ES2936725T3 - Composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

Se proporciona una composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer que tiene un efecto terapéutico o profiláctico mejorado junto con efectos secundarios reducidos. Esta composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer contiene al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en glicerofosfocolina (G) y sus sales farmacéuticamente aceptables como primer ingrediente activo y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en herperidina (H), narirutina (N) y sus sales farmacéuticamente aceptables como segundo ingrediente activo. Esta composición promueve la remielinización, promueve la actividad de la α-secretasa y también suprime la expresión de la β-secretasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer.

La técnica relacionada

Como nos enfrentamos a una sociedad que envejece mucho, la cantidad de personas con demencia que visitan una institución médica está aumentando rápidamente. De acuerdo con el Informe Mundial sobre el Alzheimer de 2015, había 46,8 millones de personas con demencia en todo el mundo, y habrá 131,50 millones de personas viviendo con demencia en todo el mundo para 2050. La cantidad de personas con demencia se duplica aproximadamente cada 20 años, y se ha advertido que la demencia es una enfermedad que provocará una crisis mundial. Por lo tanto, se ha vuelto imperativo el desarrollo de un método efectivo de prevención y un método efectivo de tratamiento para la demencia.

El síntoma cardinal de la enfermedad de Alzheimer, la principal causa de demencia es la demencia progresiva, pero se ha descubierto que un aumento en el número de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro, así como la atrofia cerebral debido al déficit de neuronas, son características patológicas. Teniendo en cuenta estas características, la degeneración o el déficit de neurocitos en la región de la materia gris se ha considerado una causa de la enfermedad de Alzheimer. Es decir, la placa senil se forma por la condensación y el depósito de la proteína p amiloide en el cerebro de acuerdo con el trastorno metabólico de la proteína precursora de amiloide (en lo sucesivo, la proteína precursora de amiloide se denominará "APP" y la proteína p amiloide se denominará en lo sucesivo como ''Ap''), y se ha considerado que esta condensación y depósito de Ap provoca la formación de una maraña neurofibrilar, pérdida de neuronas y, en consecuencia, disfunción cognitiva. También se ha encontrado que los oligómeros de Ap solubles que se forman en el proceso de agregación de Ap se correlacionan con la disminución de las sinapsis nerviosas que están estrechamente relacionadas con la gravedad de la demencia. Por lo tanto, se ha investigado ampliamente el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer con el fin de reducir la cantidad de expresión de Ap, especialmente los oligómeros de Ap solubles.

Por otro lado, sin embargo, recientemente se ha informado que se ha encontrado una anomalía en la sustancia blanca del cerebro de los pacientes de Alzheimer, donde, especialmente, la mielina está notablemente disminuida, y la anomalía en la sustancia blanca se ha encontrado no solo en el esplenio del cuerpo calloso que es el sitio de mielinización temprana y la rodilla del cuerpo calloso que es el sitio de mielinización posterior, pero también en la región inferior CAI del hipocampo; por lo tanto, se ha sugerido que la degeneración axonal o la desmielinización en la región de la sustancia blanca pueden ser un factor potencialmente importante en la disfunción cognitiva leve y en la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, se ha considerado el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer con el fin de recuperarse de la desmielinización.

Documento de no patente 1 (J Neurosci Res. 85:954-966, 2007) informa que la cantidad de proteína básica de mielina fosforilada, especialmente proteína básica de mielina fosforilada que tiene una masa molecular de 21,5 kDa (en adelante, la proteína básica de mielina se denomina "MBP'', la MBP fosforilada se denomina "p-MBP", MBP que tiene una masa molecular de X kDa se denomina "XkDaMBP'', y la XkDaMBP fosforilada se denomina "p-XkDaMBP"), disminuyó notablemente durante la desmielinización inducida por el envejecimiento y por la aplicación del inductor de desmielinización cuprizona, y que una molécula desencadenante para la formación de mielina fue un receptor Fc de inmunoglobulina, y el receptor Fc y una molécula desencadenante de Fyn se convirtieron en una señal para controlar el encendido y apagado de una proteína G pequeña (Rho), activar aún más MAPK como su efector, promover la fosforilación de MBP, estratificar una membrana de mielina y mantener la compresión de mielina. Este documento informa además que la recuperación de la desmielinización en el ratón tratado con cuprizona y el ratón viejo se logró mediante la administración de Ninjin'yoeito y Ninjin'yoeito puede ser un tratamiento eficaz dirigido a la cascada de señalización de FcRY/Fyn-Rho(Rac1)-MAPK(P38 MAPK)-p-MBP. Este documento informa además que la administración de Ninjin'yoeito a un ratón anciano de 31 meses durante 2 meses disminuyó la relación G (la relación entre el diámetro de un axón y el diámetro del axón y la vaina de mielina que lo rodea) como un medida del progreso de la desmielinización desde el nivel previo a la administración de aproximadamente 0,82 hasta aproximadamente 0,73, donde la recuperación de la desmielinización fue comparable a la de un ratón de 3 meses (valor de la relación G: aproximadamente 0,75) (véase la Figura 1C de este documento ). Además, el documento de no patente 2 (Psychgeriatrics 2015 [doi:10.1111/psyg.12125]) informa que, como resultado de la administración combinada de Ninjin'yoeito durante 24 horas a pacientes con Alzheimer de leve a moderado para quienes el donepezil no es lo suficientemente efectivo, se logró una mejora significativa en el mantenimiento del rendimiento cognitivo y en el estado depresivo se ha encontrado en comparación con un grupo de administración única de donepezilo.

El documento de no patente 3 (Evid Based Complement Alternative Med. 2011 [doi:10.1093/ecam/neq001]) informa que, de los 12 tipos de galénicas que constituyen Ninjin'yoeito, Chinpi derivado de Citrus unshiu fue un componente activo para recuperarse de la desmielinización debida al envejecimiento, y la recuperación de la desmielinización se realizó no por la represión de la desmielinización sino por la remielinización, y además informa que el cultivo de una célula progenitora de oligodendrocitos que se convierte en mielina en presencia de hesperidina y/o narirutina, que son componentes principales del Chinpi promovió la generación de p-21.5kDaMBP y procedió rápidamente a la proliferación y diferenciación de la célula progenitora de oligodendrocitos, de la misma manera que el cultivo de una célula progenitora de oligodendrocitos en presencia de Chinpi. Además, el documento de patente 1 (JP 2008-127325 A) propone un promotor de la generación de p-MBP que comprende hesperidina y/o narirutina como principios activos y su uso en el tratamiento y/o prevención de la demencia. El Chinpi derivado de Citrus unshiu se diferencia de la cáscara seca de cítricos derivada de la mandarina u otros cítricos en que el primero contiene una mayor cantidad tanto de hesperidina como de narirutina.

Documento de no patente 4 (J. Nuevo Rem. & Clín. 2015; 64; 1072-1083) reporta que, en el cerebro de un ratón tembloroso con hipoplasia de mielina debido a la deleción del exón 3-7 del gen MBP, la vía de generación no-Ap fue inhibida y el fragmento N-terminal denominado sAPPa, que se genera por la escisión de la a-secretasa APP, no se desarrolló, y que en el cerebro de un ratón anciano al que se le administró Ninjin'yoeito durante 2 meses, se incrementó la p-21.5kDaMBP y al mismo tiempo los oligómeros Ap solubles, que se derivan de los Ap generados en la ruta de generación de Ap, se redujeron significativamente, y con base en los resultados de los experimentos mencionados anteriormente, se infiere que la ruta de generación de Ap es reprimida por la acción de MBP y, por lo tanto, se promueve la ruta de generación de no Ap y se reprime la generación de oligómeros de Ap solubles y se genera sAPPa. La ruta de generación de Ap es una ruta en la que la p-secretasa escinde APP y genera el fragmento N-terminal denominado sAPPp y el fragmento C-terminal denominado CTF-p, y luego la Y-secretasa escinde este fragmento y genera Ap y el dominio intracelular APP (AICD) y la ruta de generación no Ap es una ruta en la que la a-secretasa escinde la APP y genera el fragmento N-terminal denominado sAPPa y el fragmento C-terminal denominado CTF-a, y luego, la Y-secretasa escinde este fragmento y genera p3 y AICD.

