ITRM20100679A1 - Acido d-aspartico, acido l-aspartico, loro sali o loro combinazioni per il ripristino dell attività cognitiva e della memoria negli ammalati di alzheimer e in altre demenze senili. - Google Patents

Description

Acido D-aspartico, acido L-aspartico, loro sali o loro combinazioni per il ripristino dell'attività cognitiva e della memoria negli ammalati di Alzheimer e in altre demenze senili

La presente invenzione concerne acido D-aspartico, acido L-aspartico, loro sali o loro combinazioni per il miglioramento dell'attività cognitiva e di memoria negli ammalati di Alzheimer e in altre demenze senili.

La malattia di Alzheimer fu individuata per la prima volta dal Tedesco Alois Alzheimer all'inizio del secolo scorso ed è dovuto all'insorgenze di placche amiloide nel cervello che avvolgono e distruggono i neuroni cerebrali. Per cui le persone colpite da questa malattia perdono le funzioni cognitive e di memoria, non riconoscono i luoghi dove si trovano e perdono anche la conoscenza delle persone che lo circondano compreso i propri familiari. Nelle forme più avanzate, gli ammalati di Alzheimer diventano completamente inattivi e inefficienti nell'autogestirsi (non curano la propria persona, non si cibano, né si lavano e non risentono degli stimoli escretori). Le persone colpite dalla malattia di Alzheimer rappresentano circa il 3-5% della popolazione maschile e femminile all'età tra i 55 e 65 anni, con aumento di circa il 5-8% nelle persone tra i 65 e i 75 anni e del 15-20% circa nella persone tra i 75 e 85 anni.

Il decorso della malattia comprende una prima fase lieve, poi una fase intermedia, e infine una fase severa. La malattia viene spesso anticipata dal cosiddetto mild cognitive impairment (MCI), un leggero calo di prestazioni in diverse funzioni cognitive (memoria, orientamento e capacità verbali) accompagnato da amnesia progressiva ed altri deficit cognitivi. Il deficit di memoria è prima circoscritto a sporadici episodi nella vita quotidiana, ovvero disturbi di quella che viene chiamata on-going memory (ricordarsi cosa si è mangiato a pranzo, cosa si è fatto durante il giorno) e della memoria prospettica (che riguarda l'organizzazione del futuro prossimo, come ricordarsi di andare a un appuntamento). Poi, man mano il deficit aumenta, anche la memoria episodica retrograda (riguardante fatti della propria vita o eventi pubblici del passato) e la memoria semantica (le conoscenze acquisite), mentre la memoria procedurale (che riguarda l'esecuzione automatica di azioni) viene relativamente risparmiata fino alle fasi avanzate della malattia. A partire dalle fasi lievi e intermedie possono poi manifestarsi crescenti difficoltà di produzione del linguaggio, con incapacità nella definizione di nomi di persone od oggetti.

Nelle fasi avanzate, possono manifestarsi problematiche comportamentali (vagabondaggio, coazione a ripetere movimenti o azioni, reazioni comportamentali incoerenti) o psichiatriche (confusione, ansia, depressione, ed occasionalmente deliri e allucinazioni) . Col progredire della malattia le persone non solo presentano deficit di memoria, ma risultano deficitarie nelle funzioni strumentali mediate dalla corteccia associativa, e possono pertanto presentare afasia e aprassia.

A livello epidemiologico, tranne che in rare forme genetiche famigliari in cui la persona viene colpita dalla malattia nell'età giovanile, il principale fattore correlato all'incidenza della patologia è l'età. In genere, dopo 65 anni di età, l'incidenza della malattia aumenta progressivamente con l'aumentare dell'età, per raggiungere una diffusione significativa nella popolazione oltre gli 85 anni. Le cause biologiche e biochimiche della malattia sono dovute a una diffusa distruzione di neuroni, causata principalmente da una piccola proteina (o polipeptide) di 42 amminoacidi , la β-amiloide. Tale peptide si origina da una grossa proteine di membrana di peso molecolare di circa 90.000 Dalton, la β-Amyloid Protein Precursor (β-APP). La β-ΑΡΡ, è una proteina presente sulla membrana piasmatica neuronaie e si trova in parte all'interno della membrana del neurone e in parte fuori del neurone (trasmenbranale). Quando questa proteina viene idrolizzata in due punti precisi, per azione di due enzimi, la β-secretase e la γ-secretase, si libera il peptide di 42 aminoacidi che diventa col tempo insolubile e precipita sui neuroni formando un aggroviglio di placche: le placche amiloidi che avvolgono e distruggono i neuroni attivi (1). Si verifica quindi un blocco della trasmissione sinaptica e un'atrofia cerebrale progressiva. E' stata anche osservata una forte diminuzioni di acetilcolina nel cervello, un neurotrasmettitore fondamentale per la funzionalità del cervello, con riduzione dunque della memoria e ogni altra facoltà intellettiva (2).

Nei soggetti sani quando la β-ΑΡΡ (β-Amyloid Protein Precursor) viene degradata in situ per azione di due enzimi digestivi. La α-secretasi e la βsecretasi (una variante della α-secretasi) tagliano una proteina precursore di grosse dimensioni (una proteina trasmembranale) denominata β-Amiloide Protein Precursor (β-ΑΡΡ) generando un frammento peptidico di 42 amminoacidi che è la β-amiloide. La β-amiloide, una volta generata, diventa insolubile e si deposita in aggregati extracellulari sulla membrana dei neuroni formando le placche amiloidi. Queste sono ammassi cellulari e che col tempo distruggono i neuroni sani e danno anche luogo ad un processo infiammatorio che attiva una risposta immunitaria richiamando macrofagi e neutrofili con produzione di citochine, interleuchine che contribuiscono al danno neuronaie. Altri studi hanno individuato che nei malati di Alzheimer interviene un ulteriore meccanismo patologico. All'interno dei neuroni, una proteina chiamata "Tau", fosforilata in maniera anomala, si accumula nei cosiddetti "aggregati neurofibrillari" distruggendo i neuroni colinergici delle aree corticali, sottocorticali e delle aree ippocampali. L'ippocampo è una struttura encefalica che svolge un ruolo fondamentale nell'apprendimento e nei processi di memoria e di conseguenza la distruzione dei neuroni di queste zone è ritenuta essere la causa principale della perdita di memoria.

