CN110494144A - 用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其具有改善的治疗或预防的效果和减少副的作用。本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物包含：选自由作为第1有效成分的甘油磷酸胆碱(G)及其药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物；和选自由作为第2有效成分的橙皮苷(H)、柚皮芸香苷(N)、及它们的药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物。该组合物促进再髓鞘化，促进α‑分泌酶的活性，并且也抑制β‑分泌酶的表达。

Description

用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物
技术领域
本发明涉及用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物。
背景技术
在正迎来超老龄化社会的如今，到医疗机构就诊的痴呆症患者的数量正急剧增加，根据2015年的世界阿尔茨海默报告，2015年在全世界中生存着4，680万人的痴呆症患者，预计到2050年为止将增加至1亿3，150万人。该数值每过20年就变为约2倍，警示痴呆症为在全球规模上带来危机的疾病。因此，当务之急为建立针对痴呆症有效果的治疗方法和预防方法。
占据作为痴呆症的原因中最多的阿尔茨海默病，虽然以进行性的痴呆为主要病情，但作为病理学特征而在脑内确认了多处老年斑、神经原纤维变化，也确认了由神经元的脱落导致的脑的萎缩，因此，认为阿尔茨海默病发病的原因为灰白质部位的神经细胞的变性和脱落。即，目前认为伴随着淀粉样蛋白前体蛋白质的代谢异常的脑内淀粉样蛋白β蛋白质的凝聚沉积(下文中，将淀粉样蛋白前体蛋白质表示为“APP”，将淀粉样蛋白β蛋白质表示为“Aβ”。)从而导致老年斑形成，而以该Aβ的凝聚沉积作为起因，引起神经原纤维变化的形成、神经元的消失、进而发生认知智力的降低。另外，已经明确显示在Aβ凝聚的过程中形成的可溶性Aβ低聚物与神经突触的减少有关，而神经突触的减少与痴呆症的严重程度密切相关。为此，已广泛研究了以减少Aβ特别是可溶性Aβ低聚物的表达量为目的的阿尔茨海默病的治疗方法和/或预防方法。
另一方面，近年来，报道了在阿尔茨海默病患者的脑中确认到白质异常，特别是髓鞘的减少明显，不仅在作为初期髓鞘形成部位的胼胝体压部、作为后期髓鞘形成部位的胼胝体膝部，就连海马CAI下部区域也可以观察到白质异常，提示了在轻度认知功能障碍和阿尔茨海默病中，白质部位的轴突变性和脱髓鞘为重要因素的可能性，因此，已经研究了以恢复脱髓鞘为目的的阿尔茨海默病的治疗方法和/或预防方法。
在非专利文献1(J neurosci Res 85：954-966，2007)中，报道了在由于适用老化及作为脱髓鞘诱导药Cuprizone而诱发的脱髓鞘之间，磷酸化髓鞘碱性蛋白，特别是经磷酸化的分子质量21.5kDa的髓鞘碱性蛋白(下文中，将髓鞘碱性蛋白表示为“MBP”，将磷酸化MBP表示为“p-MBP”，将分子质量为XkDa的MBP表示为“XkDaMBP”，将磷酸化的XkDaMBP表示为“p-XkDaMBP”)的量显著减少；以及，髓鞘形成的触发分子为免疫球蛋白Fc受体，Fc受体和Fyn的触发分子作为信号，调节小G蛋白(Rho)的开及关，进一步将作为其效应子的MAPK发生活化而促进MBP的磷酸化，使髓鞘膜叠层化，保持髓鞘的压缩，进一步，报道了通过人参养荣汤的施用实现了在Cuprizone处理小鼠及老年小鼠中的脱髓鞘的恢复，人参养荣汤实现了以FcRγ/Fyn-Rho(Racl)-MAPK(P38 MAPK)-p-MBP信号传导系统为目标的有效治疗。在该文献中，报道了在对31个月大的老年小鼠施用人参养荣汤2个月后，认定了如下脱髓鞘的恢复：作为脱髓鞘发展的量度的G-比值(轴突的直径，相对于轴突及轴突周围的髓鞘的直径的比例)的值从施用前的约0.82，降低至约0.73，与3个月大的小鼠(G-比值的值为约0.75)相媲美(参考该文献的图1C)。另外，在非专利文献2(Psychogeriatics 2015.[doi：10.1111/psyg.12125])中，报道了对用多奈哌齐效果不够的轻症～中症的阿尔茨海默病患者进行了人参养荣汤24小时的合用施用，结果与多奈哌齐单独组相比，确认到对保持认知功能和抑郁状态的有意义的改善。
在非专利文献3(Evid Based Complement Alternative Med.2011.[doi：10.1093/ecam/neq001])中，报道了在构成人参养荣汤的12种草药中，源自温州蜜柑的陈皮是将由老龄引起的脱髓鞘状态恢复的主要成分，以及脱髓鞘状态的恢复并非出于脱髓鞘的抑制而是通过其带来的再髓鞘化，进一步，报道了如果在作为上述陈皮的主要成分的橙皮苷和/或柚皮芸香苷的存在下培养向髓鞘发展的少突胶质细胞祖细胞，则与在陈皮的存在下培养的那些同样地使p-21.5kDaMBP的生成亢进，少突胶质细胞祖细胞的增殖、分化急速地进行。而且，在专利文献1(日本特开2008-127325号公报)中，提出了作为有效成分含有橙皮苷和/或柚皮芸香苷的p-MBP产生促进剂、及使用其的痴呆症的治疗和/或预防。需要说明的是，源自温州蜜柑的陈皮在橙皮苷和柚皮芸香苷这两者的含量多这点上，与源自橘(Mandarin orange)或其它柑橘类的陈皮不同。
在非专利文献4(新药和临床2015；64；1072-1083)中，报告了在由于缺少提供MBP的基因的外显子3-7因而发生了髓鞘发育不全的Shiverer小鼠的脑中，非Aβ产生途径被抑制，通过α-分泌酶切割APP而产生的被称为sAPPα的N末端片段不表达，以及，在施用人参养荣汤2个月的老年小鼠的脑中，p-21.5kDaMBP增加，且由在Aβ产生途径中生成的Aβ被诱导成的可溶性Aβ低聚物显著减少，根据上述实验结果，推测由于MBP的作用而使Aβ产生途径抑制，因而在使非Aβ产生途径促进而使得可溶性Aβ低聚物的产生受到抑制的同时，倾向于生成sAPPα。需要说明的是，Aβ产生途径是指：β分泌酶对APP进行切割而产生被称为sAPPβ的N末端片段、和被称为CTF-β的C末端片段，γ-分泌酶对该片段进行切割而产生Aβ和APP胞内结构域(AICD)的途径，非Aβ产生途径是指：α-分泌酶对APP进行切割而产生被称为sAPPα的N末端片段、和被称为CTF-α的C末端片段，γ-分泌酶对该片段进行切割而产生p3和AICD的途径。
