ES2924861T3 - Célula madre tisular humana y uso de la misma - Google Patents

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Abstract

Célula madre de tejido humano en la que se introduce un gen de interés en un locus genético de un gen marcador de células madre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Célula madre tisular humana y uso de la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere a una célula madre tisular humana y al uso de la misma. Más específicamente, la presente invención se refiere a una célula madre tisular humana, un método para introducir un gen de interés en un locus genético de un gen marcador de células madre de una célula madre tisular humana, un método para analizar si una célula madre tisular humana es una célula madre, un método de cribado de un fármaco antineoplásico eficaz frente a una célula madre cancerosa y un método de ensayo de la eficacia de un fármaco antineoplásico frente a una célula madre cancerosa y una célula cancerosa.
Se reclama prioridad de la solicitud de patente japonesa n.° 2017-063171, presentada el 28 de marzo de 2017. Técnica antecedente
Una teoría de las células madre cancerosas se centra en una subpoblación de células cancerosas que mantienen el crecimiento tumoral y la autorreplicación (véase, por ejemplo, NPL 1). De acuerdo con la teoría de las células madre cancerosas, se considera que existe una pequeña cantidad de células madre cancerosas en el tejido tumoral desde una etapa temprana de la carcinogénesis, y el tejido tumoral se forma mediante la autorreplicación repetida y la diferenciación de las células madre cancerosas.
Lista de citas
Bibliografía que no es de patentes
[NPL 1] Kreso A. y Dick J. E., Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell, 4 (14), 275-291, 2014.
Descripción de la invención
Problema técnico
Sin embargo, no se ha establecido una técnica para realizar la manipulación de genes específica del locus genético en células madre tales como las células madre cancerosas. Por lo tanto, en particular, fue difícil analizar las células madre tisulares humanas en un linaje celular y confirmar que una célula individual tiene capacidad de autorreplicación y capacidad de diferenciación. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una técnica para realizar la manipulación de genes específica del locus genético en células madre tisulares.
Solución al problema
La solución se define mediante las reivindicaciones.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar una técnica para realizar la manipulación de genes específica del locus genético en una célula madre tisular.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 (a) es un diagrama esquemático de un locus del gen LGR5 humano. La FIG. 1(b) es un diagrama esquemático que muestra una estructura de una construcción selectiva preparada en el Ejemplo Experimental 1. La FIG. 1(c) es un diagrama esquemático que muestra una estructura del locus del gen LGR5 de un organoide preparado en el Ejemplo Experimental 1.
Las Figs. 2(a) a 2(c) muestran micrografías de fluorescencia de un corte tisular de tejido tumoral derivado de un organoide trasplantado a un ratón en el Ejemplo Experimental 2. Las FIG. 2(d) a 2(f) muestran micrografías de fluorescencia obtenidas al observar un corte tisular de cáncer de colon derivado de un paciente a partir del cual se estableció un clon de organoide en el Ejemplo Experimental 2.
Las Figs. 3(a) a 3(c) muestran diagramas que ilustran el marcaje mediante un marcador de linaje celular.
La FIG. 4 es un diagrama que ilustra una estructura de un locus del gen LGR5 de un organoide preparado en el Ejemplo Experimental 4 y el comportamiento de un gen suicida inducido por fármacos.
La FIG. 5(a) es una micrografía de fluorescencia que muestra un resultado obtenido al observar un corte de tejido tumoral de un ratón de control en el Ejemplo Experimental 4. La FIG. 5(b) es una micrografía de fluorescencia que muestra un resultado obtenido al observar un corte de tejido tumoral de un ratón al que se le administró AP20187, en el Ejemplo Experimental 4.
La FIG.6 es un gráfico que muestra un resultado obtenido midiendo el tamaño de un tumor de cada ratón (Dimerizador) al que se le administra AP20187 y un ratón de control (Vehículo), regularmente.
Las FIG. 7(a) y 7(b) muestran gráficos de un resultado obtenido midiendo regularmente el tamaño del tejido tumoral derivado de un organoide, en el Ejemplo Experimental 5.
La FIG. 8 es una micrografía de un organoide, que muestra un resultado típico del Ejemplo Experimental 6.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
[Célula madre tisular]
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una célula madre tisular en la que se introduce un gen de interés en un locus genético de interés.
En la presente realización, la célula madre tisular puede ser una célula humana o una célula animal no humana. La célula madre es una célula que tiene capacidad de autorreplicación y capacidad de diferenciación. La célula madre tisular es una célula madre que existe en el tejido, también llamada célula madre somática, y es diferente de una célula madre embrionaria (célula ES) o una célula madre pluripotente inducida (célula iPS). En la presente memoria descriptiva, la célula madre tisular incluye una célula madre cancerosa. Además, se supone que la célula madre tisular de la presente realización incluye una célula que puede desdiferenciarse hasta una célula madre debido a la plasticidad celular.
En la técnica relacionada, era difícil realizar una manipulación genética específica del locus genético en una célula madre tisular. Por otro lado, como se describe más adelante en los Ejemplos, los inventores aclararon que una célula madre tisular en la que se introduce un gen de interés en un locus genético de interés se puede preparar realizando una manipulación genética específica del locus genético en un organoide cultivado que contiene una célula madre tisular.
En la célula madre tisular de la presente realización, el locus genético de interés puede ser cualquier locus genético de interés, por ejemplo, puede ser un locus de un gen marcador de células madre. Más detalladamente, la célula madre tisular de la presente realización puede ser una célula madre cancerosa, y el locus genético de interés puede ser un locus genético de un gen marcador de células madre cancerosas. Los ejemplos del gen marcador de células madre cancerosas incluyen LGR5, proteína modular de unión a calcio 2 relacionada con SPARC (SMOC2), miembro B de la familia de moléculas de guía repulsiva (RGMB), AXIN2, olfatomedina 4 (OLFM4), proteína asociada al ciclo de división celular 7 (CDCA7), proteína con repeticiones ricas en leucina y dominios similares a inmunoglobulina 1 (LRIG1), proteína de dedo anular 43 (RNF43) y factor de transcripción 2 de Bh LH de la familia Achaete-Scute (ASCL2), pero no se limitan a los mismos.