Non esiste una cura specifica per la malattia di Alzheimer. E' stato osservato che nel cervello dell'Alzheimer si ha diminuzione dei livelli di acetilcolina, un neurotrasmettitore chimico a livello del sistema nervoso centrale e periferico. Inibitori della colinesterasi (l'enzima che catabolizza 1'acetilcolina) quali, per esempio, la fisostigmina, la galantamina, la neostigmina e la rivastigmina sono utilizzati in terapia allo scopo di attenuare la perdita di acetilcolina (3). Comunque, è da riportare che questi farmaci usati hanno solo una temporanea efficacia nel tempo.

Un'altra serie di farmaci sono quelli che agiscono direttamente sul sistema glutamatergico, come la memantina e il donepezil. Anche questi farmaci hanno una efficacia limitata nel tempo di trattamento (4).

Poiché le formazioni di placche amiloidi nel cervello Alzheimer sono accompagnate da una infiammazione in sito, vengono spesso usati farmaci ad azione antinfiammatoria. Infine, per la cura dell'Alzheimer viene anche usato il Gingko biloba (un estratto da radici di piante tropicali) sulla base dell'ipotesi che estratti di questa pianta sono in grado di migliorare il flusso ematico cerebrale (5) con un apporto di ossigeno.

Un nuovo approccio per la cura della malattia di Alzheimer è stato l'uso di inibitori delle β-secretasi. Sono stati proposti alcuni composti sintetici appartenenti ai derivati del diclorofenolo (6). Tuttavia, questi composti, per quanto abbiano dato risultati incoraggianti su animali da laboratorio, non sono stati utilizzati sull'uomo nella terapia di Alzheimer perché quando somministrati oralmente non sono in grado di oltrepassare la barriera ematoencefalica .

Infine, è stato proposta una cura fondata sull'immunoterapia con l'uso di vaccini a base di anticorpi anti-Beta-amiloide. Anche in questo caso la terapia non ha avuto successo perché 1'anticorpo non è in grado di oltrepassare la barriera ematoencefalica (7).

Oltre alla malattia di Alzheimer, esistono altri tipi di demenze senili che rientrano tutte in un quadro clinico di demenze vascolari, ossia sono caratterizzate dall'insufficiente afflusso di sangue cerebrale e quindi da una ridotto apporto di ossigeno e sostanze nutritive. La forma più comune di demenza senile è 1'arterosclerosi cerebrale provocata da ictus cerebrale o da una qualunque causa di interruzione del flusso sanguigno.

Alla luce di quanto sopra esposto risulta pertanto evidente l'esigenza di fornire nuove terapie per il trattamento della malattia di Alzheimer che non presenti gli svantaggi delle terapie note.

L'acido D-aspartico è un amminoacido naturale avente la stessa struttura chimica dell'acido L-aspartico (1'amminoacido fisiologico presente in forma libera nei tessuti animali ed è anche un costituente delle proteine), ma una differente configurazione spaziale (Fig. 1). L'acido D-aspartico fu scoperto per la prima volta nel 1977 nel cervello del mollusco marino Octopus vulgaris (8) ed in seguito è stato trovato nei tessuti endocrini e nervosi di diverse specie animali (9) incluso il ratto (10-13) e l'uomo (14-15). Elevati livelli dell'acido D-aspartico si trovano nel sistema nervoso degli embrioni di mammiferi incluso il ratto (12-13) e l'uomo (15). Invece, nell'adulto elevati livelli di D-aspartico si trovano nelle ghiandole endocrine (16-20). Recenti studi effettuati su alcuni molluschi marini hanno dimostrato che l'acido D-aspartico è presente nella retina ed ha un ruolo nel sistema visivo (21-22). Inoltre, esperimenti effettuati su fettine di ippocampo di topo hanno dimostrato che il D-aspartico è implicato nella plasticità sinaptica dei neuroni (23) ed, infine, esperimenti di water maze (metodo sperimentale per valutare l'apprendimento spaziale dei ratti e topi) effettuati su giovani ratti hanno dimostrato che esiste una diretta correlazione tra la concentrazione dell'acido D-aspartico nel cervello e la memoria spaziale (24). Interessante è riportare che nell'uomo è stato dimostrato che nel cervello di pazienti affetti dalla malattia di Alzheimer (tessuto cerebrale ottenuto post-mortem), la concentrazione dell'acido D-aspartico è significativamente ridotto rispetto al cervello delle persone non affette dalla malattia di Alzheimer (25). Nella materia bianca del cervello di Alzheimer la concentrazione dell'acido D-Aspartico è mediamente di 10.5 nmoli/g di tessuto mentre nel cervello delle persone sane è di 22.4 nmoli/g di tessuto. Valori simili sono riscontrati anche nella materia grigia (25). Inoltre, susseguenti studi condotti sul cervello di persone affette dalla malattia di Alzheimer e cervello sano, hanno dimostrato che anche in altre regioni del cervello, (corteccia frontale, ipotalamo, ippocampo, corteccia parietale ed occipitale, cervelletto, etc), la concentrazione dell'acido D-aspartico negli Alzheimer è stata riscontrata significativamente ridotta rispetto a quella che si trova nelle omologhe del cervello sano (26) (Fig. 2). L'autore della presente invenzione ha ora trovato che l'acido D-aspartico è un neurotrasmettitore endogeno nei neuroni del cervello di ratto e umano, è localizzato specificamente nelle vescicole sinaptiche (strutture neuronali contenenti neurotrasmettitori chimici) ed è coinvolto nell'apprendimento e memoria. Gli studi condotti dimostrano che l'acido D-aspartico nell'uomo è capace di migliorare l'apprendimento e memoria per attivazione dei recettori del D-aspartico presenti nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo che rappresentano le aree del cervello maggiormente implicate nell'apprendimento e memoria. Pertanto, l'acido D-aspartico nell'uomo costituisce un ausilio per il miglioramento della memoria, ad esempio, nei casi di malattia di Alzheimer e nelle demenze senile. In modo simile può essere impiegato l'acido L-aspartico che costituisce il precursore chimico per la sintesi dell'acido D-aspartico. Infatti, per opera di una racemase endogena, L-aspartico viene convertito in D-aspartico.

Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione composti scelti tra Acido D-Aspartico, Acido L-Aspartico, loro sali o loro combinazioni per l'uso nel trattamento delle demenze per il ripristino dell'attività cognitiva e di memoria, in cui le demenze sono ad esempio malattia di Alzheimer o demenze senili.

Costituiscono ulteriore oggetto della presente invenzione, combinazioni comprendenti o consistenti in Acido D-Aspartico e Acido L-Aspartico o loro sali per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento delle demenze, quali ad esempio malattia di Alzheimer o demenze senili, per il ripristino dell'attività cognitiva e di memoria.

La presente invenzione concerne l'uso assoluto (100%) dell'acido D-Aspartico (o dei suoi sali) o dell'uso assoluto (100%) dell'acido L-aspartico (o dei suoi sali). Inoltre, l'invenzione concerne combinazioni comprendenti o consistenti in Acido D-Aspartico e Acido L-Aspartico o loro sali per l'uso menzionato sopra, in cui la percentuale di acido D-aspartico o quella di L-aspartico o dei loro sali varia da 0.1% a 99.9% sul totale di detti acidi o sali.

I sali di acido D-Aspartico o di acido L-aspartico possono essere scelti dal gruppo che consiste in sali di Sodio, Potassio, Calcio, Magnesio, Zinco, Selenio, rame, manganese, iodio.

Le combinazioni secondo l'invenzione possono comprendere ulteriormente almeno un amminoacido scelto nel gruppo che consiste in Acido D- o L-glutammico; D-o L-asparagina; D- o L-Glutammina; D- o L-Serina; D-o L-Alanina; D- o L-Treonina; D- o L-Istidina, D- o L-Arginina; D- o L-Cysteina; D- o L-Cystina; D- o L-Valina; D- o L-Metionina; D- o L-Tyrosina; D- o L-Fenialanina; D- o L-Isoleucina; D- o L-Leucina; D- o L-Serina; D- o L-Carnitina o D- o L-Acetil-carnitina.

Le combinazioni dell'invenzione possono inoltre comprendere un ketoacido o un suo sale, quale ad esempio acido alta-ossalacetico, acido alfaketoglutarico .

Secondo un ulteriore aspetto, le combinazioni dell'invenzione possono comprendere almeno una vitamina idrosolubile e/o liposolubile.

Tra le vitamine idrosolubili possono essere citate le seguenti:

Vitamina B1 (tiamina)

Vitami na B2 (riboflavina)

Vitami na B3 o Vitamina PP (niacina o acido nicotinico )

Vitami na B5 o Vitamina W (acido pantotenico) Vitami na B6 o Vitamina Y (piridossina o piridossami na o piridossale)

Vitami na B8 o Vitamina H (biotina)

Vitami na B9 o Vitamina M (acido folico)

Vitami na B12 (cobalamina)

Vitami na C (acido ascorbico)

Tra le vitamine liposolubili possono essere citate le seguenti

Vitami na A (retinolo ed analoghi)

Vitami na D (ergocalcif erolo D2e colecalciferolo D3)

Vitamina E (tocoferolo)

Vitamina K (naftochinone e derivati)

Inoltre, le combinazioni dell'invenzione possono comprendere almeno un ossidante scelto tra:

Coenzima Q-10

Acido ascorbico

Glutat ione

Malat onina

Tocoferoli e tocotrienoli (Vitamina E)

Superossido dismutasi

Sistema tioredossina e glutatione

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati in cui:

Figura 1 mostra la composizione 5 configurazione stereo chimica della molecola Acido D-Aspartico (D-Asp) , Acido L-Aspartico (L-Asp) .

Figura 2 mostra la concentrazione dell'acido D-aspartico in varie regioni del cervello Alzheimer e normale (controllo). I valori della figura si riferiscono alla concentrazione dell'acido D-aspartico determinato nell 'omogenato totale del tessuto cerebrale.

Figura 3 mostra un esempio di separazione dell'acido D-aspartico e dell'acido L-aspartico dagli altri amino acidi all'HPLC. La figura mostra un tipico cromatogramma di una corsa all'HPLC di una miscela di amminoacidi standard costituita da 20 picomoli di acido D-aspartico e 100 picomoli di L-aspartico e altri L-amminoacidi (L-Glu,L-Ser-L-His, L-Thr, Gly, L-Arg, L-Ala, L-Tyr, L-Val, L-Met, L-Ile, L-Leu, L-Phe e L-Lys), derivatizzati con OPA-NAC (ortoftaldialdeide-N-acetyl-L-Cisteine ). L'acido D-aspartico si separa dagli altri amminoacidi e può essere quantificato sulla base dell'area del picco.

Figura 4 mostra Sinaptosomi e vescicole sinaptiche dal cervello umano. La figura mostra un tipico esempio di sinaptosomi e di vescicole sinaptiche purificate dal cervello umano di una persona sana di circa 30 anni. I sinaptosomi (0.8-1.5 pm di grandezza) rappresentano le estremità periferiche del neurone e sono pieni di vescicole sinaptiche (40-70 nm di grandezza) contenenti i neurotrasmettitori chimici.

Esempio 1 : Studio sul ruolo degli acidi D-Aspartico e L-aspartico nel ripristino della memoria in pazienti affetti della malattia di Alzheimer e in altre demenze senili

Lo studio svolto è suddiviso nelle seguenti fasi: 1) Dimostrazione che nel cervello umano l'acido D-aspartico è presente nelle vescicole sinaptiche (particelle subcellulari delle terminazioni nervose contenenti i neurotrasmettitori chimici che sono coinvolto nella trasmissione sinaptica); esiste un meccanismo di sintesi dell'acido D-aspartico nei neuroni a partire dell'acido L-aspartico; i neuroni posseggono recettori specifici per l'acido D-aspartico responsabili della comunicazione tra un neurone e 1'altro.

2) Dimostrazione che l'uso dell'acido D-aspartico in pazienti affetti dalla malattia di Alzheimer incrementa le capacità cognitive e memoria.

