CN110312522A - 赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶-1抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了用于免疫检验点抑制的方法和组合物中的赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶‑1(LSD1)抑制剂。本发明还涉及蛋白质分子及其在改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)或(v)间充质细胞向上皮细胞转化(MET)中的至少一种中的用途。

Description

赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶-1抑制剂及其用途
本申请要求于2016年9月7日提交的题为“Inhibitors and Uses Therefor”的澳大利亚临时申请第2016903602号的优先权，其全部内容通过引用特此并入本文。
发明领域
本发明大体上涉及用于免疫检验点抑制的方法和组合物中的赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶-1(LSD1)抑制剂。本发明还涉及蛋白质分子及其在改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)或(v)间充质细胞向上皮细胞转化(MET)中的至少一种中的用途。
发明背景
在本说明书中对任何之前的公开物(或来源于其的信息)或对任何已知的物质的引用不是并且不应当被视为承认或确认或以任何形式暗示该之前的出版物(或来源于其的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的所致力于的领域中的常规公知常识的一部分。
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)通过其调节T细胞活化和降低免疫应答的能力而在免疫系统的调节中起重要作用。PD-1在活化的T细胞(包括免疫抑制性CD4+T细胞(Treg)和耗尽的(exhausted)CD8+T细胞)、B细胞、髓样树突状细胞(MDC)、单核细胞、胸腺细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达(Gianchecchi等人(2013)Autoimmun.Rev.,12:1091-1100)。
PD-1信号通路有助于正常个体中的中枢和外周耐受性的维持，从而避免破坏正常宿主组织。在胸腺中，PD-1与其配体的相互作用抑制阳性选择，从而抑制CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性T细胞的转化(Keir等人(2005)J.Immunol.,175:7329-7379)。抑制逃避阴性选择的自身反应性和炎性效应物T细胞以避免间接的免疫介导的组织损伤依赖于PD-1信号通路(Keir等人(2006)J.Exp.Med.,203:883-895)。
PD-1被两种配体结合：程序性细胞死亡配体-1(PD-L1；B7-H1；CD274)和程序性细胞死亡配体-2(PD-L2；B7-DC；CD273)。PD-L1在包括T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞的多种细胞类型上表达(Chen等人(2012)Clin Cancer Res,18(24):6580-6587；Herzberg等人(2016)The Oncologist,21:1-8)。PD-L1表达还在许多类型的肿瘤细胞和局部肿瘤环境中的其他细胞中被上调(Herzberg等人(2016)The Oncologist,21:1-8)。PD-L2主要在诸如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原呈递细胞上表达，但是也可以依赖于微环境刺激而在多种其他免疫细胞和非免疫细胞上被诱导表达(Herzberg等人(2016)The Oncologist,21:1-8；Kinter等人(2008)J.Immunol.,181:6738-6746；Zhong等人(2007)Eur.J.Immunol.,37:2405-2410；Messal等人(2011)Mol.Immunol.,48:2214-2219；Lesterhuis等人(2011)Mol.Immunol.,49:1-3)。
PD-1、PD-L1和PD-L2被局部肿瘤环境中的恶性细胞和其他细胞过表达。PD-1在较大比例的来自许多不同肿瘤类型的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上被高表达，并抑制局部效应物免疫应答。PD-1的TIL表达与受损的效应物功能(细胞因子产生和对肿瘤细胞的细胞毒性效力)和/或多种肿瘤类型中的不良结果相关(Thompson等人(2007)Clin Cancer Res,13(6):1757-1761；Shi等人(2011)Int.J.Cancer,128:887-896)。PD-L1的表达已经被发现与包括肾癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、尿路上皮癌、胃癌和胰腺癌的许多肿瘤类型中的不良结果呈强相关(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.,26:677-704；Shi等人(2011)Int.J.Cancer,128:887-896)。PD-L2已经被显示在肿瘤的子集中上调，并且也与不良结果相关联。
因此，PD-1信号传导通路的成员是用于治疗癌症和感染的重要治疗靶，并且靶向该通路的新治疗剂是期望的。
发明概述
本发明部分地基于LSD1抑制剂抑制免疫检验点，特别是PD-L1和/或PD-L2的发现。因此，本发明人设想，LSD1抑制剂可以被用于一系列应用，包括用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答，或用于治疗癌症，特别是转移性癌症或感染。
因此，在本发明的一个方面，提供了LSD1抑制剂用于抑制受试者中的PD-L1活性和/或PD-L2活性的用途。
在本发明的另一方面，提供了一种抑制受试者中的PD-L1活性和/或PD-L2活性的方法，该方法包括向受试者施用LSD1抑制剂。在本发明的一个相关方面，提供了一种抑制受试者中PD-L1的细胞核易位(nuclear translocation)和/或PD-L2的细胞核易位的方法，该方法包括向受试者施用LSD1抑制剂。
在本发明的又另一个方面，提供了LSD1抑制剂用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答的用途。在一个相关方面，本发明提供了一种包含LSD1抑制剂和免疫调节剂的组合物。
在另一个方面，本发明提供了LSD1抑制剂用于增强抗感染剂的效力的用途。在本发明的一个相关方面，提供了一种包含LSD1抑制剂和抗感染剂的组合物。
在本发明的又另一个方面，提供了一种增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用LSD1抑制剂。
在本发明的另一个方面，提供了一种抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性的方法，该方法包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。
在本发明的仍另一个方面，提供了LSD1抑制剂用于抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性的用途，包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。在本发明的一个相关方面，提供了一种抑制PD-L1和/或PD-L2过表达细胞中PD-L1细胞核易位和/或PD-L2细胞核易位的方法，该方法包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。
本发明人还设想，基于LSD1多肽亚序列的蛋白质分子和结构相关的分子抑制LSD1活性，包括LSD1向细胞核内的易位，且因此也可用于抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性，如上文和本文其他部分宽泛地描述的。此外，还提出此类蛋白质分子抑制PKC的磷酸化活性、尤其是PKC-θ的磷酸化活性。这些分子也被证明在抑制EMT、在抑制癌症干细胞肿瘤细胞和非癌症干细胞肿瘤细胞的形成和维持以及在诱导MET中具有极大活性，这使得它们可用于治疗与LSD1过表达相关的一系列状况诸如癌症。
因此，本发明的另一个方面提供了一种抑制蛋白激酶C(PKC)的磷酸化活性的方法，该方法包括将PKC过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的又另一个方面，提供了一种改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的方法，该方法包括将所述PKC过表达细胞与形成调节、增殖调节、维持调节、EMT调节或MET调节的量的分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明还提供了一种治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中癌症包含至少一种PKC过表达细胞，该方法包括向受试者施用分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的另一个方面，提供了一种抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的方法，该方法包括将LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的又另一个方面，提供了一种抑制LSD1活性的方法，该方法包括将LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明的另一个方面提供了一种抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的方法，该方法包括将LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的仍另一个方面，提供了一种改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的方法，该方法包括将所述LSD1过表达细胞与形成调节、增殖调节、维持调节、EMT调节或MET调节的量的分离或纯化的蛋白质分子接触，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明还扩展到一种治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中癌症包含至少一种LSD1过表达细胞，该方法包括向受试者施用分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的仍另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子用于抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在另一个方面，本发明提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的另一方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子用于改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的另一方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明还预期分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中该癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
在另一个方面，本发明提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列，其中该癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
在本发明的仍另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的又另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在另一方面，本发明提供了分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1的活性的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明预期分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1活性的药物中的用途，该蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的另一方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的仍另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
本发明还扩展到分离或纯化的蛋白质分子用于改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
在本发明的仍另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中该癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
本发明的又另一个方面提供了分离或纯化的蛋白质分子在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中该癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
本发明的另一个方面提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性中使用。
在本发明的又另一个方面，提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种中使用。
在本发明的仍另一个方面，提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症中使用，其中该癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1中使用。
在本发明的又另一个方面，提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1的活性中使用。
本发明还预期一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位中使用。
在本发明的另一个方面，提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于在改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种中使用。
在仍另一个方面，本发明提供了一种分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，该分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症中使用，其中该癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
在本发明的另一个方面，提供了分离或纯化的蛋白质分子，该分离或纯化的蛋白质分子由式I表示：
Z1RRTX1RRKRAKVZ2 (I)
其中：
“Z1”和“Z2”独立地不存在或独立地选自包含从约1个至约50个氨基酸残基(和其间的所有整数个残基)的蛋白质部分和保护部分中的至少一种；且
“X1”选自包括S、T、A、G及其修饰形式的小氨基酸残基；
其中蛋白质分子不同于由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白质分子：
EGRRTSRRKRAKVE [SEQ ID NO:4]。
附图简述
图1是MCF7乳腺癌细胞系[用PMA刺激的(MCF7ST)和未刺激的(MCF7NS)]和MDA-MB-231(MDA)乳腺癌细胞系中的PD-L1表达和在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)表达的照片和图形表示。示出了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(nuclearbias)(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图2是MDA-MB-231乳腺癌细胞系中在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1p)的表达和PD-L2的表达的照片和图形表示。示出了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图3描绘了MCF7细胞[用PMA刺激的粘附细胞(MCF7ST AD)；用PMA刺激的悬浮细胞(MCF7 ST SUS)；和未刺激的(MCF7 NS)]和MDA-MB-231细胞中CD44、PD-L1和PD-L2的表达。未刺激的、用PMA刺激的或用PMA和TGF-β刺激的并对PD-L1染色的可诱导MCF7细胞的FACS图示出于图3A中。图3B描绘了MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中CD44 mRNA、PD-L1 mRNA和PD-L2mRNA的表达。图3C描绘了在用LSD1 siRNA处理的MCF7细胞中CD44 mRNA、PD-L1 mRNA和PD-L2 mRNA的表达。
图4是肽抑制剂L1、L2和L3对刺激的MCF7细胞(MCF7ST)和未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)和MDA-MB-231细胞(MDA)中的在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1p)的表达和细胞核定位的作用的图形和照片表示。确定了总细胞核荧光(TNFI)。
图5是肽抑制剂L1、L2和L3对刺激的MCF7细胞(MCF7ST)和未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)中PD-L1的表达和细胞核定位的作用的图形和照片表示。确定了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)和细胞核偏向(Fn/c)。
图6是肽抑制剂L1、L2和L3对MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达和细胞核定位的作用的图形和照片表示。确定了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)和细胞核偏向(Fn/c)。
图7是用媒介物(Con)、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)(60mg/kg、30mg/kg和10mg/kg)(Abrax)或多西他赛(Docetaxel)(10mg/kg和4mg/kg)(Doc)治疗小鼠MDA-MB-231异种移植物的效果的图形和照片表示。图7A示出了在治疗期间肿瘤的体积随时间的变化。图7B示出了在白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛治疗的细胞中相对于单独的媒介物治疗的细胞中的(i)在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)、(ii)表皮生长因子受体(EGFR)和(iii)SNAIL的细胞核荧光信号(TNFI)。
图8是用媒介物(Con)、白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)(Abrax)、苯乙肼(41mg/kg、27mg/kg或13.5mg/kg)(Phenel)或其组合治疗对小鼠异种移植物MDA-MB-231细胞的效果的图形和照片表示。图8A-E描绘了肿瘤尺寸和体积随时间的变化。
图9是用白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)(Abrax)、苯乙肼(41mg/kg)(Phenel)或其组合治疗对小鼠异种移植物MDA-MB-231细胞的效果的图形和照片表示。图9描绘了在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)、细胞角蛋白和PD-L1的表达。本图评估了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图10是用白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)(Abrax)、苯乙肼(41mg/kg)(Phenel)或其组合治疗对小鼠异种移植物MDA-MB-231细胞的效果的图形和照片表示。本图评估EGFR和细胞表面波形蛋白(CSV)的细胞核(TNFI)表达和细胞质(TCFI)表达。
图11是用媒介物(Mock；组A)、白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)(组B)或多西他赛(10mg/kg)(组E)治疗对小鼠异种移植物MDA-MB-231细胞的效果的图形和照片表示。本图示出了PD-L2和间充质标志物MET的表达。本图评估了总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图12示出了从患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞的代表性图像。图像示出了具有间充质状态的侵袭性癌症中牵涉的转录因子SNAIL的表达；作为循环肿瘤细胞的标志物的波形蛋白和细胞角蛋白的表达；在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的表达；PD-L1的表达；和PD-L2的表达。
图13是从乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中的在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的表达、PD-L1的表达和细胞表面波形蛋白(CSV)的表达的照片(图13A)和图形(图13B)表示。描绘了总细胞核荧光(TNFI)、细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图14是从乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中的在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的表达、PD-L2的表达和细胞角蛋白的表达的照片和图形表示。描绘了总细胞核荧光(TNFI)、细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图15是从乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中的细胞表面波形蛋白的表达、SNAIL的表达和PD-L1的表达的照片(图15A)和图形(图15B)表示。描绘了总细胞核荧光(TNFI)、细胞质荧光(TCFI)、细胞核偏向(Fn/c)和共定位的程度(PCC)。
图16描绘了从响应于用帕吉林(Pargyline)(Parg)和苯乙肼治疗的乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)、细胞角蛋白和PD-L2的总细胞质表达(TCFI)。
图17是从与媒介物(Mock)相比响应于用帕吉林(图17A)和苯乙肼(图17B)治疗的乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中的细胞表面波形蛋白、PD-L1和SNAIL的表达的照片和图形表示。示出了总细胞荧光(TCFI)。
图18示出了细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂帕博西尼(Palbociclib)(Palbo)或瑞博西尼(Ribociclib)(Ribo)、苯乙肼(Phenel)及其组合对从两个乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞的细胞核中PD-L1(nPD-L1)的表达和细胞表面PD-L1(sPD-L1)的表达的作用，其中图18A示出了从患者A获得的数据，并且图18B示出了从患者B获得的数据。示出了FACS数据及其图形表示。
图19是三种肽LSD1抑制剂L1、L2和L3与对照(Ctrl)相比对MDA-MB-231细胞中LSD1的细胞核易位的作用的图形和照片表示。示出了LSD1表达的细胞核偏向(Fn/c)。
图20描绘了LSD1肽抑制剂L1、L2和L3(50μM和100μM)对MCF7细胞中癌症干细胞(CSC)形成的作用。示出了FACS数据及其图形表示。
图21描绘了LSD1肽抑制剂L1、L2和L3(50μM和100μM)对MDA-MB-231细胞中癌症干细胞(CSC)形成的作用。示出了FACS数据及其图形表示。
图22是LSD1肽抑制剂L1、L2和L3(50μM和100μM)与对照(Mock)相比对MDA-MB-231(MDA)细胞中PD-L1的表达的作用的照片和图形表示。示出了总细胞荧光(TFI)。
图23是LSD1肽抑制剂L1、L2和L3与对照(Pep-对照)相比对MDA-MB-231(MDA)细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达的作用的照片和图形表示。示出了总细胞核荧光(TNFI)。
图24是L1、L2和L3与对照(Pep-对照)相比对MDA-MB-231(MDA)细胞中MET(间充质标志物)的表达的作用的照片和图形表示。示出了总细胞核荧光(TNFI)。
图25是未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)、PMA刺激的粘附MCF7细胞(MCF7 ST)和PMA刺激的漂浮性MCF7细胞(MCF7 FLT)以及MDA-MB-231(MDA)细胞中PKC-θ的表达和LSD1的表达的照片和图形表示。数据代表平均值±SEM。使用ImageJ的绘图谱(profile)特征以绘制荧光信号强度沿跨越细胞核的单线的图(n＝每个细胞核5条线，5个单独的细胞)。为线上的每一点绘制所指示的抗体对的具有标准误差的平均荧光信号强度。对信号绘图以比较与相对抗体相比每种抗体的信号如何变化。为每个绘图谱确定共定位的程度(PCC)。还示出了总细胞核荧光(TNFI)。
图26是响应于用PKC-θ抑制剂C27或BIM处理的未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)和刺激的MCF7细胞(MCF7ST)以及MDA-MB-231(MDA)细胞中的在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的表达的照片和图形表示。示出了总细胞核荧光(TNFI)。示出的数据代表至少20个单独的细胞的平均值±SEM。
图27描绘了与对照(Mock)相比，白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)和多西他赛(10mg/kg)处理对异种移植的MDA-MB-231细胞中的在丝氨酸111处磷酸化的LSD1的表达的作用。示出了代表性图像和示出总细胞核荧光(TNFI)的图。示出的数据代表至少20个单独的细胞的平均值±SEM。
图28是与对照(Mock)相比，LSD1siRNA(si-LSD1)对PMA刺激的(ST)MCF7细胞和未刺激的(NS)MCF7细胞中的LSD1的表达和SNAIL的表达的作用的照片和图形表示。示出的数据代表至少20个细胞的平均值±SEM。
图29是与对照(Mock)相比，LSD1的催化活性的抑制剂NCD36(NCB)和帕吉林(Parg)对PMA刺激的(ST)MCF7细胞和未刺激的(NS)MCF7细胞中的LSD1的表达和SNAIL的表达的作用的照片和图形表示。示出的数据代表至少20个细胞的平均值±SEM。
图30是与对照(Mock)相比，LSD1 siRNA(si-LSD1)、帕吉林(Parg)和NCD36(NCB)对MDA-MB-231细胞中的LSD1的表达和SNAIL的表达的作用的照片和图形表示。示出的数据代表至少20个细胞的平均值±SEM。
图31是与对照(Ctrl)相比，肽抑制剂L1、L2和L3对MDA-MB-231细胞中的LSD1的表达的作用的照片和图形表示。示出的数据代表至少20个细胞的平均值±SEM。示出了LSD1表达的细胞核偏向(Fn/c)。
发明详述
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以被用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下文中定义了以下术语。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。通过实例的方式，“一个要素(an element)”意指一个要素或多于一个要素。
“约”意指变化多达参考的量(quantity)、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度的15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量(quantity)、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度。
术语“同时施用(administration concurrently)”、“同时施用(administeringconcurrently)”或“同时施用(administered concurrently)”等是指含有两种或更多种活性物质的单一组合物的施用，或各活性物质同期地(contemporaneously)或同时地(simultaneously)或在足够短的时间段内顺序地作为单独组合物和/或通过各自的途径递送而施用，有效结果等同于当所有这些活性物质作为单一组合物施用时获得的结果。“同时地(simultaneously)”意指活性剂基本上同时被施用，并且期望地在同一制剂中一起被施用。“同期地(contemporaneously)”意指活性剂在时间上紧密地被施用，例如一种剂在另一种剂之前或之后从约一分钟内至约一天内被施用。任何同时期的时间都是有用的。然而，通常情况是，当不同时被施用时，剂将在约1分钟内至约8小时内被施用，并且优选地在小于约一小时至约四小时内被施用。当被同期(comtemporaneously)施用时，剂合适地被施用在受试者的相同部位。术语“相同部位(same site)”包括精确的位置，但可以在约0.5厘米内至约15厘米内，优选地从在约0.5厘米内至约5厘米内。本文使用的术语“分别地(separately)”意指剂以间隔被施用，例如以约一天至数周或数月的间隔被施用。活性剂可以以任何顺序被施用。本文使用的术语“顺序地(sequentially)”意指剂按顺序被施用，例如以数分钟、数小时、数天或数周的一个或更多个间隔被施用。如果适当，活性剂可以以规律的重复周期被施用。
术语“剂”或“调节剂”包括诱导期望的药理学和/或生理学作用的化合物。该术语还包括本文具体提及的包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等的那些化合物的药学上可接受的且药理学上有活性的成分。当使用上文术语时，则应当理解，该术语包括活性剂本身以及药学上可接受的药理学活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“剂”不应当被狭义解释，而应当扩展到小分子、蛋白质分子诸如肽、多肽和蛋白，以及包含它们的组合物和遗传分子诸如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞剂。术语“剂”包括能够产生和分泌本文所指多肽的细胞，以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“剂”延伸到核酸构建体，包括载体，诸如用于在一系列细胞中表达和分泌的病毒或非病毒载体、表达载体和质粒。
如本文使用的，术语“烷基”是指具有1个至10个碳原子的直链、支链或环状饱和烃类基团。在适当情况下，烷基基团可以具有特定数目的碳原子，例如包括具有呈线性或分支排列的1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的烷基的C1-6烷基。合适的烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、4-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、5-甲基戊基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
如本文使用的，术语“烯基”是指在碳原子之间具有一个或更多个双键并具有2个至10个碳原子的直链、支链或环状烃基基团。在适当情况下，烯基基团可以具有特定数目的碳原子。例如，如“C2-C6烯基”中的C2-C6包括具有呈线性或分支排列的2个、3个、4个、5个或6个碳原子的基团。合适的烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、丁二烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基、己二烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、环戊烯基、环己烯基和环己二烯基。
“芳烷基”意指被如上文定义的芳基基团取代的如上文定义的烷基，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、-H2CH(CH3)CH2苯基等及其衍生物。
如本文使用的，“芳香族的”或“芳基”意图意指每个环中至多7个原子的任何稳定的单环或双环碳环，其中至少一个环是芳香族的。此类芳基元件的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基或苊基(acenaphthyl)。
在某些情况下，取代基可以用包括零的碳的范围定义，诸如(C0-C6)亚烷基-芳基。如果芳基被认为是苯基，该定义将包括苯基本身以及例如，-CH2Ph、-CH2CH2Ph、CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph。
还将认识到，本文描述的化合物可以具有不对称中心，并且因此能够以多于一种立体异构形式存在。因此本发明还涉及在一个或更多个不对称中心处基本上纯的异构体形式的化合物，例如大于约90％ee，诸如约95％或97％ee或大于99％ee，以及其混合物，包括外消旋混合物。此类异构体可以是天然存在的，或者可以通过不对称合成制备，例如使用手性中间体，或者通过手性拆分。
如本文使用的，术语“和/或(and/or)”是指和包含一个或更多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选地解释(或)时缺少组合。
如本文使用的术语“抗原”是指能够在脊椎动物，尤其是哺乳动物中引起免疫应答的蛋白、肽或其他分子或大分子的全部或部分。此类抗原也与用该蛋白、肽或其他分子或大分子免疫的动物的抗体反应。
术语“抗原结合分子”在本文中用于指对靶抗原具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语延伸到免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和显示抗原结合活性的非免疫球蛋白衍生的蛋白框架。
术语“癌症干细胞”(CSC)是指具有肿瘤引发和肿瘤维持能力，包括广泛增殖、形成新肿瘤并维持癌症发展的能力的细胞，即驱动肿瘤的形成和生长的具有无限增殖潜能的细胞。CSC在生物学上与大多数肿瘤细胞不同，并且具有与干细胞相关的特征，特别是自我更新和繁殖以及产生特定癌症样品中存在的所有细胞类型的能力。术语“癌症干细胞”(CSC)包括干细胞(SC)中的基因改变和变成CSC的细胞中的基因改变两者。在特定实施方案中，CSC是乳腺CSC，乳腺CSC合适地是CD24+CD44+，CD24+CD44+的例示性实例包括CD44高CD24低。与LSD1相关的术语“催化活性”在本文中用于指蛋白质中甲基化的赖氨酸残基的脱甲基化，所述蛋白质诸如组蛋白，尤其是组蛋白3。
在整个本说明书和所附的权利要求中，除非上下文另外要求，否则措词“包括(comprise)”、以及变型诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”，将被理解为意味包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其他的整数或步骤或整数或步骤的组。因此，使用术语“包含”等指示列出的整数是必需的或要求的，但其他整数是任选的并且可以存在或可以不存在。“由以下组成(consisting of)”意指包括并且限于措辞“由以下组成”之后的任何事物。因此，措辞“由以下组成”指示列出的要素是必需的或要求的，并且不可以存在其他要素。“主要由以下组成(consisting essentially of)”意指包括在该措辞之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列要素在本公开中指定的活动或动作的其他要素。因此，措辞“主要由以下组成”指示列出的要素是必需的或要求的，但其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这依赖于它们是否影响列出的要素的活性或作用。在特定实施方案中，在本文公开的特定氨基酸序列的上下文中，术语“主要由以下组成”在其范围内包括特定氨基酸序列上游的约1个至约50个任选的氨基酸(和其间的所有整数个任选的氨基酸)和/或特定氨基酸序列下游的约1个至约50个任选的氨基酸(和其间的所有整数个任选的氨基酸)。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指显示与参考序列基本的序列同一性的序列诸如核酸或氨基酸序列(例如与参考核酸序列的全部或部分至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％序列同一性)或显示与参考氨基酸序列基本的序列相似性或同一性的氨基酸序列(例如与参考氨基酸序列的全部或部分至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％序列相似性或同一性)。
“衍生物”意指通过修饰，例如通过如本领域所理解的与其他化学部分缀合或复合或通过翻译后修饰技术，衍生自基础分子的分子诸如多肽。术语“衍生物”在其范围内还包括对亲本序列做出的改变，包括提供功能上等同的分子的添加或缺失。
如本文使用的，术语“剂量单位形式”是指适于作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上的离散单位，每个单位包含与所需的药学上可接受的媒介物缔合的、经计算以产生所期望的治疗作用的预定量的活性材料。