Además, el cáncer derivado de la célula madre cancerosa no se limita particularmente y, por ejemplo, la célula madre cancerosa puede incluir una célula madre cancerosa de cáncer de colon, cáncer gástrico o cáncer pancreático. Los inventores confirmaron que, en estas células madre cancerosas, se puede usar un gen LGR5 como marcador de células madre cancerosas.
Además, los inventores aclararon que se puede introducir un gen de interés en un locus de interés de una célula madre tisular de una célula normal realizando una manipulación genética específica del locus genético en un organoide cultivado derivado de una célula normal.
Se puede determinar si se trata del organoide cultivado derivado de una célula normal o del organoide cultivado derivado de la célula cancerosa por el requisito de un factor de crecimiento necesario para cultivar el organoide, la confirmación de la mutación genética mediante secuenciación, la confirmación de la anomalía cromosómica y similares.
Además, en la célula madre de la presente realización, el gen de interés puede ser cualquier gen. Por ejemplo, el gen de interés también puede ser un gen indicador. Además, el gen indicador puede introducirse en una región distinta del exón 1 de un gen ubicado en el locus genético de interés. Por ejemplo, el gen indicador puede introducirse en el exón 18 del gen LGR5. El gen indicador no se limita particularmente, y los ejemplos del mismo incluyen varias proteínas y enzimas fluorescentes.
En la manipulación genética específica del locus genético mediante la edición del genoma y similares, el gen de interés se introduce en el exón 1 de un gen objetivo. Los inventores primero intentaron introducir el gen indicador en el exón 1 del gen LGR5 de una célula madre de cáncer de colon. Sin embargo, esta introducción de genes no se pudo realizar fácilmente. Por otro lado, como se describe más adelante en los Ejemplos, cuando el gen indicador se introdujo en el exón 18 del gen LG5, la introducción del gen deseado se pudo realizar de manera eficiente.
El gen de interés que se va a introducir en el locus genético de interés no necesita tener una secuencia promotora. Es decir, el gen de interés puede configurarse para expresarse mediante un promotor en el locus genético de interés.
Por ejemplo, el promotor puede expresar el gen de interés en el locus de interés, uniendo un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un sitio de salto ribosómico como T2A o P2A, o similar, a un lado 5' del gen de interés.
La célula madre tisular de la presente realización puede ser una célula madre cancerosa en la que se introduce un segundo gen indicador que está operado por el promotor de expresión forzada, además de un primer gen indicador que se introduce en el locus genético del gen marcador de la célula madre cancerosa y está operado por el promotor del gen marcador. No es necesario introducir el segundo gen indicador específicamente en el locus genético. Además, como promotor de expresión forzada, se puede utilizar un promotor utilizado normalmente para la expresión forzada de un gen en una célula animal, y los ejemplos del mismo incluyen el promotor CMV y el promotor EF1 a, pero no se limitan a los mismos.
El primer gen indicador y el segundo gen indicador son preferiblemente distinguibles entre sí. Por ejemplo, el primer gen indicador y el segundo gen indicador pueden ser genes que codifican proteínas fluorescentes que emiten fluorescencia con diferentes longitudes de onda entre sí.
El primer gen indicador se expresa cuando se expresa el gen marcador de células madre cancerosas, es decir, cuando la célula mantiene una propiedad de célula madre cancerosa. Por otro lado, el segundo gen indicador se expresa independientemente de la expresión del gen marcador de células madre cancerosas, es decir, tanto cuando la célula madre cancerosa mantiene la propiedad de célula madre cancerosa como cuando la célula madre cancerosa pierde la propiedad de célula madre cancerosa. Por lo tanto, la expresión del primer gen indicador indica la presencia de la célula madre cancerosa, y la expresión del segundo gen indicador indica tanto la presencia de la célula madre cancerosa como la presencia de la célula cancerosa. El término célula cancerosa se refiere a una célula cancerosa que no expresa un gen marcador de células madre cancerosas.
Como se describe más adelante en los Ejemplos, se puede distinguir y evaluar un efecto sobre la célula madre cancerosa y la célula cancerosa cultivando la célula madre cancerosa en presencia de una sustancia que se va a analizar y midiendo un nivel de expresión del primer gen indicador y del segundo gen indicador. Por lo tanto, la célula madre cancerosa se puede usar para la exploración de un fármaco antineoplásico, y similares, eficaz contra la célula madre cancerosa.
[Método de introducción del gen de interés en el locus genético de interés de la célula madre tisular]
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un método para introducir un gen de interés en un locus de interés de un gen de una célula madre tisular, que incluye: una etapa de introducción del gen de interés en el locus genético de interés de un organoide que contiene la célula madre tisular. El método de la presente realización puede ser un método que incluye una etapa de introducción del gen de interés en el locus genético de interés de las células que forman el organoide cultivado.
En el método de la presente realización, la célula madre es la misma que las descritas anteriormente, y los ejemplos de la misma incluyen una célula madre cancerosa y una célula madre somática.
En la técnica relacionada, era difícil realizar la manipulación genética en una célula madre, tal como una célula madre cancerosa y una célula madre tisular. En particular, era difícil realizar una manipulación genética específica del locus genético en una célula madre tisular. Por otro lado, como se describe más adelante en los Ejemplos, los inventores aclararon que se puede preparar un organoide cultivado en el que se introduce el gen de interés realizando la modificación genética de un gen de un organoide cultivado que contiene la célula madre tisular.
Además, como se describe más adelante en los Ejemplos, de acuerdo con la presente realización, es posible realizar una manipulación genética específica del locus genético en la célula madre tisular. En consecuencia, se puede preparar una célula madre tisular en la que se introduce un gen de interés en el locus genético de interés.
En la presente memoria descriptiva, el término organoide significa un tejido similar a un órgano obtenido mediante cultivo tridimensional de una célula. Además, en la presente memoria descriptiva, también se incluye una masa celular en el organoide. El método para el cultivo tridimensional no se limita particularmente, y los ejemplos del mismo incluyen un método que usa Matrigel, un método que usa colágeno y un método que usa laminina.