另一方面，作为参与髓鞘化的物质，存在L-α-甘油磷酸胆碱或被称为α-GPC的甘油磷酸胆碱(下文中，将甘油磷酸胆碱表示为“α-GPC”)。α-GPC是在脑及乳汁中可见的天然化合物，α-GPC在胆碱代谢体系中，利用在作为髓鞘形成负责细胞的少突胶质细胞的细胞膜上存在的ENPP6(胆碱特异性的磷酸二酯酶)而被代谢为胆碱，生成的胆碱被用于少突胶质细胞的脂质合成中而髓鞘化发生进展(参考非专利文献5(Scientific reports|6：20995|Doi：10.1038/srep20995))。进而，已知该α-GPC具有认知功能改善效果。例如，在非专利文献6(Ann N Y Acad Sci.1994Jun 30；717：253-69)中，报道了对2，044人的脑卒中患者施用了1，000mg/天的量的α-GPC 28天，接着以口服方式施用了400mg/天的量5个月，结果患者的认知能力恢复，在非专利文献7(Clin Ther.2003Jan；25(1)：178-93)中，报道了对从轻度至中度的阿尔茨海默型痴呆症发病者将α-GPC以400mg胶囊×1日3次的量施用180天后，确定到认知功能的改善效果。另外，在专利文献2(EP1203584A1)中，提出了将乙酰基胆碱酯酶抑制剂和α-GPC的合用。
对α-GPC而言，除了认知功能改善效果以外，已经确认了生长激素分泌促进、肝功能障碍改善、血压降低、胆碱浓度降低改善等有用的效果，但也报告了有害的副作用。例如，在非专利文献6中，报道了在2.14％的患者中确认有害的副作用，0.7％有胃灼热，0.5％有恶心、呕吐，0.4％有失眠、亢奋，0.2％有头痛，及有0.7％的患者希望中止治疗。因此，虽然α-GPC是在体内可见的天然化合物，但需要说明的是，应该避免大量摄取α-GPC。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2008-127325号公报
专利文献2：EP1203584A1
非专利文献
非专利文献1：J neurosci Res 85：954-966，2007
非专利文献2：Psychogeriatics 2015.[doi：10.1111/psyg.12125]
非专利文献3：Evid Based Complement Alternative Med.2011.[doi：10.1093/ecam/neq001]
非专利文献4：新药和临床2015；64；1072-1083
非专利文献5：Scientific reports|6：20995|Doi：10.1038/srep20995
非专利文献6：Ann N Y Acad Sci.1994Jun 30；717：253-69
非专利文献7：Clin Ther.2003Jan；25(1)：178-93
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，由于作为人参养荣汤或源自温州蜜柑的陈皮的有效成分的橙皮苷和/或柚皮芸香苷而言，具有促进有用的p-MBP产生的作用，促进再髓鞘化，抑制有毒的可溶性Aβ低聚物的产生，因此，期待通过利用它们而对阿尔茨海默病有效的治疗和/或预防。但是，向来一直要求使治疗和/或预防的效果进一步提高，同时应该避免有害的副作用。
为此，本发明的目的在于提供能够满足上述要求的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物。
用于解决问题的方案
发明人首先对在非专利文献4中示出的MBP产生与sAPPα产生的关系进行了更详细的研究。作为阿尔茨海默病的疾病模型小鼠，使用了导入了人的瑞典移位型APP(APPK670N/M671L)基因的基因修饰小鼠Tg2576(下文中，称为“Tg2576小鼠”)，对于3个月大的年轻小鼠的脑、与可确认到Aβ的大量蓄积的28个月大的老年小鼠的脑之间的p-MBP的表达量的差异进行了调查，进一步，对在解整合素金属蛋白酶(A Disintegrin andMetalloprotease(ADAMs))之中也已知显示α-分泌酶活性的ADAM9与p-MBP的结合状态的差异进行调查时，将调查结果示于以下，但在老年小鼠的脑中，未确认到p-21.5kDaMBP的表达、也未确认到ADAM9与p-21.5kDaMBP的结合。根据该结果，判断了如果p-21.5DaMBP与ADAM9和结合，则ADAM9变得显示α-分泌酶活性，使sAPPα的产生得到促进。
另外，在将少突胶质细胞祖细胞使用仅含有α-GPC仅的培养液、仅含有橙皮苷和/或柚皮芸香苷的培养液、及除了α-GPC以外还含有橙皮苷和/或柚皮芸香苷的培养液进行培养时，发现在使用除了α-GPC以外还含有橙皮苷和/或柚皮芸香苷的培养液的情况下，少突胶质细胞祖细胞的增殖、分化变得显著。以上结果意味着，在非专利文献5中示出的ENPP6被橙皮苷和/或柚皮芸香苷活化，利用被活化的ENPP6而将α-GPC迅速代谢为胆碱，从而被利用于少突胶质细胞的分化、成熟中，这是迄今未知的作用。由此，可以期待通过α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的合用能够使再髓鞘化迅速发展而脱髓鞘发生恢复。
进而，在将在水中添加了橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的饮料、在水中添加了橙皮苷和柚皮芸香苷的饮料、及在水中添加了α-GPC的饮料给予26个月大的老年Tg2576小鼠时，与给予了含有橙皮苷和柚皮芸香苷的饮料的老年小鼠的脑及给予了含有α-GPC的饮料的老年小鼠的脑相比，可知在给予了含有橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的饮料的老年小鼠的脑中，p-21.5kDaMBP的表达量显著增加。该显著增加的表达量，即使与通过施用含有橙皮苷和柚皮芸香苷的饮料而增加的表达量与通过施用含有α-GPC的饮料而增加的表达量加和而成量相比，也是显著的，因此确认了橙皮苷和/或柚皮芸香苷与α-GPC的协同效果。在给予了含有橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的饮料的老年小鼠的脑中，由于该p-21.5kDaMBP的表达量的显著增加，一方面，如从上述体外的实验结果所期待的那样，使再髓鞘化显著地发展而脱髓鞘发生恢复，另一方面，该显著增加的p-21.5kDaMBP与ADAM9结合而使α-分泌酶活性促进，使在非Aβ产生途径中的sAPPα的产生显著亢进。
而且，与给予含有橙皮苷和柚皮芸香苷饮料的老年小鼠的脑及给予含有α-GPC饮料的老年小鼠的脑相比，可知将给予含有橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的饮料的老年小鼠的脑中作为β-分泌酶之一的BASE1的表达量显著减少，与此相随，有毒的可溶性Aβ低聚物的表达量显著减少。该显著减少的BASE1及可溶性Aβ低聚物的表达量，即使与通过施用含有橙皮苷和柚皮芸香苷的饮料的减少的表达量与通过施用含有α-GPC的饮料的减少的表达量加和而成的量相比，也是显著的。认为利用α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的协同效果，再髓鞘化迅速地进行发展而脑的损伤发生恢复，因此，BASE1的表达量显著减少，可溶性Aβ低聚物的表达量也显著减少。