1.1 Metodo per la determinazione dell'acido D-aspartico all'HPLC

La determinazione dell'acido D-aspartico e di altri amminoacidi nel cervello umano è stata effettuata modificando il metodo descritto in (27) come segue. 0.5 g di cervello umano (Alzheimer o normale) è stato omogeneizzato in acido perclorico 0.2 M in rapporto di 1:10, poi centrifugato a 13.000 rpm per 5 min. 10 μΐ del sovranatante (campione) sono mescolati con 200 μΐ di tampone borato 0.2 M, pH 10.0 e 20 μΐ di OPA-NAC (OPA-N-acethyl cisteina; costituito di 20 mg di OPA e 10 mg di N-acetylcisteina in 2 mi di metanolo al 50%), dopo 2 min si aggiunge 900 μΐ di H20 distillata e infine 100 μΐ di questa miscela si iniettano sulla colonna di HPLC (High Liquid Chromatography) usando un programma di corsa costituito da una soluzione A (citrato fosfato 0.03 M pH 5.3 contenete 5% di aceto nitrile) e una soluzione B (costituito da 90% aceto nitrile). Il programma corsa era: 0-10% di B in 10 min, poi 10-100% di B in 7 min, poi 100% di B in 5 min e 0% di B in 1 min. Con questo programma l'acido D-Asp esce ad un tempo di eluizione di 5.5 min seguito da L-Asp a 6.2 min e da L-Glu a 8.0 min e poi da altri amminoacidi. Come standard veniva usato una miscela costituita da 0.1 mM acido D-aspartico e 0.2 mM di altri amino acidi al posto del campione. La stessa procedura è stata effettuata per determinazione della concentrazione del D-Asp e altri amminoacidi nell'omogenato di cervello intero umano Alzheimer e controllo e nelle vescicole sinaptiche isolate da questi tessuti cerebrali. In questo caso, 100 μΐ di una sospensione di vescicole sinaptiche ottenuto come descritto nel prossimo paragrafo sono stati omogeneizzati con 100 μΐ di acido perclorico 0.2 M e centrifugato come sopra e il sovranatante usato come campione per la determinazione degli amminoacidi. I cervelli di pazienti Alzheimer e i cervelli normali sono stati ottenuti post-mortem dalla banca organi della Loyola Università di Chicago (USA). In Fig. 3 viene riportato in tipico esempio di determinazione dell'acido D-Asp e di altri aminoacidi (Fig. 3).

1.2 Determinazione dell'acido D-aspartico nel cervello tal quale e nelle vescicole sinaptiche

dal cervello di pazienti sani e Alzheimer

Lo scopo di questo esperimento è verificare se l'acido D-aspartico è presente come neurotrasmettitore nelle vescicole sinaptiche (particelle subcellulari delle terminazioni del neurone di grandezza 40-60 nm) e se esiste una differenza di concentrazioni tra cervello Alzheimer e cervello di controllo. Per isolare le vescicole sinaitiche, è stato eseguito l'isolamento dei sinaptosomi, strutture biologiche circolari di 0.8-1.5 μπι e che rappresentano la parte terminale delle terminazioni nervose (dendriti) . Essi si ottengono per omogeneizzazione del tessuto nervoso con una soluzione isoosmotica di saccarosio. I sinaptosomi contengono le vescicole sinaptiche che sono ricche di neurotrasmettitori chimici quali: 1'acetilcolina, acido L-glut ammico, acido L-aspartico serotonina, GABA, etc. La preparazione dei sinaptosomi è stata effettuata come segue: 1 g di tessuto cerebrale è stato omogeneizzato in 20 mi di 0.32 M saccarosio in 0.05 M Tris-HCl, pH 7.5 con un potter omogeneizzatore di vetro con distanza pistone-pareti di vetro di 15-20 A. L'omogenato è stato poi centrifugato a 1.000 g per 10 min ed il sovranatante è stato centrifugato a 22.000 g per 20 min. Il risultante precipitato è stato ripreso in 4 mi di saccarosio 0.32 M e stratificato su un gradiente di saccarosio costituito da 20 mi di saccarosio 1.2 M e 20 mi di saccarosio 0.8 M e poi centrifugato a 22.000 g per 2 ore. La frazione sinaptosomiale visibile tra 1'interi accio tra la soluzione 1.2 M e 0.8 M di saccarosio è stata prelevata e diluita con un eguale volume tampone fisiologico (125 mM NaCl, 3 mM KC1, 1.2 mM MgS04, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2P04, 22 mM glucose, 10 mM Na2HC03pH 7.4) e centrifugato per 90 min at 22.000 g . Il precipitato (sinaptosomi) è stato ripreso in 400 μΐ di 0.32 M di saccarosio, pH 7.4 e stratificato su un secondo gradiente costituito da 5 mi di saccarosio 1.2 M, 5 mi di saccarosio 0.95 M e 5 mi di saccarosio 0.75 M rispettivamente e centrifugato a 22.000 g per 90 min. La frazione sinaptosomiale situata nell'interfaccia tra lo 0.95 M e 0.75 M di saccarosio veniva prelevata e diluita in 4 mi di tampone fisiologico e analizzata alla microscopia elettronica. Per la preparazione delle vescicole sinaptiche (SV), 3 mi della sospensione di sinaptosomi sono stati diluiti con 30 mi H20 distillata per rompere i sinaptosomi per osmosi (le vescicole essendo troppo piccole non si rompono) e lasciato per 30 min ad agitare. Poi è stta eseguita la centrifugazione per 20 min a 22.000 g ed il pellet costituito da vescicole sinaptiche purificate è stato ripreso in 0.5 mi di NaCl 0.9%. Una parte del pellet è stata usata per la morfologia al microscopio elettronico ed una parte è stata utilizzata per l'analisi del contenuto dell'acido D-aspartico. A tal uopo il pellet di vescicole sinaptiche è stato omogeneizzato con un doppio volume di acido perclorico 0.2 M (per rompere le vescicole e recuperare gli amminoacidi in esse contenute) e centrifugato per 5 min a 22.000 g. Il sovranatante è stato poi analizzato all'HPLC per il contenuto dell'acido D-aspartico e di altri amminoacidi. In Fig. 4 viene riportato un esempio di un preparato di sinaptosomi e vescicole sinaptiche ottenuto da un cervello umano normale, mentre nella Tabella 1 viene riportato la concentrazione dell'acido D-aspartico e di altri amminoacidi nell'omogenato di cervello in toto e nelle vescicole sinaptiche ottenute dal cervello di pazienti Alzheimer e di pazienti sani. Il risultato ottenuto da quest'esperimento dimostra che l'acido D-aspartico è presente nel cervello in quantità molto piccole rispetto al agli altri amminoacidi; ma nelle vescicole sinaptiche esso si trova ad una alta concentrazione in paragone degli altri amminoacidi presente nelle vescicole (Tabella 1). Questo significa dunque che l'acido D-aspartico che si trova nel cervello è tutto concentrato nelle vescicole sinaptiche, cioè in quelle strutture subcellulari che contengono i neurotrasmettitori chimici. Questo pattern di concentrazioni è simile a quello che accade per 1'acetilcolina e dissimile al L-glutammico. Infatti, anche 1'acetilcolina nel cervello si trova prevalentemente nelle vescicole sinaptiche e come tale funge da neurotrasmettitore, invece L-glutammico si trova ad alte concentrazione in tutto il tessuto nervoso incluso le vescicole sinaptiche. Evidentemente l'acido L-glutammico assolve ad un ruolo metabolico e anche come neurotrasmettitore. In conclusione, l'acido D-aspartico può essere considerato un nuovo neurotrasmettitore chimico implicato nei processi di apprendimento e memoria poiché come è riportato più avanti, l'assunzione di un integrazione a base di D-Aspartico nei pazienti Alzheimer migliora la memoria (vedi appresso). A conferma di questa ipotesi è la dimostrazione che nel cervello di pazienti Alzheimer il contenuto dell'acido D-aspartico è significativamente ridotto rispetto al cervello di pazienti controllo. La Tabella 1 mostra la concentrazione dell'acido D-aspartico (D-Asp), L-aspartico (L-Asp) ed L-glutammico (L-Glu) nel cervello intero di pazienti normali e Alzheimer e nelle vescicole sinaptiche ottenute dagli stessi cervelli