En el método de la presente realización, el organoide cultivado no se limita particularmente siempre que sea un organoide que incluya una célula madre tisular, y los ejemplos del mismo incluyen una célula de organoide epitelial, organoides de células tumorales epiteliales y similares. Además, los ejemplos de la célula epitelial incluyen una célula epitelial gastrointestinal del estómago, intestino delgado, intestino grueso, conducto biliar, epitelio del conducto pancreático y similares, y células epiteliales de tejidos distintos de los órganos digestivos, tales como la mama y la próstata.
Como método de cultivo del organoide, se puede utilizar un método de cultivo conocido. En particular, en el método de cultivo de una célula madre derivada de tejido canceroso, es posible seleccionar un método de cultivo optimizado individualmente para cada tejido canceroso (por ejemplo, véase Fujii M., et al., Nature Protocols, Vol. 10, 1474-1485, 2015; Mihara E., et al., eLIFE, Vol. 5, E11621,2016; Fujii M., et al., Cell Stem Cell, vol. 18, 827-838, 2016).
En el método de la presente realización, como etapa de introducción del gen de interés en el organoide cultivado, se puede usar un método de introducción de genes conocido. En particular, como se muestra en los Ejemplos, es preferible realizar la introducción por electroporación. Además, después de la electroporación, el método incluye preferiblemente una etapa de cultivo del organoide cultivado a 30 °C durante 2 días. Los inventores aclararon que la eficiencia de la introducción de genes en un organoide puede mejorarse significativamente al proporcionar dicha etapa.
[Método para analizar si las células madre tisulares son células madre]
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un método para analizar si la célula madre tisular marcada con un marcador de linaje celular operado por el promotor del gen objetivo es una célula madre, y el método incluye una etapa de detección de la autorreplicación y diferenciación de la célula madre tisular realizando un análisis de linaje celular en la célula madre tisular, en el que la detección tanto de la autorreplicación como de la diferenciación de la célula madre tisular indica que la célula madre tisular es una célula madre. El marcador de linaje celular se describirá más adelante.
El método de la presente realización es un método para analizar que una célula considerada célula madre tisular es una célula madre. Además, el método de la presente realización es un método para analizar si el gen objetivo es o no un marcador de células madre. Es decir, el método de la presente realización es un método para analizar si el gen objetivo es o no un marcador de células madre, y el método incluye una etapa de cultivo de una célula marcada con un marcador de linaje celular que está operado por un promotor del gen objetivo; y una etapa de detección de la autorreplicación y diferenciación de la célula realizando un análisis de linaje celular en la célula, en el que la detección tanto de la autorreplicación como de la diferenciación de la célula indica que el gen objetivo es un marcador de células madre.
Una célula madre es una célula que tiene capacidad de autorreplicación y capacidad de diferenciación. Por lo tanto, para demostrar que la célula objetivo es una célula madre, es necesario demostrar que una célula objetivo realiza tanto la autorreplicación como la diferenciación. Alternativamente, para demostrar que el gen objetivo es un marcador de células madre, es necesario demostrar que una célula individual que expresa el gen objetivo realiza tanto la autorreplicación como la diferenciación.
Para demostrar que una célula individual realiza tanto la autorreplicación como la diferenciación, es necesario demostrar que una célula derivada de una célula individual realiza tanto la autorreplicación como la diferenciación, realizando un análisis de linaje celular que rastrea y observa las células derivadas de una célula individual. El análisis de linaje celular es un método de análisis que identifica y rastrea una célula que es descendiente de una célula individual de un objetivo, independientemente de si la célula individual del objetivo repite o no la división celular o se diferencia y cambia una propiedad de la misma.
En la presente memoria descriptiva, un marcador de linaje celular se refiere a un marcaje que puede identificar que una célula dada es la progenie de una célula individual de interés, incluso si la célula individual de interés repite la división celular o se diferencia y cambia una propiedad de la misma.
En el método de la presente realización, una célula que expresa el gen objetivo se marca con un marcador de linaje celular para que sea operado por el promotor del gen objetivo. Como resultado, es posible identificar y observar una célula que expresa el gen objetivo y una progenie del mismo. Como resultado, cuando se confirma que la célula marcada realizó tanto la autorreplicación como la diferenciación, se puede demostrar que el gen objetivo es un marcador de células madre. El marcador de linaje celular está operado preferiblemente por el promotor del gen objetivo en el locus genético objetivo.
El marcador de linaje celular no se limita particularmente siempre que la célula pueda marcarse de manera que pueda rastrearse la progenie de la misma. Por ejemplo, una proteína inductora de marcador de linaje celular expresada por el promotor del gen objetivo y una construcción de marcador de linaje celular que se introduce en una célula por separado pueden usarse en combinación. La proteína inductora de marcador de linaje celular actúa sobre la construcción de marcador de linaje celular para marcar la célula de una manera específica del linaje celular.
Como marcador de linaje celular más específico, por ejemplo, se pueden usar variantes de un sistema Cre-LoxP tal como un sistema Cre-loxP, un sistema VCre-VLoxP y un sistema SCre-SloxP; se puede usar un sistema Flp-Frt que usa una enzima recombinante derivada de Saccharomyces cerevisiae; y estos se pueden usar en combinación.
Los ejemplos de la proteína inductora de marcador de linaje celular incluyen la recombinasa Cre, la recombinasa VCre, la recombinasa SCre y la recombinasa Flp.
Como construcción de marcador de linaje celular, por ejemplo, se puede usar una construcción de marcador de linaje celular que puede realizar el marcaje del linaje celular mediante la proteína inductora de marcador de linaje celular usada. Por ejemplo, cuando la proteína inductora de marcador de linaje celular es la recombinasa Cre, se puede usar una construcción que tiene una secuencia loxP y puede detectarse cuando se produce la recombinación genética. La construcción del marcador de linaje celular puede configurarse, por ejemplo, para expresar una proteína fluorescente cuando se produce la recombinación genética.
De acuerdo con este sistema, la recombinación genética ocurre cuando el gen objetivo se ha expresado y luego la célula expresa, por ejemplo, una proteína fluorescente. Dado que la célula expresa una proteína fluorescente incluso cuando se divide, es posible realizar un análisis del linaje celular.
En el método de la presente realización, una célula madre tisular en la que se introduce la proteína inductora del marcador de linaje celular para que sea operado por el promotor del gen objetivo puede prepararse mediante el método descrito anteriormente. Por otro lado, la construcción del marcador de linaje celular no necesita introducirse específicamente en el locus genético.