Además, la glicerofosfocolina, también denominada a-GPC o L-a-glicerilfosforilcolina (en adelante, la glicerofosfocolina se denominará “a-GPC”) es una sustancia implicada en la mielinización. El a-GPC es un compuesto natural contenido en el cerebro o en la leche que se metaboliza en el metabolismo de la colina a colina por ENPP6, una fosfodiesterasa específica de colina que existe en la membrana celular de los oligodendrocitos como células formadoras de mielina, y la colina generada es utilizada para la síntesis de lípidos de oligodendrocitos y luego continúa la mielinización (ver documento de no patente 5 [Informes científicos |6:20995|Doi:10.1038/srep20995]). También se sabe que la a-GPC tiene un efecto mejorador sobre las funciones cognitivas. Por ejemplo, el documento de no patente 6 (Ann N Y Acad Sci. 30 de junio de 1994; 717: 253-69) informa que la administración de 1000 mg de a-GPC por día durante 28 días y la posterior administración oral de 400 mg de a-GPC por día durante 5 meses a 2044 pacientes con accidente cerebrovascular provocó la recuperación de las capacidades cognitivas de los pacientes, y el documento de no patente 7 (Clin Ther. 2003 enero; 25(1): 178-93) informa que la administración de a-GPC en la cantidad de una cápsula de 400 mg 3 veces al día a pacientes con Alzheimer de leve a moderado durante 180 días produjo un efecto de mejora en la función cognitiva. Además, el documento de patente 2 (EP 1203584 A1) sugiere el uso concurrente de un inhibidor de la acetilcolinesterasa junto con a-GPC.

Se han reconocido en a-GPC efectos ventajosos tal como un efecto de mejora sobre la función cognitiva, así como la promoción de la secreción de la hormona del crecimiento, la mejora de la lesión hepática, la disminución de la presión arterial o la mitigación de la disminución de la concentración de colina, pero las reacciones adversas nocivas a los fármacos también han sido reportadas. Por ejemplo, el documento de no patente 6 informa que se han encontrado reacciones adversas nocivas a fármacos en 2,14 % de los pacientes, de los cuales 0,7 % fue acidez estomacal, 0,5 % vómitos/émesis, 0,4 % insomnio/agitación, 0,2 % cefalea y 0,7 % de los pacientes esperaban la interrupción del tratamiento. Por lo tanto, debe evitarse la ingesta de una gran cantidad de a-GPC, aunque a-GPC es un compuesto natural que se encuentra en el cuerpo humano.

Documento de no patente 8 (Complemento con base en Evid Alternativa Med. 2016 [doi: 10.1155/2016/8692698]) reporta que el tratamiento con el extracto de Chinpi derivado de Citrus unshiu indujo un aumento específico en 21.5kDaMBP, condujo a la reaparición de células que expresan Ddx54 en la zona ventrículo-subventricular y cuerpo calloso de ratones viejos, y promovió la remielinización. El documento informa además que el tratamiento con constituyentes de Chinpi, hesperidina más narirutina en cultivos de OPC in vitro, condujo a un aumento en las OPC que expresan Ddx54, y sugiere que Ddx54 juega un papel crucial en la remielinización. Documento de no patente 9 (Revista europea de química médica 121 (2016) 810-822) informa que la hesperidina es un inhibidor de BACE1 de alta afinidad y solo 500 nM de hesperidina muestra una inhibición completa de la actividad enzimática. El documento informa además que la hesperidina inhibe por completo la formación de fibrillas de amiloide y exhibe un ensayo de eliminación de radicales ABTS^+ moderado pero fuerte capacidad de eliminación de radicales hidroxilo. Documento de no patente 10 (J Neural Transm (2013) 120: 1397-1409) presta atención a la señalización de cAMP/PKA/ERK/CREB vinculada a la transcripción mediada por CRE, que es crucial para el aprendizaje y la memoria. En el documento, se compararon los extractos de Citrus reticulata ricos en nobiletina designados como "Nchinpi" y los extractos de Citrus reticulata estándar de nobiletina o Citrus unshiu designados como "Chinpi". El documento informa que los extractos de Nchinpi, cuyo contenido de nobiletina era 16 veces mayor que el de los extractos de Chinpi, facilitaron la transcripción mediada por CRE en neuronas del hipocampo cultivadas, mientras que los extractos de Chinpi no mostraron tal actividad, y que los extractos de Nchinpi, pero no los extractos de Chinpi, estimularon la señalización de PKA/ERK/CREB.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: JP 2008-127325 A

Documento de patente 2: EP 1203584 A1

Documentos de no patentes

Documento de no patente 1: J Neurosci Res. 85: 954-966, 2007

Documento de no patente 2: Psicogeriatría 2015 [doi: 10.1111/psyg.12125]

Documento de no patente 3: Complemento basado en Evid Alternativa Med. 2011 [doi:10.1093/ecam/neq001] Documento de no patente 4: J. Nuevo Rem. & Clín. 2015; 64; 1072-1083

Documento de no patente 5: Informes científicos |6:20995|Doi:10.1038/srep20995

Documento de no patente 6: Ann N Y Acad Sci. 30 de junio de 1994; 717: 253-69

Documento de no patente 7: Clin Ther. 2003 enero, 25(1); 178-93

Documento de no patente 8: Complemento basado en Evid Alternativa Med. 2016 [doi: 10.1155/2016/8692698] Documento de no patente 9: Revista europea de química médica 121 (2016) 810-822

Documento de no patente 10: J Neural Transm (2013) 120: 1397-1409

Sumario de la invención

Problemas para resolver con la invención

Como se mencionó anteriormente, Ninjin'yoeito, o hesperidina y/o narirutina como principios activos de Chinpi derivados de Citrus unshiu, tiene un efecto beneficioso porque promueve la generación útil de p-MBP, promueve la remielinización e inhibe la generación de oligómeros Ap solubles tóxicos, de manera que puede esperarse un tratamiento y/o prevención efectivos de la enfermedad de Alzheimer mediante su uso. Sin embargo, siempre se ha solicitado una mayor mejora en los efectos del tratamiento y/o la prevención y, al mismo tiempo, deben evitarse las reacciones adversas nocivas a los fármacos.

Por lo tanto, el propósito de la presente invención es ofrecer una composición de tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer que pueda satisfacer la solicitud antes mencionada.

Medios para solucionar problemas

Los inventores han realizado un examen más detallado de la relación entre la generación de MBP y la generación de sAPPa que se muestra en el documento de no patente 4. Como modelo de ratón patológico para la enfermedad de Alzheimer, se utilizó el gen Tg2576 de ratón modificado en el que se introdujeron los genes APP humanos mutantes suecos (APP K670N/M671L) (en lo sucesivo denominado "ratón Tg2576") para investigar la diferencia en la cantidad de Expresión de p-MBP y la diferencia del estado de unión de p-eMBP con A Desintegrina y Metaloproteasa (ADAM) 9, que es particularmente conocido por mostrar actividad de a-secretasa entre ADAM, entre el cerebro de ratones jóvenes de 3 meses y el cerebro de los ratones viejos de 28 meses. Se sabe que una gran cantidad de Ap se acumula en el cerebro de ratones viejos de 28 meses. Los resultados de la investigación se muestran a continuación, y no se encontró expresión de p-21,5kDaMBP, o no se encontró unión entre ADAM9 y p-21,5kDaMBP en el cerebro de los ratones viejos. De estos resultados se concluye que, si la p-21.5kDaMBP y la ADAM9 están unidas, la ADAM9 mostrará actividad a-secretasa y se promoverá la generación de sAPPa.

Además, se encontró que, cuando se cultivaron células precursoras de oligodendrocitos utilizando un líquido de cultivo que contenía solo a-GPC, un líquido de cultivo que contenía solo hesperidina y/o narirutina, o un líquido de cultivo que contenía a-GPC además de hesperidina y/o narirutina, la proliferación y diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos se hizo notable cuando se usó el líquido de cultivo que contenía a-GPC, así como hesperidina y/o narirutina. Esto significa que ENPP6 que se muestra en el documento de no patente 5 activado por hesperidina y/o narirutina, y a-GPC se metaboliza rápidamente en colina por el ENPP6 activado y se utiliza para la diferenciación y maduración de oligodendrocitos. Esta acción es hasta ahora desconocida. Con base en esto, se puede esperar un rápido progreso de la remielinización y la recuperación de la desmielinización mediante el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y/o narirutina.