在治疗或预防状况的上下文中，“有效量”意指对于预防引发该状况的症状、控制该状况的此类症状和/或治疗该状况的现存症状有效的，以单一剂量或作为一系列的部分，向需要此类治疗或预防的个体施用一定量的剂或组合物。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群体、组合物的制剂、医疗情况的评估和其他相关因素而变化。据预计，该量将落入可通过常规试验确定的相对较宽的范围内。
如本文使用的，术语“效应物T细胞”包括起消除抗原作用的T细胞(例如通过产生调节其他细胞活化的细胞因子或通过细胞毒性活性)。
如本领域熟知的，增强免疫应答(“免疫增强(immunoenhancement)”)意指提高动物对外来抗原或疾病特异性抗原(例如癌症抗原)的应答能力，即被引发(primed)以攻击此类抗原的那些细胞在数目、活性以及检测和破坏这些抗原的能力上被提高。免疫应答的强度通过标准测试来测量，测试包括：通过本领域已知的方法直接测量外周血淋巴细胞；自然杀伤细胞细胞毒性测定(assay)(参见，例如Provinciali等人(1992)J.Immunol.Meth.,155:19-24)，细胞增殖测定(参见，例如Vollenweider和Groseurth(1992)J.Immunol.Meth.,149:133-135)，免疫细胞和子集的免疫测定(参见，例如Loeffler等人(1992)Cytom.,13:169-174；Rivoltini等人(1992)Can.Immunol.Immunother.,34:241-251)；或用于细胞介导的免疫力的皮肤测试(参见，例如Chang等人(1993)Cancer Res.,53:1043-1050)。通过上述测试测量的免疫应答的强度的任何统计学上显著的增加被认为是本文使用的“增强的免疫应答(enhanced immune response)”或“免疫增强”。增强的免疫应答还通过以下指示：身体表现，诸如发烧和炎症，以及全身和局部感染的康复，和疾病中症状的减轻，即肿瘤尺寸的减小、疾病或状况的症状的减轻，所述疾病或状况包括但不限于麻风病、肺结核、疟疾、口疮性溃疡、疱疹性疣和乳头状瘤疣、牙龈炎、动脉粥样硬化、艾滋病的伴随物如卡波西肉瘤、支气管感染等。此类身体表现也定义本文使用的“增强的免疫应答”或“免疫增强”。
如本文使用的，术语“上皮向间充质转化”(EMT)是指从上皮细胞向间充质表型的转化，这是胚胎发育的正常过程。EMT也是受损的起离子和流体转运器作用的上皮细胞藉以变成基质重塑性间充质细胞的过程，在上皮癌(carcinoma)中，该转化通常导致改变的细胞形态、间充质蛋白的表达和增强的侵袭性。用于定义体外EMT的标准包括上皮细胞极性的失去、分离成单独的细胞以及随后在获得细胞运动性之后的分散(参见Vincent-Salomon和Thiery(2003),Breast Cancer Res.,5(2):101-6)。在EMT期间，在表达、分布和/或功能方面改变的分子类别，以及原因上涉及的分子类别，包括生长因子(例如转化生长因子(TGF)-β、wnts)、转录因子(例如SNAI、SMAD、LEF和细胞核β-连环蛋白)、细胞与细胞粘附轴的分子(钙粘蛋白、连环蛋白)、细胞骨架调节剂(Rho家族)和细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活物)(参见Thompson和Newgreen,Cancer Res.2005；65(14):5991-5)。
如本文使用的，术语“上皮”是指身体内外表面的覆盖物，包括血管和其他小空腔的内层。它由上皮细胞的集合组成，形成相对薄的片或层，这是由于组成细胞通过细胞至细胞连接相互和广泛地横向粘附。该层是极化的并且具有顶面和基底面。尽管上皮细胞的严密组织，但上皮确实具有一定的可塑性，并且上皮层中的细胞可以改变形状，诸如从扁平变为柱状，或者在一端缩进并在另一端扩张。然而，这些倾向于在细胞群中发生，而不是单独发生(参见Thompson和Newgreen,Cancer Res.2005；65(14):5991-5)。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在编码序列的情况下，表达涉及将编码序列转录成mRNA，并将mRNA翻译成一种或更多种多肽。相反地，非编码序列的表达只涉及将非编码序列转录成转录物。术语“表达”在本文中也用于指蛋白或分子在特定位置的存在，因此可以与“定位”互换使用。
“表达载体”是指能够指导载体中包含的多核苷酸的转录，并合适地合成多核苷酸编码的肽或多肽的任何遗传元件。此类表达载体是本领域技术人员已知的。
如应用于化学物质的术语“基团”是指形成分子的一部分的一组原子。在一些情况下，基团可以包括两个或更多个相互结合以形成分子的一部分的原子。基团可以是单价的或多价的(例如二价的)，以允许与分子的一个或更多个另外的基团结合。例如，一价基团可以被设想为一个分子，其中该分子的氢原子中的一个被去除以允许与分子的另一个基团结合。基团可以是带正电荷的或带负电荷的。例如，带正电荷的基团可以被设想为添加了一个或更多个质子(即H+)的中性基团，而带负电荷的基团可以被设想为去除了一个或更多个质子的中性基团。基团的非限制性实例包括但不限于：烷基基团、亚烷基基团、烯基基团、亚烯基基团、炔基基团、亚炔基基团、芳基基团、亚芳基基团、亚胺基(iminyl)基团、亚胺基(iminylene)基团、氢化物基团、卤素基团(halo group)、羟基基团、烷氧基基团、羧基基团、硫代基团、烷硫基基团、二硫化物基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、烷基氨基基团、二烷基氨基基团、甲硅烷基基团和甲硅烷氧基基团。诸如烷基、烯基、炔基、芳基和杂环基的基团，无论是单独使用还是在复合词中使用，或者在基团的定义中使用，可以任选地被一个或更多个取代基取代。如本文使用的“任选地取代的”是指基团可以被或可以不被一个或更多个选自以下的基团进一步取代：烷基、烯基、炔基、芳基、卤素(halo)、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、苯基氨基、二苯基氨基、苄基氨基、二苄基氨基、肼基、酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、杂环基、杂环氧基、杂环基氨基、卤代杂环基、羧基酯、羧基、羧基酰胺、巯基、烷硫基、苄硫基、酰硫基(acylthio)和含磷基团。如本文使用的，术语“任选地取代的”也可以是指用羰基(C＝O)基团取代CH2基团。任选的取代基的非限制性实例包括烷基，优选地C1-8烷基(例如C1-6烷基，诸如甲基、乙基、丙基、丁基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基)、羟基C1-8烷基(例如羟甲基、羟乙基、羟丙基)、烷氧基烷基(例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基等)、C1-8烷氧基(例如C1-6烷氧基，诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基)、卤素(氟、氯、溴、碘)、单氟甲基、单氯甲基、单溴甲基、二氟甲基、二氯甲基、二溴甲基、三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基、羟基、苯基(其本身可以被如本文描述的任选的取代基进一步取代，任选的取代基例如羟基、卤素、甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、氨基)、苄基(其中CH2和/或苯基基团可以如本文描述的被进一步取代)、苯氧基(其中CH2和/或苯基基团可以如本文描述的被进一步取代)、苄氧基(其中CH2和/或苯基基团可以如本文描述的被进一步取代)、氨基、C1-8烷基氨基(例如C1-6烷基，诸如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基)、二C1-8烷基氨基(例如C1-6烷基，诸如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基)、酰氨基(例如NHC(O)CH3)、苯基氨基(其中苯基本身可以如本文描述的被进一步取代)、硝基、甲酰基、-C(O)-C1-8烷基(例如C1-6烷基，诸如乙酰基)、O-C(O)-烷基(例如C1-6烷基，诸如乙酰氧基)、苯甲酰基(其中CH2和/或苯基基团本身可以被进一步取代)、用C＝O、CO2H、CO2C1-8烷基取代CH2(例如C1-6烷基，诸如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)、CO2苯基(其中苯基本身可以被进一步取代)、CONH2、COHP苯基(其中苯基本身可以如本文描述的被进一步取代)、CONH苄基(其中CH2和/或苯基基团可以如本文描述的被进一步取代)、CONH C1-8烷基(例如C1-6烷基，诸如甲基酰胺、乙基酰胺、丙基酰胺、丁基酰胺)、CONH C1-8烷基胺(例如C1-6烷基，诸如氨基甲基酰胺、氨基乙基酰胺、氨基丙基酰胺、氨基丁基酰胺)、-C(O)杂环基(例如-C(O)-1-哌啶、-C(O)-1-哌嗪、-C(O)-4-吗啉)、-C(O)杂芳基(例如-C(O)-1-吡啶、-C(O)-1-哒嗪、-C(O)-1-嘧啶、-C(O)-1-吡嗪)、CONH二C1-8烷基(例如C1-6烷基)。
“杂芳烷基”基团意指被杂芳基基团取代的如上文定义的烷基，例如-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等及其衍生物。
如本文使用的，术语“杂芳基”或“杂芳族”代表在每个环中高达7个原子的稳定的单环或双环，其中至少一个环是芳香族的，并且含有从1个至4个选自由O、N和S组成的组的杂原子。在该定义的范围内的杂芳基基团包括但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。如同下文杂环的定义，“杂芳基”也被理解为包括任何含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
“杂环基”和“杂芳基”的另外的实例包括但不限于以下：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基(benzothiophenyl)、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基(carbolinyl)、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲哚吖嗪基、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉基、异噁唑啉基、氧杂环丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁基、吖丙啶基、1,4-二噁烷基、六氢吖庚因基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁基、亚甲基二氧苯甲酰基、四氢呋喃基、和四氢噻吩基及其N-氧化物。杂环基取代基的连接可以经由碳原子或经由杂原子发生。
如本文使用的，“杂亚芳基”是指优选地约3元至约15元的二价的单环或多环体系，其中环体系中的原子中的一个或更多个、更优选地1个至3个是杂原子，也就是与碳不同的元素，例如氮、氧和硫原子。杂亚芳基基团可以任选地被一个或更多个、优选地1个至3个芳基基团取代基取代。示例性的杂亚芳基基团包括例如1,4-亚咪唑基。
如本文使用的术语“杂环”、“杂脂族基”或“杂环基”意图意指含有从1个至4个选自由O、N和S组成的组的杂原子的5元至10元的非芳香族杂环，并且包括双环基团。
杂环基烷基”基团意指被杂环基团取代的如上文定义的烷基，例如-CH2吡咯烷-1-基、-(CH2)2哌啶-1-基等，及其衍生物。
如本文使用的，术语“高”是指大于正常、大于标准诸如预定量度的量度或相对地大于另一子组量度的子组量度。例如，CD44高是指大于正常CD44量度的CD44量度。因此，“CD44高”总是至少对应于受试者身体相关部位或来自受试者的身体相关样品中的可检测的CD44。可以根据本领域技术人员可得的任何方法确定正常量度。术语“高”还可以指等于或大于诸如预定截止值的预定量度的量度。如果受试者对于特定标志物不是“高”，则对于该标志物是“低”。通常，用于确定受试者是“高”或“低”的截止值应当被选择为使得该划分成为临床相关的。
术语“激素受体阴性(HR-)肿瘤”意指不表达对于一种激素的受体的肿瘤，该激素刺激肿瘤的增殖、存活或活力超过如通过标准方法(例如对患者生物学样品中细胞核的免疫组织化学染色)确定的某一阈值。阈值可以例如使用Allred得分或基因表达测量。参见例如Harvey等人(1999,J Clin Oncol,17:1474-1481)和Badve等人(2008,J Clin Oncol,26(15):2473-2481)。在一些实施方案中，肿瘤不表达雌激素受体(ER-)和/或孕酮受体(PR-)。
术语“激素受体阳性(HR+)肿瘤”意指表达对于一种激素的受体的肿瘤，该激素刺激肿瘤的增殖、存活或活力超过如通过标准方法(例如对患者生物学样品中细胞核的免疫组织化学染色)确定的某一阈值。阈值可以例如使用Allred得分或基因表达测量。参见例如Harvey等人(1999,J Clin Oncol,17:1474-1481)和Badve等人(2008,J Clin Oncol,26(15):2473-2481)。在一些实施方案中，肿瘤表达雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)。
术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，后代可以不必然与原始亲本细胞完全相同(在形态中或在总DNA互补中)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或多核苷酸体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
“杂交”在本文中用于表示为互补核苷酸序列产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体的配对。互补碱基序列是通过碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T配对并且C与G配对。在RNA中U与A配对并且C与G配对。在这方面，如本文使用的术语“匹配”和“错配”是指互补核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效杂交，诸如以上提及的经典的A-T和G-C碱基对。错配是不有效杂交的核苷酸的其他组合。在本发明中，优选的配对机制涉及氢键结合，氢键结合可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷碱基(nucleobase))之间的Watson-Crick氢键结合、Housteen或反向Housteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核苷碱基。杂交可以在本领域技术人员已知的不同环境下发生。
如本文使用的术语“烃基”包括任何含碳和氢的原子团，包括饱和基团、不饱和基团、芳香族基团、直链基团或支链基团或包括多环基团的环状基团。烃基包括但不限于C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C10环烷基、芳基诸如苯基和萘基、Ar(C1-C8)烷基诸如苄基，它们中的任何一种可以被任选地取代。
本文对“免疫相互作用”的提及包括对以下的提及：分子之间的任何相互作用、反应或其他形式的缔合，并且特别地其中分子中的一个是免疫系统的组分或模拟免疫系统的组分。
本文使用的术语“抑制剂”是指降低或抑制靶分子的至少一种功能或生物学活性的剂。例如，LSD1抑制剂可降低或减少LSD1的至少一种功能或生物学活性。LSD1抑制剂可以抑制或减少LSD1的细胞核易位，可以抑制或减少LSD1的催化活性，可以抑制或减少LSD1的磷酸化，和/或可以抑制或减少LSD1的表达。在特定实施方案中，术语“LSD1抑制剂”是指抑制LSD1的细胞核易位的剂。
如本文使用的，术语“分离的”是指基本上(substantially)或本质上(essentially)不含在它天然状态中通常伴随它的组分的材料。例如，“分离的蛋白质分子”是指蛋白质分子从其天然细胞环境和从与细胞的其他组分的缔合脱离的体外分离和/或纯化。“基本上不含”意指，蛋白质分子的制品是至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。在优选的实施方案中，蛋白质分子的制品具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(以干重计)的非本发明的主题的分子(本文中也称为“污染分子”)。当蛋白质分子被重组产生时，其还期望地基本上不含培养基，即培养基占制品体积的少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。本发明包括以干重计至少0.01毫克、0.1毫克、1.0毫克和10毫克的分离或纯化的制品。
术语“低级烷基”是指具有从1个至6个碳原子的直链和支链烷基基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基、2-甲基戊基等。在一些实施方案中，低级烷基基团是甲基或乙基。
术语“低级烷氧基”是指具有从1个至6个碳原子的直链和支链烷氧基基团，诸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、2-甲基戊氧基等。通常，低级烷氧基基团是甲氧基或乙氧基。
如本文使用的，术语“LSD1过表达细胞”是指以可检测地高于正常细胞的水平表达LSD1的脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞或鸟类细胞，尤其是哺乳动物细胞。该细胞可以是脊椎动物细胞，诸如灵长类细胞；鸟类细胞；家畜动物细胞诸如绵羊细胞、牛细胞、马细胞、鹿细胞、驴细胞和猪细胞；实验室测试动物细胞诸如兔细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞和仓鼠细胞；伴侣动物细胞，诸如猫细胞和狗细胞；和捕获的野生动物细胞诸如狐狸细胞、鹿细胞和澳洲野狗(dingo)细胞。在特定实施方案中，LSD1过表达细胞是人类细胞。在特定实施方案中，LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；优选地是癌症干细胞肿瘤细胞。与正常细胞或对比细胞(例如乳腺细胞)相比，过表达也可以是以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
如本文使用的，术语“间充质向上皮转化”(MET)是可逆的生物学过程，其涉及从能动的、多极的或纺锤形的间充质细胞转化为称为上皮的极化的细胞的平面阵列。MET是EMT的反向过程。MET发生于正常发育、癌症转移和诱导的多能干细胞重编程中。
如本文使用的，术语“间充质”是指胚胎中胚层的部分，其由凝胶状基质中的松散填充的、未特化的细胞集合组成，结缔组织、骨、软骨以及循环系统和淋巴系统从其发育。间充质是形成相对扩散的组织网络的细胞集合。间充质并不是完整的细胞层，并且细胞通常只在细胞表面具有参加与其相邻细胞粘附的点。这些粘连也可以涉及钙粘蛋白缔合(参见Thompson和Newgreen(2005),Cancer Res.,65(14):5991-5)。
“调节”意指直接或间接增加或降低靶分子的水平或功能性活性。例如，剂可以通过与靶分子以外的分子相互作用间接调节水平/活性。在这方面，编码靶多肽的基因的间接调节在其范围内包括调节第一核酸分子的表达，其中第一核酸分子的表达产物调节编码靶多肽的核酸分子的表达。
如本文使用的，术语“过表达(overexpress)”、“过表达(overexpression)”、“过表达(overexpressing)”或“过表达的(overexpressed)”可互换地指与正常细胞相比，通常在癌细胞中，以可检测的更高水平转录或翻译的基因(例如LSD1基因或PKC基因)。因此，过表达是指蛋白和RNA两者的过表达(由于增加的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、改变的稳定性和改变的蛋白降解)，以及由于改变的蛋白转运模式(增加的细胞核定位)和增加的功能性活性(例如，如在底物的酶水解增加的情况)的局部过表达。与正常细胞或对比细胞(例如乳腺细胞)相比，过表达也可以是以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
如本文使用的术语“可操作地连接”意指将结构基因置于调节元件的调节控制之下，调节元件包括但不限于启动子，然后启动子控制基因的转录和任选地基因的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选的是，将遗传序列或启动子放置在离基因转录起始位点的一定距离处，该距离与遗传序列或启动子和在其天然环境中其控制的基因(即遗传序列或启动子衍生自的基因)之间的距离大约相同。如本领域所知，该距离中的一些变化可被调整而不失去功能。相似地，调节序列元件关于将被置于其控制下的异源基因的优选的放置由该元件在其自然环境(即其所衍生自的基因)中的定位来定义。
“药学上可接受的载体”意指包含并非生物学上或其他方面不期望的材料的药物媒介物，即该材料可以连同所选活性剂一起向受试者施用，而不会引起任何不良反应或大量的(substantial)不良反应。载体可以包括赋形剂和其他添加剂，诸如稀释剂、洗涤剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。
相似地，如本文提供的化合物的“药理学上可接受的”盐、酯、酰胺、前药或衍生物为并非生物学上或其他方面不期望的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。
“苯基烷基”意指被苯基取代的如上文定义的烷基，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等及其衍生物。苯基烷基是芳烷基基团的子集。
术语“磷酸化活性”在本文中用于指PKC磷酸化蛋白底物上的羟基基团，尤其是蛋白底物上的丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基基团的能力。
如本文使用的，术语“PKC过表达细胞”是指以可检测地高于正常细胞的水平表达PKC，特别是PKC-θ的脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞或鸟类细胞，特别是哺乳动物细胞。该细胞可以是脊椎动物细胞，诸如灵长类细胞；鸟类细胞；家畜动物细胞诸如绵羊细胞、牛细胞、马细胞、鹿细胞、驴细胞和猪细胞；实验室测试动物细胞诸如兔细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞和仓鼠细胞；伴侣动物细胞，诸如猫细胞和狗细胞；和捕获的野生动物细胞诸如狐狸细胞、鹿细胞和澳洲野狗细胞。在特定实施方案中，PKC过表达细胞是人类细胞。在特定实施方案中，PKC过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；优选地是癌症干细胞肿瘤细胞。与正常细胞或对比细胞(例如乳腺细胞)相比，过表达也可以是以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
如本文使用的，术语“多肽(Polypeptide)”、“蛋白质分子(proteinaceousmolecule)”、“肽(peptide)”和“蛋白质(protein)”可互换地使用以指氨基酸残基的聚合物和其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或更多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。本主题蛋白质分子的可溶性形式是特别有用的。本定义中包括例如包含一种或更多种氨基酸的类似物的多肽，所述氨基酸类似物包括例如非天然氨基酸或具有取代的连接的多肽。
如本文使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(prevented)”或“预防(preventing)”是指提高受试者对发展疾病或状况的抵抗力的预防性治疗，或者换言之，降低受试者将发展疾病或状况的可能性，以及在疾病或状况已经开始之后的治疗，以便完全减少或消除疾病或状况，或者防止疾病或状况恶化。这些术语在它们的范围内还包括预防疾病或状况发生于可能易患该疾病或状况但尚未被诊断患有该疾病或状况的受试者。
“促炎性免疫应答”意指与对照、健康哺乳动物中的一种或更多种促炎性细胞因子的水平和/或效应物T细胞的水平相比，包括促炎性细胞因子(例如IL-6、IL-23、IL-17、IL-1α、IL-1β和TNF-α)的水平增加和/或效应物T细胞的水平增加中的一种或更多种的免疫应答。
术语“减少(reduce)”、“抑制(inhibit)”、“抑制(suppress)”、“降低(decrease)”和语法上的等同物，当用于指第一样品中的物质和/或现象相对于第二样品的水平时，意指第一样品中的物质和/或现象的量(quantity)比第二样品中的物质和/或现象的量(quantity)低任何量(amount)，该量(amount)使用本领域公认的任何统计分析方法是统计上显著的。在一个实施方案中，减少可以主观地确定，例如当患者提及他们对诸如疼痛、疲劳等的疾病症状的主观感知时。在另一个实施方案中，减少可以客观地确定，例如当来自患者的样品中的CSC和/或非CSC肿瘤细胞的数目低于来自患者的早期样品中的数目时。在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少10％。在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少25％。在又另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少50％。在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少75％。在又另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少90％。可选择地，差异可以被表示为“n倍”差异。
术语“选择性”及其语法变体在本文中用于指抑制靶分子而基本上不抑制另一分子功能的剂。例如，LSD1选择性抑制剂是抑制LSD1而基本上不抑制另一LSD的功能或诸如单胺氧化酶(MAO)的另一种酶的功能的剂。通常，对LSD1具有选择性的剂显示出关于另一LSD或MAO的抑制，LSD1选择性大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍。在其他实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少50倍。在另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少100倍。在仍另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少500倍。在又另外的实施方案中，选择性分子对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO的抑制大至少100倍。
如本文使用的，术语“盐”和“前药”包括任何药学上可接受的盐、酯、水合物或任何其他化合物，当向接受者施用时，该化合物能够(直接地或间接地)提供本发明的蛋白质分子或其活性代谢物或残留物。合适的药学上可接受的盐包括药学上可接受的无机酸的盐或药学上可接受的有机酸的盐，所述无机酸为诸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸，所述有机酸为诸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁酸、抗坏血酸和戊酸。碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子形成的那些，所述阳离子诸如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵。而且，碱性含氮基团可以用诸如以下的试剂季铵化：低级烷基卤化物诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物、碘化物，或者硫酸二烷基酯，诸如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯及其他。然而，应当理解，非药学上可接受的盐也落在本发明的范围内，因为这些在制备药学上可接受的盐中可以是有用的。盐和前药的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，可以通过本发明的化合物与金属氢氧化物的反应制备金属盐。酸盐可以通过将适当的酸与本发明的蛋白质分子反应来制备。
如本文使用的术语“严格性”是指在杂交和洗涤程序期间的温度和离子强度条件，以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格性越高，固定化靶核苷酸序列和洗涤之后保持与靶杂交的所标记的探针多核苷酸序列之间的互补性的程度将会越高。术语“高严格性”是指在其下仅具有高频率的互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。所需的严格性依赖于核苷酸序列，并依赖于杂交期间存在的各种组分。通常，严格的条件被选择为比在定义的离子强度和pH用于特定序列的热解链温度(Tm)低约10℃至20℃。Tm为50％的靶序列与互补的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH)。
如本文使用的术语“受试者”是指对其需要治疗或预防的脊椎动物受试者，特别是哺乳动物或鸟类受试者。合适的受试者包括但不限于灵长类；鸟类；家畜动物诸如绵羊、牛、马、鹿、驴和猪；实验室测试动物诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠；伴侣动物诸如猫和狗；和捕获的野生动物诸如狐狸、鹿和澳洲野狗。特别地，受试者为人类。然而，应当理解，上述术语不意味存在症状。
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得需要的药理学作用和/或生理学作用。在对疾病或状况(例如血液恶性肿瘤)和/或可归因于该疾病或状况的不利影响的部分或完全治愈方面，作用可以是治疗性的。这些术语还包括哺乳动物、特别是人类中的状况或疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病或状况，即阻止其发展；或(b)减轻疾病或状况，即引起疾病或状况的消退。
如本文使用的，术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和增殖，无论恶性或良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常部分地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文使用的，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前”是指通常在癌症之前或发展成癌症的状况或生长。术语“非转移性”是指良性癌症或者保持在原发部位的癌症，并且没有渗到淋巴或血管系统中或者原发部位以外的组织中。通常，非转移性癌症是为0期、I期或II期癌症的任何癌症。“早期癌症”意指没有侵袭性或转移性的癌症，或者被归类为0期、I期或II期癌症。术语“晚期癌症”通常指III期或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的子阶段。本领域技术人员将理解，II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症依赖于癌症的特定类型。癌症的示例性实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、上皮癌、视网膜母细胞瘤、黑素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、直肠癌和食道癌。在一个示例性实施方案中，癌症是乳腺癌。
如本文使用的，术语“载体”是指一种多核苷酸分子，合适地是衍生自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，多核苷酸可以被插入或克隆到其中。载体可以含有一个或更多个独特的限制性位点，并且可以能够在包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织的定义的宿主细胞中自主复制，或是与定义的宿主的基因组可整合的，使得克隆的序列为可复制的。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性质粒或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。可选择地，载体可以是当被引入宿主细胞时被整合进基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。载体系统可以包含单一载体或质粒、共同包含待引入到宿主细胞的基因组的总DNA或转座子中的两个或更多个载体或质粒。载体的选择通常将依赖于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。在本例中，载体优选地是病毒或病毒衍生的载体，其在真菌、细菌或动物细胞，优选地在哺乳动物细胞中可操作地起作用。此类载体可以衍生自痘病毒、腺病毒或酵母。载体还可以包括选择标记物，例如可用于选择合适的转化体的抗生素抗性基因。此类抗性基因的实例是本领域技术人员已知的，并且包括赋予对抗生素卡那霉素和G418抗性的nptII基因以及赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
除非另外特别说明，本文描述的每个实施方案将经必要修改后应用到各个和每一个实施方案。
2.LSD1抑制剂
本发明部分基于LSD1抑制剂抑制免疫检验点，特别是PD-L1和/或PD-L2的确定。因此，本发明人设想了LSD1抑制剂可以被用于一系列应用，包括用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答，或用于治疗癌症或感染。
LSD1抑制剂包括并包含减少LSD1的累积、功能或稳定性的任何活性剂；或者降低LSD1基因的表达；并且此类抑制剂包括但不限于小分子和大分子，诸如核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、多糖、脂多糖、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。在一些实施方案中，LSD1抑制剂是LSD1催化活性的抑制剂或LSD1细胞核易位的抑制剂。
在一些实施方案中，LSD1抑制剂选择性抑制LSD1超过至少一种其他LSD或另一种酶诸如MAO。在一些实施方案中，LSD1抑制剂选择性抑制LSD1超过其他LSD亚型和MAO。在一些实施方案中，LSD1抑制剂显示出关于另一种LSD或MAO的抑制，LSD1选择性大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍。在其他实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少50倍。在另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少100倍。在仍另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少500倍。在又另外的实施方案中，选择性分子对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO的抑制大至少100倍。在一些实施方案中，LSD1抑制剂是非选择性LSD1抑制剂。
2.1核酸分子
在一些实施方案中，LSD1抑制剂是起抑制LSD1转录物的转录或翻译的作用的拮抗核酸分子。该类型的代表性转录物包括对应于以下任何一个序列的核苷酸序列：(1)如列出于例如GenBank登记号NM_015013.3、NP_001009999.1和NM_001009999.2中的人类LSD1核苷酸序列；(2)与(1)中提及的序列中的任何一个共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列；(3)在至少低、中或高严格性条件下与(1)中提及的序列杂交的核苷酸序列；(4)编码以下氨基酸序列中的任何一个的核苷酸序列：如列出于例如GenPept登记号NP_055828.2、NP_001009999.1和O60341.2中的人类LSD1氨基酸序列；(5)编码氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列与(4)中提及的序列中的任何一个共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性；和编码氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列与(4)中提到的任何一种序列共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
例示性拮抗核酸分子包括反义分子、适配体、核酶和三联体形成分子、RNAi和外部指导序列。核酸分子可以充当靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂、调节物和刺激物，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其他分子的新活性。
拮抗核酸分子可以与任何大分子相互作用，所述大分子诸如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链。因此，拮抗核酸分子可以与LSD1 mRNA或LSD1的基因组DNA相互作用，或者拮抗核酸分子可以与LSD1多肽相互作用。通常，基于靶分子和拮抗核酸分子之间的序列同源性，拮抗核酸分子被设计为与其他核酸相互作用。在其他情况下，拮抗核酸分子和靶分子之间的特异性识别不是基于拮抗核酸分子和靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。
在一些实施方案中，使用反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA结合并阻止蛋白翻译直接阻断LSD1的翻译。反义分子被设计为通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用可以被设计为通过例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂交体降解来促进靶分子的破坏。可选择地，反义分子可以被设计为中断通常将在靶分子上发生的加工功能，诸如转录或复制。反义分子可以基于靶分子的序列被设计。存在许多通过寻找靶分子的最易接近的区域优化反义效率的方法。非限制性方法包括使用DMS和DEPC的体外选择实验和DNA修饰研究。在特定实例中，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。在特定实施方案中，使用衍生自翻译起始位点的反义寡脱氧核糖核苷酸，例如-10和+10之间的区域。