En la técnica relacionada, era difícil realizar una manipulación genética específica del locus genético en una célula madre tisular. Por lo tanto, era difícil introducir la proteína inductora del marcador de linaje celular en la célula madre tisular para que fuera operada por el promotor del gen objetivo. Sin embargo, como se describió anteriormente, los inventores aclararon que es posible realizar una manipulación genética específica del locus genético en células madre tisulares introduciendo un gen en un organoide cultivado.
Como resultado, es posible marcar la célula madre tisular con un marcador de linaje celular introduciendo una proteína inductora del marcador de linaje celular para que sea operada por el promotor del gen objetivo e introduciendo el marcador de linaje celular construido por separado en la célula madre tisular, y es posible analizar si un gen objetivo es o no un marcador de células madre.
[Método de cribado de fármacos antineoplásicos eficaces contra las células madre cancerosas]
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar un fármaco antineoplásico eficaz contra una célula madre cancerosa, que incluye: un etapa de cultivo de una célula madre cancerosa en la que se introduce un gen indicador que está operado por un promotor de un gen marcador de células madre cancerosas, en presencia de una sustancia a analizar; y un etapa de medición de un nivel de expresión de un gen indicador, en el que una disminución en el nivel de expresión del gen indicador indica que la sustancia a analizar es un fármaco antineoplásico eficaz contra las células madre cancerosas.
En el método de cribado de la presente realización, la célula madre cancerosa se puede cultivar en forma de un organoide que contiene la célula madre cancerosa. Además, la célula madre cancerosa es preferentemente una célula madre cancerosa que se ha demostrado que es una célula madre cancerosa mediante el método descrito anteriormente. Es decir, el gen marcador de células madre cancerosas es preferiblemente una célula madre cancerosa que se ha demostrado que es un marcador de células madre cancerosas mediante el método descrito anteriormente.
Además, el gen indicador no se limita particularmente, y los ejemplos del mismo incluyen varias proteínas y enzimas fluorescentes. El gen indicador está operado preferiblemente por el promotor en el locus del gen marcador de células madre cancerosas.
Como se describe más adelante en los Ejemplos, el efecto de la sustancia que se va a analizar en la célula madre cancerosa se puede medir mediante el método de cribado de la presente realización. Como resultado, es posible cribar el fármaco antineoplásico eficaz contra la célula madre cancerosa. La sustancia a analizar no se limita particularmente, y los ejemplos de la misma incluyen una biblioteca de compuestos y una biblioteca de fármacos existentes que incluyen un fármaco de anticuerpo.
Según otra realización de la presente invención, se proporciona un método para analizar la eficacia de un fármaco antineoplásico contra una célula madre cancerosa y una célula cancerosa, que incluye: una etapa de cultivo de una célula madre cancerosa en la que se introducen un primer gen indicador que está operado por un promotor de un gen marcador de células madre cancerosas y un segundo gen indicador que está operado por un promotor de expresión forzada, en presencia del fármaco antineoplásico; y una etapa de medición de un nivel de expresión de cada uno de los genes indicadores primero y segundo, en el que una disminución en el nivel de expresión del primer gen indicador indica que el fármaco antineoplásico es un fármaco antineoplásico eficaz contra la célula madre cancerosa, y una disminución en el nivel de expresión del segundo gen indicador indica que el fármaco antineoplásico es un fármaco antineoplásico eficaz contra la célula madre cancerosa y la célula cancerosa.
El método de la presente realización es un método de cribado de un fármaco antineoplásico. Como promotor de expresión forzada, se puede utilizar un promotor utilizado normalmente para la expresión forzada de un gen en una célula animal, y los ejemplos del mismo incluyen el promotor CMV y el promotor EF1 a, pero no se limitan a los mismos.
En el método de la presente realización, el promotor opera preferentemente sobre el primer gen indicador en el locus genético del gen marcador de células madre cancerosas. Además, el primer gen indicador y el segundo gen indicador son preferiblemente distinguibles entre sí. Por ejemplo, el primer gen indicador y el segundo gen indicador pueden ser genes que codifican proteínas fluorescentes que emiten fluorescencia con diferentes longitudes de onda entre sí.
Como se describe más adelante en los Ejemplos, el efecto de un fármaco antineoplásico objetivo sobre la célula madre cancerosa y la célula cancerosa puede evaluarse mediante el método de la presente realización. En consecuencia, el método de la presente realización se puede utilizar para seleccionar un fármaco antineoplásico o similar eficaz contra las células madre cancerosas.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los Ejemplos experimentales, pero la presente invención no se limita a los siguientes Ejemplos experimentales.
[Ejemplo experimental 1]
(Introducción del gen indicador en el locus del gen LGR5 de una célula madre de cáncer de colon)
«Preparación de la construcción»
El plásmido CRISPR-Cas9 selectivo del exón 18 de un gen LGR5 se preparó mediante un método general. La FIG.
1(a) es un diagrama esquemático de un locus del gen LGR5 humano. Además, se preparó una construcción selectiva que introduce el gen indicador en el exón 18 del gen LGR5. Como gen indicador, se utilizó un gen que codifica la proteína fluorescente verde (GFP). La FIG. 1(b) es un diagrama esquemático que muestra una estructura de la construcción selectiva preparada.
La construcción selectiva se preparó uniendo los brazos 5' y 3', cada uno con una longitud de 1 kpb, al plásmido IRES-GFP-loxP-EF1-RFP-T2A-Puro-loxP (modelo "HR180PA-1", System Bioscience).
«C u ltivo de organoide>>
Se realizó un experimento con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio. El tejido de cáncer de colon extirpado de un paciente se cortó en pequeños fragmentos y se lavó al menos 10 veces con tampón fosfato (PBS) enfriado con hielo. Posteriormente, se le añadió Liberasa (modelo "TH", Roche Life Sciences) y se digirió a 37 °C durante 60 minutos con pipeteo enérgico cada 15 minutos. Posteriormente, el fragmento restante se volvió a digerir usando una enzima (tipo "TrypLE Express", Invitrogen) a 37 °C durante 20 minutos.