También se encontró que, cuando se añadía al agua una bebida en la que se añadían hesperidina y narirutina y a-GPC, una bebida en la que se añadían hesperidina y narirutina al agua, o una bebida en la que se añadía a-GPC al agua a ratones viejos TG 2576 de 26 meses, la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP aumentó notablemente en el cerebro de los ratones viejos a los que se les administró la bebida que contenía hesperidina y narirutina y a-GPC en comparación con el cerebro de los ratones viejos a los que se les administró la bebida que contenía hesperidina y narirutina y en el cerebro de los ratones viejos a los que se administró la bebida que contenía a-GPC. Esta cantidad de expresión notablemente aumentada fue aún más notable que la cantidad de expresión total aumentada por la administración de la bebida que contenía hesperidina y narirutina y por la administración de la bebida que contenía a-GPC y, por lo tanto, el efecto sinérgico de hesperidina y narirutina y a-GPC fue reconocido. Además, debido a este notable aumento de la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP en el cerebro de los ratones viejos a los que se les administró la bebida que contenía hesperidina y narirutina y a-GPC, se recuperó la desmielinización mediante una remielinización notablemente promovida como se esperaba por el resultado mencionado anteriormente en el experimento in vitro, y además, se unieron p-21.5kDaMBP y ADAM9 notablemente aumentados y se promovió la actividad de a-secretasa, se promovió notablemente la generación de sAPPa en la vía de generación no Ap.

Además, también se encontró que, en el cerebro de los ratones viejos a los que se les administró la bebida que contenía hesperidina y narirutina y a-GPC, la cantidad de expresión de BACE1, un tipo de p-secretasa, se redujo notablemente en comparación con el cerebro de los ratones viejos a los que se administró la bebida que contenía hesperidina y narirutina y en el cerebro de los ratones viejos a los que se administró la bebida que contenía a-GPC y, en consecuencia, la cantidad de expresión de oligómeros de Ap solubles tóxicos disminuyó notablemente. La cantidad de expresión de estos oligómeros de BACE1 y Ap solubles notablemente disminuidos fue más notable que la cantidad total de la cantidad de expresión disminuida debido a la administración de la bebida que contenía hesperidina y narirutina y la cantidad de expresión disminuida debido a la administración de la bebida que contenía a- GPC. Es concebible que la cantidad de expresión de BACE1 disminuya notablemente y la cantidad de expresión de oligómeros de Ap solubles también disminuya notablemente porque la remielinización avanza rápidamente y el daño cerebral se recupera por el efecto sinérgico de a-GPC y hesperidina y narirutina.

Por tanto, la presente invención se refiere a una composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer que comprende:

al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en glicerofosfocolina y sales farmacológicamente permisivas de la misma como primer principio activo; y

al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en hesperidina, narirutina y sus sales farmacológicamente permisivas como segundo principio activo,

que promueve la remielinización, promueve la actividad de la a-secretasa y reprime la expresión de la p-secretasa,

en donde la composición comprende hesperidina y narirutina como segundo principio activo.

La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención puede reducir sustancialmente la cantidad de administración por día de a-GPC, para el cual se han informado reacciones adversas nocivas al fármaco, por ejemplo, en el documento de no patente 6 por el efecto sinérgico de a-GPC y hesperidina y narirutina. La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención comprende preferiblemente de 10 a 120 mg del primer principio activo y de 30 a 100 mg del segundo principio activo como dosificación diaria para un adulto. La cantidad diaria para usar de 10 a 120 mg de a-GPC es un octavo o menos de la cantidad de uso inicial y un tercio o menos de la cantidad de uso posterior en el documento de no patente 6, y una décima parte o menos de la cantidad de uso en documento de no patente 7.

En la composición para su uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, tanto la hesperidina como la narirutina están comprendidas como segundo principio activo. La hesperidina y la narirutina se pueden combinar por separado con a-GPC, y la hesperidina y la narirutina se pueden agregar en forma de Chinpi derivado de Citrus unshiu o el extracto de Chinpi. El Chinpi derivado de Citrus unshiu comprende abundantemente tanto hesperidina como narirutina, con lo cual ambas se pueden agregar fácil y convenientemente.

Cuando se formula la composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, la formulación puede ser un fármaco combinado que comprende tanto el primer principio activo como el segundo principio activo, o un kit compuesto por un agente que comprende el primer principio activo principio y un agente que comprende el segundo principio activo. El fármaco combinado o cada agente que constituye el kit puede comprender un componente distinto del primer principio activo y el segundo principio activo en la medida en que no produzca un efecto adverso al efecto de la presente invención. Si la composición está en forma de kit, no hay limitación en el orden de administración y puede administrarse primero cualquier agente.

La composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se puede administrar en forma de ingesta oral o parenteral, y se puede administrar en forma de fármaco, cuasi-fármaco, alimento saludable (incluyendo suplemento), etcétera. La composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se puede administrar de forma continua ya que no hay preocupación por las reacciones adversas dañinas al fármaco, y en aras de la facilidad, es preferible administrarlo por vía oral como alimento saludable.

Efectos ventajas de la invención

En la presente invención, la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP aumenta notablemente debido al efecto sinérgico del primer principio activo y el segundo principio activo, y debido a este aumento notable, se promueve notablemente la remielinización y se recupera la desmielinización, la a- se promueve la actividad de secretasa y se promueve notablemente la generación de sAPPa y, además, se reduce la cantidad de expresión de p-secretasa de acuerdo con la recuperación de la desmielinización y se reprime notablemente la generación de Ap. Por lo tanto, se logrará el tratamiento y/o la prevención efectivos de la enfermedad de Alzheimer.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los hallazgos de la encuesta sobre la expresión de p-MBP y ADAM9 en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer; (a) muestra el resultado de detección de p-MBP y ADAM9 mediante inmunotransferencia, y (b) muestra la abundancia de p-MBP y ADAM9.

La Figura 2 muestra fotografías de contraste de fase con un aumento de 400 veces que muestran el estado de proliferación y diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos cuando se cultivan células precursoras de oligodendrocitos en un recipiente de cultivo que contiene a-GPC, hesperidina, narirutina o una combinación de los mismos.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento en el que se cultivan células precursoras de oligodendrocitos en un líquido de cultivo que contiene a-GPC o en un líquido de cultivo que contiene a-GPC y hesperidina, y luego se realiza la inmunotinción usando el anticuerpo O1 como marcador de diferenciación para oligodendrocitos, y se calcula la proporción del número de oligodendrocitos O1 positivos frente al número total de células.

La Figura 4 muestra los hallazgos de la encuesta sobre la abundancia de p-21.5kDaMBP en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC (bebida G), el extracto sólido de Chinpi (bebida HN) y ambos (bebida GHN). administrado.

La Figura 5 muestra los resultados del estudio de la abundancia de ADAM9 maduro en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos.

La Figura 6 muestra los resultados del estudio de la abundancia de sAPPa en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos.

La Figura 7 muestra los resultados del estudio de la abundancia de CTF-a en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos.

La Figura 8 muestra los resultados del estudio de la abundancia de BACE1 en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos.

La Figura 9 muestra los resultados de la encuesta sobre la abundancia de oligómero Ap en el cerebro del modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos.

La Figura 10 muestra micrografías electrónicas con un aumento de 19.000 veces que muestran la recuperación de la desmielinización cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos al modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer.

La Figura 11 muestra los resultados de la evaluación de la recuperación de la desmielinización con valores de relación G cuando se administran a-GPC, el extracto sólido de Chinpi y ambos al modelo de ratón patológico de la enfermedad de Alzheimer.

Descripción detallada de la invención

La composición para su uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención comprende:

al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en glicerofosfocolina y sales farmacológicamente permisivas de la misma como primer principio activo; y

al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en hesperidina, narirutina y sus sales farmacológicamente permisivas como segundo principio activo,

y la composición comprende hesperidina y narirutina como segundo principio activo.