因此，本发明涉及用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其促进再髓鞘化，促进α-分泌酶的活性且抑制β-分泌酶的表达，
所述组合物包含：
选自由作为第1有效成分的甘油磷酸胆碱及其药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物；及
选自由作为第2有效成分的橙皮苷、柚皮芸香苷、及它们的药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物。
在本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物中，由于α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的协同效果，因此，能够将例如非专利文献6中报道了有害的副作用的α-GPC的每日施用量大幅减少。对本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物而言，作为成人每人的每日施用量，优选含有10～120mg的第1有效成分和30～100mg的第2有效成分。对每1日10～120mg的α-GPC的使用量而言，是非专利文献6中的初期使用量的1/8以下，后期使用量的1/3以下的量，是非专利文献7中的使用量的1/10以下的量。
在本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物中，优选作为第2有效成分包含橙皮苷和柚皮芸香苷这两者，也可以将橙皮苷和柚皮芸香苷分别与α-GPC组合，也可以将橙皮苷和柚皮芸香苷以源自温州蜜柑的陈皮或该陈皮的提取物的形式进行添加。源自温州蜜柑的陈皮大量包含橙皮苷和柚皮芸香苷这两者，可以将两者简便地添加。
在将本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物进行制剂化的情况下，只要是包含第1有效成分和第2有效成分这两者的复合剂的形式即可，也可以是由包含第1有效成分的药剂和包含第2有效成分的药剂而形成的试剂盒的形式。在构成复合剂及试剂盒的各剂中，在对本发明的效果不造成不良影响的范围内，也可以包含第1有效成分及第2有效成分以外的成分。在为试剂盒的形式的情况下，对施用的顺序没有限制，可以先施用任一种药剂。
本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，也可以以口服及非肠胃给药的任意形式进行施用，可以以医药品、准药、保健食品(包括补充剂)等形式施用。本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物由于不用担心有害的副作用，因此能够连续地施用，从方便的角度出发优选作为保健食品而口服施用。
发明的效果
在本发明中，通过第1有效成分与第2有效成分的协同效果，p-21.5kDaMBP的表达量显著增加，通过该显著的增加，使再髓鞘化显著亢进而脱髓鞘发生恢复，另外，使α-分泌酶活性促进而使sAPPα的产生显著亢进，而且，伴随脱髓鞘的恢复，β-分泌酶的表达量减少，从而使Aβ的产生显著得到抑制。因此，实现阿尔茨海默病的有效的治疗和/或预防。
附图说明
[图1]调查阿尔茨海默病的疾病模型小鼠的脑中的p-MBP及ADAM9的表达的结果，(a)示出了基于免疫印迹法的p-MBP及ADAM9的检测结果，(b)示出了p-MBP及ADAM9的存在量。
[图2]将少突胶质细胞祖细胞在含有α-GPC、橙皮苷、柚皮芸香苷或它们的组合的培养容器中进行培养，观察少突胶质细胞祖细胞的增殖、分化的状态的相差显微镜照片，倍率为400倍。
[图3]为示出将少突胶质细胞祖细胞在含有α-GPC、或α-GPC和橙皮苷的培养液中培养之后，使用作为少突胶质细胞的分化标记的O1抗体实施了免疫染色，算出的O1阳性少突胶质细胞的数量相对于总细胞数的比例的结果的图。
[图4]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC(G饮料)、陈皮干燥提取物(HN饮料)、及两者(GHN饮料)时的脑中的p-21.5kDaMBP的存在量的调查结果的图。
[图5]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脑中的成熟型ADAM9的存在量的调查结果的图。
[图6]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脑中的sAPPα的存在量的调查结果的图。
[图7]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脑中的CTF-α的存在量的调查结果的图。
[图8]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脑中的BASE1的存在量的调查结果的图。
[图9]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脑中的Aβ低聚物的存在量的调查结果的图。
[图10]为示出对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脱髓鞘恢复的情形的电子显微镜照片，倍率为19000倍。
[图11]为示出将对阿尔茨海默病的疾病模型小鼠施用了α-GPC、陈皮干燥提取物、及两者时的脱髓鞘恢复的情形利用G-比值的值进行评价的结果的图。
具体实施方式
本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其包含：
选自由作为第1有效成分的甘油磷酸胆碱及其药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物，及
选自由作为第2有效成分的橙皮苷、柚皮芸香苷、及它们的药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物。