Posteriormente, se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 4 °C y 200xg durante 3 minutos. Posteriormente, el precipitado se suspendió en Matrigel (BD Bioscience) y se dispensó en placas de 24 pocillos cada una para tener 25 pL/pocillo. Posteriormente, se añadió un medio después de la polimerización de Matrigel.
Como medio, se usó un medio en el que se añadieron penicilina, estreptomicina, HEPES 10 mM, GlutaMAX 2 mM (Thermo Fisher Scientific), 1xB27 (Life Technologies), gastrina I 10 nM (Sigma) y N-acetilcisteína 1 mM (Wako Pure Chemical Industries) a un medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 que se utilizó como medio básico. Además, en algunos casos, se añadieron al medio 50 ng/ml de EGF recombinante de ratón, 100 ng/ml de Noggin recombinante de ratón y A83-01 (Tocris) 500 nM.
Los inventores aclararon previamente que un organoide de cáncer de colon puede cultivarse durante un largo período de tiempo mediante el método de cultivo descrito anteriormente, y que el organoide de cáncer de colon contiene una célula madre de cáncer de colon.
«Introducción de genes>>
Se introdujo un gen en el organoide cultivado mediante un método de electroporación. Después de la introducción del gen, el organoide cultivado se cultivó a 30 °C durante 2 días. Posteriormente, 3 días después de la introducción del gen, se realizó un cultivo selectivo en presencia de 2 pg/mL de puromicina durante 3 días.
Posteriormente, se seleccionaron los clones de organoides resistentes a fármacos y se propagaron individualmente. Se extrajo el ADN genómico de cada clon de organoide y se confirmó mediante PCR y transferencia de Southern que se había introducido un gen de interés.
Posteriormente, se retiró el casete de selección RFP-T2A-Puro flanqueado por la secuencia loxP mediante una infección transitoria con un adenovirus que expresaba la recombinasa Cre. Posteriormente, se seleccionaron y clonaron organoides negativos para RFP. Posteriormente, se confirmó mediante PCR que se retiró el casete de selección RFP-T2A-Puro.
Utilizando el método anterior, se obtuvieron organoides de 3 clones denominados CRC7, CRC12 y CRC28. La FIG.
1(c) es un diagrama esquemático que muestra una estructura del locus del gen LGR5 del organoide obtenido. En lo sucesivo, estos organoides pueden denominarse "organoides LGR5-GFP" en algunos casos.
[Ejemplo experimental 2]
(Confirmación de la jerarquía de las células madre)
«Xenoinjerto de organoide»
Se realizó un experimento con animales con la aprobación del Comité de Experimentos con Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio. Los organoides LGR5-GFP de 3 clones preparados en el Ejemplo experimental 1 se xenoinjertaron cada uno bajo las cápsulas renales de ratones inmunodeficientes. Como ratones inmunodeficientes, se usaron ratones NOD/Shi-scid IL-2RYnull (NOG) (de 7 a 12 semanas de edad, macho).
«Detección de células madre cancerosas y células cancerosas diferenciadas»
Se retiró un tumor formado de cada ratón y se fijó inmediatamente con paraformaldehído al 4% para preparar un corte de tejido congelado. Posteriormente, se detectó la fluorescencia de GFP que indicaba la presencia de una célula madre cancerosa en el corte de tejido preparado. Además, mediante inmunotinción se detectó queratina 20 (KRT20) como marcador de diferenciación.
Las FIG. 2(a) a 2(c) muestran micrografías de fluorescencia del corte de tejido tumoral derivado del organoide trasplantado. En la FIG. 2, "Xenoinjerto" indica el tejido tumoral derivado del organoide xenoinjertado, y "Paciente" indica el tejido tumoral derivado de un paciente que se describirá más adelante. Además, la barra de escala indica 100 |jm. La FIG. 2 (a) muestra el resultado del tejido tumoral derivado del clon CRC7 del organoide LGR5-GFP, la FIG. 2 (b) muestra el resultado del tejido tumoral derivado del clon CRC12, y la FIG. 2 (c) muestra el resultado del tejido tumoral derivado del clon CRC28.
Como resultado, quedó claro que una célula positiva para GFP (una célula madre cancerosa) estaba presente en una región más externa del tumor, y KRT20 (una célula diferenciada) estaba presente dentro del tumor.
Además, las FIG. 2(d) a 2(f) muestran micrografías de fluorescencia de un resultado de la detección del ARNm de LGR5 mediante hibridación in situ y la detección de KRT20 mediante inmunotinción en un corte de tejido de cáncer de colon derivado del paciente del que se estableció cada clon de organoide.
La FIG. 2 (d) muestra el resultado del tejido tumoral del paciente utilizado para establecer el clon CRC7, la FIG. 2 (e) muestra el resultado del tejido tumoral del paciente utilizado para establecer el clon CRC12, y la FIG. 2 (f) muestra el resultado del tejido tumoral del paciente utilizado para establecer el clon CRC28.
Como resultado, también en el tejido tumoral del paciente, estaba claro que una célula que expresaba LGR5 (una célula madre cancerosa) estaba presente en una región más externa del tumor, y KRT20 (una célula diferenciada) estaba presente dentro del tumor.
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la jerarquía de las células madre en el tejido tumoral del paciente se reprodujo en el tejido tumoral derivado del organoide.
[Ejemplo experimental 3]
(Prueba de que la célula que expresa el gen LGR5 es una célula madre cancerosa)
Se marcó una célula madre cancerosa con un marcador de linaje celular y se realizó un análisis de linaje celular para examinar si una célula individual realiza tanto la autorreplicación como la diferenciación.
<<Marcaje con un marcador de linaje ce lu lar»
En primer lugar, se marcó una célula madre cancerosa con un marcador de linaje celular para que fuera operada por un promotor del gen LGR5. Las FIG. 3(a) a 3(c) muestran diagramas que ilustran el marcaje con el marcador de linaje celular.
Primero, se introdujo una construcción IRES-CreER en el locus del gen LGR5 de un organoide cultivado derivado de cáncer de colon mediante el mismo método que en el Ejemplo experimental 1. La proteína CreER es una recombinasa que normalmente existe en el citoplasma, pero se mueve hacia el núcleo al unirse a tamoxifeno y hace que se produzca la recombinación con la secuencia loxP. La FIG. 3(a) es un diagrama que muestra un diagrama esquemático de un locus del gen LGR5 completo.