适配体是合适地以特异性方式与靶分子相互作用的分子。适配体通常是长度范围在15-50个碱基的小核酸，折叠成定义的二级和三级结构，诸如茎环或G-四链体。适配体可以结合诸如ATP和茶碱的小分子，以及诸如逆转录酶和凝血酶的大分子。适配体可以与靶分子以小于10-12M的Kd非常紧密地结合。合适地，适配体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适配体可以以非常高程度的特异性结合靶分子。例如，在靶分子与仅在分子上的单一位置不同的另一分子之间的结合亲和力中具有大于10,000倍差异的适配体已被分离出。期望地，适配体与靶分子具有的Kd比适配体与背景结合分子的Kd低至少10倍、100倍、1000倍、10,000倍或100,000倍。用于产生针对感兴趣的目标(例如PHD、FIH-1或vHL)的适配体的合适方法为“通过指数富集系统演化配体(Systematic Evolution of Ligands byEXponential Enrichment)”(SELEXTM)。SELEXTM方法描述于美国专利5,475,096和美国专利5,270,163中(也参见WO91/19813)。简言之，将核酸混合物在有利于结合的条件下与靶分子接触。将未结合的核酸从结合的核酸中分隔，并且核酸-靶复合物解离。然后，解离的核酸被扩增以产生富含配体的核酸的混合物，该混合物根据需要被进行结合、分隔、解离和扩增的重复循环，以产生对靶分子高度特异的高亲和力核酸配体。
在其他实施方案中，抗LSD1核酶被用于催化LSD1RNA的特异性切割。核酶作用的机制包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后为核酸内溶解性(endonucleolytic)切割。存在数种不同类型的催化核酸酶反应或核酸聚合酶类型反应的核酶，核酶是基于在自然系统中存在的核酶，诸如锤头核酶、发夹核酶和四膜虫核酶。也有许多自然系统中不存在的核酶，但是它们已被工程化以催化特定的新反应。代表性核酶切割RNA底物或DNA底物。在一些实施方案中，使用切割RNA底物的核酶。潜在的RNA靶内的特异性核酶切割位点最初通过扫描靶分子寻找核酶切割位点来鉴定，核酶切割位点包括以下序列：GUA、GUU和GUC。当鉴定后，对应于含有切割位点的靶基因区域的15个和20个核糖核苷酸之间的短RNA序列可以被评价预测的结构特征，诸如可以使寡核苷酸序列不合适的二级结构。候选靶的合适性也可以通过使用核糖核酸酶保护测定测试它们对与互补寡核苷酸杂交的可及性来评价。
形成功能性核酸分子的三链体是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，形成称为三链体的结构，其中形成复合体的三条DNA链依赖于Watson-Crick碱基配对和Hoogsteen碱基配对二者。三链体分子是优选的，因为它们可以以高亲和力和特异性结合靶区域。通常希望三链体形成分子以小于10-6、小于10-8、小于10-10或小于10-12的Kd结合靶分子。
外部指导序列(external guide sequence)(EGS)是结合靶核酸分子形成复合物的分子，并且该复合物被切割靶分子的RNA酶P识别。EGS可以被设计为特异性靶向所选择的RNA分子。RNA酶P辅助加工细胞内的转运RNA(tRNA)。通过使用引起靶RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS，细菌RNA酶P可以被招募以切割几乎任何RNA序列。相似地，真核EGS/RNA酶P指导的RNA的切割可以被使用以切割真核细胞内需要的靶。
在其他实施方案中，介导LSD1基因或LSD1转录物的RNA干扰(RNAi)的RNA分子可以被使用以减少或消除基因表达。RNAi是指通过引入与靶基因的转录物同源的单链RNA或通常双链RNA(dsRNA)干扰或破坏靶基因的产物。RNAi方法，包括双链RNA干扰(dsRNAi)或小干扰RNA(siRNA)，已经在包括哺乳动物细胞和线虫秀丽线虫(C.elegans)的许多生物中被广泛记录(Fire等人(1998)Nature,391:806-811)。在哺乳动物细胞中，RNAi可以通过小干扰RNA(siRNA)的21个至23个核苷酸(nt)双链体被触发(Chiu等人(2002)Mol.Cell.,10:549-561；Elbashir等人(2001)Nature,411:494-498)，或通过使用具有RNA聚合酶III启动子的DNA模板体内表达的微RNA(miRNA)、功能性小发夹RNA(shRNA)或其他dsRNA被触发(Zeng等人(2002)Mol.Cell,9:1327-1333；Paddison等人(2002)Genes Dev.,16:948-958；Lee等人(2002)Nature Biotechnol.,20:500-505；Paul等人(2002)Nature Biotechnol.,20:505-508；Tuschl(2002)Nature Biotechnol.,20:440-448；Yu等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99(9):6047-6052；McManus等人(2002)RNA,8:842-850；Sui等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99(6):5515-5520)。
在特定实施方案中，使用对应于LSD1基因的至少一部分的dsRNA本身、并且尤其是dsRNA产生性构建体，以减少或消除LSD1基因的表达。RNAi介导的基因表达的抑制可以使用本领域报道的任何技术来实现，例如通过将编码茎环或发夹RNA结构的核酸构建体转染到靶细胞的基因组中，或者通过表达转染的核酸构建体，该构建体在会聚的(convergent)启动子之间具有对LSD1基因的同源性、或在单一启动子之后以头对头或尾对尾的重复具有对LSD1基因的同源性。可以使用任何相似的构建体，只要构建体产生具有折叠回到自身的能力的单一RNA并产生dsRNA，或者只要构建体产生两个单独的RNA转录物，然后两个单独的RNA转录物退火以形成与靶基因具有同源性的dsRNA。
对于RNAi不需要绝对同源性，对于约200个碱基对的dsRNA，描述了更低的阈值在约85％同源性(Plasterk和Ketting(2000)Current Opinion in Genetics and Dev.,10:562-67)。因此，依赖于dsRNA的长度，RNAi编码核酸可以在它们包含的对靶基因转录物的同源性的水平中变化，即100个至200个碱基对的dsRNA与靶基因具有至少约85％同源性，以及更长的dsRNA、即300个至100个碱基对的dsRNA、对靶基因具有至少约75％同源性。表达设计为与单独表达的RNA退火的单一RNA转录物的RNA编码构建体，或表达来自会聚的启动子的单独转录物的单一构建体，长度合适地为至少约100个核苷酸。表达设计为通过内部折叠形成dsRNA的单一RNA的RNA编码构建体，长度通常为至少约200个核苷酸。
用于表达dsRNA形成构建体的启动子可以是任何类型的启动子，如果所得dsRNA对被靶向用于破坏的细胞谱系中的基因产物是特异性的。可选择地，启动子可以是谱系特异的，因为它仅在特定发育谱系的细胞中表达。当与在非靶向细胞谱系中表达的基因的同源性中观察到一些重叠时，这可能是有利的。启动子也可以是通过外部控制因素或通过细胞内环境因素可诱导型的。
在一些实施方案中，指导其对应的特定mRNA的切割的约21个至约23个核苷酸的RNA分子，例如Tuschl等人在U.S.2002/0086356中描述的，可以被用于介导RNAi。此类21-nt至23-nt RNA分子可以包含3'羟基基团，可以是单链或双链(作为两个21-nt至23-nt RNA)，其中dsRNA分子可以是平末端或包括突出(overhanging)末端(例如5'、3')。
在一些实施方案中，拮抗核酸分子是siRNA。siRNA可以通过任何合适的方法制备。例如，可以参考国际公布WO 02/44321，其公开了当与3'突出末端碱基配对时能够序列特异性降解目标mRNA的siRNA，该文献通过引用并入本文。序列特异性基因沉默可以在哺乳动物细胞中使用模拟酶Dicer产生的siRNA的合成的、短双链RNA实现。siRNA可以是化学或体外合成的，或者可以是短双链发夹状RNA(shRNA)细胞内加工成siRNA的结果。合成的siRNA通常使用算法和常规DNA/RNA合成仪设计。供应商包括Ambion(Austin,Tex.)、ChemGenes(Ashland,Mass.)、Dharmacon(Lafayette,Colo.)、Glen Research(Sterling,Va.)、MWBBiotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colo.)和Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA也可以使用诸如Ambion的SILENCERTM siRNA Construction Kit的试剂盒在体外合成。
从载体产生siRNA更通常地是通过短发夹RNA(shRNA)的转录完成的。用于产生包含shRNA的载体的试剂盒是可得的，诸如Imgenex的GENESUPPRESSORTM Construction Kit和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。此外，用于制备siRNA和向受试者递送siRNA的方法也是本领域熟知的。参见，例如US 2005/0282188、US 2005/0239731、US2005/0234232、US 2005/0176018、US 2005/0059817、US 2005/0020525、US 2004/0192626、US2003/0073640、US 2002/0150936、US 2002/0142980、和US 2002/0120129，其中每一项通过引用并入本文。
本领域中描述了说明性RNAi分子(例如LSD1siRNA和shRNA)(例如Yang等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:21499-21504；和He等人(2012)Transcription,3:1-16)或从Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,CA,USA)和OriGene Technologies,Inc.(Rockville,MD,USA)商购可得。
2.2基于多肽或肽的分子
本发明进一步预期基于肽或多肽的抑制剂化合物。例如，BHC80(也称为PHD指蛋白21A)与LSD1形成复合物的一部分，并且可以抑制LSD1脱甲基酶活性。因此，本发明进一步考虑BHC80或其生物学活性片段用于抑制LSD1催化活性的用途。BHC80多肽的氨基酸序列和编码BHC80多肽的核苷酸序列是公开可得的。在这方面，可以参考例如GenBank登记号NP057705表示智人(Homo sapiens)BHC80氨基酸序列、和GenBank NM016621表示编码GenBank登记号NP057705中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；2)GenBank登记号NP620094表示小鼠(Mus musculus)BHC80氨基酸序列、和GenBank NM138755表示编码GenBank登记号NP620094中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；3)GenBank登记号NP00118576.1表示鸡(Gallus gallus)BHC80氨基酸序列、和GenBank NM001199647表示编码GenBank登记号NP00118576.1中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；和4)GenBank登记号DAA21793表示牛(Bos taurus)BHC80氨基酸序列。
说明性BHC80多肽选自由以下组成的组：(1)包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与上述GenBank BHC80多肽条目的任一项中所列氨基酸序列共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相似性；(2)包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与上述GenBank BHC80多肽条目的任一项中所列氨基酸序列共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；(3)包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，该核苷酸序列在至少低、中或高严格性条件下与上述GenBank BHC80多核苷酸条目的任一项中所列核苷酸序列杂交；(4)包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，该核苷酸序列与上述GenBankBHC80多核苷酸条目的任一项中所列的核苷酸序列共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性；和(5)根据(1)至(4)中任一项的多肽的片段，其抑制LSD1催化活性。
BHC80多肽可以通过递送多肽本身被引入细胞，或通过将包含编码BHC80多肽的核苷酸序列的BHC80核酸引入细胞而引入细胞。在一些实施方案中，BHC80核酸包含选自以下的核苷酸序列：(1)上述GenBank BHC80多核苷酸条目的任一项中所列BHC80核苷酸序列；(2)与(1)中提及的序列中的任何一个共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列；(3)在至少低、中或高严格性条件下与(1)中提及的序列杂交的核苷酸序列；(4)编码上述GenBank BHC80多肽条目的任一项中所列氨基酸序列的核苷酸序列；(5)编码氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列与(4)中提及的序列中的任何一个共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相似性；以及编码氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列与(4)中提及的序列中的任何一个共有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
BHC80核酸可以呈重组表达载体的形式。BHC80核苷酸序列可以可操作地与表达载体中例如启动子的转录控制元件连接。合适的载体包括，例如重组逆转录病毒、慢病毒和腺病毒；逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体和质粒表达载体。在一些情况下，表达载体整合到细胞的基因组中。在其他情况下，表达载体在细胞中以附加体状态存留。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(参见，例如Li等人(1994)Invest Ophthalmol Vis Sci,35:2543-2549；Borras等人(1999)Gene Ther,6:515-524；Li和Davidson(1995)PNAS,92:7700-7704；Sakamoto等人(1999)H Gene Ther,5:1088-1097；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如Ali等人(1998)Hum Gene Ther,9:8186；Flannery等人(1997)PNAS,94:6916-6921；Bennett等人(1997)Invest Ophthalmol Vis Sci,38:2857-2863；Jomary等人(1997)Gene Ther,4:683-690；Rolling等人(1999)Hum Gene Ther,10:641-648；Ali等人(1996)Hum Mol Genet.,5:591-594；Srivastava在WO93/09239中；Samulski等人(1989)J.Vir.,63:3822-3828；Mendelson等人(1988)Virol.,166:154-165；和Flotte等人(1993)PNAS,90:10613-10617)；SV40、单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人(1997)PNAS,94:10319-23；Takahashi等人(1999)J Virol,73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒，和衍生自逆转录病毒，诸如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)等。
2.3小分子
本发明还预期减少LSD1的催化活性的小分子试剂。
适合于在本发明中使用的减少LSD1的催化活性的小分子试剂包括也抑制LSD1催化活性的MAO抑制剂、抑制LSD1催化活性的多胺化合物、抑制LSD1催化活性的苯基环丙胺衍生物等。
MAO抑制剂的非限制性实例包括MAO-A选择性抑制剂、MAO-B选择性抑制剂和MAO非选择性抑制剂。MAO抑制剂的例示性实例包括报道的MAO-A同种型(isoform)和/或MAO-B同种型的抑制剂，所述MAO-A同种型优先使5-羟色胺(血清素)(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)脱氨，所述MAO-B同种型优先使苯乙胺(PEA)和苄胺(MAO-A和MAO-B两者都代谢多巴胺(DA))脱氨。在多种实施方案中，MAO抑制剂可以是不可逆的或可逆的(例如MAO-A(RIMA)的可逆抑制剂)，并且可以具有针对MAO-A和/或MAO-B的不同的效力(例如非选择性双重抑制剂或同种型选择性抑制剂)。
在一些实施方案中，MAO抑制剂选自：氯吉兰(Clorgyline)；L-丙炔苯丙胺；异卡波肼(MarplanTM)；死藤水(ayahuasca)；烟肼酰胺(nialamide)；异丙烟肼；异丙氯肼(iproclozide)；吗氯贝胺(AurorixTM)；4-氯-N-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺)；苯乙肼(NardilTM、(±)-2-苯基乙基肼)；反式苯环丙胺(ParnateTM、(±)-反式-2-苯基环丙烷-1-胺)(苯乙肼的同类物(congeneric))；托洛沙酮；左-丙炔苯丙胺(SelegilineTM)；骆驼蓬(harmala)；RIMAs(例如吗氯贝胺，描述在Da Prada等人(1989),J Pharmacol Exp Ther,248:400-414中)；溴法罗明(brofaromine)；和贝氟沙通(befloxatone)，描述在Curet等人(1998),J Affect Disord,51:287-30)中，拉扎贝胺(Ro196327)，描述在Ann.Neurol.,40(1):99-107(1996)中，和SL25.1131(3(S),3a(S)-3-甲氧基甲基-7-[4,4,4-三氟丁氧基]-3,3a,4,5-四氢-1,3-噁唑并[3,4-a]喹啉-1-酮)，描述在Aubin等人(2004).J.Pharmacol.Exp.Ther.,310:1171-1182中)；盐酸司来吉兰(L-丙炔苯丙胺、ELDEPRYL、ZELAPAR)；二甲基司来吉兰；沙芬酰胺(safinamide)；雷沙吉兰(AZILECT)；二苯美仑；脱氧鸭嘴花碱(desoxypeganine)；骆驼蓬碱(harmine)(也称为肉叶芸香碱(telepathine)或巴那斯特菱(banasterine))；利奈唑胺(ZYVOX、ZYVOXID)；帕吉林(EUDATIN、SUPIRDYL)；二烯内酯卡瓦内酯去甲氧基麻醉椒素(dienolide kavapyrone desmethoxyyangonin)；5-(4-芳基甲氧基苯基)-2-(2-氰基乙基)四唑；NCD36(盐酸2-[N-(4-苯基苯羰基)]氨基-6-(反式-2-苯基环丙烷-1-氨基)-N-(3-甲基苄基)己酰胺)等。
小分子LSD1抑制剂也可以选自多胺化合物，如例如由Woster等人在美国公布第2007/0208082号中描述的，其通过引用以其整体并入本文中。LSD1的说明性多胺抑制剂包括根据式(II)的化合物：
或其盐、溶剂化物或水合物，其中n是从1至12的整数；m和p独立地是从1至5的整数；q是0或1；每个R1独立地选自由C1-C8烷基、C4-C15环烷基、C3-C15支链烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基、C7-C24杂芳烷基组成的组；和
其中R3选自由C1-C8烷基、C4-C15环烷基、C3-C15支链烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基和C7-C24杂芳烷基组成的组；并且
每个R2独立地选自氢或C1-C8烷基。
合适的多胺化合物是式(II)的化合物，其中一个或两个R1是C6-C20芳基，诸如单环芳基，包括但不限于苯基。在一个实施方案中，该化合物具有式II，并且每个R1是苯基。在一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是4。在另一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是7。
合适的多胺化合物是式(II)的化合物，其中至少一个或两个R1是C8-C12烷基或C1-C8烷基，诸如直链烷基。一个或两个R1可以是C1-C8直链烷基，诸如甲基或乙基。在一个实施方案中，每个R1是甲基。一个或两个R1可以包含C4-C15环烷基基团或者可以是C4-C15环烷基基团，诸如含有直链烷基基团的环烷基基团，其中环烷基基团经由其烷基或环烷基部分被连接至分子。例如，一个或两个R1可以是环丙基甲基或环己基甲基。在一个实施方案中，一个R1是环丙基甲基或环己基甲基，并且另一个R1是直链烷基基团，诸如直链C1-C8未被取代的烷基基团，包括但不限于乙基基团。在一个实施方案中，R1是C3-C15支链烷基基团，诸如异丙基。当R1是C1-C8取代的烷基时，取代的烷基可以被任何取代基取代，包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺。因此，在一个实施方案中，R1是被胺取代的C1-C8烷基基团，使得R1可以是例如烷基-NH2或烷基-胺-烷基部分，诸如-(CH2)yNH(CH2)zCH3，其中y和z独立地是从1至8的整数。在一个实施方案中，R1是-(CH2)3NH2。
在一个实施方案中，化合物具有式(II)，其中一个或两个R1是C7-C24取代的或未被取代的芳烷基，在一个实施方案中，所述芳烷基经由其烷基部分(例如苄基)被连接至分子。在一个实施方案中，两个R1是芳烷基部分，其中该部分的烷基部分被两个芳基基团取代，并且该部分经由其烷基基团被连接至分子。例如，在一个实施方案中，一个或两个R1是C7-C24芳烷基，其中烷基部分被两个苯基基团取代，诸如当R1是2,2-二苯基乙基或2,2-二苄基乙基时。在一个实施方案中，式III的两个R1是2,2-二苯基乙基，并且n是1、2或5。在一个实施方案中，式III的每个R1是2,2-二苯基乙基，n是1、2或5，并且m和p各自是1。
在一个实施方案中，至少一个R1是氢。当一个R1是氢时，另一个R1可以是上文关于R1列出的任何部分，包括芳基基团诸如苄基。上文列出的式III的任何化合物包括其中R2中的至少一个或两个是氢或C1-C8取代的或未被取代的烷基的化合物。在一个实施方案中，每个R2是未被取代的烷基，诸如甲基。在另一个实施方案中，每个R2是氢。上文列出的式III的任何化合物可以是其中q为1并且m和p相同的化合物。因此，式III的多氨基胍可以关于多氨基胍核心对称(例如，不包括R1)。可选择地，式III的化合物可以是不对称的，例如当q为0时。在一个实施方案中，m和p是1。在一个实施方案中，q是0。在一个实施方案中，n是从1至5的整数。
在一些实施方案中，该化合物是多氨基双胍或N-烷基化的多氨基双胍。N-烷基化的多氨基双胍意图为其中至少一个双胍的至少一个亚胺氮被烷基化的多氨基双胍。在一个实施方案中，化合物是式III的多氨基双胍或其盐、溶剂化物或水合物，其中q是1，并且至少一个R1或每个R1具有以下结构：
其中每个R3独立地选自由C1-C8烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基和C7-C24杂芳烷基组成的组；并且每个R2独立地是氢或C1-C8烷基。
在一个实施方案中，在多氨基双胍化合物中，至少一个R3或每个R3是C1-C8烷基。例如，当R3是C1-C8烷基时，烷基可以被任何取代基取代，包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺。因此，在一个实施方案中，R3是被胺取代的C1-C8烷基基团，使得R3可以是例如烷基-NH2或烷基-胺-烷基部分，诸如-(CH2)yNH(CH2)zCH3，其中y和z独立地是从1至8的整数。在一个实施方案中，R3是-(CH2)3NH2。R3也可以是C4-C15环烷基或C3-C15支链烷基。在一个实施方案中，至少一个R3或每个R3是C6-C20芳基。在一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是4。在另一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是7。
在一个实施方案中，该化合物是式III的多氨基双胍，其中至少一个R3是C7-C24芳烷基，在一个实施方案中，该芳烷基经由其烷基部分被连接至分子。在一个实施方案中，每个R3是芳烷基部分，其中该部分的烷基部分被一个或两个芳基基团取代，并且该部分经由其烷基部分被连接至分子。例如，在一个实施方案中，至少一个R3或每个R3是芳烷基，其中烷基部分被两个苯基基团或苄基基团取代，诸如当R3是2,2-二苯基乙基或2,2-二苄基乙基时。在一个实施方案中，每个R3是2,2二苯基乙基，并且n是1、2或5。在一个实施方案中，每个R3是2,2-二苯基乙基，并且n是1、2或5，以及m和p各自是1。
上文列出的式III的任何多氨基双胍化合物包括其中R2中的至少一个或两个是氢或C1-C8烷基的化合物。在一个实施方案中，每个R2是未被取代的烷基，诸如甲基。在另一个实施方案中，每个R2是氢。
上文列出的式III的任何多氨基双胍化合物包括其中q为1并且m和p相同的化合物。因此，式III的多氨基双胍可以关于多氨基双胍核心对称。可选择地，式III化合物可以是不对称的。在一个实施方案中，m和p是1。在一个实施方案中，q是0。在一个实施方案中，n是从1至5的整数。在一个实施方案中，q、m和p各自为1，并且n为1、2或5。
通过本公开内容可以理解和清晰地传达，关于式III公开的每个R1、R2、R3、m、n、p和q意图为并且包括它们的所有组合，如同R1、R2、R3、m、n、p和q的每个和每种组合被具体地和单独地列出一样。
式III的代表性化合物包括，例如：
在某些实施方案中，多胺化合物由根据式IV的结构表示：
或其盐、溶剂化物或前药。
其中n是1、2或3；
每个L独立地是长度为从约2个至14个碳原子的连接基，例如长度为约2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个或14个碳原子，其中连接基主链原子可以是饱和的或不饱和的，通常不超过一个、两个、三个或四个不饱和的原子将存在于连接主链(tetherbackbone)中，其中每个主链原子可以是被取代的或未被取代的(例如用C1-C8烷基取代)，其中连接基主链可以包括环状基团(例如环己基-1,3-二基基团，其中在主链中包括环的3个原子)；
每个R12独立地选自氢和C1-C8烷基；并且
每个R11独立地选自氢、C2-C8烯基、C1-C8烷基或C3-C8支链烷基(例如甲基、乙基、叔丁基、异丙基、戊基、环丁基、环丙基甲基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、5-NH2-戊-1-基、丙基-1-基甲基(苯基)次膦酸酯、二甲基双环[3.1.1]庚基)乙基，2-(十氢萘基)乙基等)、C6-C20芳基或杂芳基、C1-C24芳烷基或杂芳烷基(2-苯基苄基、4-苯基苄基、2-苄基苄基、3-苄基苄基、3,3-二苯基丙基、3-(苯并咪唑基)-丙基，4-异丙基苄基、4-氟苄基、4-叔丁基苄基、3-咪唑基-丙基、2-苯基乙基等)、-C(＝O)-C1-C8烷基、-C(＝O)-C1-C8烯基、-C(＝O)-C1-C8炔基，氨基取代的环烷基(例如被伯胺、仲胺、叔胺或季胺取代的环烷基基团，诸如5-NH2-环庚基、3-NH2-环戊基等)和C2-C8烷酰基(例如用甲基基团和烷基叠氮化物基团取代的烷酰基)。
在某些实施方案中，每个L独立地选自：-CHR13-(CH2)m-、-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)mCHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)p-
其中：
m是从1至5的整数；
A是(CH2)m、乙烷-1,1-二基或环己-1,3-二基；
p是从2至14的整数，诸如1、2、3、4、或5；
n是从1至12的整数；并且
R13是C1-C8烷基。
关于式IV的被取代的芳烷基或杂芳烷基意图并且包括用芳基基团或杂芳基基团取代的烷酰基部分，即-C(＝O)-芳基、-C(＝O)-芳烷基、-C(＝O)-杂芳基和-C(＝O)-杂芳烷基。在一个实施方案中，芳烷基部分或杂芳烷基部分的烷基部分经由其烷基部分被连接至分子。例如，R11中的至少一个或两个可以是芳烷基部分，诸如2-苯基苄基、4-苯基苄基、3,3-二苯基丙基、2-(2-苯基乙基)苄基、2-甲基-3-苯基苄基、2-萘基乙基、4-(芘基)丁基、2-(3-甲基萘基)乙基、2-(1,2-二氢苊-4-基)乙基等。在另一个实施方案中，R11中的至少一个或两个可以是杂芳烷基部分，诸如3-(苯并咪唑基)丙酰基、1-(苯并咪唑基)甲酰基、2-(苯并咪唑基)乙酰基、2-(苯并咪唑基)乙基等。
在某些实施方案中，式IV的化合物包含至少一个选自由以下组成的组的部分：叔丁基、异丙基、2-乙基丁基、1-甲基丙基、1-甲基丁基、3-丁烯基、异戊-2-烯基、2-甲基丙-3-醇基(olyl)、乙基硫基(ethylthiyl)、苯硫基(phenylthiyl)、丙炔酰基、1-甲基-1H-吡咯-2-基；三氟甲基、环丙烷甲醛、卤素取代的苯基、硝基取代的苯基、烷基取代的苯基、2,4,6-三甲基苄基、卤素-5-取代的苯基(诸如对-(F3S)-苯基、叠氮基和2-甲基丁基)。
在某些实施方案中，在式IV中，每个R11独立地选自氢、正丁基、乙基、环己基甲基、环戊基甲基、环丙基甲基、环庚基甲基、环己基-2-基和苄基。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式IV的结构，其中n为3，使得该化合物具有根据式V的结构：
其中L1、L2和L3独立地选自-CHR13-(CH2)m-、-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)m-CHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)p-；
其中m、A、p、n和R13如上文定义。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式V的结构，其中：L1为-CHR13-(CH2)m-；L2为-CHR13-(CH2)n-CHR13-；并且L3为-(CH2)m-CHR13-；其中R11、R12、R13、m和n如上文定义。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式V的结构，其中：L1、L2和L3独立地为-CH2-A-CH2-；并且R12是氢；其中R11和A如上文定义。在特定的实施方案中，A和R11中的至少一个包含烯基部分。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式V的结构，其中：L1、L2和L3独立地为-(CH2)p-，其中p如上文定义；并且R12为氢。在特定的实施方案中，对于L1和L3，p是从3至7的整数，并且对于L3，p是从3至14的整数。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式V的结构，其中：L1和L3独立地为-(CH2)p-；L2为-CH2-A-CH2-；并且R12为氢；其中R12、p和A如上文定义。在特定的实施方案中，对于L1和L3，p是从2至6的整数，并且对于L3，A为(CH2)x，其中x是从1至5的整数，或者环己-1,3-二基。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式IV的结构，其中n为2，使得该化合物具有根据式VI的结构：
其中L1和L2独立地选自-CHR13-(CH2)m-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)n、CHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)p-；
其中m、A、p、n和R13如上文定义。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式VI的结构，其中：L1为-(CH2)p-；并且L2为-(CH2)m-CHR13-；其中R13、m和p如上文定义。在特定的实施方案中，对于L1，p为从3至10的整数，并且对于L2，n为从2至9的整数。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式VI的结构，其中：L1和L2为-(CH2)p-；其中p如上文定义。在特定的实施方案中，p为从3至7的整数。
在某些实施方案中，多胺化合物具有式IV的结构，其中n为1，使得该化合物具有根据式VII的结构：
其中L1为-(CH2)p-，其中p如上文定义。在特定的实施方案中，n为从2至6的整数。
在特定的实施方案中，在式VII中，一个R11是氨基取代的环烷基(例如用伯胺、仲胺、叔胺或季胺取代的环烷基基团)或C2-C8烷酰基(该烷酰基可以被一个或更多个诸如甲基基团或烷基叠氮化物基团的取代基取代)；并且另一个R11是C2-C8烷基或C7-C24芳烷基。
式IIII的代表性化合物包括，例如：
为LSD1的抑制剂的苯基环丙胺衍生物包括由式VIII表示的化合物：
其中：
R1-R5中的每一个独立地选自H、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰氨基、酰氧基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、氰基、氰酰基、卤代芳基、羟基、杂芳基氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸酯、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫氰酸基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
R6为H或烷基；
R7为H、烷基或环烷基；
R8为-L-杂环基，其中-L-杂环基的环或环体系具有从0个至3个选自以下的取代基：卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰氨基、酰氧基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、氰基、氰酰基、卤代芳基、羟基、杂芳基氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸酯、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、氰硫基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基,和C-酰氨基；或
R8为-L-芳基，其中-L-芳基的环或环体系具有从1个至3个选自以下的取代基：卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰氨基、酰氧基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、氰基、氰酰基、卤代芳基、羟基、杂芳基氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸酯、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫氰酸基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
其中每个L独立地选自-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)nO(CH2)n-、和-(CH2)nS(CH2)n-，并且其中每个n独立地选自0、1、2和3；
或其药学上可接受的盐。
在一些情况下，L是共价键。在一些情况下，R6和R7为氢。在一些情况下，R1-R5中的一个选自-L-芳基、-L-杂环基和-L-碳环基。
在式VIII的化合物的一些实施方案中，R8环或环体系上的一个或多个取代基选自羟基、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-N(C1-3烷基)2、-NH(C1-3烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(C1-3烷基)、-C(＝O)N(C1-3烷基)2、-S(＝O)2(C1-3烷基)、-S(＝O)2NH2、-S(O)2NH2、-S(O)2N(C1-3烷基)2、-S(＝O)2NH(C1-3烷基)、-CN、-NH2、和-NO2。
在某些实施方案中，本发明的化合物具有式(VIII)，其中：
每个R1-R5任选地被取代并且独立地选自-H、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰氨基、酰氧基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、氰基、氰酰基、卤代芳基、羟基、杂芳基氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫氰酸基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
R6选自-H和烷基；
R7选自-H、烷基和环烷基；
R8选自-C(＝O)NRxRy和-C(＝O)Rz；
Rx当存在时选自-H、烷基、炔基、烯基、-L-碳环基、-L-芳基和-L-杂环基，所有这些基团任选地被取代(除-H外)；
Ry当存在时选自-H、烷基、炔基、烯基、-L-碳环基、-L-芳基和-L-杂环基，所有这些基团任选地被取代(除-H外)，其中Rx和Ry可以是环状连接的；
Rz当存在时选自-H、烷氧基、-L-碳环基、-L-杂环基、-L-芳基，其中芳基、杂环基或碳环基任选地被取代；每个L是将式VIII的主支架连接至碳环基基团、杂环基基团或芳基基团的连接基，其中连接基-L-的烃部分是饱和的、部分饱和的或不饱和的，并且独立地选自具有以下式的饱和的母体基团：-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)(CH2)-、-(CH2)nC(＝O)NH(CH2)n-、-(CH2)nNHC(O)O(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)NH(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝S)S(CH2)n-、-(CH2)nOC(＝O)S(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)n-、-(CH2)nS(CH2)n-和-(CH2)nNHC(＝S)NH(CH2)n-，其中每个n独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。根据该实施方案，任选地被取代的是指0个或1个至4个任选的取代基，所述任选的取代基独立地选自酰氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、环烷氧基、烷基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、碳环基、氰基、氰酰基、卤素、卤代烷基、卤代芳基、羟基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫氰酸基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基。在该实施方案的更具体的方面中，任选的取代基是1个或2个任选的选自卤素、烷基、芳基和芳烷基的取代基。