Usando el primer principio activo y el segundo principio activo al mismo tiempo, la cantidad de expresión de p-21,5 kDaMBP aumenta notablemente en comparación con cuando solo se usa el primer principio activo o solo el segundo principio activo. Esta cantidad de expresión notablemente aumentada es aún más notable que la cantidad de expresión total aumentada por el uso del primer principio activo y por el uso del segundo principio activo. Además, mediante este aumento notable de la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP, se promueve notablemente la remielinización y se recupera la desmielinización, y, además, se unen p-21.5kDaMB y ADAM9 notablemente aumentados, se promueve la actividad de a-secretasa y se promueve notablemente la generación de sAPPa en la vía de generación no Ap. Además, la expresión de p-secretasa se reprime de acuerdo con la recuperación de la desmielinización y la generación de Ap en la ruta de generación de Ap se reprime notablemente.

El a-GPC, el primer principio activo, se puede sintetizar, por ejemplo, mediante la hidrólisis de fosfatidil colina obtenida mediante la expresión de aceite y el refinado de soja con lipasa, pero también se puede utilizar el a-GPC comercialmente disponible. El a-GPC se puede usar en forma de una sal farmacológicamente permisiva, por ejemplo, sal clorhidrato, sal fosfórica, sal cítrica, sal acetato o carbonato, o en forma de solvato. La hesperidina y la narirutina, el segundo principio activo, también están disponibles comercialmente, y se pueden usar en forma de una sal farmacológicamente permisiva, por ejemplo, sal clorhidrato, sal fosfórica, sal cítrica, sal acetato o carbonato, o en forma de un estado de solvato, o, además, en forma de un producto de transglicosilación para mejorar la solubilidad en agua. El producto de transglicosilación se hidroliza en hesperidina o narirutina en el cuerpo. Además, también se puede usar Chinpi derivado de Citrus unshiu que comprende hesperidina y narirutina como principios activos o un extracto obtenido dando un tratamiento de extracción tal como extracto de agua caliente al Chinpi. La materia seca del líquido de extracto de agua caliente está disponible comercialmente como extracto sólido, por lo que es conveniente utilizar el extracto sólido. También se puede usar una sustancia seca de fruta cítrica distinta de Citrus unshiu o un extracto de la misma.

En la composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención, el primer principio activo y el segundo principio activo pueden combinarse en las cantidades deseadas, y estos pueden administrarse por ingesta oral o parenteral, y pueden administrarse en forma de fármaco, cuasi-fármaco, alimentos saludables (incluyendo los suplementos), etc. La composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención no presenta reacciones adversas nocivas a los fármacos, por lo que puede administrarse de forma continua, y por conveniencia, es preferible administrarla por vía oral como suplemento.

La formulación puede ser un fármaco combinado que comprende el primer principio activo y el segundo principio activo, o un kit compuesto por un agente que comprende el primer principio activo y un agente que comprende el segundo principio activo. Si la formulación está en forma de kit, no hay limitación en el orden de administración, y cualquier agente puede administrarse primero, y también cada uno puede administrarse de forma continua o puede administrarse después de un buen período de tiempo.

En el caso del fármaco combinado o en el caso del agente que constituye el kit, puede formularse para uso oral como cápsula, agente masticable, tableta, polvo, gránulo, jarabe o una formulación parenteral tal como inyección, gota o supositorio de acuerdo con el fin previsto. En el caso del kit, la forma de cada agente puede ser igual o diferente.

En la fabricación de estas formulaciones, el primer principio activo y el segundo principio activo normalmente se mezclan con un vehículo farmacológicamente aceptable que se selecciona de acuerdo con el propósito previsto, es decir, un vehículo sólido tal como dextrina y lactosa, o un vehículo líquido como agua, agua salada o glicerina, y luego se formula en una forma prescrita. Estas formulaciones pueden comprender otros componentes, por ejemplo, vitaminas tales como la vitamina C y la vitamina E, minerales tales como el hierro y el zinc, componentes funcionales tales como el extracto de hoja de Gingko y el ácido docosahexaenoico, así como aditivos de uso común como aglutinante, espesante, lubricante, sabor, edulcorante, tampón, conservante o agente antimicrobiano, siempre que no se indique un efecto adverso al efecto de la presente invención.

Además, la composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención se puede mezclar en diversos tipos de alimentos y bebidas, por ejemplo, bebidas tales como agua mineral y bebida refrescante, productos lácteos tales como queso y yogur, y alimentos dulces tales como gelatina, galletas y dulces.

La cantidad de administración de la composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención puede determinarse adecuadamente de acuerdo con los síntomas, la edad, el peso, etc., de los pacientes de Alzheimer, así como la forma o número de administración y el uso simultáneo de otras formulaciones, etc., pero como cantidad de administración por día por adulto, generalmente es preferible la combinación de 10 a 120 mg del primer principio activo y 30 a 100 mg del segundo principio activo. Es preferible la combinación de 10 a 120 mg de a-GPC, 20 a 75 mg de hesperidina y 4 a 35 mg de narirutina. En la presente invención, se espera un efecto de mejora suficiente incluso con una cantidad tan pequeña de administración, y se evitan las reacciones adversas dañinas al fármaco.

La composición para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de la presente invención promueve la remielinización, promueve la actividad de la a-secretasa y reprime la expresión de la p-secretasa, por lo que el efecto rápido del tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer puede ser previsto. Además, se puede utilizar eficazmente para el tratamiento y/o prevención de enfermedades de desmielinización tales como esclerosis múltiple, trastorno cognitivo leve, demencia distinta de la enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, encefalomielitis aguda diseminada, esclerosis difusa inflamatoria y encefalomielopatía necrosante aguda o subaguda de Leigh, debido a que promueve la remielinización.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son la explicación de la presente invención.

(A) Ambiente animal y de reproducción

Los ratones Tg2576 modificados genéticamente en los que se introdujeron los genes APP humanos mutantes suecos (APPK670N/M671L) se obtuvieron del Laboratorio Jackson en los Estados Unidos y se usaron en los siguientes experimentos. Se sabe que Ap se acumula masivamente debido a la manifestación excesiva de APP en el cerebro de estos ratones cuando tienen 9 meses o más, y la desmielinización debido al envejecimiento ocurre cuando tienen 24 meses o más. Los ratones Tg2576 obtenidos se mantuvieron en criaderos a temperatura ambiente 25 ± 1 grados centígrados, humedad relativa 55 ± 1 % y un ciclo de iluminación de 12 horas luz y 12 horas oscuridad (encendido: 7:00, apagado: 19:00 ). Estos experimentos con animales se llevaron a cabo en las instalaciones de experimentación con animales de la Universidad de Keio de acuerdo con su directriz de experimentación con animales, que se preparó con base en las directrices del NIH que estipulan el uso y manejo adecuados de los animales de experimentación.

(B) Experimento 1: relación entre p-MBP y ADAM9

El documento de no patente 4 muestra que sAPPa no se expresó en el cerebro de un ratón tembloroso con hipoplasia de mielina porque la vía de generación no Ap está inhibida, pero se desconocen los detalles; por lo tanto, la relación entre ADAM9, que se sabe que muestra actividad a-secretasa, y p-MBP se investigó con el siguiente experimento a través de la combinación de un método de inmunoprecipitación que usa un anticuerpo monoclonal anti-MBP e inmunotransferencia que usa un anticuerpo monoclonal MBP o anticuerpo policlonal anti-ADAM9.

(1) Procedimiento del experimento

(a) Solubilización del cerebro con un agente tensioactivo

Cada uno de los ratones Tg2576 de 3 meses con poca acumulación de Ap y sin desmielinización en su cerebro y los ratones Tg2576 de 28 meses con una gran cantidad de acumulación de Ap y desmielinización en su cerebro fueron sacrificados bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Wako Pure Chemical Industries), e inmediatamente se realizó una craneotomía para aislar todo el cerebro. Se midió el peso del cerebro aislado y se añadieron 10 mL de sales tamponadas con fosfato (PBS) enfriadas con hielo por gramo de peso de cerebro, y otros 10 mL de un líquido en el que se concentró una concentración del 1 % de poli(oxietileno) octilfenil éter (nombre comercial: Triton (marca registrada) X-100, Sigma-Aldrich Japón) a la solución diluida 100 veces de cóctel inhibidor de proteasa 100x (Merck) y el cerebro se solubilizó con un homogeneizador. La suspensión de homogeneizado de cerebro obtenida se recuperó a 1,5 mL de un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 30 minutos en condiciones de 4 grados centígrados y 100.000 rpm.