与仅使用第1有效成分或仅使用第2有效成分相比，通过第1有效成分与第2有效成分的合用，p-21.5kDaMBP的表达量显著增加。该增加的表达量，即使与仅使用第1有效成分时的表达量与仅使用第2有效成分时的表达量加和而成的量相比，也是显著的。通过该显著的p-21.5kDaMBP的表达量的增加，一方面，使再髓鞘化显著亢进而脱髓鞘发生恢复，另一方面，该显著增加的p-21.5kDaMBP和ADAM9发生结合而促进α-分泌酶活性，使非Aβ产生途径中的sAPPα的产生显著亢进。另外，伴随脱髓鞘的恢复，β-分泌酶的表达受到抑制，在Aβ产生途径中的Aβ的产生受到显著抑制。
作为第1有效成分的α-GPC，可以通过例如利用大豆的榨油、纯化得到的磷脂酰胆碱利用脂肪酶进行水解而合成，也可以取得市售的那些。α-GPC可以以药理学上允许的盐，例如：盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、碳酸盐的形式使用，也可以以溶剂合物的形式使用。对作为第2有效成分的橙皮苷及柚皮芸香苷而言也是，可以取得市售的那些、也可以以药理学上允许的盐，例如：盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、碳酸盐的形式使用，也可以以溶剂合物的形式使用，进一步，为了使水溶性提高，也可以以糖转移体的形式使用。糖转移体在体内被水解为橙皮苷或柚皮芸香苷。另外，也可以使用作为有效成分包含橙皮苷及柚皮芸香苷的源自温州蜜柑的陈皮、或对该陈皮实施热水提取等提取处理实施而得到的提取物。由于热水提取液干燥后作为干燥提取物进行市售，因此，使用干燥提取物是简便的。也可以利用除了温州蜜柑以外的柑橘类的干燥物或其提取物。
在本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物中，将第1有效成分与第2有效成分以期望量进行组合，它们可以以口服及非肠胃给药的任意形式施用，也可以医药品、准药、保健食品(包括补充剂)等形式施用。本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物由于不具有有害的副作用，因此能够连续地施用，从方便的角度出发优选作为补充剂而口服施用。
在进行制剂化的情况下，只要是第1有效成分与第2有效成分的复合剂的形式即可，也可以是包含第1有效成分的药剂和包含第2有效成分的药剂而形成的试剂盒的形式。在为试剂盒的形式的情况下，对施用的顺序没有限制，可以先施用任一种剂，各剂可以连续地施用，也可以隔开时间而施用。
在为复合剂的情况下、为构成试剂盒的各剂的情况下，均可以根据使用目的而制剂化为胶囊剂、咀嚼剂、片剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆剂等口服施用用制剂，或注射剂、点滴剂、栓剂等非口服给药用制剂的形式。在为试剂盒的形式的情况下，各剂的剂型可以相同也可以不同。
在这些制剂的制造中，第1有效成分和第2有效成分通常与使用目的而选择的药理学允许的赋形剂，即，糊精、乳糖等固体赋形剂，水、盐水、甘油等液体赋形剂进行混合而进行剂型化为给定形状。在这些制剂中，在对本发明的效果不造成不良影响的范围内，也可以包含其它成分，例如：维生素C、维生素E等维生素类，铁、锌等矿物质类，银杏叶提取物，二十二碳六烯酸等功能性成分，除此以外，粘合剂、增稠剂、润滑剂、香料、甜味料、缓冲剂、保存剂、抗菌剂等常用的添加物。
进一步，本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物也可以配合在矿泉水、软饮料等饮料，奶酪、酸奶等乳制品，果冻、饼干、糖果等点心类等各种食物和饮料中。
本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物的施用量，可以根据阿尔茨海默病患者的病情、年龄、体重等、施用形式、施用次数、与其他制剂的合用等而适当确定，作为成人每人的每日施用量，通常优选在第1有效成分为10～120mg、第2有效成分为30～100mg的范围内组合。作为第2有效成分而使用橙皮苷和柚皮芸香苷的两者的情况下，优选在α-GPC为10～120mg、橙皮苷为20～75mg、柚皮芸香苷为4～35mg的范围内组合。在本发明中，即使是这样的少量施用也可以期待充分的改善效果，另外，有害的副作用也得以避免。
本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物由于促进再髓鞘化，促进α-分泌酶的活性且抑制β-分泌酶的表达，因此，可期待迅速的阿尔茨海默病的治疗和/或预防的效果。另外，由于促进再髓鞘化，因此，本发明的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物也可以有效地用于多发性硬化症、轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病以外的痴呆症、精神分裂症、急性播散性脑脊髓炎、炎症性弥漫性硬化症、急性或亚急性坏死性脑脊髓炎等脱髓鞘疾病的治疗和/或预防中。
实施例
使用以下实施例说明本发明，但本发明并不限于以下实施例。
(A)动物、饲养环境
在以下实验中使用的导入了人的瑞典移位型APP(APPK670N/M671L)基因的基因修饰小鼠Tg2576从美国的The Jackson Laboratory得到。对于该小鼠，已知由于APP过量表达，因此在脑中Aβ在9个月大以后大量蓄积，此外，在24个月大以后发生基于年龄增加的脱髓鞘。将得到的Tg2576小鼠，利用室温25±1℃，相对湿度55±1％的饲养设施，在12小时/12小时明暗的照明循环(7：00开灯，19：00熄灯)的环境中饲养。需要说明的是，该动物实验遵照了基于设定了实验动物的合理的使用及管理的NIH指导方针而制成的庆应义塾大学动物实验指导方针，利用所述大学内的动物实验设施进行。
(B)实验1：p-MBP与ADAM9的关系
虽然在非专利文献4中示出了发生了髓鞘发育不全的Shiverer小鼠的脑中，非Aβ产生途径受到抑制而sAPPα不表达，但细节尚不清楚，因此，通过以下实验，通过使用了抗MBP单克隆抗体的免疫共沉淀法和使用了抗p-MBP单克隆抗体或抗ADAM9多克隆抗体的免疫印迹法的组合调查了已知显示α-分泌酶活性的ADAM9与p-MBP的关系。
(1)实验步骤
(a)基于表面活性剂的脑的溶解
将在脑中几乎未蓄积Aβ也未发生脱髓鞘的3个月大的Tg2576小鼠，及在脑中大量蓄积Aβ并发生了脱髓鞘的28个月大的Tg2576小鼠，分别利用异氟烷(和光纯药工业株式会社)在吸入麻醉下进行安乐死，立即开颅摘出全脑。测定摘出的脑的重量，对于脑重量每1g添加了经冰冷却的磷酸缓冲生理盐水(PBS)10mL，进一步，添加在100x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(默克株式会社)的100倍稀释液中添加了1％浓度的聚(氧乙烯)辛基苯基醚(商品名；Triton(注册商标)X-100：Sigma Aldrich Japan株式会社)而成的液体10mL之后，使用均化器将脑溶解。将得到的脑均浆悬浊液回收到1.5mL的Eppendorf管中，在4℃，100000rpm的条件下离心分离30分钟。