在某些实施方案中，在式VIII中，R8为-CORz，使得该化合物具有以下结构：
其中：R1-R7在上文描述；并且Rz为任选地被从1个-4个任选的取代基取代的-L-杂环基，所述任选的取代基独立地选自酰氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、环烷氧基、烷基、烷硫基、环烷基硫基、炔基、氨基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳基硫基、碳环基，氰基、氰酰基、卤素、卤代烷基、卤代芳基、羟基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基、硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫氰酸基、三卤代甲烷磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基，并且其中所述-L-独立地选自-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)n-和-(CH2)nS(CH2)n-，其中每个n独立地选自0、1、2和3。
在该实施方案的特定方面中，每个L独立地选自-(CH2)n-(CH2)n-和-(CH2)n-O-(CH2)n，其中每个n独立地选自0、1、2和3。在该实施方案的更具体的方面中，每个L选自键、-CH2-、-CH2CH2-、-OCH2-、-OCH2CH2-、-CH2OCH2-、-CH2CH2CH2-、-OCH2CH2CH2-和-CH2OCH2CH2-。在还更具体的方面中，每个L选自键、CH2-、-CH2CH2-、OCH2-和-CH2CH2CH2-。在又一还更具体的方面中，L选自键和-CH2-。
式VIII的示例性化合物包括：
式VIII的示例性化合物包括：N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基乙酰胺、N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}-N-丙-2-炔基乙酰胺、N-异丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-(叔丁基)-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-(2-吗啉-4-基-2-氧代乙基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酸甲酯、N-环丙基-2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-甲基-反式-2-(苯基环丙基氨基)丙酰胺、1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮、1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-(反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮、1-(4-苄基哌嗪-1-基)-2-(反式)-2-苯基环丙基氨基)-乙酮、2-(反式)-2-苯基环丙基氨基)-1-(4-苯基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-N-环丙基乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(联苯-4-基甲氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、(反式)-N-(4-氟苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(4-氟苄基)-2-苯基环丙铵、4-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)苄腈、(反式)-N-(4-氰基苯基)-2-苯基环丙铵、(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲基)苄基)环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲基)苄基)环丙铵、(反式)-2-苯基-N-(吡啶-2-基甲基)环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(吡啶-3-基甲基)环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(吡啶-4-基甲基)环丙胺、(反式)-N-((6-甲基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(噻唑-2-基甲基)环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(噻吩-2-基甲基)环丙胺、(反式)-N-((3-溴噻吩-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((4-溴噻吩-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3,4-二氯苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3-氟苄基)-2-苯基环丙铵、(反式)-N-(2-氟苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(喹啉-4-基甲基)环丙胺、(反式)-N-(3-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-苯基-N-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)环丙胺、(反式)-N-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((4-甲基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)吡啶-3-醇、(反式)-N-((6-溴吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、4-(((反式)-2-(4(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)苄腈、(反式)-N-(4-(苄氧基)苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-苄基-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙胺、(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(4-甲氧基苄基)环丙胺、(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(4-氟苄基)环丙胺-、(反式)-2-苯基-N-(喹啉-2-基甲基)环丙胺、(反式)-2-苯基-N-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)环丙胺、(反式)-N-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(喹啉-3-基甲基)环丙胺、(反式)-N-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((5-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((2-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((3H-吲哚-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、3-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)苄腈、(反式)-N-(2-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、3-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)吡啶-2-胺、(反式)-N-((2-氯吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3,4-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((2,3-二氢苯并呋喃-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)甲基)-2-苯基-环丙胺、(反式)-N-(2,6-二氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲氧基)苄基)环丙胺、(反式)-N-(5-氟-2-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2-氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((4-甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2-氟-6-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((2-甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((4,7-二甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(4-甲氧基-3-甲基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3-氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(4-甲氧基-2-甲基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚-6-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚-7-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((2,2-二甲基苯并二氢吡喃-6-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(4-甲氧基-2,3-二甲基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(4-甲氧基-2,5-二甲基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2-氟-4,5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(3-氯-4,5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2-氯-3,4-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2,4-二甲氧基-6-甲基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2,5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2,3-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(2-氯-3-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((1H-吲哚-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺、(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基甲基)环丙胺、(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(2-甲氧基苄基)环丙胺、(反式)-N-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)乙基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(1-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基)乙基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(1-(5-氟-2-甲氧基苯基)乙基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-(1-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-基)-2-苯基环丙胺、(反式)-N-((3-甲基-1,2,4-噁二唑-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺；
及其药学上可接受的盐。
可选择的小分子LSD1抑制剂化合物可以选自选择性的LSD1和LSD1/MAOB双抑制剂，其例如被公开在WO2010/043721(PCT/EP2009/063685)、WO2010/084160(PCT/EP2010/050697)、PCT/EP2010/055131；PCT/EP2010/055103；和EP申请第EP10171345中，所有这些专利申请都在不与本公开内容不一致的程度上以其整体通过引用被明确地并入本文。该类型的代表性化合物包括苯基环丙胺衍生物或同系物，其例示性实例包括：在胺基团上具有一个或两个取代的苯基环丙胺；在胺基团上具有零个、一个或两个取代且在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代的苯基环丙胺；在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代的苯基环丙胺；在胺基团上具有零个、一个或两个取代的苯基环丙胺，其中PCPA的苯基基团被选自芳基或杂环基的另一个环体系取代(交换)，以产生在胺基团上具有零个、一个或两个取代基的芳基环丙胺或杂芳基环丙胺；苯基环丙胺，其中PCPA的苯基基团被选自芳基或杂环基的另一个环体系取代(交换)，以产生芳基环丙胺或杂环基环丙胺，其中所述所述芳基部分或杂环部分上的所述芳基环丙胺或杂环基环丙胺在胺基团上具有零个、一个或两个取代并且在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代；在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代的苯基环丙胺；或任何上文描述的苯基环丙胺类似物或衍生物，其中环丙基具有一个、两个、三个或四个另外的取代基。合适地，本段中上文描述的杂环基基团是杂芳基。
苯基环丙胺衍生物或类似物的非限制性实施方案包括“环丙胺酰胺”衍生物和“环丙胺”衍生物。“环丙胺乙酰胺”衍生物的具体实例包括但不限于：N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}-N-丙-2-炔基乙酰胺、N-异丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-(叔丁基)-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-(2-吗啉-4-基-2-氧代乙基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺、2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酸甲酯、1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮、1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮、1-(4-苄基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮、2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)-1-(4-苯基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(1,1'-联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-N-环丙基乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酮、2-((反式)-2-(联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-甲基-反式-2-(苯基环丙基氨基)丙酰胺、2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺、N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、N-环丙基-N'-[(反式)-2-苯基环丙基]乙烷-1,2-二胺、N,N-二甲基-N'-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)乙烷-1,2-二胺、(3R)-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺、(3S)-N,N-二甲基-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺、(3R)-N,N-二甲基-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(2-哌嗪-1-基乙基)胺、N,N-二乙基-N'-[(反式)-2-苯基环丙基]乙烷-1,2-二胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(2-哌啶-1-基乙基)胺、(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)环丙胺、(反式)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-2-(3'-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙胺、(反式)-2-(3'-氯联苯-4-基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)环丙胺、(R)-1-(2-((反式)-2-(3'-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基氨基)乙基)吡咯烷-3-胺、和N1-环丙基-N2-((反式)-2-(3'-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基)乙烷-1,2-二胺。
“环丙胺”衍生物的具体实例包括但不限于：N-4-氟苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺、N-4-甲氧基苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺、N-苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]氨基-甲基)吡啶-3醇、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-甲基吡啶-2-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(4-氯吡啶-3-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(4-三氟甲基吡啶-3-基-甲基)胺、N-(3-甲氧基苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(喹啉-4-基甲基)胺、N-(2-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、N-(3-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3,4-二氯-1-苯基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(5-溴-噻吩-2-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-溴-噻吩-2-基甲基)-胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(噻吩-2-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(1,3-噻唑-2-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-甲基-吡啶-2-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-4-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-3-基甲基)胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-2-基甲基)胺、[(反式)-2-苯基环丙基]-N-[4-(三氟甲基)苄基]胺、({[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}甲基)苄腈、N-(4-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺、N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-溴-吡啶-2-基甲基)胺、N-4-氰基苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺、N-4-[(苄氧基)-苄基]-N-[(反式)-2-(4-苯基)环丙基]胺、2-((反式)-2-(4-(4-氰基苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-氰基苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(4-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3-溴苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-(3,5-二氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酰胺、2-((反式)-2-(3'-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基氨基)乙酰胺和2-((反式)-2-(3'-氯联苯-4-基)环丙基氨基)乙酰胺。
LSD1抑制剂的其他实例为，例如苯乙肼或帕吉林(炔丙基胺)或其衍生物或类似物。苯乙肼和帕吉林(炔丙基胺)的衍生物和类似物包括但不限于：其中母体化合物的苯基基团被杂芳基或任选地被取代的环状基团替换的化合物，或母体化合物的苯基基团任选地被环状基团取代的化合物。在一个方面中，苯乙肼或帕吉林衍生物或其类似物具有如本文描述的选择性LSD1抑制活性或双重LSD1/MAOB抑制活性。在一些实施方案中，苯乙肼衍生物或类似物在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代基。在一个方面中，苯乙肼衍生物或类似物具有被芳基基团或杂环基基团取代(交换)的苯基基团，其中所述芳基基或杂环基基团具有零个、一个、二个、三个、四个或五个取代基。在一个方面中，帕吉林衍生物或类似物在苯基基团上具有一个、两个、三个、四个或五个取代基。在一个方面中，帕吉林衍生物或类似物具有被芳基基团或杂环基基团取代(交换)的苯基基团，其中所述芳基基团或杂环基基团具有零个、一个、二个、三个、四个或五个取代基。制备这样的化合物的方法是本领域技术人员已知的。
本发明还预期如例如Binda等人(2010,J.Am.Chem.Soc.,132:6827–6833，其据此通过引用以其整体并入本文中)描述的反式苯环丙胺(tranylcypromine)衍生物作为LSD1催化功能的抑制剂。这样的化合物的非限制性实例包括：
可选择地，LSD1抑制剂化合物可以选自Benelkebir等人(2011,Bioorg.Med.Chem.19(12):3709-16，其据此通过引用以其整体并入本文中)描述的反式苯环丙胺类似物。该类型的代表性类似物，包括邻-溴类似物、间-溴类似物和对-溴类似物，包括：(1R,2S)-2-(4-溴苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4c)、(1R,2S)-2-(3-溴苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4d)、(1R,2S)-2-(2-溴苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4e)、(1R,2S)-2-(联苯-4-基)环丙胺盐酸盐(化合物4f)。
还可以参考Culhane等人(2010,J.Am.Chem.Soc.,132:3164–3176，其据此通过引用以其整体并入本文中)公开的肽支架化合物，其包括氯乙烯基、内-环丙胺和肼官能团。Culhane等人公开的非限制性化合物包括炔丙基-Lys-4、N-甲基炔丙基-Lys-4H3-21、顺式-3-氯烯丙基-Lys-4H3-21、反式-3-氯烯丙基-Lys-4H3-21、外-环丙基-Lys-4H3-21、内-环丙基-Lys-4H3-21、内-二甲基环丙基-Lys-4、肼基-Lys-4H3-21和肼基-Lys-4H3-21。
可选择的可用于抑制LSD1的环丙胺化合物包括Fyfe等人在美国公布第2013/0197013号中公开的那些，其通过引用以其整体并入本文中。被公开为对抑制LSD1选择性的LSD1的说明性环丙胺抑制剂包括根据式IX的化合物：
其中：
E为-N(R3)-、-O-、或-S-，或者为-X3＝X4-；
X1和X2独立地为C(R2)或N；
X3和X4，当存在时，独立地为C(R2)或N；
(G)为环基基团(如式IX中所示，环基基团(G)具有n个取代基(R1))；
每个(R1)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自-H、烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1个、2个或3个独立地选择的任选的取代基，或者两个(R2)基团可以一起形成具有1个、2个或3个独立地选择的任选的取代基的杂环基基团或芳基基团，其中所述任选的取代基独立地选自烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、羧酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰胺基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚磺酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸酯；
R3为-H或(C1-C6)烷基基团；
每个L1独立地为亚烷基或杂亚烷基；并且
n为0、1、2、3、4或5；
或对映体、非对映体、或其混合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IX的化合物由式X表示：
其中：
X1为CH或N；(G)为环基基团；
每个(R1)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1个、2个或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、羧酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰胺基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚磺酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸酯；
每个L1独立地为亚烷基或杂亚烷基；
m为0、1、2或3；并且n为0、1、2、3、4或5，条件是n和m被独立地选择成使得当X1为-CH-并且(G)为芳基时，n+m大于零；
或对映体、非对映体、或其混合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在其他实施方案中，式IX的化合物由式XI表示：
其中：
(G)为环基基团；
每个(R1)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有0个、1个、2个或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、羧酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰胺基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚磺酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸酯；
每个L1独立地为亚烷基或杂亚烷基；m是0、1、2或3；并且
n为0、1、2、3、4或5；
或对映体、非对映体、或其混合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在仍其他的实施方案中，式IX的化合物由式XII表示：
其中：
E为-N(R3)-、-O-、或-S-，或者为-X3＝X4-；
X1、X2、X3和X4独立地为C(R2)或N，条件是当E为-X3＝X4-时，X1、X2、X3和X4中的至少一个为N；
(G)为环基基团；每个(R1)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1个、2个或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、羧酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰胺基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚磺酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸酯；
R3为-H或(C1-C6)烷基基团；每个L1为亚烷基或杂亚烷基；并且n为0、1、2、3、4或5；
或对映体、非对映体、或其混合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在仍其他的实施方案中，式IX的化合物由式XIII表示：
其中：
X1、X2、X3和X4独立地为CH或N，条件是X1、X2、X3和X4中的至少一个为N；
(G)为环基基团；每个(R1)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰胺基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1个、2个或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、羧酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰胺基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚磺酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸酯；每个L1为亚烷基或杂亚烷基；
m为0、1、2、或3；并且n为0、1、2、3、4或5；
或对映体、非对映体、或其混合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
根据式IX的代表性化合物合适地选自：(反式)-2-(3'-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙胺、(反式)-2-(三联苯-4-基)环丙胺、4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-4醇、4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-醇、(反式)-2-(6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3,5-二氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(4-氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3-氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(4-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苄腈、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苄腈、(反式)-2-(6-p-甲苯基吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-间甲苯基吡啶-3-基)环丙胺、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺、2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚、(反式)-2-(6-(3-甲氧基-4-甲基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2,4-二氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2,4,6-三氟苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氯苯酚、(反式)-2-(6-(2-氟-3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(5-氯噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(5-甲基噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(1H-吲哚-6-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-5-基)吡啶-3-基)环丙胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)-3-甲基吡啶-2-基)苯酚、(反式)-2-(6-(3-氯苯基)-5-甲基吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(5-甲基-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(4-氟-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(2-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(2-氟-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3-氯-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(2-氯-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-甲氧基苄腈、5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-甲基苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-氯苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯酚、(反式)-2-(6-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(3,5-双(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)乙酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)甲磺酰胺、(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-3-基)吡啶-3-基)环丙胺、5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)噻吩-2-甲腈、(反式)-2-(6-(4-甲基噻吩-3-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(2-氯-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(2-(4-氯苯基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、4-(3-((反式)-2-氨基环丙基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)苯酚、4-(3-((反式)-2-氨基环丙基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)-吡啶-2-基)苯甲酰胺、(反式)-2-(2-甲基-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-羟基苄腈、(反式)-2-(6-(3,4-二氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2,3-二氟苯酚、(反式)-2-(6-(3-氯-4-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺、5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-3-氯-2-氟苯酚、(反式)-2-(6-(1H-吲唑-6-基)吡啶-3-基)环丙胺、(反式)-2-(6-(9H-咔唑-2-基)吡啶-3-基)环丙胺、6-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)二氢吲哚-2酮、6-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯并呋喃-2(3H)-酮、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)吡啶-2(1H)-酮、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)苯磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)丙烷-2-磺酰胺、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-4-氟联苯-3-醇、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯联苯-3-醇、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯-4-氟联苯-3-醇、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)苯磺酰胺、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)丙烷-2-磺酰胺、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)甲烷磺酰胺、N-(2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)甲烷磺酰胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-甲氧基苄腈、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-2-基)甲烷磺酰胺、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-6-甲氧基联苯-3-甲腈、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)-6-甲氧基联苯-3-基)甲烷磺酰胺、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基联苯-3-甲腈、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基联苯-3-基)甲烷磺酰胺、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-羟基苄腈、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-羟基苯基)甲烷-磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)乙烷磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)甲烷磺酰胺、3-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚、(反式)-2-(5-(3-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环丙胺、4-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚、2-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚、2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚、2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚、2-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚、3-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚、2-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚、3-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚、3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)嘧啶-2-基)苯酚、4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)嘧啶-2-基)苯酚、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-甲氧基苯基)甲烷磺酰胺、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯-[1,1'-联苯]-3-基)甲烷磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氯苯基)甲烷磺酰胺、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)-4-氟-[1,1'-联苯]-3-基)甲烷磺酰胺、N-(5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯基)甲烷磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)乙烷磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-4-氰基苯磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-3-氰基苯磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-2-氰基苯磺酰胺、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)-4-氰基苯磺酰胺、N-(4'-((反式)-2-氨基环丙基)-[1,1'-联苯]-3-基)-1,1,1-三氟甲烷磺酰胺、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲腈、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-[1,1'-联苯]-2-醇、4'-((反式)-2-氨基环丙基)-3'-甲氧基-[1,1'-联苯]-3-醇、N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯基)-2-氰基苯磺酰胺；或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在其他实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自苯基环丙胺衍生物，如例如Ogasawara等人(2013,Angew.Chem.Int.Ed.,52:8620-8624，其据此通过引用以其整体并入本文中)所描述的。该类型的代表性化合物由式XIV表示：
其中Ar1为5元至7元芳基环或杂芳基环；
Ar2和Ar3各自独立地选自任选地被1个至3个取代基取代的5元至7元芳基环或杂芳基环；
R1和R2独立地选自氢和羟基，或者R1和R2一起形成＝O、＝S或＝NR3；
R3选自氢、-C1-6烷基或-OH；
m为从1至5的整数；并且
n为从1至3的整数；
或其药学上可接受的盐。
在式XIV的特定实施方案中，以下中的一种或更多种适用：
Ar1为六元芳基环或杂芳基环，尤其是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1,3,5-三嗪、1,2,4-三嗪和1,2,3-三嗪，更特别地是苯基；
Ar2为六元芳基环或杂芳基环，尤其是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1,3,5-三嗪、1,2,4-三嗪和1,2,3-三嗪，尤其是苯基；尤其是其中六元芳基环或杂芳基环任选地被一个任选的取代基取代，尤其是在3位或4位；
Ar3为六元芳基环或杂芳基环，尤其是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1,3,5-三嗪、1,2,4-三嗪和1,2,3-三嗪，尤其是苯基；尤其是其中六元芳基环或杂芳基环任选地被一个任选的取代基取代，尤其是在3位或4位。
关于Ar1和Ar2的特定的任选的取代基包括：-C1-6烷基、-C2-6烯基、-CH2F、-CHF2、-CF3、卤素、芳基、杂芳基、-C(O)NHC1-6烷基、-C(O)NHC1-6烷基NH2、-C(O)-杂环基，尤其是甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、-CH2F、-CHF2、-CH3、Cl、F、苯基、-C(O)NH(CH2)1-4NH2和-C(O)-杂环基；
R1和R2一起形成＝O、＝S或＝NR3，尤其是＝O或＝S，更尤其是＝O；
R3为H、-C1-3烷基或-OH，尤其为H、-CH3或-OH。
m为2至5，尤其是3至5，更尤其是4，
n为1或2，尤其是1。
在一些实施方案中，式XIV的化合物是式XIVa的化合物：
其中Ar2和Ar3如关于式XIV所定义的。
由式XIV表示的非限制性化合物包括以下化合物：
化合物 Ar<sub>2</sub> Ar<sub>3</sub>
1b 苯基 苯基
1c 4-甲基苯基 苯基
1d 4-叔丁基苯基 苯基
1e 4-氯苯基 苯基
1f 4-氟苯基 苯基
1g 4-苯基-苯基 苯基
1h 4-三氟甲基苯基 苯基
1i 3-(2-氨基乙基氨基甲酰基)苯基 苯基
1j 3-(哌嗪-1-羰基)苯基 苯基
1k 4-苯基-苯基 4-甲基苯基
1l 4-苯基-苯基 4-氟苯基
1m 4-苯基-苯基 4-苯基-苯基
1n 4-苯基-苯基 4-叔丁基苯基
1o 4-苯基-苯基 3-甲基苯基
1p 4-苯基-苯基 3-氟苯基
1q 4-苯基-苯基 3-苯基-苯基
式(XIV)的化合物的合成和抑制活性由Ogasawara等人(2013，上文)描述。
其他LSD1抑制剂包括但不限于例如以下中公开的那些：Ueda等人(2009,J.Am.Chem.Soc.,131(48):17536-17537)；包括Mimasu等人(2010,Biochemistry,49(30):6494-6503)。
其他苯基环丙胺衍生物和类似物在例如以下中被发现：Kaiser等人(1962),J.Med.Chem.,5:1243-1265；Zirkle等人(1962)，J.Med.Chem.,1265-1284；美国专利第3365458号；第3471522号和第3532749号；Bolesov等人(1974)，Zhurnal OrganicheskoiKhimii,10(8):1661-1669；和俄罗斯专利第230169号(19681030)。
2.4通过筛选测定鉴定的抑制剂
连同已知的LSD1抑制剂，本发明还包括通过任何合适的筛选测定鉴定的LSD1抑制剂。因此，本发明扩展到筛选抑制性剂的方法，该抑制性剂可用于抑制LSD1，并继而可用于抑制免疫检验点，特别是PD-L1和/或PD-L2。在一些实施方案中，筛选方法包括(1)将制品与测试试剂接触，其中该制品包括(i)多肽，其包含对应于LSD1的至少生物学活性片段或LSD1变体或衍生物的氨基酸序列，或者(ii)多核苷酸，其包含可产生LSD1基因的转录物或LSD1基因的转录物的部分的核苷酸序列，或者(iii)多核苷酸，其包含调节LSD1基因的表达的遗传序列(例如转录元件)的至少一部分、LSD1基因可操作地与报告基因连接；和(2)检测多肽、多核苷酸或报告基因的表达产物的水平或功能性活性相对于在测试试剂的不存在下的参考水平或功能性活性的改变。相对于在测试试剂的不存在下的正常或参考水平和/或功能性活性，多肽、转录物或转录物部分或报告基因的表达产物的水平和/或功能性活性中检测到的减少，表明该试剂可用于抑制免疫检验点，特别是PD-L1和/或PD-L2。
落入本发明范围内的抑制剂包括LSD1的水平、功能性活性或细胞核易位的抑制剂，包括拮抗抗原结合分子，以及LSD1的抑制剂肽片段、反义分子、核酶、RNAi分子和共抑制分子以及多糖和脂多糖抑制剂。
候选试剂包括许多化学类别，虽然通常它们是有机分子，优选地是具有分子量大于50道尔顿且小于约2,500道尔顿的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白结构性相互作用必需的官能团，特别是氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基基团，期望地包括至少两个官能团。候选试剂通常包含被一个或更多个上述官能团取代的同素环状碳或杂环结构或芳香族或多芳香族结构。候选试剂也存在于生物分子中，包括但不限于：肽类、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物、结构类似物或其组合。
LSD1的小(非肽)分子抑制剂是特别有利的。在这方面，小分子是合意的，因为此类分子在口服施用之后更容易被吸收，具有更少的潜在抗原决定簇，或者比更大的基于蛋白的药物更可能穿过细胞膜。小有机分子也可以具有获得进入适当的细胞并影响基因的表达(例如通过与基因表达中涉及的调节区或转录因子相互作用)的能力；或者通过抑制或增强辅助分子的结合来影响基因的活性的能力。
可选择地，呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可得的或容易产生的。此外，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理学和生物化学手段修饰，并可以用于产生组合文库。已知的药理学剂可以被进行定向或随机化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
也可以针对已知的药理学活性化合物及其化学类似物筛选。
用于根据本发明的调节剂的筛选可以通过任何合适的方法实现。例如，该方法可以包括将表达对应于编码LSD1基因的多核苷酸的细胞与猜想具有抑制活性的剂接触，并筛选LSD1的水平或功能性活性的抑制，或筛选由多核苷酸编码的转录物的水平的抑制，或筛选多肽或转录物的下游细胞靶(下文称为靶分子)的活性或表达的抑制。检测此类调节可以使用包括但不限于以下的技术实现：ELISA、基于细胞的ELISA、抑制ELISA、蛋白印迹、免疫沉淀、狭线印迹或斑点印迹测定、免疫染色、RIA、闪烁邻近测定、使用抗原结合分子缀合物或诸如荧光素或罗丹明的荧光物质的抗原缀合物的荧光免疫测定、Ouchterlony双向扩散分析、使用亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素检测系统的免疫测定以及包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的核酸检测测定。
应当理解，LSD1由其调节或表达的多核苷酸可以天然存在于作为测试对象的细胞中，或者为了测试的目的多核苷酸可以已经被引入宿主细胞。此外，天然存在或引入的多核苷酸可以被组成性表达，从而提供可用于筛选下调序列的编码产物的表达的剂的模型，其中下调可以在核酸水平或表达产物水平。此外，对于多核苷酸被引入细胞的程度，该多核苷酸可以包含编码LSD1的整个编码序列，或者该多核苷酸可以包含该编码序列的一部分(例如LSD1的活性位点)或调节编码LSD1的对应基因的表达的部分(例如LSD1启动子)。例如，与多核苷酸天然相关的启动子可以被引入到作为测试对象的细胞中。在该情况下，当仅启动子被使用时，检测启动子活性的调节可以实现，例如，通过将启动子可操作地与合适的报告多核苷酸连接，报告多核苷酸包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和儿茶酚胺乙酰转移酶(CAT)。表达的调节可以通过测量与报告多核苷酸相关的活性来确定。
这些方法提供了进行高通量筛选推定抑制剂的机制，该推定抑制剂诸如构成合成文库、组合文库、化学文库和天然文库的蛋白质剂或非蛋白质剂。这些方法还将促进检测结合编码LSD1的多核苷酸或抑制上游分子的表达的剂，上游分子的表达随后抑制编码LSD1的多核苷酸的表达。因此，这些方法提供了检测根据本发明的直接或间接抑制LSD1的表达或活性的剂的机制。
在可选择的实施方案中，使用商购可得的测定筛选测试试剂，商购可得的测定的例示性实例包括EpiQuik Histone Demethylase LSD1 Inhibitor Screening Assay Kit(Epigentek Group,Brooklyn,NY)或LSD1 Inhibitor Screening Assay Kit(CaymanChemical Company,Ann Arbor,MI)。
可以在动物模型中进一步测试化合物，以鉴定那些具有最强的体内作用的化合物。这些分子可以用作“先导化合物”用于药物的进一步开发，例如，通过对化合物进行顺序修饰、分子建模和合理药物设计中使用的其他常规程序。
2.5新型蛋白质分子LSD1抑制剂
本发明人还设想了抑制LSD1的新型蛋白质分子。特别地，本发明人已经发现，包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成的蛋白质分子抑制LSD1，尤其是抑制LSD1的细胞核易位。此类蛋白质分子抑制癌症干细胞肿瘤细胞和非癌症干细胞肿瘤细胞的形成和维持。因此，本发明人设想了本发明的蛋白质分子可以被用于治疗或预防癌症。此外，本发明人设想了本发明的蛋白质分子可以可用于涉及PD-L1活性和/或PD-L2活性的状况诸如感染，或用于增强免疫应答。因此，在本发明的另一个实施方案中，LSD1抑制剂是分离或纯化的蛋白质分子，其包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
LSD1的氨基酸序列(Uniprot编号O60341-1)示出于SEQ ID NO:5中。残基108-118在下文序列中被下划线标出。
在一些实施方案中，蛋白质分子是由式I表示的分离或纯化的蛋白质分子：
Z1RRTX1RRKRAKVZ2 (I)
其中：
“Z1”和“Z2”独立地不存在或独立地选自包含从约1个至约50个氨基酸残基(和其间的所有整数个残基)的蛋白质部分和保护部分中的至少一种；且
“X1”选自包括S、T、A、G及其修饰形式的小氨基酸残基。
在一些实施方案中，“X1”选自S和A。
在一些实施方案中，“X1”选自S、A及其修饰形式。在一些实施方案中，“X1”选自S、A和S(PO3)。
在一些实施方案中，“X1”是S的修饰形式，特别是S(PO3)。
在一些实施方案中，“Z1”是由式II表示的蛋白质分子：
X2X3X4 (II)
其中：
“X2”不存在或为保护部分；
“X3”不存在或选自任何氨基酸残基；和
“X4”选自任何氨基酸残基。
在一些实施方案中，“X3”选自包括R、K及其修饰形式的碱性氨基酸残基。在一些实施方案中，“X3”是R。
在一些实施方案中，“X4”选自包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。在一些实施方案中，“X4”是W。
在一些实施方案中，“Z2”不存在。
在一些实施方案中，式I的分离或纯化的蛋白质分子包含以SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成或主要由以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成：
RRTSRRKRAKV [SEQ ID NO:1]；
RRTARRKRAKV [SEQ ID NO:2]；
或
RWRRTARRKRAKV [SEQ ID NO:3]。
在特定实施方案中，式I的分离或纯化的蛋白质分子包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列、由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列组成或主要由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，式I的分离或纯化的蛋白质分子不同于由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白质分子：
EGRRTSRRKRAKVE [SEQ ID NO:4]。
本发明还预期SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体蛋白质分子。此类“变体”蛋白质分子包括通过以下衍生自天然蛋白的蛋白：对天然蛋白的N末端和/或C末端缺失(所谓的截短)或添加一个或更多个氨基酸；在天然蛋白中的一个或更多个位点缺失或添加一个或更多个氨基酸；或在天然蛋白中的一个或更多个位点取代一个或更多个氨基酸。
本发明包括的变体蛋白具有生物学活性，即它们继续具有天然蛋白的需要的生物学活性。此类变体可以产生自例如遗传多态性或人为操作。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的蛋白质分子可以被以包括氨基酸取代、缺失、截短和插入的多种方式改变。用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列变体可以通过诱变编码SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中熟知的。参见例如Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)，Kunkel等人(1987,Methods in Enzymol,154:367-382)，美国专利第4,873,192号，Watson等人(“Molecular Biology of the Gene”,Fourth Edition,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)和其中引用的参考文献。关于不影响感兴趣的蛋白的生物学活性的适当的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequenceand Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到。用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选cDNA文库的具有选定特性的基因产物的方法是本领域已知的。此类方法可适用于快速筛选通过组合诱变SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的蛋白质分子产生的基因文库。递归整体诱变(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)，一种增强文库中功能性突变体的频率的技术，可以与筛选测定组合使用，以鉴定活性变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering,6:327-331)。保守取代，诸如一个氨基酸被另一个具有相似特性的氨基酸交换，可以是期望的，如下文更详细讨论的。
与亲本(例如天然存在的或参考的)氨基酸序列诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3相比，本发明的变体肽或多肽可以在沿其序列的多种位置包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代(conservative amino acid substitution)”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义，如下文中详细讨论的。
本发明的蛋白质分子的氨基酸序列根据某些特征或亚类的氨基酸来定义。氨基酸残基通常被亚分类为如下主要亚类：
酸性：残基由于在生理pH质子的失去而具有负电荷，并且当含有该残基的肽在生理pH处于水性介质中时，该残基被水性溶液吸引，从而寻求在该肽的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性：残基由于在生理pH或生理pH的一个或两个pH单位内与质子缔合而具有正电荷(例如组氨酸)，并且当含有该残基的肽在生理pH处于水性介质中时，该残基被水性溶液吸引，从而寻求在该肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电：残基在生理pH带电，并且因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸，诸如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
疏水性：残基在生理pH不带电，并且当含有该残基的肽在生理pH处于水性介质中时，该残基被水性溶液排斥，从而寻求在该肽的构象中的内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性：残基在生理pH不带电，但是当含有该残基的肽在生理pH处于水性介质中时，该残基不被水性溶液充分排斥，因此该残基将寻求该肽的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
此描述也将某些氨基酸表征为“小的(small)”，因为即使缺少极性基团，其侧链也不够大到赋予疏水性。除脯氨酸外，“小的”氨基酸是当至少一个极性基团在侧链上时具有四个或更少的碳，以及当侧链上没有极性基团时具有三个或更少的碳的那些氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于脯氨酸已知的对肽链二级构象的作用，基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一个特别情况。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基基团的氮以及α-碳结合。然而，数个氨基酸相似性矩阵(例如，由Dayhoff等人(1978),A model of evolutionary change inproteins.Matrices for determining distance relationships In M.O.Dayhoff，(ed.)，Atlas of protein sequence and structure,Vol.5,pp.345-358,NationalBiomedical Research Foundation,Washington DC；和由Gonnet等人，1992,Science 256(5062):1443-1445公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸包括在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的同组中。因此，为了本发明的目的，将脯氨酸分类为“小的”氨基酸。
分类为极性或非极性所需的吸引或排斥的程度是任意的，并且因此，本发明具体预期的氨基酸已被分类为一种或另一种。大多数不被具体命名的氨基酸可根据已知行为进行分类。
氨基酸残基可进一步被亚分类为环状或非环状和芳香族或非芳香族，关于残基的侧链取代基团的不言自明的分类，和小的或大的。倘若存在额外的极性取代基，如果其含有总共四个碳原子或更少(包括羧基碳)，则残基被认为是小的；如果不存在额外的极性取代基，则三个或更少。小氨基酸残基当然总是非芳香族的。依赖于其结构特性，氨基酸残基可以落入两个或更多个类别中。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据该方案的亚分类被示出于表1。
表1：氨基酸亚分类
保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸、或用结构相关的氨基酸相似地替换氨基酸，将不会对所得的在本发明中可用的变体肽的性质具有大的作用。氨基酸改变是否导致抑制LSD1的蛋白质分子，可以通过测定其活性容易地确定。保守取代在表2中在示例性和优选取代的标题下显示。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过选择在其维持(a)在取代区域中的肽骨架的结构，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中没有显著差异的取代来实现。引入取代后，针对生物活性筛选变体。
表2：示例性和优选的氨基酸取代
其中Nle用于指正亮氨酸。
可选地，用于进行保守取代的相似氨基酸可以基于侧链的身份被分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；和第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸，如Zubay,Biochemistry,第三版,Wm.C.Brown Publishers(1993)中描述的。
因此，本发明的肽中预测的非必需氨基酸残基通常被来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基替换。可选择地，突变可以沿着本发明的肽的编码序列的全部或部分被随机引入，诸如通过饱和诱变，并且可以关于亲本多肽的活性筛选所得突变体，例如本文描述的，以鉴定保留该活性的突变体。诱变编码序列之后，编码的肽可以被重组表达并确定其活性。“非必需”氨基酸残基是可以从本发明的实施方案肽的野生型序列改变而不取消或基本上改变其一种或更多种活性的残基。合适地，改变基本上不改变这些活性中的一个，例如，活性是野生型活性的至少20％、40％、60％、70％或80％。相比之下，“必需”氨基酸残基是，当其从本发明的实施方案肽的野生型序列改变时，导致亲本分子的活性的消失，使得少于20％的野生型活性存在。例如，相对于在Z1处开始的式(I)的编号，此类必需氨基酸残基包括在位置2的Arg(或其修饰形式)、在位置2、位置3、位置6、位置7和位置9的Arg(或其修饰形式)、在位置4的Thr(或其修饰形式)、在位置8和位置11的Lys(或其修饰形式)、在位置10的Ala(或其修饰形式)和在位置12的Val(或其修饰形式)。
因此，本发明还预期本发明的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3的蛋白质分子的变体，其中变体由一个或更多个氨基酸残基的添加、缺失或取代与亲本序列不同。通常，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数确定的，变体将显示出与例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中列出的亲本或参考蛋白质分子序列至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相似性。期望地，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数确定的，变体将与例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3中列出的亲本或参考肽序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。落入本发明的变体肽的范围内的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的变体，可以通常以至少1个但少于4个、3个、2个或1个氨基酸残基与亲本分子不同。在一些实施方案中，本发明的变体肽以至少1个但少于4个、3个、2个或1个氨基酸残基与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中的对应序列不同。在一些实施方案中，相对于在Z1处开始的式(I)的编号，本发明的变体肽的氨基酸序列包含在位置2的Arg(或其修饰形式)、在位置2、位置3、位置6、位置7和位置9的Arg(或其修饰形式)、在位置4的Thr(或其修饰形式)、在位置8和位置11的Lys(或其修饰形式)、在位置10的Ala(或其修饰形式)和在位置12的Val(或其修饰形式)。在一些实施方案中，本发明的变体肽的氨基酸序列包含式I的蛋白质分子。在具体实施方案中，本发明的变体肽抑制LSD1，特别是LSD1细胞核易位。
如果序列比较需要比对，通常为了最大相似性或同一性而比对序列。由于缺失或插入或错配而从环中脱出的序列通常被认为是差异。合适地，差异是在非必需残基处的差异或改变或是保守取代。
在一些实施方案中，序列之间的序列相似性或序列同一性的计算如下进行：
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列为了最佳比较目的被比对(例如，为了最佳比对空位可以被引入到第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中，并且出于比较目的非同源序列可以被忽略)。在一些实施方案中，为了比较目的比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少40％，更通常至少50％或60％，及甚至更通常至少70％，80％，90％或100％。然后在对应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸被比较。当在第一序列中的位置被在第二序列中对应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。对于氨基酸序列比较，当在第一序列中的位置被在第二序列中对应位置上的相同或相似氨基酸残基(即保守取代)占据时，则分子在该位置是相同的。
两个序列之间的同一性百分比为，考虑到为了两个序列的最佳比对需要被引入的空位的数目和每一个空位的长度，序列在单独的位置上的共有的相同氨基酸残基的数目的函数。相比之下，两个序列之间的相似性百分比为考虑到为了两个序列的最佳比对需要被引入的空位的数目和每一个空位的长度，序列在单独的位置上共有的相同和相似氨基酸残基的数目的函数。
序列的比较和序列之间的同一性百分比或相似性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在某些实施方案中，氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比使用已经被并入到GCG软件包中的GAP程序中(Devereaux,等人(1984)Nucleic Acids Research,12:387-395)的Needleman和Wünsch(1970，J.Mol.Biol.,48:444-453)算法，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。在一些实施方案中，氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比可以使用已经被并入到ALIGN程序(2.0版)中的Meyers和Miller(1989，Cabios，4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4来确定。
本发明还预期由多核苷酸序列编码的分离的、合成的或重组的肽，该多核苷酸序列在如本文定义的严格性条件下，尤其是在中、高或非常高的严格性条件下，优选地在高或非常高的严格性条件下，与编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的肽的多核苷酸序列或其非编码链杂交。本发明还预期分离的包含多核苷酸序列的核酸分子，该多核苷酸序列在本文定义的严格性条件下，尤其是在中、高或非常高的严格性条件下，优选地在高或非常高的严格性条件下，与编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的肽的多核苷酸序列或其非编码链杂交。
如本文使用的，术语“在严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件，并且可以包括低严格性、中严格性、高严格性和非常高严格性条件。
进行杂交反应的指导可以见于Ausubel等人(1998)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.)，特别在第6.3.1节-第6.3.6节中。水性和非水性方法两者都可以使用。本文提及的低严格性条件包括并涉及(encompass)在42℃从至少约1％v/v到至少约15％v/v甲酰胺和从至少约1M到至少约2M盐用于杂交，以及在42℃至少约1M到至少约2M盐用于洗涤。低严格性条件还可以包括在65℃1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％十二烷基硫酸钠(SDS)用于杂交，以及在室温(i)2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、5％SDS用于洗涤。低严格性条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在至少50℃洗涤两次(对于低严格性条件洗涤温度可以增加至55℃)。中严格性条件包括并涉及(encompass)在42℃从至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺和从至少约0.5M到至少约0.9M盐用于杂交，以及在55℃至少约0.1M到至少约0.2M盐用于洗涤。中严格性条件还可以包括在65℃1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS用于杂交，以及在60℃-65℃(i)2×SSC、0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA、1mMEDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS用于洗涤。中严格性条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在60℃洗涤一次或更多次。高严格性条件包括并涉及(encompass)在42℃从至少约31％v/v到至少约50％v/v甲酰胺和从约0.01M到约0.15M盐用于杂交，以及在55℃约0.01M到约0.02M盐用于洗涤。高严格性条件还可以包括在65℃1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于杂交，以及在超过65℃的温度(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS用于洗涤。高严格性条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃杂交，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤一次或更多次。
在本发明的一些方面，提供了由多核苷酸序列编码的本发明的分离的、合成的或重组的肽，该多核苷酸序列在高严格性条件下与编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:3的肽的多核苷酸序列或其非编码链杂交。在某些实施方案中，本发明的分离的、合成的或重组的肽由多核苷酸序列编码，该多核苷酸序列在非常高的严格性条件下与编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的肽的多核苷酸序列或其非编码链杂交。非常高的严格性条件的一个实施方案包括在0.5M磷酸钠、7％SDS中在65℃杂交，随后在0.2×SSC、1％SDS中在65℃洗涤一次或更多次。在一些实施方案中，相对于在Z1处开始的式(I)的编号，本发明的变体肽的氨基酸序列包含在位置2的Arg(或其修饰形式)、在位置2、位置3、位置6、位置7和位置9的Arg(或其修饰形式)、在位置4的Thr(或其修饰形式)、在位置8和位置11的Lys(或其修饰形式)、在位置10的Ala(或其修饰形式)和在位置12的Val(或其修饰形式)。在一些实施方案中，本发明的变体肽的氨基酸序列包含式I的蛋白质分子。在特定实施方案中，本发明的变体肽抑制LSD1，特别是LSD1细胞核易位。
其他严格性条件是本领域熟知的，并且本领域技术人员将认识到，多种因素可以被操作，以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可以用于确保高程度的杂交。关于详细实例，参见Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons,Inc.)，特别是2.10.1页至2.10.16页和Sambrook等人(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Press)，特别在第1.101节至第1.104节。