(b) Método de inmunoprecipitación

Se añadieron 200 pL del anticuerpo monoclonal anti-MBP SMI-99 (Merck Millipore) con una concentración de 200 pg/mL a 200 pL del sobrenadante obtenido tras la centrifugación (concentración de proteína 1 mg/tubo) obtenido en el paso (a) y se dejó reaccionar durante la noche a 4 grados centígrados con agitación para formar un complejo antígeno-anticuerpo. Además, se añadieron 50 pL de perlas de Sepharose en las que se inmovilizó Proteína A (nombre comercial; Proteína A-Sepharose (marca registrada): Sigma-Aldrich Japón) y se hicieron reaccionar a 4 grados centígrados con agitación durante la noche para adsorber el complejo antígeno-anticuerpo en las perlas. A continuación, la suspensión obtenida se centrifugó a 4 grados centígrados y 12.000 rpm durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante, se añadieron al sedimento 800 pL de solución de lavado (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, monolaurato de polioxietilensorbitán al 0,005 % (nombre comercial: Tween-20): todo Sigma-Aldrich Japón), pipeteado lentamente y luego centrifugado a 4 grados centígrados, 12.000 rpm durante 15 minutos. Después de repetir el procedimiento anterior desde la adición de la solución de lavado hasta la centrifugación dos veces más, 50 pL de tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio (SDS) 2x (Tris-HCl 0,125 M (pH 6,8) (Wako Pure Chemical Industries), glicerol al 20 % (Wako Pure Chemical Industries), SDS al 4 % (Wako Pure Chemical Industries), 2-mercaptoetanol al 10 % (Nacalai Tesque), azul de bromofenol al 0,004 % (Sigma-Aldrich Japan)) al sedimento, se calentó a 100 grados centígrados durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 4 grados centígrados y 14.000 rpm durante 15 minutos para obtener un líquido sobrenadante que contenía el complejo antígeno-anticuerpo.

(c) Electroforesis (SDS-PAGE)

La SDS-PAGE se llevó a cabo utilizando gel de gradiente del 4 al 20 % (TEFCO). La placa de gel se colocó en un aparato de electroforesis y se introdujo el tampón de electroforesis. A continuación, se introdujeron 25 pL del líquido sobrenadante que contenía el complejo antígeno-anticuerpo obtenido en el proceso (b) mencionado anteriormente en los pocillos de la placa de gel, se sometieron a electroforesis a temperatura ambiente durante unos 30 minutos en condiciones de 5 mA y se sometieron a electroforesis adicionales durante aproximadamente 90 minutos bajo la condición de 25 mA.

(d) Inmunotransferencia

Se introdujo una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (nombre comercial: Immobilon-P: tamaño de poro 0,45 pm, Merck Millipore) en un líquido de transcripción (Tris 31 mM (Nacalai Tesque), glicina 0,24 M (Sigma-Aldrich Japón), metanol al 20 % ( Wako Pure Chemical Industries)) y se agita durante 15 minutos. La membrana de PVDF recuperada y el gel después de la electroforesis obtenido en el proceso (c) antes mencionado se pusieron en contacto, se pasó una corriente eléctrica a temperatura ambiente en la condición de 20 mA/cm2 y la proteína se transcribió a la membrana de PVDF. Después de la transcripción y tinción con Coomassie Brilliant Blue (Wako Pure Chemical Industries) y secado, se administró un tratamiento de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora a la membrana de PVDF utilizando un tampón de bloqueo en el que se disolvió leche descremada al 5 % (Defco) en Solución salina tamponada con Tris 10x diluida 10 veces (TBS) (Tris 0,5 M (pH 8,1) (Nacalai Tesque), NaCl 1,5 M (Sigma-Aldrich Japón), ácido clorhídrico 1N (Wako Pure Chemical Industries)).

Se brindó una respuesta primaria de anticuerpos a 4 grados centígrados durante toda la noche a la membrana de PVDF obtenida después del tratamiento de bloqueo usando el anticuerpo monoclonal PC12 Anti-p-MBP (Merck Millipore, dilución 1/500) o el anticuerpo C-15 policlonal Anti-ADAM9 (Santa Cruz Biotechnology, dilución 1/500) junto con el anticuerpo monoclonal de ratón contra la p-actina como control interno (Sigma-Aldrich Japón, dilución 1/1000) como anticuerpos primarios. El tampón de bloqueo mencionado anteriormente se usó para la dilución. La membrana de PVDF después de la respuesta del anticuerpo primario se limpió 3 veces con un tampón de bloqueo en el que se disolvió leche descremada al 1 % en TBS 10x diluido 10 veces. Luego, se llevó a cabo una respuesta secundaria de anticuerpos a temperatura ambiente durante 2 horas utilizando Affinipure IgG anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) o Affinipure IgG anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), que se diluyeron de 800 a 1000 veces con el tampón de bloqueo, la membrana de PVDF se limpió 3 veces durante 10 minutos cada vez usando un tampón de bloqueo en el que se disolvió leche descremada al 1 % en 10x TBS diluido 10 veces, y el antígeno se detectó mediante una reacción de fosfatasa alcalina. La reacción de la fosfatasa alcalina se llevó a cabo haciendo reaccionar durante 30 minutos a 1 hora bajo condiciones sombreadas utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (Wako Pure Chemical Industries) como sustrato para la fosfatasa alcalina, nitro azul tetrazolio (Wako Pure Chemical Industries) como acoplador de color y una solución tampón (0,1 M Tris (Nacalai Tesque), 0,1 M NaCl (Sigma-Aldrich Japón), 0,05 M MgCl² (Sigma-Aldrich Japón)). El resultado de detección de antígeno se determinó con el valor medio ± error estándar de 3 experimentos independientes.

(2) Resultado experimental

La Figura 1 muestra los resultados de la encuesta de las abundancias de p-MBP y ADAM9 en los cerebros de los ratones Tg2576 de 3 meses y los ratones Tg2576 de 28 meses a través de los procesos (a) a (d) mencionados anteriormente. La Figura 1 (a) muestra la imagen de la membrana de PVDF en la que se detecta p-MBP y ADAM9 por la reacción de la fosfatasa alcalina, y la Figura 1(b) muestra las abundancias de p-MBP y ADAM9 obtenidas por la imagen de la Figura 1 ( a), que están normalizados por p-actina como patrón interno.

Los ratones Tg2576 tienen 4 isoformas de MBP, con masas moleculares de 14 kDa, 17,5 kDa, 18,5 kDa y 21,5 kDa. La Figura 1 (b) muestra que todas estas 4 isoformas se expresan en el cerebro de los ratones Tg2576 de 3 meses de edad, mientras que en el cerebro de los ratones Tg2576 de 28 meses, las isoformas de mayor masa molecular se expresan menos y p-21.5kDaMBP no se expresa en absoluto. Además, se muestra que, en comparación con la abundancia de ADAM9 detectada en el experimento con el cerebro de los ratones Tg2576 de 3 meses, la abundancia de ADAM9 detectada en el experimento usando el cerebro de los ratones Tg2576 de 28 meses es notablemente bajo, y ADAM9 apenas se detecta. Se encuentra a partir de estos resultados que p-MBP, especialmente p-21,5kDaMBP, se une a ADAM 9 en el cerebro de ratones Tg2576. Como se sabe que la actividad enzimática está controlada por la unión de la proteína adaptadora al dominio del citoplasma de ADAM9, se considera que la unión de p-MBP, especialmente p-21.5kDaMBP al dominio del citoplasma de ADAM9 hace que ADAM9 se transforme en una forma madura que muestra actividad a-secretasa y se promueve la generación de sAPPa.