(b)免疫共沉淀法
向在上述(a)工序中得到的离心后的上清液(蛋白质浓度1mg/管)200μL中，加入浓度200μg/mL的抗MBP单克隆抗体SMI-99(Merck Millipore公司)20μL，于4℃过夜搅拌同时使其反应，形成了抗原-抗体复合物。进一步，加入固定化有蛋白A的Sepharose珠(商品名二蛋白A-Sepharose(注册商标)：Sigma Aldrich Japan株式会社)50μL，于4℃过夜搅拌同时使其反应，使上述抗原-抗体复合物吸附至上述Sepharose珠。然后，将得到的悬浊液在4℃，12000rpm的条件下离心15分钟，废弃上清液之后，向沉淀添加800μL的洗涤液(10mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、0.005％聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯(商品名：Tween-20)：全部来自Sigma Aldrich Japan株式会社)，进行缓慢吹打之后，在4℃，12000rpm的条件下离心分离15分钟。将从添加上述洗涤液至离心为止的步骤再重复2次后，向沉淀添加2x十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(0.125M Tris-HCl(pH 6.8)(和光纯药株式会社)、20％丙三醇(和光纯药工业株式会社)、4％SDS(和光纯药工业株式会社)、10％2-巯基乙醇(NacalaiTesque株式会社)、0.004％溴酚蓝(Sigma Aldrich Japan株式会社))50μL，于100℃加温5分钟，然后在4℃，14000rpm的条件下离心15分钟，得到了包含上述抗原-抗体复合物的上清液。
(c)电泳(SDS-PAGE)
对SDS-PAGE而言，使用4～20％梯度凝胶(特富科株式会社)进行。将凝胶板安装至电泳装置，引入泳动缓冲液。接着，将利用上述(b)工序得到的包含抗原-抗体复合物的上清液25μL引入凝胶板的孔中，利用室温在5mA的条件下电泳约30分钟，进一步在25mA的条件下电泳约90分钟。
(d)免疫印迹法
将聚偏氟乙烯(PVDF)膜(商品名；Immobilon-P：孔径0.45μm：Merck Millipore公司)转印液(31mM Tris(Nacalai Tesque株式会社)引入0.24M甘氨酸(Sigma AldrichJapan株式会社)、20％甲醇(和光纯药工业株式会社))中振荡15分钟，使回收的PVDF膜与利用上述(c)工序得到的电泳之后的凝胶接触，利用室温在20mA/cm2的条件下施加电流，将蛋白质转印在PVDF膜上。将转印后利用考马斯亮蓝(和光纯药工业株式会社)进行染色而经干燥的PVDF膜，使用将在10倍稀释的10x Tris缓冲生理盐水(TBS)(0.5M Tris(pH 8.1)(Nacalai Tesque株式会社)、1.5M NaCl(Sigma Aldrich Japan株式会社)、1N盐酸(和光纯药株式会社))中溶解了5％的脱脂奶粉(Defco株式会社)而成的封闭缓冲液，利用室温实施了1小时封闭处理。
向封闭处理后的PVDF膜，作为一次抗体，使用针对作为内标的β肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich Japan株式会社，1/1000稀释)，以及抗p-MBP单克隆抗体PC12(Merck Millipore公司，1/500稀释)或抗ADAM9多克隆抗体C-15(Santa CruzBiotechnology公司，1/500稀释)，于4℃过夜，施行了一次抗体反应。在稀释中使用了上述封闭缓冲液。将一次抗体反应后的PVDF膜，使用在10倍稀释的10x TBS中溶解了1％的脱脂奶粉而成的封闭缓冲液洗涤3次。接下来，使用用封闭缓冲液稀释至800～1000倍的碱性磷酸酶缀合亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson Immuno Research Laboratories公司)或碱性磷酸酶缀合亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research Laboratories公司)，利用室温进行二次抗体反应2小时，使用在10倍稀释的10x TBS中溶解了1％的脱脂奶粉而成的封闭缓冲液，每10分钟洗涤3次之后，进行了基于碱性磷酸酶反应的抗原的检测。对碱性磷酸酶反应而言，使用作为碱性磷酸酶的底物的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(和光纯药工业株式会社)、作为生色剂的硝基蓝四唑(和光纯药工业株式会社)、缓冲液(0.1MTris(Nacalai Tesque株式会社)、0.1M NaCl(Sigma Aldrich Japan株式会社)，0.05MMgCl2(Sigma Aldrich Japan株式会社))，通过在遮光下反应30分钟～1小时而进行。另外，对抗原的检测结果而言，以3次独立实验的平均值±标准误差进行了评价。
(2)实验结果
图1示出在利用上述(a)～(d)的工序而调查的3个月大的Tg2576小鼠的脑、和28个月大的Tg2576小鼠的脑中的p-MBP和ADAM9的存在量的结果的图。图1(a)示出利用碱性磷酸酶反应检测的p-MBP及ADAM9的PVDF膜的图像，图1(b)示出从图1(a)的图像得到的利用作为内标的β肌动蛋白进行标准化后的p-MBP及ADAM9的存在量。
Tg2576小鼠具有分子质量为14kDa、17.5kDa、18.5kDa及21.5kDa的4个MBP亚型。从图1(b)可知，在3个月大的Tg2576小鼠的脑中，这4个亚型全部处于表达中，与此相对，在28个月大的Tg2576小鼠的脑中，越高分子质量的亚型表达量越小，完全确认不到p-21.5kDaMBP的表达。另外，可知与使用了3个月大的Tg2576小鼠的脑的实验中检测的ADAM9的存在量相比，在使用了28个月大的Tg2576小鼠的脑的实验中检测的ADAM9的存在量显著更小，几乎未检测到ADAM9。从这些结果可知，在Tg2576小鼠的脑中，p-MBP特别是p-21.5kDaMBP与ADAM9发生结合。己知ADAM9的细胞质结构域通过与接合蛋白质进行结合而对酶活性进行调节，因此，认为p-MBP特别是p-21.5kDaMBP通过与ADAM9的细胞质结构域结合，将ADAM9转换为成熟型而变得倾向于显示α-分泌酶活性，使sAPPα的产生得以促进。