虽然严格洗涤通常在从约42℃至68℃的温度进行，但本领域技术人员将理解，其他温度也可以适用于严格条件。最大杂交速率通常发生在用于形成DNA-DNA杂交体的Tm以下约20℃至25℃。本领域熟知，Tm是解链温度，或者两个互补多核苷酸序列解离的温度。用于估算Tm的方法在本领域是熟知的(参见Ausubel等人(1998)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.)在2.10.8页)。通常，DNA的完全匹配双链体的Tm可以通过下式预测作为近似值：
Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)
其中：M是Na+的浓度，优选地在0.01M至0.4M的范围内；％G+C是鸟苷和胞嘧啶碱基的总和占碱基总数的百分比，在30％G+C和75％G+C之间；％甲酰胺是按体积计甲酰胺浓度的百分比；长度是DNA双链体中碱基对的数量。随机错配的碱基对的数目中每1％的增加，双链DNA的Tm降低大约1℃。洗涤通常在Tm-15℃进行，用于高严格性，或在Tm-30℃进行，用于中严格性。
在杂交程序的一个实例中，将含有固定化DNA的膜(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记的探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％BSA)、0.1％SDS和200mg/mL变性鲑精DNA)中在42℃杂交过夜。然后对膜进行两次连续的中严格性洗涤(即在45℃2×SSC，0.1％SDS 15分钟，随后在50℃2×SSC，0.1％SDS 15分钟)，随后两次连续的更高的严格性洗涤(即在55℃0.2×SSC，0.1％SDS 12分钟，随后在65-68℃0.2×SSC和0.1％SDS溶液12分钟)。
本发明的蛋白质分子还包括包含具有修饰的侧链的氨基酸的肽，在肽合成期间掺入非天然氨基酸残基和/或其衍生物，以及使用交联剂和对本发明的肽施加构象限制的其他方法。侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，诸如通过用乙酸酐酰化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐酰化氨基基团；用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)酰胺化；用氰酸酯氨基甲酰化氨基基团；用吡哆醛-5-磷酸吡哆醛化赖氨酸，随后用硼氢化钠还原；通过与醛反应还原烷基化，随后用硼氢化钠还原；以及用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苄基化(trinitrobenzylation)氨基基团。
羧基基团可以通过形成O-酰基异脲(acylisourea)被碳二亚胺活化，随后进行后续衍生化来修饰，例如衍生成对应的酰胺。
精氨酸残基的胍基团可以通过与试剂诸如2,3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。
色氨酸残基可以例如通过用2-羟基-5-硝基苄基溴化物或磺酰卤化物烷基化吲哚环来修饰，或者通过用N-溴代丁二酰亚胺氧化来修饰。
酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化来修饰以形成3-硝基酪氨酸衍生物。
在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸、硒代半胱氨酸、O-磷酸丝氨酸以及α,α-二氟亚甲基膦酰基丝氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本发明考虑的非天然氨基酸列表显示在表3中。
表3：示例性非天然氨基酸
虽然本发明的蛋白质分子可以固有地渗透膜，但是膜渗透部分与蛋白质分子的缀合可以进一步增加膜渗透。因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包含至少一个膜渗透部分。膜渗透部分可以被缀合在蛋白质分子的任何位置。合适的膜渗透部分包括脂质部分、胆固醇和蛋白质，诸如细胞渗透肽和聚阳离子肽；尤其是脂质部分。
合适的细胞渗透肽可以包括例如US 20090047272、US 20150266935和US20130136742中描述的肽。因此，合适的细胞穿透肽可以包括但不限于碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽以及含有Arg和Lys残基的非天然类似物的碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽，诸如YGRKKRPQRRR(HIV TAT47-57；SEQ ID NO:6)，RRWRRWWRRWWRRWRR(W/R；SEQ ID NO:7)，CWK18(AlkCWK18；SEQ ID NO:8)，K18WCCWK18(Di-CWK18；SEQ ID NO:9)，WTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan；SEQ ID NO:10)，GLFEALEELWEAK(DipaLytic；SEQ ID NO:11)，K16GGCRGDMFGCAK16RGD(K16RGD；SEQ ID NO:12)，K16GGCMFGCGG(P1；SEQ IDNO:13)，K16ICRRARGDNPDDRCT(P2；SEQ ID NO:14)，KKWKMRRNQFWVKVQRbAK(B)bA(P3；SEQ IDNO:15)，VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA(P3a；SEQ ID NO:16)，IGRIDPANGKTKYAPKFQDKATRSNYYGNSPS(P9.3；SEQ ID NO:17)，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1；SEQ ID NO:18)，PLAEIDGIELTY(Plae；SEQ ID NO:19)，K16GGPLAEIDGIELGA(Kplae；SEQ ID NO:20)，K16GGPLAEIDGIELCA(cKplae；SEQ ID NO:21)，GALFLGFLGGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(MGP；SEQ IDNO:22)，WEAK(LAKA)2-LAKH(LAKA)2LKAC(HA2；SEQ ID NO:23)，(LARL)6NHCH3(LARL46；SEQ IDNO:24)，KLLKLLLKLWLLKLLL(Hel-11-7；SEQ ID NO:25)，(KKKK)2GGC(KK；SEQ ID NO:26)，(KWKK)2GCC(KWK；SEQ ID NO:27)，(RWRR)2GGC(RWR；SEQ ID NO:28)，PKKKRKV(SV40NLS7；SEQID NO:29)，PEVKKKRKPEYP(NLS12；SEQ ID NO:30)，TPPKKKRKVEDP(NLS12a；SEQ ID NO:31)，GGGGPKKKRKVGG(SV40 NLS13；SEQ ID NO:32)，GGGFSTSLRARKA(AV NLS13；SEQ ID NO:33)，CKKKKKKSEDEYPYVPN(AV RME NLS17；SEQ ID NO:34)，CKKKKKKKSEDEYPYVPNFSTSLRARKA(AVFP NLS28；SEQ ID NO:35)，LVRKKRKTEEESPLKDKDAKKSKQE(SV40 N1 NLS24；SEQ ID NO:36)，和K9K2K4K8GGK5(Loligomer；SEQ ID NO:37)；HSV-1间层蛋白VP22；与细胞核输出信号(NES)融合的HSV-1间层蛋白VP22r；大肠杆菌(Escherichia coli)肠毒素EtxB(H57S)的突变体B亚单位；脱毒的外毒素A(ETA)；HIV-1Tat蛋白的蛋白转导结构域，GRKKRRQRRRPPQ(SEQ IDNO:38)；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)触角足(Antennapedia)结构域Antp(氨基酸43-58)，RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:39)；Buforin II，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ IDNO:40)；hClock-(氨基酸35-47)(人时钟蛋白(human Clock protein)DNA结合肽)，KRVSRNKSEKKRR(SEQ ID NO:41)；MAP(模式两亲性肽)(model amphipathic peptide)，KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO:42)；K-FGF，AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:43)；Ku70衍生肽，其包含选自包含以下的组的肽：VPMLKE(SEQ ID NO:44)、VPMLK(SEQ ID NO:45)、PMLKE(SEQ ID NO:46)或PMLK(SEQ ID NO:47)；朊病毒，小鼠Prpe(氨基酸1-28)，MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP(SEQ ID NO:48)；pVEC，LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO:49)；Pep-I，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:50)；SynBl，RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ IDNO:51)；Transportan，GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:52)；Transportan-10，AGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:53)；CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-半胱酰胺(cysteamide)(SEQ ID NO:54)；Pep-7，SDLWEMMMVSLACQY(SEQ ID NO:55)；HN-1，TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO:56)；VT5，DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD(SEQ ID NO:57)；或pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO:58)。
在优选实施方案中，膜渗透部分是脂质部分，诸如C10-C20脂肪酰基基团，尤其是十八酰基(硬脂酰基；C18)，十六酰基(棕榈酰基；C16)或十四酰基(肉豆蔻酰基；C14)；最尤其是十四酰基。在优选实施方案中，膜可渗透部分与蛋白质分子的N-末端或C-末端氨基酸残基缀合(附着)，或通过蛋白质分子的赖氨酸侧链的胺缀合(附着)，尤其地与蛋白质部分的N-末端氨基酸残基缀合(附着)。
对于本发明的特定用途和方法，可能需要具有高水平的稳定性的蛋白质分子，例如，以增加蛋白质分子在受试者中的半衰期。因此，在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子包含稳定部分，稳定部分在本文中也称为“保护部分”。稳定部分可以被缀合在蛋白质分子上的任何位置。合适的稳定部分包括聚乙二醇(PEG)或加帽部分，包括乙酰基基团、焦谷氨酸或氨基基团。在优选实施方案中，乙酰基基团和/或焦谷氨酸与蛋白质分子的N末端氨基酸残基缀合。在特定实施方案中，蛋白质分子的N末端是焦谷氨酰胺(pyroglutamide)或乙酰胺。在优选实施方案中，氨基基团与蛋白质分子的C末端氨基酸残基缀合。在特定实施方案中，本发明的蛋白质分子在C末端具有伯酰胺。在优选实施方案中，PEG与蛋白质分子的N末端或C末端氨基酸残基缀合，或通过赖氨酸侧链的胺缀合，尤其地通过N末端氨基酸残基或通过赖氨酸侧链的胺缀合。
在优选实施方案中，本发明的蛋白质分子在C末端具有伯酰胺或自由羧基基团(C末端酸)，并在N末端具有伯胺。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子是环肽。不希望受到理论的束缚，肽的环化被认为降低了肽对降解的敏感性。在特定实施方案中，蛋白质分子使用N-至-C环化(头至尾环化)来环化，优选地通过酰胺键来环化。此类肽不具有N末端或C末端氨基酸残基。在特定实施方案中，本发明的蛋白质分子具有酰胺环化的肽骨架。在其他实施方案中，本发明的蛋白质分子使用侧链至侧链环化来环化，优选地通过二硫键或内酰胺桥来环化。
在一些实施方案中，N末端和C末端使用连接部分来连接。连接部分可以是肽接头，使得环化产生酰胺环化的肽骨架。连接部分的肽序列内的变化是可能的，使得连接部分可以被修饰以改变蛋白质分子的物理化学性质，并潜在地减少本发明的蛋白质分子的副作用，或另外例如通过提高稳定性来提高蛋白质分子的治疗用途。连接部分将具有合适的长度，以跨越肽的N末端和C末端之间的距离，而基本上不改变蛋白质分子的结构构象，例如肽类连接部分的长度可以在2个和10个氨基酸残基之间。在一些实施方案中，可能需要更长或更短的肽类连接部分。
本发明的蛋白质分子可以呈盐或前药的形式。本发明的蛋白质分子的盐优选地是药学上可接受的，但是应当理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内。
本发明的蛋白质分子可以呈结晶形式和/或呈溶剂合物形式，例如水合物。可以使用本领域已知的方法进行溶剂化。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子选择性抑制LSD1超过至少一种其他LSD或另一种酶诸如MAO。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子选择性抑制LSD1超过其他LSD亚型和MAO。在一些实施方案中，相对于抑制另一种LSD或MAO，本发明的蛋白质分子显示出LSD1选择性大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍。在其他实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少50倍。在另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少100倍。在仍另外的实施方案中，选择性分子显示出对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO大至少500倍。在又另外的实施方案中，选择性分子对LSD1的抑制比对另一LSD或MAO的抑制大至少100倍。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子是非选择性LSD1抑制剂。
本发明还预期编码本发明的蛋白质分子的核酸分子。因此，在本发明的另一个方面，提供了分离的核酸分子，其包含编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列或与编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，本发明的蛋白质分子诸如式I的蛋白质分子；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或如本文描述的变体蛋白质分子。
在一些实施方案中，由多核苷酸序列编码的蛋白质分子不同于由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白质分子。
本发明的分离的核酸分子可以是DNA或RNA。当核酸呈DNA形式时，核酸可以是基因组DNA或cDNA。本发明的核酸分子的RNA形式通常是mRNA。
虽然核酸分子通常是分离的，但是在一些实施方案中，核酸分子可以被整合到其他遗传分子诸如表达载体中，与其他遗传分子诸如表达载体连接，或另外与其他遗传分子诸如表达载体融合或缔合。通常，表达载体包括可操作地与多核苷酸序列连接的转录和翻译调节核酸。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列，本发明的蛋白质分子诸如式I的蛋白质分子；SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或如本文描述的变体蛋白质分子。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子可以通过引入包含编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列的一种或更多种表达构建体在细胞内被产生，该表达构建体诸如表达载体。
本发明设想了在以下宿主细胞内重组性产生本发明的蛋白质分子：诸如哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞或人胚胎肾(HEK293)细胞)、酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞或Arxula adeninivorans细胞)或细菌细胞(例如大肠杆菌细胞、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)细胞)。
对于治疗性应用，本发明还预期在以下细胞内体内产生本发明的蛋白质分子：LSD1、PKC-θ、PD-L1和/或PD-L2过表达细胞，尤其是LSD1过表达细胞，诸如脊椎动物细胞，特别是哺乳动物或鸟类细胞，尤其是哺乳动物细胞。
例如，如US 5,976,567中描述的，天然或合成核酸的表达通常通过以下来实现：将编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸序列可操作地与调节元件(例如启动子，其可以是组成型的或可诱导型的)连接，合适地将构建体掺入表达载体中并将载体引入合适的宿主细胞中。通常的载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、和可用于调节核酸的表达的启动子。载体任选地包含通用表达盒，该通用表达盒含有至少一个独立的终止子序列、允许盒在真核生物、原核生物或两者中的复制的序列(例如穿梭载体)和用于原核系统和真核系统两者的选择标志物。载体可以适合于在原核生物、真核生物或两者中复制和整合。参见，Giliman和Smith(1979),Gene,8:81-97；Roberts等人(1987)Nature,328:731-734；Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,volume 152,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)；Sambrook等人(1989),Molecular Cloning-a Laboratory Manual(第二版)Vol.1-3,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel等人(1994)Current Protocolsin Molecular Biology,eds.，Current Protocols，Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.之间合资(补编)(Supplement)。
含有来自诸如逆转录病毒的真核病毒的调节元件的表达载体通常被用于在真核细胞中表达核酸序列。SV40载体包括pSVT7和pMT2。衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且衍生自Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他显示出对在真核细胞中表达有效的启动子的指导下表达蛋白的任何其他载体。
虽然可以使用多种载体，但是应当注意，病毒表达载体可用于修饰真核细胞，因为病毒载体转染靶细胞并整合到靶细胞基因组中的效率高。该类型的说明性表达载体可以衍生自病毒DNA序列，病毒DNA序列包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、和逆转录病毒(诸如B、C和D逆转录病毒)、以及泡沫病毒(spumaviruses)和修饰的慢病毒。用于转染动物细胞的合适的表达载体由以下描述：例如Wu和Ataai(2000Curr.Opin.Biotechnol.,11(2):205-208；Vigna和Naldini(2000)J.Gene Med.,2(5):308-316；Kay等人(2001)Nat.Med.,7(1):33-40；Athanasopoulos等人(2000)Int.J.Mol.Med.,6(4):363-375；和Walther和Stein(2000)Drugs,60(2):249-271。
表达载体的多肽或肽编码部分可以包含天然存在的序列、或已经使用重组技术工程化的天然存在的序列的变体。在变体的一个实例中，编码本发明的蛋白质分子的多核苷酸的密码子组成被修饰，以允许本发明的蛋白质分子在哺乳动物宿主中的增强的表达，使用的方法利用了特定哺乳动物细胞或组织类型中的密码子使用偏好或密码子翻译效率，例如国际公布WO 99/02694和WO 00/42215中阐述的。简言之，后面这些方法是基于以下观察：不同细胞或组织之间不同密码子的翻译效率不同，并且这些差异可以连同基因的密码子组成一起使用，以调节特定细胞或组织类型中蛋白的表达。因此，对于构建密码子优化的多核苷酸，亲本多核苷酸的至少一个现存密码子用同义密码子替换，该同义密码子在靶细胞或组织中具有比其替换的现存密码子更高的翻译效率。虽然优选的是，用具有更高翻译效率的同义密码子替换亲本核酸分子的所有现存密码子，但这不是必需的，因为即使用部分替换也可以实现增加的表达。合适地，替换步骤影响亲本多核苷酸的现存密码子的5％、10％、15％、20％、25％、30％、更优选地35％、40％、50％、60％、70％或更多。
表达载体与导入其的细胞相容，使得本发明的蛋白质分子可由细胞表达。表达载体通过任何合适的方法引入细胞，合适的方法依赖于表达载体的特定选择和所用细胞。此类引入方法对本领域技术人员是熟知的。例如，引入可以通过使用以下来实现：接触(例如在病毒载体的情况下)、电穿孔、转化、转导、接合或三亲交配(conjugation ortriparental mating)、转染、用阳离子脂质感染膜融合物、用DNA包被的微粒高速轰击、用磷酸钙-DNA沉淀孵育、直接微注射到单细胞中等。其他方法也是可用的并且对于本领域技术人员是已知的。可选择地，载体通过例如脂质体的阳离子脂质的方法引入。此类脂质体是商购可得的(例如由Invitrogen Waltham MA,USA提供的LipofectamineTM等)。
本发明的蛋白质分子可以使用重组DNA技术或通过化学合成来制备。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子使用标准肽合成方法，诸如溶液合成或固相合成来制备。本发明的蛋白质分子的化学合成可以手动或使用自动合成仪来进行。例如，线性肽可以使用Boc或Fmoc化学使用固相肽合成来合成，如以下中所述：Merrifield(1963)J Am Chem Soc，85(14):2149-2154；Schnolzer,等人(1992)Int J Pept ProteinRes,40:180-193；Ensenat-Waser,等人(2002)IUBMB Life,54:33-36；WO 2002/010193和Cardosa等人(2015)Mol Pharmacol,88(2):291-303。在脱保护和从固体支持物切割之后，使用合适的方法诸如制备色谱法，纯化线性肽。
在其他实施方案中，本发明的蛋白质分子可以被环化。环化可以使用数种技术来进行，例如，如Davies(2003)J Pept Sci,9:471-501中描述的。
在一些实施方案中，使用重组DNA技术制备本发明的蛋白质分子。例如，本发明的蛋白质分子可以通过包括以下步骤的程序制备：(a)制备包含多核苷酸序列的构建体，该多核苷酸序列编码本发明的蛋白质分子并可操作地与调节元件连接；(b)将构建体引入宿主细胞中；(c)培养宿主细胞以表达多核苷酸序列，从而产生本发明的编码的蛋白质分子；以及(d)从宿主细胞分离本发明的蛋白质分子。本发明的蛋白质分子可以使用标准方案重组性制备，例如以下中所述：Klint等人(2013)PLOS One,8(5):e63865；Sambrook,等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Press)，特别在第16节和第17节中；Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(John Wileyand Sons,Inc.)，特别在第10章和第16章；以及Coligan,等人(1997)Current Protocolsin Protein Science(John Wiley and Sons,Inc.)，特别在第1章、第5章和第6章。
3.药物组合物
根据本发明，LSD1抑制剂可用于抑制免疫检验点，特别是抑制PD-L1和/或PD-L2的组合物和方法。本发明的蛋白质分子还可用于治疗或预防诸如癌症或感染的涉及LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2过表达的状况的组合物和方法。因此，在一些实施方案中，LSD1抑制剂可以呈药物组合物的形式，其中该药物组合物包含LSD1抑制剂和药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方案中，LSD1抑制剂是本发明的蛋白质分子。
LSD1抑制剂可以作为中性或盐形式被配制到药物组合物中。
如本领域技术人员将理解的，药学上可接受的载体或稀释剂的选择将依赖于施用的途径以及状况的性质和待治疗的受试者。本领域技术人员可以容易地确定特定的载体或递送系统和施用途径。载体或递送系统和施用途径应当仔细选择，以确保LSD1抑制剂的活性在制剂的制备期间不被消耗，并且LSD1抑制剂能够完整到达作用部位。本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、直肠、局部、鼻内、眼内、透粘膜、经肠、肠内、肌内、皮下、髓内、鞘内、室内、脑内、阴道内、膀胱内、静脉内或腹膜内施用。
合适的用于可注射使用的药物形式包括无菌可注射溶液或分散体，和用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。此类形式在制造和储存的条件下应该是稳定的，并且可以保存防止还原、氧化和微生物污染。
本领域技术人员将能够容易地使用常规方法确定LSD1抑制剂的适当的制剂。制备和施用技术可以在例如Remington(1980)Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.最新版中找到。
优选的pH范围和合适的诸如抗氧化剂的赋形剂的鉴定在本领域是常规的，例如，如在Katdare和Chaubel(2006)Excipient Development for Pharmaceutical,Biotechnology and Drug Delivery Systems(CRC Press)中描述的。缓冲体系被常规地用于提供所需范围的pH值，并且可以包括但不限于：羧酸缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和琥珀酸盐；甘氨酸；组氨酸；磷酸盐；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)；精氨酸；氢氧化钠；谷氨酸盐和碳酸盐缓冲液。合适的抗氧化剂可以包括但不限于：酚类化合物诸如丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene)(BHT)和丁羟茴醚(butylated hydroxyanisole)；维生素E；抗坏血酸；还原剂诸如甲硫氨酸或亚硫酸盐；金属螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；盐酸半胱氨酸；亚硫酸氢钠；焦亚硫酸钠；亚硫酸钠；棕榈酸抗坏血酸酯；卵磷脂；没食子酸丙酯和α-生育酚。
对于注射，LSD1抑制剂可以在水性溶液中，合适地在生理学上相容的缓冲液诸如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液中来配制和稀释。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。
本发明的组合物可以被配制为用于施用的呈含有可接受的稀释剂(诸如盐水和无菌水)的液体的形式，或者可以呈含有可接受的稀释剂或载体以赋予所需的质地、稠度、粘度和外观的洗剂、乳膏或凝胶的形式。本领域技术人员熟悉的可接受的稀释剂和载体包括但不限于：乙氧基化的和非乙氧基化的表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(诸如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、pH平衡剂、纤维素衍生物、乳化剂诸如非离子性有机和无机碱、防腐剂、蜡酯、类固醇醇类(steroid alcohols)、甘油三酯、磷脂诸如卵磷脂和脑磷脂、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水性羊毛脂衍生物和亲水性蜂蜡衍生物。
可选择地，LSD1抑制剂可以容易地使用本领域熟知的药学上可接受的载体配制为适于口服施用的剂量，这也被考虑用于本发明的实施。此类载体使得本发明的生物活性剂可被配制为剂型诸如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于被待治疗的患者口服摄入。这些载体可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。
用于肠胃外施用的药物制剂包括呈水溶性形式的LSD1抑制剂的水性溶液。此外，LSD1抑制剂的悬浮液可以被制备为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液黏度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的剂。
无菌溶液可以通过将活性化合物以所需的量在适当的溶剂中与如上文描述的所需的其他赋形剂混合，然后灭菌诸如过滤来制备。通常，分散体通过将无菌的活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物包含基本的分散介质和如上文描述的所需的赋形剂。无菌干粉可以通过真空干燥或冷冻干燥包含活性化合物和如上文描述的其他需要的赋形剂的无菌溶液来制备。
用于口服用途的药物制剂可以通过如下来获得：将LSD1抑制剂与固体赋形剂混合，并且如果需要，在添加合适的助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别地为：填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品诸如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐诸如藻酸钠。此类组合物可以通过任何药学的方法制备，但是所有方法包括将一种或更多种如上文描述的治疗剂与构成一种或更多种必需成分的载体结合(association)的步骤。通常，本发明的药物组合物可以以方法自身是已知的方法制备，例如借助于常规的混合、溶解、颗粒化、糖衣丸制备、磨细、乳化、包封、包埋或冻干的方法。
糖衣丸芯设有适合的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以被添加至片剂或糖衣丸包衣用于辨识或表征颗粒剂量的不同组合。
可以被口服使用的药物包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂，诸如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂诸如乳糖，粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以被溶解或悬浮于合适的液体，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。
LSD1抑制剂可以被掺入调节释放(modified-release)制品(preparation)和制剂(formulation)中，例如聚合物微球制剂(formulation)和油基或凝胶基制剂(formulation)。
在特定实施方案中，LSD1抑制剂可以以局部而不是全身方式施用，诸如通过将LSD1抑制剂直接注射到组织中，该组织优选地是皮下或网膜组织，通常以储库(depot)释放制剂(formulation)或缓释制剂(formulation)的形式施用。在其他实施方案中，LSD1抑制剂被全身施用。
此外，LSD1抑制剂可以在靶向药物递送系统中施用，诸如在合适的靶向细胞或组织并被细胞或组织选择性吸收的颗粒中施用。在一些实施方案中，LSD1抑制剂被包含于选自以下的媒介物或以其他方式与选自以下的媒介物结合(associate)：脂质体、胶束、树枝状聚合物、生物可降解颗粒、人工DNA纳米结构、脂质基纳米颗粒和碳或金纳米颗粒。在该类型的例示性实例中，媒介物选自聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乙二醇)(PEG)、PLA-PEG共聚物及其组合。
在局部施用或选择性摄取的情况下，剂的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。
为了容易施用和剂量的一致性，以剂量单位形式配制组合物是有利的。本发明的新剂量单位形式的确定取决于并直接依赖于：活性材料的独特特征、要达到的特定治疗效果以及对于治疗患有如本文详细公开的身体健康受损的疾病状况的活受试者中的疾病在活性材料的复合技术中固有的局限性。
虽然LSD1抑制剂可以是向受试者施用的唯一活性成分，但与所述LSD1抑制剂同时施用其他活性成分也在本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，LSD1抑制剂可以与一种或更多种癌症治疗或抗感染剂同时施用。LSD1抑制剂可以在癌症治疗或抗感染剂之后治疗性使用，或者可以与癌症治疗或抗感染剂一起治疗性使用。LSD1抑制剂可以与其他活性成分分开地、同时地或顺序地施用。
因此，在本发明的另一个方面，提供了包含LSD1抑制剂和抗感染剂的组合物。本发明还预期包含LSD1抑制剂和癌症治疗的组合物。
合适的癌症治疗包括但不限于放射治疗、手术、化学治疗、激素消融(ablation)治疗、促凋亡治疗和免疫治疗。
合适的放射治疗包括诱发DNA损伤的辐射和波，例如γ辐照、X射线、UV辐照、微波、电子发射和放射性同位素。通常，可以通过用上文描述的辐射的形式辐照局部的肿瘤部位来实现治疗。最可能的是，所有这些因素对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持引起宽范围的损伤。
X-射线的剂量范围的范围从50伦琴-200伦琴的每日剂量持续延长的时间段(诸如3周-4周)到2000伦琴-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化宽泛，并且依赖于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。合适的放射治疗可以包括但不限于适形外部射线放射治疗(conformal external beam radiotherapy)(50-100戈瑞(Gray)，在4周-8周分次给予)、单次或分次的高剂量近距离治疗(high dosebrachytherapy)、永久性间质近距离治疗(permanent interstitial brachytherapy)、和全身放射性同位素例如锶89。在一些实施方案中，放射治疗可以与辐射敏化剂(radiosensitizing agent)一起施用。合适的辐射敏化剂可以包括但不限于乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑(etanidazole)、氟路索(fluosol)、醚醇硝唑(misonidazole)、硝咪吗啉(nimorazole)、替莫泊芬(temoporfin)和替拉扎明(tirapazamine)。
合适的化疗剂可以包括，但不限于：抗增殖/抗肿瘤药及其组合，包括烷化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(busulphan)和亚硝基脲)、抗代谢物(例如抗叶酸剂、诸如氟吡啶类(fluoropyridines)、如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)、抗肿瘤抗生素(例如蒽环类，如阿霉素、博莱霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、放线菌素D和光辉霉素)、抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类，如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛和长春瑞滨，和紫杉类(taxoids)如紫杉醇和多西他赛)、和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类，如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)和喜树碱(camptothecin))；细胞抑制剂(cytostatic agents)诸如抗雌激素(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬(droloxifene)和艾多昔芬(Idoxifene))、雌激素受体下调剂(例如氟维司群(fulvestrant))、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)和醋酸环丙孕酮)、UH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorozole)和依西美坦)和5α-还原酶的抑制剂诸如非那雄胺；抑制癌细胞侵袭的剂(例如金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；生长因子功能的抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体，生长因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗erbb1抗体西妥昔单抗[C225])，法尼基转移酶抑制剂，MEK抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，诸如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板源性生长因子家族的抑制剂以及例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；抗血管生成剂，诸如抑制血管内皮生长因子的作用的那些(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，化合物诸如国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些)，以及通过其他机制起作用的化合物(例如利诺胺、整合素αvβ3功能的抑制剂和血管抑素)；血管破坏剂诸如考布他汀(Combretastatin)A4和国际专利申请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；反义治疗，例如针对上文列出的靶的那些，诸如一种抗ras反义物ISIS 2503；和基因治疗方法，包括例如替换异常基因诸如异常的p53或异常的GDEPT(基因指导的酶前药治疗)的方法，诸如那些使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法，以及增加患者对化学治疗或放射治疗耐受性的方法，诸如耐多药性基因治疗。