Cervello Umano Alzheimer

D-Asp L-Asp L-GIu Aminoacidi totali

Omogenato cervello

nmol/g cervello<*>18.5±5.2 3.900±450 5.750±740 47.300±5.240 % rispetto agli AAs totali<**>0.039±0.01 8.24±0.92 12.2±1.3 100

nmoli/mg proteine<***>0.34±0.15 36.4±4.1 48.4±4.8 540 ±50

Vescicole sinaptiche

nmoli/mg proteine<***>205±18 270±30 330 ±41 2.650±250 % rispetto agli AAs totali<**>7.7±1.0 10.1 ±1.1 12.4±1.4 100

Rapporto AAs/mg<****>602 7.41 6.81

di proteine

* Esprime le nmoli di D-Asp, L-Asp, L-Glu e degli amino acidi liberi totali contenuto nell'omogenato da 1 g di cervello.

** Indica il rapporto in percento della concentrazione del singolo amminoacido nei confronti degli amminoacidi totali. *** Esprime le nmoli degli amminoacidi riferiti ad 1 mg di proteine totali (solubili e insolubili) del campione di vescicole.

****Esprime il rapporto degli amminoacidi espressi come nmoli/mg di proteine del campione tra quelli presenti elle vescicole sinaptiche purificate e quelli contenuto nell'omogenato di cervello.

1.3 Sintesi dell'acido D-aspartico nel cervello umano Normale e Alzheimer

Poiché l'acido D-aspartico nel cervello viene sintetizzato ad opera di una D-aspartato racemasi, un enzima trovato in alcuni molluschi marini (28) che trasforma L-aspartico in D-aspartico (EC 5.1.1.13), in questo studio è stato indagato se anche nel cervello umano fosse presente questo enzima e se c'è differenza di attività enzimatica tra il cervello umano affetto dalla malattia di Alzheimer e il cervello umano controllo .

Il saggio enzimatico è fondato sulle seguenti reazioni: 1) Acido L-aspartico D-aspartato racemasi = Acido D-aspart ico

2) Acido D-aspartico 02+ Η20 D-aspartato ossidasi = α-ossalacetato H2O2 NH3

3) Ct-ossalacetato 2,4-dinitrofenilidrazine = (X-ossalacetato-dinitrofenilidrazina (colore giallo)

4) α-oxaloacet ato-dinitrofenilidrazina NaOH=aoxaloacetate-dinitrofenilidrazone complex (forte colore rosso porpora).

La procedura di saggio enzimatico era la seguente: 0.5 g di cervello Alzheimer o cervello di controllo è stato omogeneizzato (1:5) in 0.02 M tampone fosfato pH 8.0. Poi 500 μΐ del sovranatante sono mescolati con 100 μΐ of L-aspartato di Na 1 M (campione) o 100 μΐ di H20 distillata (bianco campione) e 10 μΐ di D-aspartato ossidasi purificato dal rene di coniglio (22) ed incubato per 2 ore at 37°C. Poi alla miscela di saggio è stato aggiunto 50 μΐ of 5 M acido perclorico, mescolato e centrifugato at 13.000 rpm per 5 min. Poi 500 μΐ del sovranatante è mescolato con 100 μΐ of 2,4-dinitrophenylhydrazine (1 mM in HC1 1 M) and lasciati per 20 min a temperature ambiente . Poi è stato aggiunto 200 μΐ of NaOH 4 M, mescolato e centrifugato a 13.000 rpm per 5 min. Il sovranatante è letto a 445 nm contro H20 distillata. Infine le D.O. del bianco campione sono sottratte dalle D.O. del campione e le D.O. nette sono indice di attività racemasi presente nel tessuto cerebrale. Per la misura dell'attività enzimatica è stato assunto che l'attività enzimatica che produce un'intensità di colore corrispondente a 1 D.O. a 445 nm e nelle condizioni di saggio enzimatico è eguale ad 1 Unita Enzimatica. Poiché in 100 μΐ della miscela di saggio c'è una quantità di enzima proveniente da 20 mg di tessuto si ricava che 1 g di tessuto contiene 50 Unità enzimatiche.

Nella Tabella 2 sono riportate le unità enzimatiche ottenute da 1 g di cervello di persone colpite da Alzheimer e da 1 g di cervello di persone sane (controllo) . Come si può notare l'attività enzimatica della racemasi nel cervello Alzheimer è ridotta significativamente e questo fenomeno è concorde con il fatto che nel cervello Alzheimer anche il contenuto dell'acido D-Asp è significativamente a concentrazioni più basse che nei controlli.

La Tabella 2 mostra l'attività enzimatica della D-aspartato racemasi (sintesi dell'acido D-Asp) nel cervello di pazienti sani e affetti dalla malattia di Alzheimer .