(C) Experimento 2: Confirmación in vitro del efecto combinado de a-GPC y hesperidina/narirutina

El cerebro de ratones del día 18 fetal se dispersó enzimáticamente con una solución mixta de Dispase II al 0,3 % y Desoxirribonucleasa al 0,05 % (ambos de Roche Molecular Biochemicals) diluidos con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen), las células dispersas obtenidas se limpiaron con DMEM y las células disociadas se pasaron a través de una malla de nailon con un diámetro de poro de 70 pm. Luego, las células se suspendieron en DMEM que contenía 10 % de suero fetal bovino, se diseminaron en placas de cultivo recubiertas con poli-L-ricina (diámetro: 10 cm) a una densidad celular de 2,0 x 107 por plato y cultivadas durante 5 días. A continuación, las células después del cultivo fueron exfoliadas utilizando PBS que contenía 0,2 % de tripsina, centrifugadas durante 10 minutos en condiciones de 4 grados centígrados y 1000 rpm, y el sedimento se suspendió en 10 mL de un medio de cultivo libre de suero (un medio en el que glucosa (5,6 mg/ml), kanamicina (60 mg/ml), insulina (5 pg/ml), transferrina (0,5 pg/ml), BSA (100 pg/ml), progesterona (0,06 ng/ml), putrescina (16 pg/ml), selenito de sodio (40 ng/ml), tiroxina (T4) (40 ng/ml) y triyodotironina (T3) (30 ng/ml) se añadieron a DMEM) a la densidad celular de 2,5 x 106 por 1 mL, cultivado a 37 grados centígrados durante dos horas en una incubadora de CO² y se obtuvieron células precursoras de oligodendrocitos (OPC).

A continuación, las OPC obtenidas se diseminaron en placas de cultivo no recubiertas (diámetro: 10 cm) a las que se les introdujo el medio de cultivo sin suero mencionado anteriormente a la densidad celular de 2,5 x 106 por plato, y se añadió cualquiera de PBS solo (control), PBS que contiene hesperidina (H), PBS que contiene narirutina (N), PBS que contiene hesperidina y narirutina, PBS que contiene a-GPC (G) o PBS que contiene hesperidina y narirutina y a-GPC como ejemplo de la presente invención, y las OPC obtenidas se cultivaron durante 48 horas. Las cantidades de hesperidina, narirutina y a-GPC en el medio de cultivo se ajustaron para que la concentración final de cada uno fuera de 10 pM.

La Figura 2 muestra las fotos de contraste de fase con un aumento de 400 veces de las células después de que hayan transcurrido 48 horas. En caso de cultivo en el medio que contiene 10 mM de hesperidina, 10 mM de narirutina o 10 mM de a-GPC, aumenta el número de células y se generan las protuberancias indicadas por flechas, lo que indica que la proliferación y diferenciación de las OPC procede, en comparación con el mando. Además, en caso de cultivo en el medio que contiene 10 pM de hesperidina y 10 pM de narirutina, se acelera la proliferación y diferenciación de las OPC. Este efecto se considera dado por el uso de un medio que contiene una densidad total de 20 pM de hesperidina más narirutina. Además, en el caso de cultivo en el medio que contiene 10 pM de hesperidina, 10 pM de narirutina y 10 pM de a-GPC, la diferenciación y maduración de las OPC se aceleran notablemente de acuerdo con lo indicado por flecha. Esto muestra que ENPP6 es activado por hesperidina y narirutina, a-GPC es rápidamente metabolizado en colina por ENPP6 activado y utilizado por la diferenciación y maduración de oligodendrocitos.

Para confirmar aún más el efecto de combinación, las OPC mencionadas anteriormente se diseminaron en placas de cultivo no recubiertas (diámetro: 10 cm) a las que se introdujo el medio de cultivo sin suero mencionado anteriormente a la densidad celular de 2,5 x 106 por placa, y se añadió cualquiera de PBS solo (control), PBS que contenía a-GPC 0 PBC que contenía a-GPC y hesperidina como una realización ejemplar y se cultivó durante 48 horas. Las cantidades de hesperidina y a-GPC se ajustaron de modo que la concentración final de cada uno fuera 0,1 mM o 1 mM. Además, las OPC se inmunotiñeron con el anticuerpo O1 como marcador de diferenciación de los oligodendrocitos, se contó el número de células totales y el número de oligodendrocitos positivos para O1 en un solo campo de visión bajo el microscopio, respectivamente, , y se calculó la proporción del número de oligodendrocitos positivos para O1 frente al número de células totales. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Como se ve en la Figura 3, los oligodendrocitos O1 positivos apenas aumentan en comparación con el control si las OPC se cultivan usando el medio que contiene 0,1 mM de a-GPC, pero al agregar 0,1 mM de hesperidina al medio, la proporción de oligodendrocitos O1 positivos aumenta bruscamente, incluso superando la mitad de la cantidad de aumento en el caso del cultivo utilizando el medio de cultivo que contiene 1 mM de a-GPC. En el caso de que se añada 1 mM de hesperidina al medio de cultivo que contiene 1 mM de a-GPC, los oligodendrocitos O1 positivos también aumentan notablemente. Por lo tanto, se confirma que el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y/o narirutina puede hacer que las OPC se diferencien rápidamente y maduren en oligodendrocitos. Con base en estos resultados, se espera que la remielinización avance rápidamente y que la desmielinización se recupere con el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y/o narirutina.

(D) Experimento 3: relación de la administración de a-GPC/Chinpi y la cantidad de expresión de oligómeros p-21.5kDaMBP/ADAM9 maduro/sAPPa /CTF-a/BACE1/Ap

Con base en el resultado del Experimento 1 mencionado anteriormente, se espera que se promueva la actividad asecretasa de ADAM9 y, por lo tanto, se promueva la generación de sAPPa en la ruta de generación no Ap, se reprime la generación de Ap en la ruta de generación Ap y, por lo tanto, la generación de oligómeros de Ap solubles tóxicos se reprime si se aumenta la cantidad de expresión de p-21,5 kDaMBP. Por lo tanto, se investigó la relación entre la administración de a-GPC/Chinpi y la cantidad de expresión de oligómeros p-21.5kDaMBP/ADAM9 maduro/sAPPa /CTF-a/BACE1/Ap.

(1) Procedimiento del experimento

(aa) Administración de a-GPC / Chinpi

Con el extracto sólido de Chinpi (que contiene 20,8 mg de hesperidina y 3,38 mg de narirutina por gramo: UCHIDA WAKANYAKU Ltd.) y un polvo que contiene 85 % de a-GPC (NOF GPC85R: NOF Corporation), bebida GHN en la que 0,017 % p/v de a-GPC y 0,5 % p/v del extracto sólido de Chinpi (hesperidina: 0,0104 % p/v, narirutina: 0,0017 % p/v) se disolvieron en agua destilada (Ejemplo), bebida HN en la que se disolvieron 0,5 % p/v del extracto sólido de Chinpi en agua destilada (Ejemplo Comparativo 1) y se preparó una bebida G en la que se disolvió 0,017 % p/v de a-GPC en agua destilada (Ejemplo Comparativo 2). Ratones Tg2576 de 26 meses de edad (peso promedio: 30 g) se separaron en 4 grupos, y se administró bebida GHN, bebida HN, bebida G o agua como control a cada grupo durante 2 meses mediante ingesta libre (cantidad promedio de bebida : 4 mL/día). Si la cantidad de administración de a-GPC, hesperidina y narirutina en este experimento de administración se convierte en la cantidad de administración de un ser humano adulto que pesa 50 kg usando un coeficiente "10" para convertir la diferencia de especies entre seres humanos y ratones (véase Reg. Toxicol. Farmacol. 24, 108-120), la cantidad de administración de a-GPC es de 113,3 mg/día, la cantidad de administración de hesperidina es de 69,3 mg/día y la cantidad de administración de narirutina es de 11,3 mg/día. Después de 2 meses de ingesta libre, los ratones a los que se administró la bebida GHN, los ratones a los que se administró la bebida HN, los ratones a los que se administró la bebida G y los ratones de control fueron sacrificados bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Wako Pure Chemical Industries), se realizó inmediatamente una craneotomía y se aisló todo el cerebro y se almacenó a -80 grados centígrados hasta su uso.