合适的免疫治疗方法可以包括但不限于增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，诸如用包括白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的细胞因子转染；降低T细胞无反应性的方法；使用转染的免疫细胞诸如细胞因子转染的树突状细胞的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；和使用抗独特型抗体(anti-idiotypicantibody)的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子(免疫效应细胞和分子被本文包括为“免疫调节剂”)来靶向并破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。单独的抗体可以用作治疗的效应物，或者它可以招募其他细胞来真正促进细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合而仅用作靶向剂。可选择地，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与恶性细胞靶相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
其他癌症治疗的实例包括植物治疗(phytotherapy)、冷冻治疗、毒素治疗或促细胞凋亡治疗。本领域技术人员将理解，该列表并未穷举可用于癌症和其他超常增生损伤的治疗方式的类型。
合适的抗感染剂包括但不限于抗微生物剂，抗微生物剂可以包括但不限于杀死以下微生物或抑制以下微生物生长的化合物：诸如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等，并且因此包括抗生素、杀阿米巴剂(amebicides)、抗真菌剂、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。抗感染药物在其范围内还包括驱肠虫药和杀线虫剂。
说明性抗生素包括：喹诺酮类(例如氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、奥索利酸(oxolinicacid)、培氟沙星、罗索沙星(rosoxacin)、替马沙星、托氟沙星、司帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、曲伐沙星(trovafloxacin)和加雷沙星(garenoxacin))、四环素类、甘氨酰环素类(glycylcyclines)和噁唑烷酮类(oxazolidinones)(例如氯四环素、地美环素(demeclocycline)、多西环素、赖甲环素(lymecycline)、美他环素(methacycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素、四环素、替加环素、利奈唑胺、tedizolid和依哌唑胺(eperezolid))、糖肽类、氨基糖苷类(例如阿米卡星、阿贝卡星(arbekacin)、布替罗星(butirosin)、地贝卡星(dibekacin)、福提霉素(fortimicins)、庆大霉素、卡那霉素、menomycin、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素(ribostamycin)、西梭米星(sisomicin)、壮观霉素、链霉素、妥布霉素)、β-内酰胺类(例如亚胺培南、美罗培南、比阿培南(biapenem)、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑啉、头孢克肟、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟、头孢替安(cefotiam)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松、头孢呋新、头孢唑喃(cefuzonam)、头孢乙腈(cephacetrile)、头孢氨苄、头孢甘酸(cephaloglycin)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢吡硫(cephapirin)、头孢拉定(Cephradine)、cefinetazole、头孢西丁(cefoxitin)、头孢替坦(cefotetan)、克拉维酸、氨曲南(azthreonam)、卡芦莫南(carumonam)、氟氧头孢(flomoxef)、拉氧头孢(moxalactam)、氮卓西林(amdinocillin)、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青霉素、苄青霉素、卡非西林(carfecillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素G、哌拉西林(piperacillin)、磺苄西林(sulbenicillin)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin)、头孢托仑(cefditoren)、SC004、KY-020、头孢地尼(cefdinir)、头孢布烯、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰(cefozopran)、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)、利福霉素类、大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素(fidaxomicin)、竹桃霉素、罗他霉素(rokitamycin)、蔷薇霉素(rosaramicin)、罗红霉素、醋竹桃霉素(troleandomycin))、酮内酯类(例如泰利霉素(telithromycin)、赛红霉素(cethromycin))、香豆霉素类(coumermycins)、林可酰胺类(lincosamides)(例如克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin))、氯霉素及其盐和组合。
说明性抗病毒药包括阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺、安普那韦(amprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、博赛泼维(boceprevir)、西多福韦(cidofovir)、达卡他韦(daclatasvir)、达芦那韦(darunavir)、地拉韦啶(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、度鲁特韦(dolutegravir)、依法韦仑(efavirenz)、埃替格韦(elvitegravir)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦地(enfuvirtide)、恩替卡韦(entacavir)、依曲韦林(etravirine)、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生(fomivirsen)、福沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸钠、更昔洛韦(ganciclovir)、茚地那韦(indinavir)、拉米夫定(lamivudine)、拉米夫定/齐多夫定(zidovudine)、洛匹那韦(lopenavir)、马拉维若(maraviroc)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、奥司他韦(oseltamivir)、PEG-干扰素α-2b、帕拉米韦(peramivir)、拉替拉韦(raltegravir)、利巴韦林(ribavirin)、利匹韦林(rilpivirine)、金刚乙胺、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、司美匹韦(simeprevir)、索菲布韦(sofosbuvir)、司他夫定(stavudine)、特拉匹韦(telaprevir)、替比夫定(telbivudine)、替诺福韦(tenofovir)、替拉那韦(tipranavir)、伐昔洛韦(valacyclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、齐多呋定(zidovudine)及其盐和组合。
合适的杀阿米巴剂或抗原虫药包括但不限于：阿托伐醌(atovaquone)、氯喹、双碘喹啉(iodoquinol)、甲氟喹、甲硝唑(metronidazole)、硝唑尼特(Nitazoxanide)、paramomycin、喷他脒(pentamidine)、替硝唑及其盐和组合。驱肠虫药可以是选自甲苯咪唑、噻嘧啶、吡喹酮、米替福新(miltefosine)、阿苯达唑、伊维菌素、噻苯咪唑及其盐和组合中的至少一种。说明性抗真菌剂可以选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇基硫酸酯复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、克霉唑、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素、灰黄霉素微粒、灰黄霉素超微粒、艾沙康唑(isavuconazonium)、伊曲康唑、酮康唑、米卡芬净(micafungin)、咪康唑、制霉菌素、泊沙康唑(posaconazole)、特比萘芬、伏立康唑(voriconazole)及其盐和组合。合适的抗疟药包括但不限于：氯喹、多西环素、羟氯喹、甲氟喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、乙胺嘧啶与磺胺多辛、奎宁及其盐和组合。抗结核药包括但不限于氨基水杨酸、贝达喹啉(bedaquiline)、卷曲霉素、氯法齐明(clofazimine)、环丝氨酸、氨苯砜、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布丁(rifabutin)、利福平、利福喷丁、链霉素及其盐和组合。
熟知的是，化学治疗和放射治疗靶向快速分裂细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗数种形式的癌症的部分提供，旨在借助于治愈性治疗减缓癌症的进展或逆转疾病的症状。然而，这些癌症治疗可能导致免疫低下状态和随后的致病性感染，并且因此，本发明还扩展到组合治疗，组合治疗使用LSD1抑制剂、癌症治疗和抗感染剂，该抗感染剂对由癌症治疗导致的免疫低下状况发展的感染或具有增加的发展感染的风险有效。合适的抗感染剂如上所述。
如前所述，为了以有效量方便有效地施用，LSD1抑制剂可以以剂量单位形式与合适的药学上可接受的载体复合。在一些实施方案中，单位剂型可以包含从约0.25μg至约2000mg范围内的量的LSD1抑制剂。LSD1抑制剂可以以从约0.25μg/mL至约2000mg/mL的载体的量存在。在药物组合物包含一种或更多种另外的活性成分的实施方案中，剂量通过参考所述成分的通常剂量和施用方式来确定。
4.免疫检验点抑制的方法
本发明人已经确定，LSD1的抑制剂抑制免疫检验点、特别是PD-L1和/或PD-L2，包括PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位、尤其是PD-L1的细胞核易位。因此，本发明人设想了LSD1抑制剂可以被用于一系列应用，包括用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答、用于增强抗感染剂的效力、或用于治疗癌症诸如转移性癌症或感染。
因此，在本发明的另一个方面，提供了一种抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性的方法，该方法包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。本发明还预期LSD1抑制剂，用于在抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性中使用。
PD-L1活性和/或PD-L2活性的抑制包括但不限于抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的相互作用、PD-L1和/或PD-L2的表达、或PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位。
因此，在本发明的又另一个方面，提供了一种抑制PD-L1和/或PD-L2过表达细胞中PD-L1的细胞核易位和/或PD-L2的细胞核易位的方法，该方法包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。本发明还提供了LSD1抑制剂用于抑制PD-L1和/或PD-L2过表达细胞中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的用途；LSD1抑制剂，用于在抑制PD-L1和/或PD-L2过表达细胞中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位中使用；以及LSD1抑制剂在制备用于抑制PD-L1和/或PD-L2过表达细胞中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的药物中的用途。
在特定实施方案中，PD-L1和/或PD-L2过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞，尤其是癌症干细胞肿瘤细胞。
本发明还预期LSD1抑制剂，用于在抑制受试者中PD-L1活性和/或PD-L2活性中使用，以及LSD1抑制剂在制备用于抑制受试者中PD-L1活性和/或PD-L2活性的药物中的用途。在一些实施方案中，受试者具有升高的PD-L1活性和/或PD-L2活性。在一些实施方案中，LSD1抑制剂抑制受试者中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位，尤其是PD-L1的细胞核易位。
因此，本发明还扩展到抑制受试者中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的方法，该方法包括向受试者施用LSD1抑制剂。在另一个方面，本发明提供了LSD1抑制剂用于抑制受试者中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的用途。本发明还提供了LSD1抑制剂在制备用于抑制受试者中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的药物中的用途，以及LSD1抑制剂，用于在抑制受试者中PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位中使用。
在一些实施方案中，LSD1抑制剂是选择性LSD1抑制剂。在可选择的实施方案中，LSD1抑制剂是非选择性LSD1抑制剂。
存在数种涉及PD-L1活性和/或PD-L2活性的状况。因此，本发明还预期LSD1抑制剂用于治疗其中PD-L1活性和/或PD-L2活性的抑制与有效治疗(包括治疗的效力增加)相关的状况的用途。本发明还提供了一种用于在受试者中治疗其中PD-L1和/或PD-L2的抑制与有效治疗相关的状况的方法，包括向受试者施用LSD1抑制剂。在另一个方面，本发明提供了LSD1抑制剂在制备用于在受试者中治疗其中PD-L1和/或PD-L2的抑制与有效治疗相关的状况的药物中的用途。
涉及PD-L1活性和/或PD-L2活性的状况包括但不限于癌症、特别是转移性癌症，或感染、特别是致病性感染。
因此，在一些实施方案中，受试者患有癌症或感染。在特定实施方案中，受试者患有癌症，特别是转移性癌症。
在一些实施方案中，癌症选自但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、肝癌或脑癌；尤其是乳腺癌；最尤其是转移性乳腺癌。
在一些实施方案中，受试者具有感染，特别是致病性感染。感染可以选自但不限于病毒、细菌、酵母、真菌、蠕虫或原生动物感染。本发明考虑的病毒感染包括但不限于由以下病毒引起的感染：HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病毒、丝状病毒、人乳头瘤病毒、人T细胞嗜淋巴病毒、人逆转录病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、肠道病毒、鼻病毒、埃博拉病毒、西尼罗病毒和呼吸道合胞病毒；尤其是由HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、Epstein-Barr病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染。细菌感染包括但不限于由以下引起的感染：奈瑟氏球菌属(Neisseria)物种、脑膜炎球菌属(Meningococcal)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、链球菌属(Streptococcal)物种、军团菌属(Legionella)物种、支原体属(Mycoplasma)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、衣原体属(Chlamydia)物种、放线菌属(Actinomyces)物种、鱼腥藻属(Anabaena)物种、拟杆菌属(Bacteroides)物种、蛭弧菌属(Bdellovibrio)物种、博德特氏菌属(Bordetella)物种、包柔氏螺旋体属(Borrelia)物种、弯曲杆菌属(Campylobacter)物种、柄杆菌属(Caulobacter)物种、绿菌属(Chlorobium)物种、着色菌属(Chromatium)物种、梭菌属(Clostridium)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、噬细胞菌属(Cytophaga)物种、异常球菌属(Deinococcus)物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、弗朗西斯菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、生丝微菌属(Hyphomicrobium)物种、细螺旋体属(Leptospira)物种、李斯特菌属(Listeria)物种、微球菌属(Micrococcus)物种、粘球菌属(Myxococcus)物种、硝化杆菌属(Nitrobacter)物种、颤藻属(Oscillatoria)物种、原绿藻属(Prochloron)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、红螺菌属(Rhodospirillum)物种、立克次体属(Rickettsia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、螺旋菌属(Spirillum)物种、螺旋体属(Spirochaeta)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、硫杆菌属(Thiobacillus)物种、密螺旋体属(Treponema)物种、弧菌属(Vibrio)物种、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、诺卡氏菌属(Nocardia)物种和分枝杆菌属(Mycobacterium)物种；尤其是由奈瑟氏菌属(Neisseria)物种、脑膜炎球菌属(Meningococcal)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、链球菌属(Streptococcal)物种、军团菌属(Legionella)物种和分枝杆菌属(Mycobacterium)物种引起的感染。本发明包括的原生动物感染包括但不限于由疟原虫属(Plasmodium)物种、利什曼原虫属(Leishmania)物种、锥虫属(Trypanosoma)物种、弓形虫属(Toxoplasma)物种、内阿米巴属(Entamoeba)物种和贾第虫属(Giardia)物种引起的感染。蠕虫感染可以包括但不限于由血吸虫属(Schistosoma)物种引起的感染。本发明考虑的真菌感染包括但不限于由组织胞浆菌属(Histoplasma)物种和念珠菌属(Candida)物种引起的感染。
在特定实施方案中，LSD1抑制剂是蛋白质分子，其如上文宽泛描述的包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成；特别是蛋白质分子，其包含式I、SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、或SEQ ID NO:3或其变体、由式I、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3或其变体组成或主要由式I、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3或其变体组成。
本发明还扩展到LSD1抑制剂用于增强抗感染剂的效力的用途。因此，在本发明的另一个方面，提供了增强受试者中抗感染剂的效力的方法，包括向受试者施用LSD1抑制剂。本发明还提供了LSD1抑制剂在制备用于增强受试者中抗感染剂的效力的药物中的用途，以及LSD1抑制剂，用于在增强受试者中抗感染剂的效力中使用。
抗感染剂可以包括但不限于抗微生物剂，抗微生物剂可以包括但不限于杀死以下微生物或抑制以下微生物生长的任何化合物：诸如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等，并且因此包括抗生素、杀阿米巴剂、抗真菌剂、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。抗感染剂在其范围内还包括驱肠虫药和杀线虫剂。说明性抗生素、杀阿米巴剂、抗真菌剂、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药被描述于上文第3节。
在特定实施方案中，受试者患有感染，尤其是致病性感染。如上文描述的，感染可以选自但不限于病毒、细菌、酵母、真菌、蠕虫或原生动物感染。
此外，本发明人已经设想了LSD1抑制剂可用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答。因此，本发明还预期LSD1抑制剂，用于增强在受试者经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答中使用，以及LSD1抑制剂在制备用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答的药物中的用途。
LSD1抑制剂和免疫调节剂可以同时地、单独地或顺序地施用。因此，本发明还扩展到包含LSD1抑制剂和免疫调节剂的组合物。此类组合物可以单独地或以该组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合的制剂向受试者施用。第3节中描述了合适的制剂。
在一些实施方案中，免疫调节剂包括但不限于对应于靶抗原的至少一部分的抗原、与靶抗原免疫相互作用的抗原结合分子、和调节对靶抗原的免疫应答的免疫调节细胞。
抗原可以是对应于用于刺激对靶抗原的免疫应答的感兴趣的靶抗原的至少一部分的任何抗原。此类抗原可以是可溶性形式(例如肽、多肽或肽或多肽可由其表达的核酸分子)，或者呈全细胞或减毒病原体制品(例如减毒病毒或细菌)的形式，或者抗原可以由抗原呈递细胞呈递，如下文更详细描述的。
可用于本发明的靶抗原可以是任何类型的生物分子，包括例如简单的中间代谢物、糖、脂质和激素、以及大分子诸如复合碳水化合物、磷脂、核酸、多肽和肽。靶抗原可以选自由宿主产生的内源性抗原或对宿主是外来(foreign)的外源性抗原。合适的内源性抗原可以包括但不限于癌症或肿瘤抗原。
癌症或肿瘤抗原的非限制性实例包括来自癌症或肿瘤的抗原，所述癌症或肿瘤选自ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生(agnogenic myeloid metaplasia)、脱发、腺泡状软组织肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠道类癌、泌尿生殖癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、妇科癌症、血液恶性肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增生症、霍奇金病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、利–弗劳梅尼综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾恶性横纹肌样肿瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性癌、口癌、多发性内分泌瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生病、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口卵巢癌、胰腺癌、鼻旁(paranasal)癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、罕见癌症及相关疾病(rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞上皮癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、Rothmund-Thomson综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾盂/输尿管)、滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、尿路斑块蛋白(uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。肿瘤特异性抗原的例示性实例包括但不限于：etv6、aml1、亲环蛋白b(急性淋巴母细胞白血病)；Ig独特型(B细胞淋巴瘤)；E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn(神经胶质瘤)；p21ras(膀胱癌)；p21ras(胆管癌)；MUC家族，HER2/neu、c-erbB-2(乳腺癌)；p53、p21ras(宫颈癌)；p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族、Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白(结肠癌)；结肠直肠相关抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC(结肠直肠癌)；癌胚抗原(CEA)(结肠直肠癌；绒毛膜癌)；亲环蛋白b(上皮细胞癌)；HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(胃癌)；α-甲胎蛋白(肝细胞癌)；Imp-1、EBNA-1(霍奇金淋巴瘤)；CEA、MAGE-3、NY-ESO-1(肺癌)；亲环蛋白b(淋巴样细胞衍生的白血病)；黑素细胞分化抗原(例如gp100、MART、Melan-A/MART-1、TRP-1、Tyros、TRP2、MC1R、MUC1F、MUC1R或其组合)和黑素瘤特异性抗原(例如BAGE、GAGE-1、gp100In4、MAGE-1(例如GenBank登记号X54156和AA494311)、MAGE-3、MAGE4、PRAME、TRP2IN2、NYNSO1a、NYNSO1b、LAGE1、p97黑素瘤抗原(例如GenBank登记号M12154)、p5蛋白、gp75、肿瘤胚胎抗原、GM2和GD2神经节苷脂、cdc27、p21ras、gp100Pmel117(黑素瘤)；MUC家族，p21ras(骨髓瘤)；HER2/neu，c-erbB-2(非小细胞肺癌)；Imp-1，EBNA-1(鼻咽癌)；MUC家族，HER2/neu，c-erbB-2，MAGE-A4，NY-ESO-1(卵巢癌)；前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(前列腺癌)；HER2/neu，c-erbB-2(肾癌)；病毒产物诸如人乳头瘤病毒蛋白(子宫颈和食道鳞状细胞癌)；NY-ESO-1(睾丸癌)；HTLV-1表位(T细胞白血病)；及其组合。
外来抗原合适地是来自致病生物的抗原。
示例性致病性生物包括但不限于：病毒、细菌、真菌寄生物、藻类和原生动物以及变形虫。病毒的例示性实例包括导致疾病的病毒，包括但不限于麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎(例如GenBank登记号E02707)和丙型肝炎(例如GenBank登记号E06890)、以及其他肝炎病毒、流感、腺病毒(例如类型4和类型7)、狂犬病(例如GenBank登记号M34678)、黄热病、Epstein-Barr病毒和其他疱疹病毒，诸如乳头瘤病毒、埃博拉病毒、流感病毒、日本脑炎(例如GenBank登记号E07883)、登革热(例如GenBank登记号M24444)、汉坦病毒、仙台病毒、呼吸道合胞病毒、正粘病毒(othromyxovirus)、水泡性口炎病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、巨细胞病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)(例如GenBank登记号U18552)。来源于这些病毒的任何合适的抗原可用于实施本发明。例如，来源于HIV的说明性逆转录病毒抗原包括但不限于抗原，诸如gag、pol和env基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和其他HIV组分。肝炎病毒抗原的例示性实例包括但不限于：抗原诸如乙型肝炎病毒的S蛋白、M蛋白和L蛋白、乙型肝炎病毒的前S抗原，以及其他肝炎例如甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，病毒组分、诸如丙型肝炎病毒RNA。流感病毒抗原的例示性实例包括但不限于抗原，诸如血细胞凝集素和神经氨酸酶以及其他流感病毒组分。麻疹病毒抗原的例示性实例包括但不限于抗原，诸如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒组分。风疹病毒抗原的例示性实例包括但不限于抗原，诸如蛋白E1和E2以及其他风疹病毒组分；轮状病毒抗原诸如VP7sc和其他轮状病毒组分。巨细胞病毒抗原的例示性实例包括但不限于抗原，诸如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原组分。呼吸道合胞病毒抗原的非限制性实例包括抗原，诸如RSV融合蛋白、M2蛋白和其他呼吸道合胞病毒抗原组分。单纯疱疹病毒抗原的例示性实例包括但不限于抗原，诸如即早期蛋白、糖蛋白D和其他单纯疱疹病毒抗原组分。水痘带状疱疹病毒抗原的非限制性实例包括抗原，诸如gPI、gpII和其他水痘带状疱疹病毒抗原组分。日本脑炎病毒抗原的非限制性实例包括抗原，诸如蛋白E、M-E、M-E-NS 1、NS 1、NS 1-NS2A、80％E和其他日本脑炎病毒抗原组分。狂犬病病毒抗原的代表性实例包括但不限于抗原，诸如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白和其他狂犬病病毒抗原组分。乳头瘤病毒抗原的例示性实例包括但不限于L1和L2衣壳蛋白以及与宫颈癌相关的E6/E7抗原，对于病毒抗原的另外的实例，参见：FundamentalVirology，第二版，编辑Fields,B.N.和Knipe,D.M.,1991,Raven Press,New York。
真菌的例示性实例包括：支顶孢属的种(Acremonium spp.)、曲霉属的种(Aspergillus spp.)、蛙粪霉属的种(Basidiobolus spp.)、双极霉属的种(Bipolarisspp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、念珠菌属的种(Candida spp.)、Cladophialophora carrionii、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、耳霉属的种(Conidiobolus spp.)、隐球菌属的种(Cryptococcus spp.)、弯孢霉属的种(Curvulariaspp.)、表皮癣菌属的种(Epidermophyton spp.)、甄氏外瓶霉(Exophiala jeanselmei)、突脐蠕孢属的种(Exserohilum spp.)、紧密着色霉(Fonsecaea compacta)、裴氏着色霉(Fonsecaea pedrosoi)、尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰孢菌(Fusariumsolani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasmacapsulatum var.capsulatum)、荚膜组织胞浆菌杜波氏变种(Histoplasma capsulatumvar.duboisii)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、Lacazia loboi、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、Leptosphaeria senegalensis、灰马杜拉分枝菌(Madurella grisea)、足马杜拉分枝菌(Madurella mycetomatis)、糠秕马拉色霉菌(Malassezia furfur)、小孢子菌属的种(Microsporum spp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、加拿大甲癣(Onychocola canadensis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、疣状瓶霉(Phialophora verrucosa)、何德毛节菌属(Piedraia hortae)、Piedra iahortae、花斑癣(Pityriasis versicolor)、波氏假性阿利什霉(Pseudallescheria boydii)、罗梅罗氏刺壳孢菌(Pyrenochaeta romeroi)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、双间柱顶孢(Scytalidiumdimidiatum)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、毛癣菌属的种(Trichophytonspp.)、丝孢酵母属的种(Trichosporon spp.)、Zygomcete fungi、伞枝犁头霉(Absidiacorymbifera)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和少根根霉。因此，可以被用于本发明的组合物和方法的说明性真菌抗原包括但不限于：念珠菌真菌抗原组分；组织胞浆菌真菌抗原，诸如热休克蛋白60(HSP60)和其他组织胞浆菌真菌抗原组分；隐球菌真菌抗原，诸如荚膜多糖类和其他隐球菌真菌抗原组分；球孢子菌真菌抗原，诸如小球抗原和其他球孢子菌真菌抗原组分；以及癣真菌抗原，诸如发癣菌素和其他球孢子菌属抗原组分。
细菌的例示性实例包括导致以下疾病的细菌：包括但不限于白喉(例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria))、百日咳(例如百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)，GenBank登记号M35274)、破伤风(例如破伤风梭菌(Clostridium tetani)，GenBank登记号M64353)、结核病(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、细菌性肺炎(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、霍乱(例如霍乱弧菌(Vibriocholerae))、炭疽(例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、伤寒、鼠疫、志贺氏菌病(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae))、肉毒中毒(例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum))、沙门氏菌病(例如GenBank登记号L03833)、消化性溃疡(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团病、莱姆病(例如GenBank登记号U59487)、其他致病性细菌包括大肠杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)。因此，可被用于本发明的组合物和方法的细菌抗原包括但不限于：百日咳细菌抗原，诸如百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌黏附素(pertactin)、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原组分；白喉细菌抗原，诸如白喉毒素或类毒素和其他白喉细菌抗原组分；破伤风细菌抗原，诸如破伤风毒素或类毒素和其他破伤风细菌抗原组分；链球菌细菌抗原，诸如M蛋白和其他链球菌细菌抗原组分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原，诸如脂多糖类和其他革兰氏阴性细菌抗原组分；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细菌抗原，诸如分枝杆菌酸、热休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其他分枝杆菌抗原组分；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)细菌抗原组分；肺炎球菌细菌抗原，诸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖类和其他肺炎球菌细菌抗原组分；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)细菌抗原，诸如荚膜多糖和其他流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)细菌抗原组分；炭疽细菌抗原，诸如炭疽保护性抗原和其他炭疽细菌抗原组分；立克次体细菌抗原，诸如rompA和其他立克次体细菌抗原组分。本文描述的细菌抗原还包括任何其他细菌、分枝杆菌、支原体、立克次体或衣原体抗原。