Tabella 2

D-Aspartato racemasi

(Unità enzimatiche/g di tessuto cerebrale)

Cervello Normale Cervello Alzheimer

Paziente n. 1 74 Paziente n. 1 55

Paziente n. 2 68 Paziente n. 2 41

Paziente n. 3 59 Paziente n. 3 39

Paziente n. 4 72 Paziente n. 4 45

Paziente n. 5 45 Paziente n. 5 28

MediaiSD 63.6±11.8 41.6±9.8

I risultati sono stati ottenuti da 5 pazienti affetti dalla malattia di Alzheimer e da 5 pazienti non affetti da questa malattia. Entrambi i gruppi di persone avevano un'età compresa tra i 70 e gli 80 anni. T test (T di Student) tra i pazienti Alzheimer e normali è P<0.000234

1.4 Recettori dell'acido D-aspartico nel cervello umano sano e nel cervello Alzheimer

I recettori per i neurotrasmettitori chimici del sistema nervoso. Sono proteine della membrana del neurone postinaptico, e costituiscono gli elementi essenziali per captare 1'imput trasmesso dal neurotrasmettitore per poi a sua volta trasformali fisiologici per la cellula (segnali visivi, di memoria etc). Nel presente studio è stato verificato se esistono nel cervello di Alzheimer i recettori dell'acido D-aspartico e se esiste una differenza di tali recettori nel cervello Alzheimer rispetto al cervello controllo. Per tale scopo sono stati effettuati esperimenti di affinità (binding) usando D-aspartico radioattivo (D-[<3>H]aspartic acid) ed in accordo con la procedure descritta in letteratura (29), modificata come segue: 0.5 g di tessuto cerebrale è stato omogeneizzato 1:10 in NaCl 0.9% . Centrifugato a 13.000 rpm per 10 min. Allontanato il sovranatante e ripreso il precipitato con 10 mi di NaCl 0.9%. Centrifugato come sopra e ripetuta l'operazione di lavaggio per altre 4 volte. Infine l'ultimo precipitato è ripreso in 2 mi di NaCl 0.9% e su questo effettuato il saggio di binding come segue: 100 μΐ di sospensione di membrane venivano mescolati con 100 μΐ of D-[<3>H]aspartate (100 nM) e 300 μΐ of tampone fosfato 0.05M pH 7.4. Poi 5.0 μΐ di ciascun amminoacido da testare alla concentrazione tra 0 e 0.1 mM veniva aggiunto alla miscela di saggio e incubato per 60 min a 20°C sotto agitazione. Poi il campione veniva centrifugato per 5 min a 13.000 rpm in Epperdorf da 2 mi e il sovranatante decantato. Il pellet veniva lavato per altre 2 volte in tampone fosfato 0.05 M pH 7.4 e finalmente il precipitato veniva sciolto in 400 μΐ di NaOH 0.1 M. Infine mescolato con 3 mi di liquido di scintillazione e determinata la radioattività (conta delle CPM) e calcolata l'affinità di membrane secondo i metodi descritti (29). I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 3. Come si può vedere dai valori riportati in detta tabella il cervello umano possiede recettori ad alta affinità verso l'acido D-aspartico. Si tratta di specifici recettori per questo amminoacido e non recettori del glutammato al quale l'acido D-aspartico si lega. Questa considerazione si ricava dal fatto che l'acido D-Aspartico radiattivo, che è stato precedentemente legato alla membrana, si stacca dalla stessa membrana quando viene usato nella miscela di binding l'acido D-aspartico non radioattivo (freddo) e questo accade a bassissima concentrazione di D-Asp. Invece, l'acido L-glutammico e l'acido L-aspartico non hanno una bassa affinità nel spostare il legame D-aspartico-membrane indicando che i recettori a cui si è legato il D-Asp è un recettore specifico per questo amminoacido. E' da osservare che più bassa è la concentrazione dell'amminoacido freddo che sposta il radioattivo, più c'è affinità di legame. NMDA e gli altri anche a concentrazioni di 100 mM non sono capaci per niente di spostare il legame del D-aspartico radioattivo. Ciò indicherebbe che questi amminoacidi non hanno alcuna capacità sui recettori del D-Asp.

Per ultimo, è importante osservare che nell'ambito del cervello Alzheimer e controllo, il cervello Alzheimer possiede una significativa riduzione di questi recettori rispetto al cervello normale. Infatti come mostra la Tabella 3, il Ki (costante di inibizione o costante di affinità), che indica la concentrazione a cui il 50% dei legami di binding vengono spostati dall'amminoacido freddo, è di 0.45±0.04mM con le membrane ottenute dal cervello Alzheimer e di 0.22±0.02 mM nel caso delle membrane ottenute dal cervello di controllo.

La tabella 3 mostra l'attività dei recettori dell'acido D-aspartico (Spostamento dei legami specifici per D-[<3>H]Asp da parte di vari amminoacidi ed aminoacidi analoghi sulle membrane post sinapt iche (PSMs) ottenute dal cervello di pazienti Alzheimer e da pazienti normali) .

La concentrazione del D-[<3>H]Asp nel saggio di binding era 100 nM egli amminoacidi o gli amminoacidi analoghi erano tra 0 e 100 μΜ . La costante di inibizione (Ki) indica la concentrazione degli amminoacidi capace di spostare il 50 % dei legami di binding. In valori indicano la media±SD ottenuti da 4 esperimenti, ciascuno effettuate su membrane piasmatiche provenienti dal cervello di Alzheimer o controllo. I valori >100 indicano che 1'amminoacido testato per lo spiazzamento era completamente inattivo. L'affinità dell'amminoacido verso i recettori di membrane è tanto più forte (specifico) quanto più basso è la concentrazione dell'amminoacido che ha spostato il 50% dei legami del (D-[<3>H]Asp) alla membrane.