(bb) Solubilización del cerebro con un agente tensioactivo

Los cerebros almacenados de los ratones a los que se administró la bebida GHN, los ratones a los que se administró la bebida HN, los ratones a los que se administró la bebida G y los ratones de control se usaron para realizar la preparación y centrifugación de la suspensión de homogeneizado de cerebro en el mismo procedimiento como el proceso (a) del Experimento 1, y luego de la centrifugación, se separó el fluido sobrenadante como fracción soluble y el sedimento por separado como fracción insoluble, y ambos se almacenaron a -80 grados centígrados.

(cc) Electroforesis (SDS-PAGE)

La fracción soluble obtenida en el proceso mencionado anteriormente (bb) se diluyó 4 veces con un tampón de muestra 4x SDS (0.0625 M Tris-HCl (pH 6.8) (Wako Pure Chemical Industries), glicerol al 10 % (Wako Pure Chemical Industries), SDS al 2 % (Wako Pure Chemical Industries), 2-mercaptoetanol al 5 % (Nacalai Tesque), azul de bromofenol al 0,002 % (Sigma-Aldrich Japón)), se deja en un baño a temperatura constante de 100 grados centígrados durante 10 minutos y se obtuvo una muestra para SDS- PAGE. SDS-PAGE se llevó a cabo utilizando la muestra para SDS-PAGE obtenida con el mismo procedimiento que se muestra en el proceso (c) del Experimento 1.

(dd) Inmunotransferencia

Con el gel después de la electroforesis obtenido en el proceso mencionado anteriormente (cc), la proteína se transcribió a la membrana de PVDF y se administró el tratamiento de bloqueo antes de la respuesta primaria de anticuerpos posterior en el mismo procedimiento que se muestra en el proceso (d) del Experimento 1. Luego, la respuesta primaria de anticuerpos de la membrana de PVDF después del tratamiento de bloqueo se llevó a cabo a 4 grados centígrados durante toda la noche. Los anticuerpos utilizados fueron el anticuerpo monoclonal de ratón 22C11 que reconoce el N-terminal de APP (Merck Millipore, dilución 1/600), el anticuerpo monoclonal de ratón 6E10 que reconoce Ap^1-16 (Covance Inc., dilución 1/1000), anticuerpo monoclonal de ratón 4G8 que reconoce Ap17-24 (Covance Inc., dilución 1/500), un anticuerpo que reconoce el extremo C-terminal de BACE1 (Calbiochem Inc., dilución 1/500), un anticuerpo que reconoce el dominio metalopeptidasa de ADAM9 (Bethyl Laboratories Inc., 1/500 dilución), anticuerpo monoclonal de ratón contra p-actina como estándar interno (Sigma-Aldrich Japón, dilución 1/1000) y anticuerpo monoclonal anti-p-MBP PC12 (Merck Millipore, dilución 1/500 cada uno). Para diluir cada anticuerpo, se utilizó un tampón de bloqueo en el que se disolvió el 5 % de leche desnatada en TBS 10x diluido 10 veces. Después de la respuesta primaria de anticuerpos, la membrana de PVDF se limpió 3 veces durante 10 minutos cada una usando un tampón de bloqueo en el que se disolvió el 1 % de leche descremada en TBS 10x diluido 10 veces. Luego se llevó a cabo una segunda respuesta de anticuerpos a temperatura ambiente durante 2 horas utilizando Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories) que se diluyó 800 veces con el tampón de bloqueo, la membrana de PVDF se limpió 3 veces durante 10 minutos cada una usando un tampón de bloqueo en el que se disolvió el 1 % de leche descremada en TBS 10x diluido 10 veces, y el antígeno se detectó por reacción de fosfatasa alcalina con el mismo procedimiento que se muestra en el proceso (d) de Experimento 1. El resultado de detección de antígeno se obtuvo con el valor medio ± error estándar de 3 experimentos independientes.

(2) Resultado experimental

La Figura 4 es una figura en la que la abundancia de p-21,5 kDaMB normalizada por la p-actina como estándar interno se muestra en forma de relación de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1. Como se puede entender de la Figura 4, la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP aumenta aproximadamente 6 veces con la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2), y aumenta aproximadamente 10 veces con la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), pero la cantidad aumentada por la administración de la bebida GHN (Ejemplo) es aproximadamente 25 veces y notable. En otras palabras, la cantidad de expresión aumentada por la administración de la bebida GHN es notable en comparación con la cantidad total encontrada de expresión aumentada por la administración de la bebida HN y la administración de la bebida G, y la sinergia de a-GPC y hesperidina y narirutina.

La Figura 5 es una figura en la que la abundancia de ADAM9 maduro normalizado por p-actina como estándar interno se muestra en forma de una relación de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1. Como puede entenderse por el resultado del Experimento 1, si p-MBP, especialmente p-21.5kDaMBP, se une al dominio del citoplasma de ADAM9, ADAM9 se convierte en un tipo maduro que muestra actividad de a-secretasa. La cantidad de expresión de ADAM9 maduro se incrementa a aproximadamente 1,45 veces por la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2), y se incrementa a aproximadamente 1,60 veces por la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), y se incrementa a aproximadamente 1,73 veces por la administración de la bebida GHN (Ejemplo). Este es el resultado del notable aumento de p-MBP, especialmente p-21.5kDaMBP por la acción sinérgica de a-GPC y hesperidina y narirutina, como se puede entender en la Figura 4. La La Figura 6 es una figura en la que la abundancia de sAPPa normalizado por p-actina como estándar interno se muestra en forma de una proporción de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1, y la Figura 7 es una figura en la que la abundancia de CTF-a normalizada por p-actina como estándar interno se muestra en forma de una proporción de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1. La sAPPa y CTF-a se generan mediante la escisión de la a-secretasa APP en el no-ruta de generación de Ap. Como se puede entender en la Figura 6, la cantidad de expresión de sAPPa aumenta aproximadamente 5,2 veces con la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2) y aumenta aproximadamente 6,4 veces con la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), mientras que la cantidad aumentada por la administración de la bebida GHN (Ejemplo) aumenta hasta aproximadamente 11,4 veces. Además, como puede entenderse de la Figura 7, la cantidad de expresión de CTF-a aumenta aproximadamente 4,6 veces con la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2), y aumenta aproximadamente 6,0 veces con la administración de la bebida HN (Comparativo Ejemplo 1), mientras que la cantidad aumentada por la administración de la bebida GHN (Ejemplo) aumenta hasta aproximadamente 8,4 veces. La cantidad de expresión de sAPPa que se muestra en la Figura 6 está bien correlacionada con la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP en la Figura 4, que muestra la acción sinérgica de a-GPC y hesperidina y narirutina con respecto a la aceleración de la actividad de asecretasa. El aumento en la cantidad de expresión de ADAM9 maduro por el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y narirutina como se muestra en la Figura 5 es pequeño, en comparación con el aumento en la cantidad de expresión de sAPPa por el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y narirutina como se muestra en la Figura 6 o el aumento en la cantidad de expresión de CTF-a por el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y narirutina como se muestra en la Figura 7. Hay muchos ADAM distintos de ADAM9 que muestran actividad de a-secretasa (por ejemplo, ADAM10, ADAM17), y es concebible que la cantidad de expresión de sAPPa y CTF-a aumente considerablemente porque la cantidad de expresión de estos ADAM completos aumenta notablemente.