(C)实验2：在体外中的α-GPC与橙皮苷/柚皮芸香苷的合用效果的确认
将胚胎18天的小鼠的大脑，利用0.3％的中性蛋白酶II和0.05％的脱氧核糖核酸(均来自Roche Molecular Biochemicals公司)的混合溶液(利用Dulbecco修饰Eagle培养基(DMEM；Invitrogen公司)稀释)而进行利用酶的分散，将得到的分散细胞利用DMEM进行洗涤后，将解离的细胞通过孔径70μm的尼龙网。接着，将细胞悬浊于含有10％的胎牛血清的DMEM中后，以每皿2.0×107个的细胞密度接种在聚-L-赖氨酸包被培养皿(直径10cm)上，培养了5天。接着，将培养后的细胞用包含0.2％的胰蛋白酶的PBS剥离，在4℃，1000转的条件下离心10分钟，将沉淀以每1mL 2.5×106个的细胞密度悬浊于10mL的无血清培养基(在DMEM中，添加了葡萄糖(5.6mg/ml)、卡那霉素(60mg/ml)、胰岛素(5μg/ml)、转铁蛋白(0.5μg/ml)、BSA(100μg/ml)、孕激素(0.06ng/ml)、腐胺(16μg/ml)、亚硒酸钠40ng/ml)、甲状腺素(T4)(40ng/ml)及三碘甲状腺氨酸(T3)(30ng/ml)而成的培养基)，在CO2培养箱中于37℃培养2小时，得到了少突胶质细胞祖细胞(OPC)。
接着，将得到的OPC以每皿2.5×106个的细胞密度接种于引入有上述无血清培养基的无包被培养皿(直径10cm)上，进一步添加仅PBS(对照)、包含橙皮苷(H)的PBS、包含柚皮芸香苷(N)的PBS、包含橙皮苷和柚皮芸香苷的PBS、包含α-GPC(G)的PBS、包含橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的PBS中的任一个，培养了48小时。调整培养基中的橙皮苷、柚皮芸香苷、及α-GPC的量使得最终浓度分别为10μM。
图2中示出对48小时之后的细胞的状态进行拍摄的相差显微镜照片，倍率为400倍。在利用包含10μM的橙皮苷、10μM的柚皮芸香苷或10μM的α-GPC的培养基进行培养的情况下，可知与对照相比，在细胞数增加的同时，产生了以箭头所示的突起，进行了OPC的增殖、分化。在使用包含橙皮苷和柚皮芸香苷各10μM的培养基培养的情况下，OPC的增殖、分化发生了亢进。认为该效果是由于使用了以合计20μM的浓度包含了第2有效成分(橙皮苷/柚皮芸香苷)的培养基。在使用以各10μM包含橙皮苷和柚皮芸香苷和α-GPC的培养基进行培养的情况下，如箭头所示的那样，OPC的分化、成熟发生了显著亢进。这意味着，ENPP6被橙皮苷和/或柚皮芸香苷活化，利用被活化的ENPP6而将α-GPC迅速代谢为胆碱，从而被利用于少突胶质细胞的分化、成熟中。
为了进一步确认合用效果，将上述OPC以每皿2.5×106个的细胞密度接种于引入有上述无血清培养基的无包被培养皿(直径10cm)上，进一步添加包含仅PBS(对照)、α-GPC的PBS、或包含α-GPC和橙皮苷的PBS，培养了48小时。调整培养基中的橙皮苷及α-GPC的量，使得各自的最终浓度为0.1mM或1mM。然后，使用作为少突胶质细胞的分化标记的O1抗体进行免疫染色，在显微镜下分别计数一个视野中的全部细胞的数量和O1阳性少突胶质细胞的数量，算出O1阳性少突胶质细胞的数量相对于全部细胞的数量的比例。将结果示于图3。
如从图3可了解的那样，在使用以0.1mM包含α-GPC的培养基进行培养的情况下，即使与对照相比，O1阳性少突胶质细胞也几乎没有增加，通过向培养基中添加0.1mM橙皮苷，O1阳性少突胶质细胞的比例急剧增加，增加至超过在使用以1mM包含α-GPC的培养基进行培养的情况下的增加量的一半。即使在向以1mM包含α-GPC的培养基中进一步添加1mM橙皮苷的情况下，也确认了O1阳性少突胶质细胞的显著增加。因此，确认了通过将α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的合用，能够迅速地使得分化、成熟为少突胶质细胞。根据这些结果，可期待α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的合用使再髓鞘化迅速发展而脱髓鞘发生恢复。
(D)实验3：α-GPC/陈皮的施用与p-21.5kDaMBP/成熟型ADAM9/sAPPα/CTF-α/BASE1/Aβ低聚物的表达量的关系
根据上述实验1的结果，期待如果p-21.5kDaMBP的表达量增加，则促进ADAM9的α-分泌酶活性，因此使非Aβ产生途径中的sAPPα的产生亢进，使Aβ产生途径中的Aβ的产生受到抑制而抑制有毒的可溶性Aβ低聚物的产生，因此，通过以下实验调查了α-GPC/陈皮的施用与p-21.5kDaMBP/成熟型ADAM9/sAPPα/CTF-α/BASE1/Aβ低聚物的表达量的关系。
(1)实验步骤
(aa)α-GPC/陈皮的施用
使用陈皮干燥提取物(每1g含有橙皮苷20.8mg、柚皮芸香苷3.38mg：内田和汉药株式会社)、含有α-GPC 85％的粉末(日油GPC85R：日油株式会社)，准备了将α-GPC以0.017w/v％的浓度以及将陈皮干燥提取物以0.5w/v％的浓度(橙皮苷；0.0104w/v％：柚皮芸香苷0.0017w/v％)溶解于蒸馏水而成的GHN饮料(实施例)，将陈皮干燥提取物以0.5w/v％的浓度溶解于蒸馏水而成的HN饮料(比较例1)，及将α-GPC以0.017w/v％的浓度溶解于蒸馏水而成的G饮料(比较例2)。将26个月大的老年Tg2576小鼠(平均体重30g)分为4组，对各个组以2个月利用自由饮水而给予了GHN饮料、HN饮料、G饮料或作为对照的水(平均饮水量4mL/天)。在该施用实验中的α-GPC、橙皮苷及柚皮芸香苷的施用量，如果使用换算人和小鼠之间的种间差异的系数“10”(参考“Regul.Toxicol.Pharmacol.24，108-120”)而换算成对成人50kg的施用量，则为α-GPC为113.3mg/天、橙皮苷为69.3mg/天及柚皮芸香苷为11.3mg/天的施用量。在2个月自由饮水后，使用异氟烷(和光纯药工业株式会社)在吸入麻醉下将施用了GHN饮料的小鼠、施用了HN饮料的小鼠、施用了G饮料的小鼠、及对照小鼠安乐死，立即开颅之后摘出全脑，于-80℃保存直至使用时。
(bb)基于表面活性剂的脑的溶解
使用处于保存的GHN饮料施用小鼠、HN饮料施用小鼠、G饮料施用小鼠及对照小鼠的脑，利用与通过实验1的(a)工序所示的步骤相同的步骤进行了脑均浆悬浊液的制备及离心，在离心之后，将上清液以可溶性级分、将沉淀以不溶性级分形式进行分离，保存于-80℃。
(cc)电泳(SDS-PAGE)