Además, se introdujo un casete indicador en el organoide en el que se introdujo IRES-CreER mediante el mismo método que en el Ejemplo experimental 1. Como casete indicador, se cortó un casete Rainbow del plásmido CMV-Brainbow-2.1R (modelo "#18723", Addgene). La FIG. 3 (b) es un diagrama que muestra un diagrama esquemático del casete Rainbow.
Se describirá el organoide marcado con el marcador de linaje celular mostrado en las FIG. 3(a) y 3(b). Una célula madre cancerosa presente en el organoide marcado con el marcador de linaje celular descrito anteriormente expresa el gen LGR5 y, por lo tanto, expresa la proteína CreER. En ausencia de tamoxifeno, dado que CreER estaba presente en el citoplasma, no se produjo la recombinación del casete Rainbow. Por lo tanto, se expresa GFP nuclear (nGFP) y se observa fluorescencia de GFP en el núcleo.
Cuando se administra tamoxifeno a la célula, el CreER se mueve hacia el núcleo y se produce una recombinación en combinaciones aleatorias en las múltiples secuencias loxP presentes en el casete Rainbow. Como resultado, por ejemplo, se forma la secuencia del gen que se muestra en la FIG. 3 (c). Como resultado, en algunos casos, la célula puede expresar cualquiera de la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente roja (RFP) y la proteína fluorescente cian (mCFP).
Una vez que una célula recombinante expresa cualquier proteína fluorescente, su progenie continúa expresando la misma proteína fluorescente. Por lo tanto, una célula derivada de una célula individual puede rastrearse y analizarse. En lo sucesivo, los organoides marcados con el marcador de linaje celular pueden denominarse "organoide LGR5-CreER/RainboW en algunos casos.
«Anális is del linaje celular de las células madre cancerosas»
Las células madre cancerosas expresan el gen LGR5. Por lo tanto, las células madre cancerosas contenidas en el organoide LGR5-CreER/Rainbow expresan CreER y, en presencia de tamoxifeno, cambian de células que emiten fluorescencia nGFP a células que emiten fluorescencia YFP, RFP y mCFP.
El análisis del linaje celular de las células madre cancerosas se realizó usando este sistema. Concretamente, en primer lugar, se xenoinjertó el organoide LGR5-CreER/Rainbow bajo la cápsula renal de ratones NOG (7-12 semanas de edad, macho) mediante el mismo método que el Ejemplo experimental 2. Posteriormente, un mes después del trasplante, se administró tamoxifeno a los ratones. Específicamente, se extrajo un tumor de cada ratón 3 días después y 28 días después de la administración del tamoxifeno, y se fijó inmediatamente con paraformaldehído al 4% para preparar un corte de tejido congelado.
Posteriormente, se realizó la observación de la fluorescencia del corte de tejido preparado, la hibridación in situ del ARNm de LGR5 y la inmunotinción de KRT20 para observar el comportamiento de la célula madre cancerosa.
Como resultado, se confirmó que inmediatamente después de la administración de tamoxifeno las células madre cancerosas estaban presentes en la región más externa del tejido tumoral. Posteriormente, se confirmó que el tejido tumoral se formaba continuamente por el clon celular con marcaje del linaje celular.
Además, también se descubrió que una célula que expresaba inicialmente el gen LGR5 forma una estructura clonal que incluye una célula positiva para LGR5 y una célula negativa para LGR5. Además, se confirmó que una célula que expresaba el gen LGR5 no expresaba inicialmente KRT20, sino que se diferenciaba en células positivas para KRT20 1 semana después de la administración del tamoxifeno.
A partir de los resultados anteriores, se demostró que en humanos una célula positiva para LGR5 es una célula madre cancerosa y tiene capacidad de autorreplicación y capacidad de diferenciación durante un largo período de tiempo. Es decir, se comprobó que en humanos el gen LGR5 es un marcador de células madre cancerosas.
[Ejemplo Experimental 4]
(Examen de la eficacia del tratamiento del cáncer selectivo de las células madre cancerosas)
Se incorporó un gen suicida inducido por fármacos en una célula madre cancerosa y se examinó la eficacia del tratamiento contra el cáncer selectivo de la célula madre cancerosa.
«Preparación de células madre cancerosas en las que se introdujo el gen suicida inducido por fárm acos»
En primer lugar, se introdujo una construcción IRES-iCaspasa9-T2A-tdTomato en el locus del gen LGR5 del organoide cultivado derivado de cáncer de colon mediante el mismo método que en el Ejemplo experimental 1. En lo sucesivo, estos organoides se denominarán "organoides LGR5-iCT" en algunos casos.
La iCaspasa 9 es un gen suicida inducido por fármacos. La iCaspasa 9 no tiene actividad en un monómero, pero forma un dímero en presencia de AP20187 (dimerizador, APExBIO) para inducir la apoptosis. Además, TdTomato es un tipo de proteína roja fluorescente (RFP).
La FIG. 4 es un diagrama que ilustra una estructura del locus del gen LGR5 completo y el comportamiento del gen suicida inducido por fármacos. En este sistema, la iCaspasa y la proteína fluorescente tdTomato son expresadas por el promotor del gen LGR5. Por lo tanto, es posible confirmar la presencia de la célula positiva para LGR5 observando la fluorescencia de tdTomato. Luego, en presencia de AP20187, la célula positiva para LGR5 induce la apoptosis y muere. Como resultado, no se observa la fluorescencia de tdTomato.
«Confirmación del comportamiento del organoide LGR5-iCT>>
El organoide LGR5-iCT se xenoinjertó debajo de la cápsula renal de ratones NOG (7-12 semanas de edad, macho) mediante el mismo método que el Ejemplo experimental 2. Posteriormente, después de formarse un tumor, se administró AP20187 a los ratones diariamente durante 5 días. Además, a los ratones de control se les administró únicamente un disolvente diariamente durante 5 días. A partir de entonces, se midió regularmente el tamaño del tumor de cada ratón.
Las FIG. 5 (a) y 5 (b) muestran micrografías de fluorescencia de un resultado obtenido extrayendo un tumor de cada ratón el 5° día desde el inicio de la administración de AP20187 para preparar un corte de tejido y detectando la fluorescencia de tdTomato y KRT20 como marcador de diferenciación mediante inmunotinción.