La Figura 8 es una figura en la que la abundancia de BACE1 como un tipo de p-secretasa normalizada por p-actina como estándar interno se muestra en forma de una proporción de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1, y la Figura 9 es una figura en la que la abundancia de hexámero Ap (en lo sucesivo denominado "6-mer'') normalizado por p-actina como estándar interno se muestra en forma de proporción de abundancia en la que la abundancia en el cerebro de los ratones de control se establece en 1. El 6-mer es un péptido del núcleo de agregación de Ap, un tipo de oligómeros de Ap solubles cuya relación entre la disfunción cognitiva es muy sugerida, y cuando la polimerización continúa con el núcleo del 6-mer, se generan 12-mer tóxicos solubles y placa senil. Como puede entenderse de la Figura 8, la cantidad de expresión de BACE1 se reduce a aproximadamente 0,96 veces por la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2) y se reduce a aproximadamente 0,87 veces por la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), pero se reduce hasta aproximadamente 0,53 veces mediante la administración de la bebida GHN (Ejemplo). Además, como se puede entender de la Figura 9, la cantidad de expresión de 6-mer se reduce a aproximadamente 0,73 veces por la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2) y se reduce a aproximadamente 0,82 veces por la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), pero se reduce hasta aproximadamente 0,34 veces mediante la administración de la bebida GHN (Ejemplo). Estos resultados muestran la acción sinérgica entre a-GPC y hesperidina y narirutina. Especialmente, el efecto reductor de BACE1 mediante el uso simultáneo de a-GPC y hesperidina y narirutina es notable, y se considera que esto refleja la recuperación de la desmielinización. En otras palabras, BACE1 no es una enzima específica de las neuronas, sino que se desarrolla abundantemente en los astrocitos; se ha encontrado que BACE1 se desarrolla en astrocitos reactivos del cerebro de pacientes de Alzheimer, y estos astrocitos reactivos se desarrollan cuando el cerebro está dañado. Como se muestra a continuación, la remielinización avanza rápidamente y la desmielinización se recupera por el efecto sinérgico de a-GPC y hesperidina y narirutina. Se considera que, debido a la recuperación de la desmielinización, se reprime el desarrollo de astrocitos reactivos y, en consecuencia, la cantidad de expresión de BACE1 disminuye notablemente y, además, la cantidad de expresión de oligómeros de Ap solubles disminuye notablemente.

Los resultados antes mencionados muestran que con la composición de la presente invención que comprende a-GPC y hesperidina y narirutina, estos principios activos actúan sinérgicamente, la cantidad de expresión de p-21.5kDaMBP aumenta notablemente; la actividad a-secretasa de ADAM9 se promueve debido a la unión con este p-21.5kDaMBP notablemente aumentado y se promueve notablemente la generación de sAPPa y CTF-a, y además, se reprime el desarrollo de BACE1 y la ruta de generación de Ap y, en consecuencia, la generación de oligómeros de Ap solubles, cuya relación con la disfunción cognitiva ha sido fuertemente sugerida, está notablemente reprimida. Por tanto, la composición de la presente invención es notablemente eficaz para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer.

(E) Experimento 4: relación entre la administración de a-GPC/Chinpi y la remielinización

La relación entre la administración de a-GPC/Chinpi y la remielinización se investigó en el siguiente experimento.

(1) Procedimiento del experimento

Se observaron con un microscopio electrónico el cerebro de los ratones a los que se administró la bebida GHN, los ratones a los que se administró la bebida HN, los ratones a los que se les administró bebida G y los ratones control, que se almacenaron en el proceso (aa) en el Experimento 2. El cerebro de cada ratón se prefijó con glutaraldehído al 2 % y luego se fijó con OsO4 al 1 %.. Los especímenes se deshidrataron en etanol, luego se incrustaron en resina epoxi (nombre comercial: Quetol 812, Nisshin EM Co., Ltd.), se obtuvieron secciones ultrafinas teñidas con 2 % de acetato de uranilo y una solución de plomo, y se observaron con un microscopio electrónico con un aumento de 19.000 veces. Para medir la proporción G (la proporción entre el diámetro de un axón y el diámetro del axón y la vaina de mielina circundante: véase Fig. 11), se usaron al menos 3 ratones por grupo y se tomaron de 8 a 10 micrografías electrónicas para cada ratón, se midieron las relaciones G para al menos 90 axones, y se calcularon el valor promedio y la desviación estándar.

(2) Resultado experimental

La Figura 10 muestra las micrografías electrónicas del cerebro de cada ratón. La p-MBP estratifica la membrana de mielina alrededor del axón y tiene el efecto de mantener la compresión de la mielina. La Figura 10 muestra que, en el cerebro de los ratones de control, la compresión de la membrana de mielina, como se indica con una flecha, no es suficiente y la desmielinización continúa, mientras que la desmielinización se recupera a medida que avanza la remielinización debido a la administración de la bebida G (Ejemplo Comparativo 2 ) y la administración de la bebida HN (Ejemplo Comparativo 1), y que la remielinización continúa debido a la administración de la bebida GHN (Ejemplo) y se reconoce notablemente la recuperación de la desmielinización. La Figura 11 muestra el valor de la proporción G calculada a partir de las micrografías electrónicas. Cuando las membranas de mielina se estratifican y comprimen alrededor del axón, el valor de la proporción G se reduce, por lo que la reducción en el valor de la proporción G sirve como medida para la recuperación de la desmielinización. Como se puede entender de la Figura 11, el valor de la proporción G en el cerebro de los ratones de control es de aproximadamente 0,83, el valor de la relación G en el cerebro de los ratones a los que se administró la bebida G y los ratones a los que se administró la bebida HN es aproximadamente 0,74; estos valores son similares al valor de la proporción G obtenido mediante la administración de Ninjin'yoeito en el documento de no patente 1, pero el valor de la proporción G en el cerebro de los ratones a los que se administró la bebida GHN se reduce aún más a aproximadamente 0,69. Esto está en igualdad con el valor de la proporción G en el cerebro de ratones normales, lo que representa un resultado extraordinario. Se considera que esto causa la notable disminución de BACE1 y, en consecuencia, la notable disminución de los oligómeros de Ap solubles, como se mencionó anteriormente.

A partir de los resultados mencionados anteriormente, se encuentra que, con la composición que comprende a-GPC y hesperidina y narirutina de la presente invención, estos principios actúan sinérgicamente, se promueve notablemente la remielinización y la desmielinización muestra recuperación. Por tanto, la composición de la presente invención es extremadamente eficaz para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer.

(F) La confirmación del efecto de mejora en las funciones cognitivas

Se fabricó una pastilla para el mareo que contenía un total de 70 mg de hesperidina y narirutina, así como 40 mg de a-GPC como dosificación diaria y se administró a los investigadores durante 2,5 a 4 meses, y sus puntajes en la escala de demencia de Hasegawa (HDS-R) fueron evaluados. El HSD-R se evalúa con una puntuación máxima de 30, donde se sospecha demencia si un examinado obtiene una puntuación de 20 o menos, y en caso de diagnóstico definitivo, las puntuaciones de 20 o menos se evalúan como leves, las puntuaciones de 11 a 19 se evalúan como medio, y las puntuaciones de 10 o menos se evalúan como avanzadas. El resultado se muestra a continuación:

Tabla 1

Como se puede entender en la Tabla 1, la puntuación aumentó de 1 a 8 puntos durante períodos cortos de 2,5 a 4 meses, aunque hay una variación en los datos. Es concebible que el efecto de mejora después de un período tan corto se deba a que la composición de la presente invención promueve la remielinización, promueve la actividad de la asecretasa, reprime la expresión de la p-secretasa y actúa de manera integral.

Aplicabilidad industrial

La presente invención permite el tratamiento y/o la prevención seguros y rápidos de la enfermedad de Alzheimer.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer que comprende: al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en glicerofosfocolina y sales farmacológicamente permisivas de la misma como primer principio activo; y

al menos un tipo de compuesto seleccionado de un grupo que consiste en hesperidina, narirutina y sus sales farmacológicamente permisivas como segundo principio activo,

que promueve la remielinización, promueve la actividad de a-secretasa y reprime la expresión de p-secretasa, en donde la composición comprende hesperidina y narirutina como segundo principio activo.

2. La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende de 10 a 120 mg del primer principio activo y de 30 a 100 mg del segundo principio activo como dosificación diaria para un adulto.

3. La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende hesperidina y narirutina en forma de Chinpi derivado de Citrus unshiu o un extracto de Chinpi.

4. La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones. 1 a 3, que se formula como un fármaco combinado que comprende tanto el primer principio activo como el segundo principio activo.

5. La composición para uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se formula como un kit compuesto por un agente que comprende el primer principio activo y un agente que comprende el segundo principio activo.

6. La composición para uso en el tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones. 1 a 5, que se administra como alimento saludable.