1.5 Accumulazione dell'acido D-aspartico e L-aspartico nel cervello e nelle vescicole sinaptiche del ratto dopo trattamento del D-aspartico esogeno Lo scopo di quest'esperimento era di conoscere se l'acido D-aspartico assunto per via orale entra nel cervello e se viene trasportato nelle vescicole sinaptiche onde esplicare la sua azione di neurotrasmettitore. L'esperimento è stato condotto su ratti adulti del ceppo Wistar (tenuti in gabbie e in ambienti idonei secondo le norme ministeriali). Ai ratti del primo gruppo costituito da 5 animali è stato fatto bere una soluzione di D-aspartato di sodio 20 mM. Ad un secondo gruppo di 5 ratti veniva dato da bere L-aspartato di sodio alla concentrazione di 20 mM e infine al terzo gruppo di 5 ratti veniva dato da bere acqua di fonte. La durata del trattamento era di 15 giorni. Alla fine del trattamento i ratti venivano sacrificati, prelevato il cervello e omogeneizzato 1:10 in saccarosio 0.32. Una parte (1/10) di ciascun omogenato veniva usata per l'analisi degli amminoacidi (vedi capitolo 1.1), e la restante parte veniva usata per la preparazione delle vescicole sinaptiche secondo la procedura descritta sopra (vedi capitolo 1.2. Infine, veniva determinato il contenuto dell'acido D-aspartico nell 'omogenato intero e nelle vescicole sinaptiche. I risultati ottenuti da questo esperimento che sono presentati nella Tabella 4, indicano dunque che quando un ratto riceve D-aspartato di sodio alla concentrazione di 20 mM per via orale, la concentrazione di questo amminoacido nel cervello incrementa di 2.42 volte rispetto al controllo (ratto che ha bevuto acqua di fonte). Interessante è l'osservazione che di tutto il D-aspartico presente nel cervello intero, almeno la metà (56%) viene trasportato nelle vescicole sinaptiche, che in termini di massa cellulare rappresentano circa la millesima parte della massa del tessuto cerebrale. Dunque questo dato dimostra che l'acido D-aspartico ha un ruolo specifico nelle vescicole sinaitiche, ossia quello di neurotrasmettitore. Oltre a questo dato, i risultati esposti nella tabella 4 dimostrano che se l'animale beve l'acido L-aspartico al posto del D-aspartico, anche una significativa aumentata concentrazione dell'acido D-aspartico si trova accumulata nel cervello e nelle vescicole sinaptiche, rispetto al controllo (Tabella 4). Questo risultato dunque dimostra che l'acido L-aspartico esogeno come anche quello endogeno si trasforma in D-aspartico ad opera di una racemasi endogena.

La tabella 4 mostra la concentrazione dell'acido D-aspartico nel cervello in toto e nelle vescicole sinaptiche nel ratto dopo assunzione di D-Asp 20 mM o L-Asp 20 mM o H20.

Tabella 4

Gruppi di ratti che hanno bevuto 20 mM sodio D-Aspartato

nmoli/g di cervello nmoli/mg di proteine

Cervello in toto<*>85±10.5 0.65±0.2

Vescicole sinaptiche’ 48±5.6 620±55

Gruppi di ratti che hanno bevuto 20 mM sodio L-Aspartato

nmoli/g di cervello nmoli/mg di proteine

Cervello in toto’ 48±4.5 0.25±0.04

Vescicole sinaptiche’ 24±4.0 220±35

Gruppi di ratti che hanno bevuto acqua di fonte (controllo)

nmoli/g di cervello nmoli/mg di proteine

Cervello in toto<*>35±4.2 0.18±0.02

Vescicole sinaptiche’ 18±3.4 150±18

SG/A-16988 I valori rappresentano la medialSD ottenuti da 5 ratti adulti trattati con 20 mM D-Aspartato di sodio o con 20 mM L-Aspartato di sodio o con acqua di rubinetto (controllo). * Indica le nmoli del D-Asp contenuto in 1 g di omogenato di cervello oppure alle nmoli riferito al contenuto di 1 mg di proteine totali (solubile ed insolubile).

** Indica le nmoli del D-Asp contenuto nelle vescicole sinaptiche preparate da 1 g di cervello oppure le nmoli riferite ad 1 mg di proteine totali (solubile ed insolubile).

1.6 Uso del D-aspartato per il recupero dell'apprendimento e memoria in pazienti

affetti dalla malattia Alzheimer

Alla luce dei risultati sopra ottenuti è stato intuitivo pensare che la somministrazione via orale di sodio D-aspartato alla persone colpite dalla malattia di Alzheimer potesse migliorare le condizione cognitive e di memoria in questi pazienti. Per cui è stato effettuato una sperimentazione su un gruppo di 6 pazienti diagnosticati affetti dalla malattia di Alzheimer ad uno stadio clinico tra moderato e grave. Tali pazienti non erano sotto alcuna terapia di farmaci anti Alzheimer.

Ad ogni paziente veniva dato per via orale una soluzione costituita da 10 mi di sodio D-aspartato alla concentrazione di 2 M ( 2.66 g di acido D-aspartico corrispondente a 3.12 g di SodioD-aspartato ) mescolata in mezzo bicchiere di acqua o di succo di frutta dopo pranzo o cena. La soluzione del sodio D-aspartato che veniva data al paziente era costituita da un integratore alimentare autorizzato dal ministero della salute e coperto di brevetto e commercializzato sotto forma di DADAVIT® e usato come integratore per altri scopi. La sperimentazione aveva la durata di 30 giorni e veniva effettuata sotto controllo medico. Dopo tale periodo sono stati valutati alcuni sintomi specifici per la malattia di Alzheimer (sotto riportati) e confrontati con quelli dello stesso paziente primo della terapia.

I sintomi usati per il corrente studio sono stati i seguenti e i risultati ottenuti sono presentati nella Tabella 5.

Amnesia: I pazienti affetti da demenza di Alzheimer hanno buon ricordo delle cose passate ma non ricordano delle cose recenti essenziali come per es. dimenticano il luogo dove si trovano, non ricordano per es. dove si trova la toilette della loro casa, etc.

Aprassia: Incapacità di compiere azioni comuni: fischiettare, preparare il caffè, cucinare, fare dei disegni .

Agnosia: L'incapacità di riconoscere cose comuni come per es. frutta, animali domestici, etc.

Anomalia: Incapacità a denominare un oggetto, pur riconoscendolo .

Disorientamento spazio-temporale : Incapacità di ricordarsi il giorno o il mese o la stagione o l'anno, come anche incapacità di ricordarsi il luogo ove si trova.

Agrafia: Il soggetto ha difficoltà di scrittura. Nelle forme più gravi non riesce a scrivere nemmeno la propria firma.