En la FIG. 5 (a), "+Vehículo" indica el resultado del ratón de control al que se le administró el disolvente solo. En la FIG. 5 (b), "+ Dimerizador" indica el resultado del ratón al que se administró AP20187. En las FIG. 5(a) y 5(b), la barra de escala indica 100 pm.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 5 (b), estaba claro que la administración de AP20187 inducía la apoptosis y la célula madre cancerosa positiva para LGR5 moría por completo. Por otro lado, la célula LGR5 negativa permaneció intacta.
Además, la FIG. 6 es un gráfico que muestra un resultado obtenido midiendo el tamaño de un tumor de cada uno de los ratones (dimerizador) a los que se administró el AP20187 y el ratón de control (vehículo), regularmente. Como resultado, se confirmó que el tamaño del tumor se redujo mediante la administración de AP20187. Eventualmente, sin embargo, quedó claro que el tamaño del tumor aumentó nuevamente.
Además, los inventores examinaron la expresión del gen LGR5 en el tejido tumoral tras la administración del AP20187. Como resultado, quedó claro que la expresión del gen LGR5 una vez que desaparecía se reconocía de nuevo. Además, también quedó claro que un nuevo aumento del tamaño del tumor correspondió a una nueva expresión del gen LGR5.
A partir de los resultados anteriores, quedó claro que la célula madre cancerosa positiva para LGR5 está involucrada en el crecimiento tumoral, y la célula cancerosa negativa para LGR5 tiene la capacidad de desdiferenciarse hasta la célula madre cancerosa positiva para LGR5. A partir de este modelo de tratamiento con células madre cancerosas que utiliza el AP20187 según el presente ejemplo experimental, quedó claro que el tratamiento a corto plazo con un solo fármaco selectivo solamente hacia la célula madre cancerosa provoca la recurrencia del tumor. Además, se reveló que el tratamiento continuo contra las células madre cancerosas podía suprimir el crecimiento del tumor, aunque el tumor no se curaba por completo.
[Ejemplo Experimental 5]
(Examen del modelo combinado de fármaco antineoplásico específico de células madre cancerosas y fármaco antineoplásico)
En el tumor preparado mediante el xenoinjerto del organoide LGR5-iCT preparado en el Ejemplo experimental 4, el AP20187 es un fármaco antineoplásico hipotético específico de células madre cancerosas. Por lo tanto, se examinó el efecto del tratamiento del cáncer mediante la combinación de AP20187 con los fármacos antineoplásicos existentes.
Específicamente, el organoide LGR5-iCT preparado en el Ejemplo experimental 4 fue xenoinjertado debajo de la cápsula renal de ratones NOG (7-12 semanas de edad, machos) por el mismo método que el Ejemplo experimental 2. Se usaron dos clones del clon CCO7 y el clon CCO25 como organoides LGR5-iCT.
Posteriormente, después de formarse un tumor, se administró a los ratones el fármaco antineoplásico existente. Como fármaco antineoplásico existente, se utilizó Cetuximab (CTX), que es un anticuerpo anti-receptor de EGF. Cetuximab se administró dos veces al inicio de la administración del fármaco (día 0) y en el día 7. Además, a los ratones de control solo se les administró el disolvente en lugar de Cetuximab.
Posteriormente, se administró AP20187 diariamente durante 5 días desde el día 8 hasta el día 12 después del inicio de la administración de Cetuximab a los ratones. Además, a modo de comparación, se utilizaron ratones de control a los que solo se les administró el disolvente diariamente durante 5 días desde el día 8 hasta el día 12 después de la administración de Cetuximab a los ratones.
Posteriormente, se midió regularmente el tamaño de los tumores de cada ratón. Las FIG. 7(a) y 7(b) muestran los gráficos de un resultado obtenido midiendo regularmente el tamaño de los tumores. La FIG. 7(a) muestra el resultado del tumor derivado del clon CCO7 del organoide LGR5-iCT, y la FIG. 7(b) muestra el resultado del tumor derivado del clon CCO25 del organoide LGR5-iCT.
En las FIG. 7(a) y 7(b), "V" indica el resultado del ratón de control, "CTX" indica el resultado del ratón al que se administró cetuximab y el disolvente, y "CTX+D" indica el resultado obtenido administrando Cetuximab y AP20187.
Como resultado, quedó claro que incluso al usar cualquier clon de organoide, el tamaño del tumor se redujo significativamente al administrar Cetuximab y AP20187 en combinación. Además, se observó una reducción tumoral superior al 95% en 5 de 6 ratones trasplantados con los clones CCO7, a los que se administró Cetuximab y AP20187 en combinación, y en 5 de 14 ratones trasplantados con los clones CCO25, se observó que los tejidos cancerosos desaparecieron por completo.
Los resultados anteriores indican que el uso combinado de un fármaco antineoplásico específico de células madre cancerosas y un fármaco antineoplásico existente es eficaz para el tratamiento del cáncer. Además, se considera que un fármaco con un efecto concomitante varía dependiendo del cáncer, y el efecto concomitante se puede predecir a partir de un nivel de expresión de LGR5 por parte del fármaco.
[Ejemplo Experimental 6]
(Examen de la eficacia de los medicamentos antineoplásicos contra las células madre cancerosas y las células cancerosas)
Se introdujo además una construcción CMV-GFP en el organoide LGR5-iCT preparado en el Ejemplo experimental 4. En la construcción CMV-GFP, se unió un gen GFP posteriormente al promotor CMV, que es el promotor de expresión forzada. Por lo tanto, independientemente de si se expresó o no el gen LGR5, el gen GFP se expresó en todas las células y emitió la fluorescencia de la proteína g Fp . En lo sucesivo, estos organoides pueden denominarse "organoides LGR5-iCT/CMV-GFP" en algunos casos.
En el organoide LGR5-iCT/CMV-GFP, la actividad de supervivencia de la célula cancerosa puede observarse mediante la fluorescencia de GFP, y la actividad de supervivencia de la célula madre cancerosa puede observarse mediante la fluorescencia de tdTomato.