将通过上述(bb)工序得到的可溶性级分利用4x SDS样品缓冲液(0.0625M Tris-HCl(pH 6.8)(和光纯药工业株式会社)、10％丙三醇(和光纯药工业株式会社)、2％SDS(和光纯药工业株式会社)、5％2-巯基乙醇(Nacalai Tesque株式会社)、0.002％溴酚蓝(SigmaAldrich Japan株式会社))稀释至4倍，在100℃的恒温槽中放置10分钟，得到了SDS-PAGE用样品。使用得到的SDS-PAGE用样品，利用与通过实验1的(c)工序所示的步骤相同的步骤进行了SDS-PAGE。
(dd)免疫印迹法
使用利用上述(cc)工序得到的电泳后的凝胶，利用与通过实验1的(d)工序所示的步骤相同的步骤，将蛋白质转印至PVDF膜，接着进行了在一次抗体反应前的封闭处理。接着，将封闭处理之后的PVDF膜的一次抗体反应于4℃过夜进行。使用的抗体：识别APP的N末端的小鼠单克隆抗体22C11(Merck Millipore公司，1/600稀释)、识别Aβ1-16的小鼠单克隆抗体6E10(Covance公司，1/1000稀释)、识别Aβ17-24的小鼠单克隆抗体4G8(Covance公司，1/500稀释)、识别BASE1的C末端的抗体(Calbiochem公司，1/500稀释)、识别ADAM9的金属肽酶结构域的抗体(Bethyl Laboratories公司，1/500稀释)、针对内标的β肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma Aldrich Japan株式会社，1/1000稀释)及抗p-MBP单克隆抗体PC12(MerckMillipore公司，均为1/500稀释)。在各抗体的稀释中，使用了在经10倍稀释的10xTBS中溶解5％的脱脂奶粉而成的封闭缓冲液。在一次抗体反应之后，使用在经10倍稀释的10xTBS中溶解了1％的脱脂奶粉溶解而成的封闭缓冲液，每10分钟洗涤3次。接着使用利用封闭缓冲液稀释至800倍的碱性磷酸酶缀合亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，利用室温进行二次抗体反应2小时，使用将在经10倍稀释的10x TBS中溶解1％的脱脂奶粉而成的封闭缓冲液每10分钟3次洗涤之后，利用与实验1的(d)工序中所示的步骤相同的步骤，进行了基于碱性磷酸酶反应的抗原的检测。对抗原的检测结果而言，以3次独立实验的平均值±标准误差进行了评价。
(2)实验结果
图4为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的p-21.5kDaMBP的存在量的图。如根据图4可了解的那样，p-21.5kDaMBP的表达量，虽然通过G饮料(比较例2)的施用而增加至约6倍、通过HN饮料(比较例1)的施用而增加至约10倍，但基于GHN饮料(实施例)的施用的增加量显著，为约25倍。即，通过GHN饮料的施用增加的表达量，即使与通过HN饮料的施用增加的表达量和通过G饮料的施用增加的表达量加和而成的量相比也是显著的，确认了α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的协同性作用。
图5为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的成熟型ADAM9的存在量的图。如根据实验1的结果可理解的那样，如果p-MBP，特别是p-21.5kDaMBP与ADAM9的细胞质结构域结合，则ADAM9成为成熟型，倾向于显示α-分泌酶活性。进而，对成熟型ADAM9的表达量而言，通过G饮料(比较例2)的施用增加至约1.45倍，通过HN饮料(比较例1)的施用增加至约1.60倍，通过GHN饮料(实施例)的施用增加至约1.73倍。这是如根据图4可了解的那样，反映了通过α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的协同性作用，p-MBP，特别是p-21.5kDaMBP显著增加的结果。图6为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的sAPPα的存在量的图，图7为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的CTF-α的存在量的图。对sAPPα及CTF-α而言，通过在非Aβ产生途径中α-分泌酶对APP进行切割而表达。如根据图6可了解的那样，对sAPPα的表达量而言，通过G饮料(比较例2)的施用增加至约5.2倍、通过HN饮料(比较例1)的施用增加至约6.4倍、通过GHN饮料(实施例)的施用也增加至约11.4倍，如图7可了解的那样，对CTF-α的表达量而言，通过G饮料(比较例2)的施用增加至约4.6倍、通过HN饮料(比较例1)的施用增加至约6.0倍、通过GHN饮料(实施例)的施用也增加至约8.4倍。从而，图6示出的sAPPα的表达量与图4示出的p-21.5kDaMBP的表达量为良好相关，确认了α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷对于α-分泌酶活性的促进的协同性作用。与图6示出的基于α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的合用的sAPPα的表达量的增加、或图7示出的基于α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的合用的CTF-α的表达量的增加相比，图5示出的基于α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的合用成熟型ADAM9的表达量的增加较少。对显示α-分泌酶活性的ADAMs而言，除了ADAM9以外也存在多种(例如：ADAM10、ADAM17)，由于这些ADAMs全部的表达量显著增加，因此，可认为sAPPα及CTF-α的表达量显著增加了。