Cambiamenti dell'umore: Il soggetto tende a cambiare umore repentino. Dalla depressione, all'euforia, al pianto associato anche a depressione, ansia, insonnia, agitazione .

Problemi linguistici: Il soggetto trova difficoltà a denominare un oggetto.

Perdita di iniziative: Perdita di ogni iniziativa e di interesse.

I risultati ottenuti in questo studio e presentati nella sia pure limitato a solo 6 pazienti, danno una chiara indicazione che l'uso del sodio D-Aspartato nei pazienti Alzheimer migliora in tutti i soggetti l'apprendimento e memoria con un ripristino delle attività cognitive di almeno il 40-60 %. La tabella 5 mostra la valutazione del recupero di apprendimento e memoria sullo stato di miglioramento dei pazienti Alzheimer (tra moderato e grave) sottoposti al trattamento con sodio D-aspartato.

Tabella 5

Amnesia Aprassia Agnosia Anomalia Disorientamento Agrafia Cambiamento Problemi Perdita

Spazio-temporale di umore linguistici di iniziative

Paziente n. 1 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

Maschio 77 anni 40-50% 40-50% 40-50% 50-60% 60-70% 30-40% 50-60% 40-50% 30-40%

gravità =moderata

Paziente n. 2 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

Maschio 80 anni 45-55% 45-55% 40-50% 45-65% 55-65% 35-45% 60-665% 35-45% 45-55%

gravità =moderata

Paziente n. 3 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

Maschio 74 anni 30-40% 25-35% 35-45% 35-45% 45-55% 25-35% 40-50% 30-40% 25-353 gravità =grave

Paziente n. 4 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

Femmina 81 anni 55-65% 55-65% 55-65% 55-65% 50-60% 45-55% 45-55% 55-65% 35-45%

gravità =moderato

Paziente n. 2 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

maschio 79 anni 35-45% 35-45% 35-45% 55-65% 45-55% 45-55% 65-75% 70-80% 35-45%

gravità =moderato

Paziente n. 2 ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino ripristino

maschio 81 anni 20-30% 20-30% 20-30% 35-45% 35-45% 0-30% 30-40% 35-45% 25-35%

gravità =grave

La valutazione viene espressa in termini di ripristino di quella specifica funzione nei confronto con persone della stessa età e non Alzheimer (valore=100%)

Conclusioni

In conclusione, tutti i risultati sperimentali, sia quelli effettuati in vitro sul tessuto umano o di ratto, sia lo studio effettuato in vivo, cioè direttamente su un gruppo di persone affette dalla malattia di Alzheimer, concorrono a dimostrare che l'acido D-Aspartico o un suo sale è implicato nel recupero nell'apprendimento e memoria.

Inoltre, anche l'acido L-Aspartico (o un suo sale) è implicato nel miglioramento della memoria negli Alzheimer, e questo è dovuto al fatto che se l'acido L-aspartico viene assunto per via orale, una parte di esso si trasforma in acido D-aspartico ad opera della D-aspartato racemase endogena e quindi esercita comunque la sua azione sulla memoria, sia pure con minore efficienza rispetto al solo uso dell'acido D-aspart ico.

Infine, dal momento che il miglioramento della memoria dovuto all'uso dell'acido D-aspartico o dell'acido L-aspartico sono causati dall 'aumentata concentrazione di questa molecola nelle vescicole sinaptiche dei neuroni cerebrali, e quindi anche della neurotrasmissione, il miglioramento della memoria può avvenire anche in pazienti affetti da altre demenze senili .

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Claims (9)

1. RIVENDICAZ IONI 1. Composti scelti tra Acido D-Aspartico, Acido L-Aspartico, loro sali o loro combinazioni per l'uso nel trattamento delle demenze quali la malattia di Alzheimer e le demenze senili.
2. 2. Combinazioni comprendenti o consistenti in Acido D-Aspartico e Acido L-Aspartico o loro sali per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento delle demenze quali la malattia di Alzheimer e le demenze senili.
3. 3. Composti come definiti nella e per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui l'acido D-Aspartico o l'acido L-Aspartico o i loro sali sono impiegati non in combinazione tra loro.
4. 4. Combinazioni comprendenti o consistenti in acido D-Aspartico e acido L-Aspartico o loro sali per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui la percentuale di acido D-aspartico o quella di L-aspartico o dei loro sali varia da 0.1% a 99.9% sul totale di detti acidi o sali.
5. 5. Composti o combinazioni come definiti in e per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui i Sali di acido D-Aspartico o di acido L-aspartico sono scelti dal gruppo che consiste in Sali di Sodio, Potassio, Calcio, Magnesio, Zinco, Selenio, rame, manganese, iodio.
6. 6. Combinazioni come definite in e per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette combinazioni comprendono ulteriormente almeno un amminoacido scelto nel gruppo che consiste in Acido D o L-glutammico; D- o L-asparagina; D- o L-Glutammina; D- o L-Serina; D- o L-Alanina; D- o L-Treonina; D- o L-Istidina, D- o L-Arginina; D- o L-Cysteina; D- o L-Cystina; D- o L-Valina; D- o L-Metionina; D- o L-Tyrosina; D- o L-Fenialanina; D- o L-Isoleucina; D-o L-Leucina; D- o L-Serina; D- o L-Carnitina o D- o Li-Aceti1-carnitina .
7. 7. Combinazioni come definite in e per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette combinazioni comprendono ulteriormente un ketoacido o un suo sale.
8. 8. Combinazioni come definite in e per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette combinazioni comprendono ulteriormente almeno una vitamina scelta nel gruppo che consiste in Vitamine idrosolubili quali Vitamina Bl, Vitamina B2, Vitamina B3, Vitamina PP, Vitamina B5, Vitamina B6, Vitamina Y, Vitamina B8, Vitamina B9, Vitamina B12, Vitamina C o Vitamine liposolubili quali Vitamina A, Vitamina D, Vitamina E, Vitamina K.
9. 9. Combinazioni come definite in e per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui dette combinazioni comprendono ulteriormente almeno un antiossidante scelto nel gruppo che consiste in Coenzima Q-10, Acido ascorbico, Glutatione, Melatonina, Tocoferoli, tocotrienoli, Superossido dismutasi, Sistema tioredossina o glutatione