培养物涂平板30℃培养20h后，分别挑选6个分散的单克隆，接入含100μg/mL氨苄西林的LB培养基中继续30℃震荡培养过夜。培养完毕后，对培养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆，进一步进行HindIII酶切鉴定，鉴定体系如下：质粒2μL，HindIII-HF 1μL，CutSmartTMBuffer2μL，去离子水15μL；37℃水浴2h，继续进行琼脂糖凝胶电泳。经酶切得到正确片段(条带分别为313bp；553bp；584bp；1192bp；2093bp；2303bp和3341bp)的克隆-20℃保存，载体命名为Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635，载体结构见图2。
实施例2构建得到的Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635载体使用细胞内持家基因PGK(磷酸甘油酸激酶)的启动子表达红色荧光蛋白FP635，从而将其包装成慢病毒后(包装步骤如实施例1)，即可以将所有感染该病毒的肿瘤细胞标记上红色荧光，同时将Nanog阳性表达的肿瘤干细胞标记上绿色荧光。由图3可知，使用上述病毒以10感染复数感染人肝癌细胞系Huh7后，可以在荧光显微镜下观察到所有细胞均标记上红色荧光，而其中肿瘤干细胞也被成功标记上绿色荧光。
实施例3GFP/RFP双荧光报告系统用于药物筛选
将单独感染有Lv-PNanog-GFP-PhPGK-FP635病毒或同时感染有Lv-PNanog-GFP和Lv-PhPGK-FP635病毒的Huh7细胞铺入96孔板，每孔铺入1×103个肿瘤细胞，培养至细胞生长汇合度至40-80％；分别加入不同药物以及药物溶媒作为对照，然后继续放入37℃细胞培养箱培养；24h后，加入活细胞染料Hoechst33342对细胞核进行标记，然后立即用高内涵成像系统检测孔板中绿色荧光和红色荧光蛋白的表达情况，检测后的细胞还可以继续培养24h到48h，可对药物作用的多个时间点分别进行检测；检测结果时利用MD高内涵成像系统附带的MetaXpress软件进行分析，过程为：以Hoechst33342所染的蓝色荧光定义细胞核以明确区分单个细胞；利用高内涵成像系统得到的图片，结合细胞核染色结果，量取其中可区分的单独分布的散在细胞的最小和最大细胞直径，并输入MetaXpress软件进行模拟分析，根据自动分析结果调整直径范围选定标准，保证95％以上的细胞可被正确区分；以每个细胞中绿色荧光的表达荧光强度值设置合适的阈值，并输入MetaXpress软件，将荧光强度在阈值及以上的细胞判定为绿色荧光表达细胞，阈值以下的细胞判定为绿色荧光不表达细胞，根据软件自动分析结果结合成像图片判定阈值设定是否合适，并进行相应的调整，通过建立上述步骤确定的阈值将细胞自动区分为绿色荧光阳性表达和不表达的细胞，并由软件进行自动细胞计数；同上对细胞中红色荧光阳性表达和不表达的细胞进行区分和计数；通过统计单位面积内GFP表达的细胞数来评估药物对肿瘤干细胞的杀伤效果，通过计算RFP表达的细胞数评估药物对所有细胞的杀伤效果，通过统计GFP/RFP的比值评估药物对肿瘤干细胞的靶向性，结果按如下公式进行计算：
为了验证上述荧光报告系统是否可以用于药物筛选，我们在上述细胞中分别或者联合加入不同浓度的两种测试药物Sorafinib和Verapamil。具体分组为：①DMSO对照；②10μMSorafinib；③100μM Sorafinib；④50μM Verapamil；⑤10μM Sorafinib和50μM Verapamil；⑥100μM Sorafinib和50μM Verapamil。通过MD公司的高内涵成像系统，我们对每个处理组进行3×3拍照成像(图4)。通过MD高内涵成像系统附带的MetaXpress软件进行分析，我们计算出每个细胞中绿色荧光的表达荧光强度值，具体数值见下表，
通过设置合适的阈值，我们可以将细胞自动区分为绿色荧光阳性表达和不表达的细胞(图5)，结果显示软件分析与实际观察的结果具有很好的一致性(图5A、5D)。并且由于我们采用了活细胞核染料Hoechst33342，因此我们也可以通过该方法评估药物的时间作用曲线(图6)。
需要说明的是，本实验没有列出的实验操作均属于本领域常规的技术手段，所采用的条件也是本领域常规采用的实验条件。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.用于肿瘤干细胞药物筛选的双荧光报告系统，其特征在于，所述双荧光报告系统包括荧光报告系统Ⅰ和荧光报告系统Ⅱ；所述荧光报告系统Ⅰ由肿瘤干细胞标记分子的基因启动子启动表达。
2.根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述标记分子为Nanog。
3.根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统Ⅱ由组成型启动子启动表达。
4.根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统Ⅱ由持家基因的启动子启动表达。
5.根据权利要求2所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统Ⅱ由细胞内持家基因磷酸甘油酸激酶的启动子启动表达。
6.根据权利要求5所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述双荧光报告系统为双荧光报告载体，其中，荧光报告系统Ⅰ和荧光报告系统Ⅱ位于同一载体；所述荧光报告系统Ⅰ为绿色荧光蛋白GFP基因的编码区，所述荧光报告系统Ⅱ为红色荧光蛋白FP635基因的编码区。
7.根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞。
8.根据权利要求7所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述肝癌干细胞为Huh7细胞。
9.权利要求1-8任一项所述双荧光报告系统在肿瘤干细胞药物筛选中的应用。
10.采用权利要求1所述双荧光报告系统进行肿瘤干细胞药物筛选的方法，其特征在于，先用包含双荧光报告系统的病毒感染肿瘤细胞并进行细胞培养；待细胞生长汇合度达到40-80％后加入药物继续培养；培养完毕后，加入细胞核染料对细胞核进行标记；根据单独分布的散在细胞确定检测细胞的直径范围；用高内涵成像系统检测绿色荧光和红色荧光蛋白的表达情况，通过统计单位面积内红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达情况评估药物对肿瘤干细胞的杀伤效果。
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