图8为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的β分泌酶之一的BASE1的存在量的图，图9为将在对照小鼠的脑中的存在量作为1而得的存在量比的形式，所示出以利用内标的β肌动蛋白进行标准化后的Aβ6聚体(表示为“6-mer”)的存在量的图。6-mer为Aβ凝聚开始的核心肽，为已提示与认知功能障碍的相关性较强的可溶性Aβ低聚物的一种，以6-mer为核心进一步进行聚合则生成毒性高的可溶性12-mer和老年斑。如根据图8可了解的那样，对BASE1的表达量而言，通过G饮料(比较例2)的施用减少至约0.96倍、通过HN饮料(比较例1)的施用仅减少至约0.87倍、通过GHN饮料(实施例)的施用减少至约0.53倍，如根据图9可了解的那样，对6-mer的表达量而言，通过G饮料(比较例2)的施用减少至约0.73倍、通过HN饮料(比较例1)的施用仅减少至约0.82倍、通过GHN饮料(实施例)的施用减少至约0.34倍，确认了α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的协同性作用。特别是，由α-GPC与橙皮苷及柚皮芸香苷的合用造成的BASE1的减少效果是显著的，认为这反映了脱髓鞘的恢复。即，BASE1不是在神经元中的特异性酶而是在星形胶质细胞中较多表达，虽然已知在阿尔茨海默病患者的脑中在反应性星形胶质细胞中确认到BASE1的表达，但该反应性星形胶质细胞是在脑受到损伤时表达的。示于以下，认为利用α-GPC与橙皮苷和/或柚皮芸香苷的协同效果，迅速地进行再髓鞘化的发展而恢复脱髓鞘，因此，反应性星形胶质细胞的表达受到抑制，与此相随，BASE1的表达量显著减少，并且可溶性Aβ低聚物的表达量也显著减少。
根据以上的结果，可知利用本发明的包含α-GPC和橙皮苷及柚皮芸香苷的组合物时，这些有效成分进行协同性作用，而p-21.5kDaMBP的表达量显著增加，一方面，通过与该显著增加的p-21.5kDaMBP的结合而使ADAM9的α-分泌酶活性促进，使sAPPα及CTF-α的产生得到显著促进，另一方面，BASE1的表达受到抑制，使Aβ的产生途径、进而使已提示与认知功能障碍的相关性较强的可溶性Aβ低聚物的产生受到显著抑制。因此，本发明的组合物用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防极其有效。
(E)实验4：α-GPC/陈皮的施用与再髓鞘化的关系
通过以下实验调查了由α-GPC及陈皮的施用造成的对再髓鞘化的影响。
(1)实验步骤
利用电子显微镜观察了在实验2的(aa)工序中保存起来的GHN饮料施用小鼠、HN饮料施用小鼠，G饮料施用小鼠、及对照小鼠的大脑。将各小鼠的大脑利用2％戊二醛进行前固定，并利用1％OsO4进行后固定。将样本在乙醇中进行脱水后，包埋在环氧树脂(商品名；Quetol 812：日新EN株式会社)中，得到利用2％乙酸铀酰及铅溶液染色的极薄片，利用电子显微镜对其在倍率19000倍下进行观察。为了进行G-比值(轴突的直径，相对于轴突及轴突周围的髓鞘的直径的比例：参考图11)的测定，每组使用至少3只小鼠而对每只小鼠拍摄了8～10枚电子显微镜照片，针对至少90个轴突测定了G-比值，算出平均值和标准偏差。
(2)实验结果
图10示出了各小鼠的脑的电子显微镜照片。p-MBP具有将轴突的周围的髓鞘膜叠层化，保持髓鞘的压缩的作用，但根据图10可知，在对照小鼠的脑中，以箭头示出的髓鞘膜的压缩是不充分的，脱髓鞘正在发展，与此相对，确认了通过G饮料(比较例2)的施用及HN饮料(比较例1)的施用，有再髓鞘化进行发展而脱髓鞘状态恢复的倾向，通过GHN饮料(实施例)的施用而使得再髓鞘化进一步发展从而显著确认到脱髓鞘的恢复。在图11中，示出了根据电子显微镜照片求出的G-比值的值。由于如果在轴突的周围，髓鞘膜发生叠层化而被压缩，则G-比值的值变小，因此，G-比值的值的减少成为脱髓鞘恢复的量度。如根据图11可了解的那样，在对照小鼠的大脑中的G-比值的值为约0.83，在G饮料施用小鼠及HN饮料施用小鼠的大脑中的G-比值的值为约0.74，与在非专利文献1中的通过人参养荣汤的施用得到的G-比值的值类似，在GHN饮料施用小鼠的大脑中的G-比值的值进一步减少，减少至约0.69。该值接近与正常小鼠的大脑中的G-比值的值等同，得到了惊人的结果。认为其原因是如上所述那样引导了BASE1的显著的减少，进而引导了可溶性Aβ低聚物的显著的减少。
根据以上的结果，可知利用本发明的包含α-GPC和橙皮苷及柚皮芸香苷的组合物时，这些有效成分进行协同性作用，使再髓鞘化显著亢进而确认到脱髓鞘的恢复。因此，本发明的组合物用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防极其有效。
(F)认知功能改善效果的确认
作为一天的施用量，制备了包含橙皮苷和柚皮芸香苷合计70mg、α-GPC 40mg的片剂，对受试者施用2.5～4个月，评价了长谷川式痴呆症量表(HDS-R)的得分。HDS-R以30分为满分进行评价，为一种若为20分以下则疑似痴呆症，在确认为痴呆症的情况下将20分以下判定为轻度、11～19分为中度、10分以下为高度的量表。将其结果示于以下。
[表1]
基于HDS-R的评价得分
G：Rivastach patch 9mg+Gramalil 1片/天合用
如根据表1可了解的那样，虽然具有偏差，但在2.5～4个月的短时期之间，确认到了1～8分的分数的升高。即使在这样的短时期也显示出了改善效果，这可认为是由于本发明的组合物促进再髓鞘化，促进α-分泌酶的活性且抑制β-分泌酶的表达，而综合性地发挥了作用。
工业实用性
根据本发明能够实现安全并且迅速的阿尔茨海默病的治疗和/或预防。

Claims (7)

1.用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其促进再髓鞘化，促进α-分泌酶的活性且抑制β-分泌酶的表达，
所述组合物包含：选自由作为第1有效成分的甘油磷酸胆碱及其药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物；及
选自由作为第2有效成分的橙皮苷、柚皮芸香苷、及它们的药理学上允许的盐组成的组中的至少一种化合物。
2.根据权利要求1所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其包含10～120mg的第1有效成分和30～100mg的第2有效成分作为成人每人每日的施用量。
3.根据权利要求1或2所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其包含橙皮苷和柚皮芸香苷作为第2有效成分。
4.根据权利要求3所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其包含源自温州蜜柑的陈皮或该陈皮的提取物形式的橙皮苷和柚皮芸香苷。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其配制为包含第1有效成分和第2有效成分二者的复合剂形式的制剂。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其配制为包含第1有效成分的药剂和包含第2有效成分的药剂形成的试剂盒形式的制剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防的组合物，其以保健食品的形式施用。
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