Utilizando el organoide LGR5-iCT/CMV-GFP, se realizó un cribado de alto rendimiento de los fármacos antineoplásicos existentes utilizados para el tratamiento del cáncer de colon y se examinaron los efectos sobre las células cancerosas y las células madre cancerosas.
La FIG. 8 es una micrografía de un organoide que muestra un resultado típico. En la FIG. 8, "CAMPO BRILLANTE" indica una imagen de observación de campo brillante. "CMV-GFP" indica una micrografía de fluorescencia obtenida al observar la fluorescencia de GFP. "LGR5-tdTomato" indica una micrografía de fluorescencia obtenida al observar la fluorescencia de tdTomato. "Combinado" indica el resultado obtenido al sintetizar la imagen de observación de campo brillante, la micrografía de fluorescencia de GFP y la micrografía de fluorescencia de tdTomato. Además, el irinotecano, el cetuximab y el oxaliplatino son fármacos antineoplásicos existentes. Cada fármaco antineoplásico se añadió a un medio de organoide a la concentración final que se muestra en la FIG. 8. Además, "DMSO" se refiere a sulfóxido de dimetilo añadido al medio en lugar del fármaco antineoplásico como control.
Como resultado, el irinotecano mostró un efecto de inhibición del crecimiento contra la célula cancerosa, pero no fue efectivo contra la célula madre cancerosa. Además, quedó claro que Cetuximab como anticuerpo anti-EGFR aumenta significativamente la actividad de supervivencia de las células madre cancerosas. Además, quedó claro que el oxaliplatino mata tanto las células madre cancerosas como las células cancerosas.
Estos descubrimientos demuestran que el método del presente Ejemplo Experimental puede usarse para seleccionar un fármaco antineoplásico o similar eficaz contra las células cancerosas.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar una técnica para realizar la manipulación genética específica del locus genético en una célula madre tisular.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una célula madre tisular humana aislada en la que se introduce un gen de interés en un locus genético de un gen marcador de células madre, en la que:
- el gen marcador de células madre es un gen del receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR5), y
- el gen de interés se introduce en el exón 18 de un locus del gen Lgr5.
2. La célula madre tisular humana según la reivindicación 1, en la que el gen de interés es un gen indicador.
3. La célula madre tisular humana según la reivindicación 1 o 2, en la que:
- el gen de interés es un primer gen indicador, y
- se introduce además un segundo gen indicador que está operado por un promotor de expresión forzada.
4. La célula madre tisular humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es una célula madre derivada de tejido canceroso.
5. Un método para introducir un gen de interés en un locus genético de un gen marcador de células madre de una célula madre tisular humana, y el método comprende una etapa de introducción del gen de interés en el locus genético del gen marcador de células madre de un organoide cultivado que contiene la célula madre tisular humana mediante la edición del genoma, en el que
- el locus genético del gen marcador de células madre es un locus del gen Lgr5, y
- el gen de interés se introduce en el exón 18 del locus del gen Lgr5.
6. El método según la reivindicación 5, en el que:
- la etapa de introducción del gen de interés se realiza mediante electroporación, y
- el método comprende además una etapa de cultivo del organoide cultivado a 30 °C durante 2 días, después de introducir el gen de interés.
7. El método según la reivindicación 5 o 6, en el que el gen de interés es un gen que codifica una proteína inductora de marcador de linaje celular.
8. Un método para analizar si una célula madre tisular humana preparada mediante el método según la reivindicación 7 es una célula madre, que comprende:
una etapa de detección de la autorreplicación y la diferenciación de la célula madre tisular humana mediante la realización de un análisis de linaje celular en la célula madre tisular humana,
en el que la detección tanto de la autorreplicación como de la diferenciación de células madre tisulares humanas indica que la célula madre tisular humana es una célula madre.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la célula madre tisular humana es una célula madre derivada de tejido canceroso.
10. Un método de cribado de un fármaco antineoplásico eficaz contra una célula madre cancerosa, que comprende:
una etapa de cultivo de una célula madre cancerosa en la que se introduce un gen indicador que está operado por un promotor de un gen marcador de células madre cancerosas, en presencia de una sustancia a analizar, y la célula madre cancerosa es la célula madre tisular humana derivada de tejido canceroso como se define en la reivindicación 4; y
una etapa de medición de un nivel de expresión del gen indicador,
en el que una disminución en el nivel de expresión del gen indicador indica que la sustancia a analizar es el fármaco antineoplásico eficaz contra la célula madre cancerosa.
11. Un método para producir un organoide de cultivo en el que se introduce un gen de interés en un locus genético de un gen marcador de células madre de una célula madre tisular humana, y el método comprende:
una etapa de introducción del gen de interés en el locus genético del gen marcador de células madre de un organoide cultivado que contiene la célula madre tisular humana mediante la edición del genoma y
una etapa de cultivo del organoide de cultivo después de introducir el gen de interés, donde el locus genético del gen marcador de células madre es un locus del gen Lgr5, donde el gen de interés se introduce en el exón 18 del locus del gen Lgr5.
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Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1530418A4 (en) * 2002-05-31 2005-10-12 Univ Leland Stanford Junior METHODS OF IDENTIFYING AND ISOLATING STEM CELLS AND CANCER STEM CELLS
EP2022848A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
WO2009142271A1 (ja) * 2008-05-21 2009-11-26 財団法人新産業創造研究機構 Ｓｌｄ５を高発現するがん幹細胞
WO2013062083A1 (ja) * 2011-10-28 2013-05-02 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞特異的分子
JP2015173601A (ja) * 2014-03-13 2015-10-05 大日本住友製薬株式会社 がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法
JP6214691B2 (ja) 2014-05-01 2017-10-18 采▲ぎょく▼科技股▲ふん▼有限公司ＶｉｓＥｒａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ 固体撮像装置
JP2016028569A (ja) * 2014-07-16 2016-03-03 学校法人慶應義塾 がん幹細胞集団の調製方法、異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤
CN104593512A (zh) * 2015-02-04 2015-05-06 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法
KR101911725B1 (ko) * 2017-01-16 2018-12-28 주식회사 코어파마 적색형광단백질을 발현하는 유전자 및 틴 에틸 에티오푸르푸린을 이용한 광역학 치료용 조성물 및 이를 이용한 광역학 치료방법

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