原生动物的例示性实例包括导致以下疾病的原生动物：包括但不限于疟疾(例如GenBank登记号X53832)、钩虫、盘尾丝虫病(例如GenBank登记号M27807)、血吸虫病(例如GenBank登记号LOS 198)、弓形虫病、锥虫病、利什曼病、贾第虫病(GenBank登记号M33641)、阿米巴病、丝虫病(例如GenBank登记号J03266)、包柔氏螺旋体病(borreliosis)和旋毛虫病。因此，可以被用于本发明的组合物和方法的原生动物抗原包括但不限于：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)抗原，诸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、红内期(blood-stage antigen)抗原pf 155/RESA和其他疟原虫抗原组分；弓形虫抗原，诸如SAG-1、p30和其他弓形虫抗原组分；血吸虫抗原，诸如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其他血吸虫抗原组分；利什曼原虫主要抗原和其他利什曼原虫抗原，诸如gp63、脂磷酸聚糖(lipophosphoglycan)及其相关蛋白和其他利什曼原虫抗原组分；和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)抗原，诸如75kDa-77kDa抗原、56kDa抗原和其他锥虫抗原组分。
本发明还预期毒素组分作为抗原。毒素的例示性实例包括但不限于：葡萄球菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素、逆转录病毒抗原(例如来源于HIV的抗原)、链球菌抗原、葡萄球菌肠毒素-A(SEA)、葡萄球菌肠毒素-B(SEB)、葡萄球菌肠毒素1-3(SE1-3)、葡萄球菌肠毒素-D(SED)、葡萄球菌肠毒素-E(SEE)以及来源于支原体、分枝杆菌和疱疹病毒的毒素。
对应于靶抗原的至少一部分的抗原可以从天然来源分离，或者可以通过本领域已知的重组技术制备。例如，肽抗原可以从MHC和从细胞群体或组织获得的抗原呈递细胞的其他呈递分子洗脱，对于该细胞群体或组织，需要修饰的免疫应答。洗脱的肽可以使用本领域已知的标准蛋白纯化技术纯化(Rawson等人(2000),Cancer Res,60(16):4493-4498)。如果需要，纯化的肽可以被测序，并且使用例如下文描述的标准蛋白合成技术产生肽的合成形式(version)。可选择地，粗抗原制品可以通过分离细胞群体或组织的样品来产生，对于该细胞群体或组织，需要修饰的免疫应答，并且裂解该样品或将该样品置于将导致形成凋亡细胞的条件(例如，用紫外线或用γ射线辐照、病毒感染、细胞因子，或者通过剥夺细胞培养基中的营养物、用过氧化氢孵育，或者用药物诸如地塞米松、神经酰胺化学治疗剂和抗激素剂诸如Lupron或他莫昔芬孵育)。然后，如下文更详细描述的，裂解物或凋亡细胞可以用作用于以可溶性形式使用或用于与抗原呈递细胞接触的粗抗原的来源。
当抗原已知时，可以使用例如以下中描述的标准方案方便地制备呈重组形式的抗原：Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory manual(Cold Spring HarborPress)，特别在第16章和第17章中；Ausubel等人(1998),Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.)，特别在第10章和第16章中；和Coligan等人(1997),Current Protocols in Protein Science(John Wiley&Sons,Inc.)，特别在第1章、第5章和第6章中。通常，抗原可以通过包括以下步骤的程序制备：(a)提供表达载体，从表达载体可表达靶抗原或靶抗原类似物或模拟物；(b)将载体引入合适的宿主细胞中；(c)培养宿主细胞以从载体表达重组多肽；和(d)分离重组多肽。
通常，表达载体将包含可操作地与调节多核苷酸连接的抗原编码多核苷酸。抗原编码多核苷酸可以从编码对应于感兴趣的靶抗原的抗原的任何合适的亲本多核苷酸构建。亲本多核苷酸合适地为天然基因或其一部分。然而，可能的是，亲本多核苷酸并非天然存在的，而是已经使用重组技术工程化的。调节多核苷酸合适地包含转录和/或翻译控制序列，这将通常适用于用于表达抗原编码多核苷酸的宿主细胞。通常，转录和翻译调节控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调节区诸如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区。本发明预期本领域已知的组成型或可诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或者组合多于一个启动子的元件的杂合启动子。由本发明考虑的启动子序列可以对待引入的宿主细胞是天然的或者可以衍生自可选择的来源，其中该区域在宿主细胞中起作用。
表达载体还可以包含3'非翻译序列，3'非翻译序列通常是指基因的包含含有多腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其他调节信号的DNA区段的部分。多腺苷酸化信号被表征为实现添加多腺苷酸片段(polyadenylic acid tracts)至mRNA前体的3'末端。多腺苷酸化信号通常依据与典型形式的5'AATAAA-3’存在同源性来识别，虽然变化并不罕见。3'非翻译调节DNA序列通常包括从约50个至1,000个核苷酸碱基对，并且除了多腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其他调节信号之外，还可以含有转录和翻译终止序列。
在某些实施方案中，表达载体还含有可选择的标志物基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的，并且将随所使用的宿主细胞而变化。
表达载体还可以包括融合配偶体(通常由表达载体提供)，使得重组多肽与融合配偶体一起表达为融合多肽。融合配偶体的主要益处在于它们有助于鉴定和/或纯化所述融合多肽。融合配偶体的熟知的实例包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六聚组氨酸(HIS6)，它们对于通过亲和层析分离融合多肽特别有用。为了通过亲和层析纯化融合多肽的目的，亲和层析的相关基质分别为谷胱甘肽缀合树脂、直链淀粉缀合树脂和镍缀合树脂或钴缀合树脂。许多这样的基质以“试剂盒”的形式可得，诸如与(HIS6)融合配偶体一起使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。优选地，融合配偶体还具有蛋白酶切割位点，诸如用于因子Xa或凝血酶，其允许相关蛋白酶部分地消化本发明的融合多肽，并且从而从中释放本发明的重组多肽。然后可以通过随后的层析分离将释放的多肽从融合配偶体分离。融合配偶体还在其范围内包括“表位标签”，表位标签通常为可从其获得特定抗体的短肽序列。特定单克隆抗体从其容易可得的表位标签的熟知的实例包括c-Myc、流感病毒血细胞凝集素和FLAG标签。
将表达载体引入宿主细胞的步骤可以通过任何合适的方法实现，方法包括病毒载体的转染、转导，包括腺病毒、修饰的慢病毒和其他逆转录病毒载体，以及转化，方法的选择将依赖于使用的宿主细胞。此类方法对本领域技术人员是熟知的。
重组多肽可以通过在适于蛋白表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞来产生，适于蛋白表达的条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化。这是本领域技术人员通过常规实验容易确定的。用于表达的合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞。用于表达根据本发明的多肽的一种优选的宿主细胞是细菌。使用的细菌可以是大肠杆菌。可选择地，宿主细胞可以是昆虫细胞，诸如，例如可以与杆状病毒表达系统一起使用的SF9细胞。
在一些实施方案中，可以与LSD1抑制剂一起施用的抗原呈构建体或载体的形式，从该构建体或载体可表达抗原。
可选择地，抗原可以使用溶液合成或固相合成来合成，例如由Atherton和Sheppard(1989,Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press atOxford University Press,Oxford,England)或由Roberge等人(1995,Science,269:202)描述的。合成的抗原的氨基酸可以是非天然存在的或天然存在的氨基酸。肽合成期间非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于以下的使用：4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本发明考虑的非天然氨基酸的列表示出于表3(上文)中。
本发明还预期使用普通分子生物学技术修饰肽抗原，从而改变它们对蛋白水解降解的耐受性、或优化溶解特性、或使它们更适合作为免疫原性剂。
肽抗原可以是可以用来刺激或抑制对感兴趣的靶抗原的免疫应答的任何合适的大小。许多因素可以影响肽大小的选择。例如，可选择肽的大小，使得肽包括T细胞表位和/或B细胞表位或对应于T细胞表位和/或B细胞表位的大小、和其加工要求。本领域技术人员将认识到，I类限制性T细胞表位的长度通常在8个和10个氨基酸残基之间，并且如果被放置在非天然侧翼残基旁边，此类表位可以通常需要2个至3个天然侧翼氨基酸残基，以确保其被有效地加工和呈递。II类限制性T细胞表位的长度范围通常在12至25个氨基酸残基之间，并且可不需要自然侧翼残基用于高效的蛋白水解加工，虽然认为自然侧翼残基可能发挥作用。II类限制性表位的另一个重要特征是，它们通常在中间含有9-10个氨基酸残基的核心，其与II类MHC分子特异性结合，伴随着该核心任何一侧的侧翼序列通过以序列独立的方式与II类MHC抗原任何一侧的保守结构缔合而使结合稳定。因此II类限制性表位的功能区通常小于约15个氨基酸残基长。线性B细胞表位的大小和影响其加工的因素，如II类限制性表位是高度可变的，虽然此类表位的大小经常小于15个氨基酸残基。从上述中，肽的大小为至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个氨基酸残基是有利的但不是必要的。合适地，肽的大小不超过约500个、200个、100个、80个、60个、50个、40个氨基酸残基。在某些有利的实施方案中，肽的大小足以由抗原呈递细胞呈递被包含在肽内的T细胞和/或B细胞表位。
用于鉴定和选择有效抗原性肽(例如能够引发免疫应答的最小肽序列)的标准可以在本领域中找到。例如，Apostolopoulos等人(2000,Curr.Opin.Mol.Ther.,2:29-36)讨论了基于对抗原呈递分子的三维结构及抗原呈递分子与抗原性肽和T细胞受体两者的相互作用的理解，用于鉴定最小抗原性肽序列的策略。Shastri(1996,Curr.Opin.Immunol.,8:271-277)公开了如何从通常与MHC分子结合的数千的肽中区分用于活化T细胞的罕见的肽。
在一些实施方案中，免疫调节细胞是抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞呈递与靶抗原的至少一部分相对应的抗原。此类抗原呈递细胞包括专职或兼性抗原呈递细胞。专职抗原呈递细胞在生理学上起作用，以被特异性T细胞受体识别的形式呈递抗原，从而刺激或无变应化(anergise)T淋巴细胞或B淋巴细胞介导的免疫应答。专职抗原呈递细胞不仅在主要组织相容性复合体(MHC)的情况下加工和呈递抗原，而且还具有为完全T细胞活化或诱导致耐受性应答需要的另外的免疫调节分子。专职抗原呈递细胞包括但不限于：巨噬细胞，单核细胞，B淋巴细胞，骨髓谱系细胞，包括单核细胞-粒细胞-DC前体、边缘区库普弗细胞、小胶质细胞、T细胞、郎格罕细胞、和树突细胞，包括并指状树突细胞和滤泡树突细胞。非专职性或兼性抗原呈递细胞通常缺乏完全T淋巴细胞活化或无反应性需要的免疫调节分子中的一种或更多种。非专职性或兼性抗原呈递细胞的实例包括但不限于：活化的T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、角质形成细胞、星形胶质细胞、滤泡细胞、小胶质细胞、胸腺皮质细胞、内皮细胞、许旺氏细胞、视网膜色素上皮细胞、成肌细胞、血管平滑肌细胞、软骨细胞、肠细胞、胸腺细胞、肾小管细胞和成纤维细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞选自单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、骨髓谱系细胞、树突细胞或郎格罕细胞。在某些有利的实施方案中，抗原呈递细胞表达CD11c并包括树突细胞。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞刺激免疫应答，包括促炎性免疫应答。
用于刺激对一个抗原或一组抗原的免疫应答的抗原呈递细胞可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法制备。用于制备用于刺激抗原特异性免疫应答的抗原呈递细胞的说明性方法由以下描述：Albert等人(国际公布WO 99/42564)，Takamizawa等人(1997,J Immunol,158(5):2134-2142)，Thomas和Lipsky(1994,J Immunol,153(9):4016-4028)，O’Doherty等人(1994,Immunology,82(3):487-93)，Fearnley等人(1997,Blood,89(10):3708-3716)，Weissman等人(1995,Proc Natl Acad Sci USA,92(3):826-830)，Freudenthal和Steinman(1990,Proc Natl Acad Sci USA,87(19):7698-7702)，Romani等人(1996,J Immunol Methods,196(2):137-151)，Reddy等人(1997,Blood,90(9):3640-3646)，Thurnher等人(1997,Exp Hematol,25(3):232-237)，Caux等人(1996,J Exp Med,184(2):695-706；1996,Blood,87(6):2376-85)，Luft等人(1998,Exp Hematol,26(6):489-500；1998,J Immunol,161(4):1947-1953)，Cella等人(1999,J Exp Med,189(5):821-829；1997,Nature,388(644):782-787；1996,J Exp Med,184(2):747-572)，Ahonen等人(1999,Cell Immunol,197(1):62-72)和Piemonti等人(1999,J Immunol,162(11):6473-6481)。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞从宿主分离、处理，并且然后重引入或重注入宿主。方便地，抗原呈递细胞可以通过手术切除、活组织检查、血液取样或其他合适的技术从待治疗的宿主获得。此类细胞在本文中被称为“自体的”细胞。在其他实施方案中，抗原呈递细胞或细胞系从与宿主不同的来源制备和/或培养。此类细胞在本文中被称为“同种异体的”细胞。期望地，同种异体抗原呈递细胞或细胞系将与潜在受体共享主要和/或次要组织相容性抗原(本文中也称为“通用的”抗原呈递细胞或细胞系)。在该类型的某些有利的实施方案中，通用抗原呈递细胞或细胞系包含主要组织相容性(MHC)I类抗原，该MHC I类抗原与高百分比(即至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％或98％)的对特定状况敏感(susceptible)或易感(predisposed)的群体相容。合适地，通用抗原呈递细胞或细胞系天然表达如本文描述的免疫刺激分子，尤其是免疫刺激膜分子，其水平足以在目的宿主中引发免疫应答，期望地为T淋巴细胞免疫应答(例如细胞毒性T淋巴细胞免疫应答)。在某些实施方案中，抗原呈递细胞或细胞系对用至少一种IFN治疗高度敏感，如本文和国际公布WO 01/88097中描述的(即意味I类HLA的高水平表达)。
在一些实施方案中，通过处理使抗原呈递细胞成为抗原特异性的，该处理包括在足以允许抗原被抗原呈递细胞内化的条件下将抗原呈递细胞与对应于靶抗原的至少一部分的抗原接触或“脉冲(pulse)”一定时间段；并且在足以加工抗原用于被抗原呈递细胞呈递的条件下培养如此接触的抗原呈递细胞一定时间段。然后，脉冲的细胞可以用于体外或体内刺激自体T细胞或同种异体T细胞。待置于与抗原呈递细胞接触的抗原的量可以由本领域技术人员依经验确定。通常，抗原呈递细胞与抗原在37℃孵育约1hr至6hr。通常，对于纯化的抗原和肽，0.1-10μg/mL适合于产生抗原特异性抗原呈递细胞。抗原应当被暴露于抗原呈递细胞一定时间段，该时间段足以使这些细胞内化抗原。用于细胞内化和呈递加工的抗原必需的时间和抗原的剂量可以使用脉冲追踪方案来确定，在脉冲追踪方案中，暴露于抗原之后为冲洗期并暴露于读出系统，例如抗原反应性T细胞。当确定细胞在其表面表达加工的抗原必需的最佳时间和剂量之后，可以使用方案来制备用于诱导致耐受性应答的细胞和抗原。在这方面，本领域技术人员将认识到，抗原呈递细胞呈递抗原必需的时间的长度可以依赖于所使用的抗原或抗原的形式、其剂量、和所使用的抗原呈递细胞以及进行抗原装载所在的条件而变化。这些参数可由技术人员使用常规程序确定。
外源性抗原向抗原呈递细胞的递送可以通过本领域技术人员已知的方法来增强。例如，已经开发了数种不同的策略用于将外源性抗原递送至抗原呈递细胞(尤其是树突细胞)的内源性加工途径。这些方法包括将抗原插入pH敏感性脂质体中(Zhou和Huang(1994),Immunomethods,4:229-235)，在胞饮吸收可溶性抗原之后胞饮体的渗透裂解(Moore等人(1988),Cell,54:777-785)，抗原与有效佐剂结合(Aichele等人(1990),J.Exp.Med.,171:1815-1820；Gao等人(1991),J.Immunol.,147:3268-3273；Schulz等人(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:991-993；Kuzu等人(1993),Euro.J.Immunol.,23:1397-1400；和Jondal等人(1996),Immunity,5:295-302)和抗原的凋亡细胞递送(Albert等人(1998),Nature,392:86-89；Albert等人(1998),Nature Med.,4:1321-1324；以及国际公布WO 99/42564和WO 01/85207中)。重组细菌(例如大肠杆菌)或转染的宿主哺乳动物细胞可以被脉冲到树突细胞上(分别作为颗粒抗原或凋亡小体)用于抗原递送。重组嵌合病毒样颗粒(VLP)也已被用作用于将外源性异源抗原递送至树突细胞系的MHC I类加工途径的媒介物(Bachmann等人(1996),Eur.J.Immunol.,26(11):2595-2600)。
可选择地，或者另外，抗原可以与溶细胞素连接或以其他方式缔合，以增强抗原向本发明的抗原呈递细胞的胞浆中的转移，用于递送至MHC I类途径。示例性溶细胞素包括皂苷化合物，诸如含皂苷的免疫刺激复合物(ISCOM)(参见，例如Cox和Coulter(1997),Vaccine 15(3):248-256和美国专利第6,352,697号)、磷脂酶(参见，例如Camilli等人(1991),J.Exp.Med.,173:751-754)、成孔毒素(例如α-毒素)、革兰氏阳性菌的天然溶细胞素，例如李斯特菌溶血素O(LLO；例如Mengaud等人(1988),Infect.Immun.,56:766-772；和Portnoy等人(1992),Infect.Immun.,60:2710-2717)、链球菌溶血素O(SLO；例如Palmer等人(1998),Biochemistry 37(8):2378-2383)和产气荚膜梭菌细胞溶素O(perfringolysinO)(PFO；例如Rossjohn等人(1997),Cell,89(5):685-692)。当抗原呈递细胞是吞噬体时，可以有利地使用酸活化的溶细胞素。例如，李斯特菌溶血素在弱酸性pH(吞噬体内的pH条件)显示出更大的成孔能力，从而促进液泡(包括吞噬体和内体)内容物向细胞质的递送(参见，例如Portnoy等人(1992),Infect.Immun.,60:2710-2717)。
溶细胞素可以以单一组合物的形式与预选抗原一起提供或者可以作为单独的组合物提供，用于接触抗原呈递细胞。在一个实施方案中，溶细胞素与抗原融合或以其他方式连接，其中融合或连接允许将抗原递送至靶细胞的胞浆。在另一个实施方案中，溶细胞素和抗原以递送媒介物的形式提供，诸如但不限于脂质体或选自病毒、细菌或酵母的微生物递送媒介物。合适地，当递送媒介物是微生物递送媒介物时，递送媒介物是无毒性的。在该类型的优选的实施方案中，递送媒介物是无毒性细菌，例如由Portnoy等人在美国专利第6,287,556号中描述的，包含编码非分泌性功能性溶细胞素的第一多核苷酸和编码一种或更多种预选抗原的第二多核苷酸，第一多核苷酸可操作地与在细菌中表达溶细胞素的调节性多核苷酸连接。非分泌性溶细胞素可以通过各种机制提供，例如，缺乏功能性信号序列、无分泌能力的微生物，诸如具有遗传损伤(例如功能性信号序列突变)的微生物，或中毒的微生物等。可以使用广泛多种无毒性、非致病性细菌；优选的微生物是相对充分描述的菌株，特别是大肠杆菌的实验室菌株，诸如MC4100、MC1061、DH5α等。其他可以被工程化用于本发明的细菌包括充分表征的、无毒性、非致病性的以下细菌的菌株：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、分枝杆菌属、沙门氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。在一个特定的实施方案中，细菌被减毒为非复制的、非整合到宿主细胞基因组中的、和/或细胞间或细胞内非能动的。
上文描述的递送媒介物可以用于将一种或更多种抗原递送至几乎任何能够胞吞本主题媒介物的抗原呈递细胞，包括吞噬性和非吞噬性抗原呈递细胞。在当递送媒介物是微生物的实施方案中，本主题方法通常需要微生物被靶细胞摄取，并随后在抗原呈递细胞液泡(包括吞噬体和内体)内裂解。
在其他实施方案中，抗原通过引入例如如上文描述的合适的表达载体在抗原呈递细胞内产生。表达载体的抗原编码部分可以包含天然存在的序列或其变体，其已经使用重组技术进行了工程化。在变体的一个实例中，使用如国际公布WO 99/02694和WO 00/42215中详细阐述的方法，抗原编码多核苷酸的密码子组成被修饰，以允许抗原在选择的靶细胞或组织中增强表达。简言之，这些方法基于观察，即不同细胞或组织之间不同密码子的翻译效率不同，并且这些差异可以连同基因的密码子组成一起使用，以调节特定细胞或组织类型中蛋白的表达。因此，对于构建密码子优化的多核苷酸，亲本多核苷酸的至少一个现存密码子被用同义密码子替换，该同义密码子在靶细胞或组织中具有比其替换的现存密码子更高的翻译效率。虽然优选的是，用具有更高的翻译效率的同义密码子替换亲本核酸分子的所有现存密码子，但这不是必需的，因为即使用部分替换也可以实现增加的表达。合适地，替换步骤影响亲本多核苷酸的现存密码子的5％、10％、15％、20％、25％、30％、更优选地35％、40％、50％、60％、70％或更多。
用于引入抗原呈递细胞的表达载体将与其相容，使得抗原编码多核苷酸可由细胞表达。例如该类型的表达载体可以衍生自病毒DNA序列，病毒DNA序列包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、和逆转录病毒(诸如B、C和D逆转录病毒)，以及泡沫病毒(spumaviruses)和修饰的慢病毒。用于转染动物细胞的合适的表达载体由以下描述：例如Wu和Ataai(2000 Curr.Opin.Biotechnol.11(2):205-208)，Vigna和Naldini(2000,J.GeneMed.,2(5):308-316)，Kay等人(2001,Nat.Med.,7(1):33-40)，Athanasopoulos等人(2000,Int.J.Mol.Med.,6(4):363-375)以及Walther和Stein(2000,Drugs,60(2):249-271)。表达载体通过任何合适的方法引入抗原呈递细胞，合适的方法将依赖于表达载体的特定选择和所用抗原呈递细胞。此类引入的方法对本领域技术人员是熟知的。例如，引入可以通过使用以下来实现：接触(例如在病毒载体的情况下)、电穿孔、转化、转导、接合或三亲交配(conjugation or triparental mating)、转染、用阳离子脂质感染膜融合物、用DNA包被的微粒高速轰击、用磷酸钙-DNA沉淀孵育、直接微注射到单细胞中等。其他方法也是可用的并且对于本领域技术人员是已知的。可选择地，载体通过例如脂质体的阳离子脂质的方法引入。此类脂质体是商购可得的(例如由Invitrogen Waltham MA,USA提供的LipofectamineTM等)。本领域技术人员将理解，用于组装和表达如本文描述的抗原编码核酸分子、免疫调节分子和/或细胞因子的技术，例如寡核苷酸的合成、核酸扩增技术、转化细胞、构建载体、表达系统等，以及将核酸分子转导或以其他方式引入细胞中的技术在本领域中已被充分确立，并且大多数技术人员熟悉特定条件和程序的标准资源材料。
在一些实施方案中，抗原特异性抗原呈递细胞通过从细胞群体或组织分离抗原呈递细胞或其前体获得，对该细胞群体或组织需要修饰免疫应答。通常，分离的抗原呈递细胞或前体中的一些将组成性呈递抗原，或者已经体内摄取了此类抗原，此类抗原是免疫应答的靶或潜在靶，为此需要刺激或抑制免疫应答。在该情况下，外源性抗原的递送不是必需的。可选择地，细胞可以来源于健康的或患病的组织的活组织检查，被裂解或致使凋亡，然后脉冲到抗原呈递细胞(例如树突细胞)上。在该类型的某些实施方案中，抗原呈递细胞是需要抗原特异性免疫应答的癌症或肿瘤细胞。癌症或肿瘤细胞的例示性实例包括肉瘤和上皮癌的细胞，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病；慢性白血病(慢性髓性(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和重链病。在某些实施方案中，癌症或肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
在上文的一些实施方案中，癌症或肿瘤细胞将构成兼性或非专职性抗原呈递细胞，并且在一些情况下可能需要进一步修饰以增强它们的抗原呈递功能。在这些情况下，抗原呈递细胞被进一步修饰以表达一种或更多种免疫调节分子，其包括动物中天然存在的可以调节或直接影响免疫应答的任何分子，包括：参与抗原加工和呈递的蛋白、诸如TAP1/TAP2转运蛋白，蛋白酶体分子、诸如LMP2和LMP7，热休克蛋白、诸如gp96、HSP70和HSP90，以及主要组织相容性复合物(MHC)或人白细胞抗原(HLA)分子；为T细胞激活提供共刺激信号的因子，诸如B7和CD40；为直接杀死T细胞或诱导T淋巴细胞或B淋巴细胞无反应性或刺激T调节细胞(Treg)产生提供共抑制信号的因子，诸如OX-2、PD-L1或PD-L2；辅助分子，诸如CD83；趋化因子；淋巴因子和细胞因子、诸如干扰素α、β和γ、白细胞介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-22等)、刺激细胞生长的因子(例如GM-SCF)和其他因子(例如肿瘤坏死因子(TNF)、DC-SIGN、MIP1α、MIP1β和转化生长因子β(TGF-β))。在某些有利的实施方案中，免疫调节分子选自B7分子(例如B7-1、B7-2或B7-3)和ICAM分子(例如ICAM-1和ICAM-2)。
代替重组表达免疫调节分子，表达所需的免疫刺激分子的抗原呈递细胞可以从细胞的异质性群体分离或选择。本发明预期任何分离/选择方法，其实例对本领域技术人员是已知的。例如，人们可以利用细胞的一种或更多种特定特征从异质群体中特异性分离该细胞。此类特征包括但不限于细胞的解剖学位置、细胞密度、细胞大小、细胞形态、细胞代谢活性、离子诸如Ca2+、K+和H+离子的细胞摄取、化合物如染色剂的细胞摄取、细胞表面上表达的标志物、蛋白质荧光和膜电位。在这方面可以使用的合适的方法包括：组织的手术切除、流式细胞术技术诸如荧光激活细胞分选(FACS)、免疫亲和分离(例如磁珠分离，诸如DynabeadTM分离)、密度分离(例如甲泛葡胺(metrizamide)、PercollTM或FicollTM梯度离心)、和细胞类型特异性密度分离。期望地，通过流式细胞术或通过使用与免疫调节分子免疫相互作用的抗原结合分子的免疫亲和分离来分离细胞。
可选择地，免疫调节分子可以以可溶性形式提供给抗原呈递细胞。在该类型的一些实施方案中，免疫调节分子是缺乏功能性跨膜结构域(例如包含B7细胞外结构域)的B7分子，其非限制性实例由McHugh等人(1998,Clin.Immunol.Immunopathol.,87(1):50-59)，Faas等人(2000,J.Immunol.,164(12):6340-6348)和Jeannin等人(2000,Immunity,13(3):303-312)描述。在该类型的其他实施方案中，免疫刺激蛋白是B7衍生物，该B7衍生物包括但不限于嵌合或融合蛋白，所述嵌合或融合蛋白包含与抗原结合分子诸如免疫球蛋白分子或其生物学活性片段连接在一起的B7分子或其生物学活性片段、或它们的变体或衍生物。例如，使用PCR，将编码对应于B7-1分子的细胞外结构域、包含从约位置1至约位置215的氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸，与编码对应于人Ig Cγ1的铰链、CH2和CH3区域的氨基酸序列的多核苷酸连接，以形成表达为B7Ig融合蛋白的构建体。编码对应于B7Ig融合蛋白的氨基酸序列的DNA已经根据布达佩斯条约在1991年5月31日保藏于Rockville,Md.的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并被授予了保藏号68627。用于制备和组装此类B7衍生物的技术由例如Linsley等人(美国专利第5,580,756号)公开。也可以参考Sturmhoefel等人(1999,Cancer Res.,59:4964-4972)，他们公开了包含与IgG2a的Fc部分框内融合的B7-1或B7-2细胞外区域的融合蛋白。
如果需要，可溶性免疫调节分子的半衰期可以通过任何合适的程序延长。优选地，用聚乙二醇(PEG)、包括单甲氧基聚乙二醇化学修饰此类分子，例如由Chapman等人(1999，Nature Biotechnology，17:780-783)公开的。
可选择地，或者另外，将抗原呈递细胞在至少一种干扰素的存在下和在足以增强细胞的抗原呈递功能的条件下培养一定时间，并洗涤细胞以去除干扰素。在该类型的某些有利的实施方案中，培养的步骤可以包括将细胞与至少一种I型干扰素和/或II型干扰素接触。所述至少一种I型干扰素合适地选自由以下组成的组：IFN-α、IFN-β、IFN-α的生物学活性片段、IFN-β的生物学活性片段、IFN-α的变体、IFN-β的变体、所述生物学活性片段的变体、IFN-α的衍生物、IFN-β的衍生物、所述生物学活性片段的衍生物、所述变体的衍生物、IFN-α的类似物和IFN-β的类似物。通常，II型干扰素选自由以下组成的组：IFN-γ、IFN-γ的生物学活性片段、IFN-γ的变体、所述生物学活性片段的变体、IFN-γ的衍生物、所述生物学活性片段的衍生物、所述变体的衍生物和IFN-γ的类似物。国际公布号WO 01/88097中描述了用于使用干扰素治疗增强抗原呈递细胞的抗原呈递功能的示例性方法和条件。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞(例如癌细胞)或细胞系被合适地致使失活，以防止当向受试者施用之后进一步增殖。可以使用任何物理学、化学或生物学灭活方法，包括但不限于辐照(一般用至少约5,000cGy，通常至少约10,000cGy，典型地至少约20,000cGy)；或者用丝裂霉素C处理(通常至少10μg/mL；更通常至少约50μg/mL)。
抗原呈递细胞可以通过多种方法获得或制备成含有和/或表达一种或更多种抗原，使得抗原或其加工形式由这些细胞呈递，用于潜在调节其他免疫细胞，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，并且特别是用于产生被引发以对特定抗原或抗原组应答的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞是免疫效应物细胞。因此，在一些实施方案中，上文描述的抗原呈递细胞可用于产生对抗原或抗原组的被引发的T淋巴细胞。在其他实施方案中，抗原特异性抗原呈递细胞可用于产生对抗原或抗原组显示出耐受性/无反应性的T淋巴细胞。诱导淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞对特定抗原显示出免疫应答或耐受性/无反应性的效率可以通过任何合适的方法来确定，包括但不限于：使用例如抗原特异性抗原呈递细胞作为抗原特异性溶细胞性T淋巴细胞(CTL)的靶，体外测定T淋巴细胞溶细胞活性；测定抗原特异性T淋巴细胞增殖(参见，例如Vollenweider和Groseurth(1992),J.Immunol.Meth.,149:133-135)，使用例如Elispot测定和ELISA测定测量B细胞对抗原的应答；审查(interrogate)细胞因子谱；或者通过测试皮肤对特定抗原的反应性来测量迟发型超敏反应(DTH)应答(参见，例如Chang等人(1993),Cancer Res.53:1043-1050)。本领域技术人员已知的可以在暴露于抗原之后检测抗原呈递细胞的表面上抗原的存在的其他方法，也被本发明考虑。
因此，本发明还提供了抗原特异性B或T淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，它们以抗原特异性方式对抗原的呈递应答。在一些实施方案中，抗原特异性T淋巴细胞通过将如上文定义的抗原呈递细胞与T淋巴细胞的群体接触来产生，T淋巴细胞的群体可以从任何合适的来源诸如脾脏或扁桃体/淋巴结获得，但优选地从外周血获得。T淋巴细胞可以作为粗制品或作为部分纯化的或基本纯化的制品使用，其合适地使用如以下标准技术获得，例如“Immunochemical Techniques,Part G:Separation and Characterization of LymphoidCells”(1984,Meth.in Enzymol.108，由Di Sabato等人编辑，Academic Press)中描述的。这包括与绵羊红细胞形成玫瑰花结(rosette)，通过尼龙毛柱或塑料柱粘附以耗尽粘附细胞，使用本领域已知的适当的单克隆抗体的免疫磁性或流式细胞术选择。
将T淋巴细胞的制品与本文描述的抗原特异性抗原呈递细胞接触足够长的时间段，用于引发T淋巴细胞或使T淋巴细胞对那些抗原呈递细胞呈递的一种或更多种抗原无反应。该时间段将为通常至少约1天，且最多约5天。
在使用耐受性或无反应性诱导性抗原特异性抗原呈递细胞的实施方案中，由此类细胞诱导的抗原特异性无反应性期望地涉及诱导一种或更多种类型的抗原特异性调节性淋巴细胞，尤其是调节性T淋巴细胞。已知数种调节性T淋巴细胞的群体以抗原特异性方式抑制其他(效应物)淋巴细胞的应答，包括例如Tr1淋巴细胞、Th3淋巴细胞、Th2淋巴细胞、CD8+CD28-调节性T淋巴细胞、CD4+CD25+调节性T淋巴细胞、自然杀伤(NK)T淋巴细胞和γδT淋巴细胞。
在IL-10的存在下，在通过同种异体单核细胞刺激人类血液T细胞数轮之后，Tr1淋巴细胞可以出现。该亚群分泌高水平的IL-10和中等水平的TGFβ，但IL-4或IFNγ很少(Groux等人(1997),Nature,389:737-742)。
Th3调节性亚群是指通过口服(或其他粘膜)途径递送抗原之后诱导的特定亚群。它们主要产生TGFβ，并且仅产生低水平的IL-10、IL-4或IFNγ，以及为IgA产生提供特定辅助(Weiner等人(2001),Microbes Infect,3:947-954)。它们能够抑制Th1型和Th2型效应物T细胞两者。
Th2淋巴细胞产生高水平的IL-4、IL-5和IL-10，但IFNγ和TGFβ较低。Th2淋巴细胞响应于环境中相对丰富的IL-4和缺乏IL-12，在它们的同源肽配体的呈递时产生(O’Garra和Arai(2000),Trends Cell Biol,10:542-550)。CD86的T淋巴细胞信号传导对Th2细胞的产生可能也很重要(Lenschow等人(1996),Immunity,5:285-293；Xu等(1997),J Immunol,159:4217-4226)。
T淋巴细胞的一个不同的CD8+CD28-调节性或“抑制”亚群可以通过体外重复性抗原刺激来诱导。它们是MHC I类限制性的，并且抑制CD4+T细胞应答。
T淋巴细胞的CD4+CD25+调节性或“抑制”亚群抑制多种自身免疫和炎性疾病，并且它们在同种异体抗原应答的抑制中也有效。特别地，这些淋巴细胞可以通过影响T细胞应答、抗体产生、细胞因子分泌和抗原呈递细胞来下调免疫应答(参见，例如Suvas等人(2003),J Exp Med.,198(6):889-901；Taams等人(2003),Transpl Immunol.,11(3-4):277-85；Jonuleit等人(2003),Transpl Immunol.,11(3-4):267-76；Green等人(2003),Proc Natl Acad Sci USA.,100(19):10878-10883)。CD4+CD25+调节性T细胞通过体外重复抗原刺激来产生(Feunou等人(2003),J Immunol.,171(7):3475-84)。
表达NK细胞标志物CD161的NK T淋巴细胞的TCR在人类中为Vα24JαQ，并且在小鼠中为Vα14Jα281，NK T淋巴细胞通过糖脂抗原的呈递被非多态性CD1d分子特异性激活(Kawano等人(1997),Science,278:1626-1629)。已经在许多实验系统中证明了NK T淋巴细胞的免疫调节性。在疾病发作之前，在数种自身免疫模型中，NK T淋巴细胞的数目减少，并且在被动转移至非肥胖糖尿病(NOD)小鼠后，可以减少发病率。CD1d呈递的糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-gal cer)的施用还导致NKT淋巴细胞的积累和这些小鼠中糖尿病的改善(Naumov等人(2001),Proc Natl Acad Sci USA,98:13838-13843)。
已经表明γδT淋巴细胞参与了多种炎性疾病中免疫应答的下调和与诱导粘膜耐受性相关的炎症的抑制。由粘膜抗原诱发的耐受性可通过少量的γδT细胞转移至未治疗的受体小鼠(McMenamin等人(1995),J Immunol,154:4390-4394；McMenamin等人(1994),Science,265:1869-1871)。此外，粘膜耐受性诱导通过施用阻断γδT细胞功能的GL3抗体阻断(Ke等人(1997),J Immunol,158:3610-3618)。
无论抗原特异性T淋巴细胞是体外还是体内与抗原呈递细胞接触而产生的，由抗原呈递细胞诱导的抗原特异性无反应性反映了抗原特异性淋巴细胞不能对随后的用特异性抗原重刺激应答。这些抗原特异性淋巴细胞合适地特征在于以抗原特异性方式产生IL-10。IL-10是一种具有强免疫抑制特性的细胞因子。IL-10在不同水平抑制抗原特异性T淋巴细胞增殖。IL-10通过下调MHC II类分子以及粘附分子和共刺激分子ICAM-1和B7.1和B7.2的表达，抑制专职性抗原呈递细胞诸如单核细胞、树突细胞和郎格罕细胞的抗原呈递和辅助细胞功能(综述于Interleukin 10(1995),de Vries and de Waal Malefyt,eds.,Landes Co,Austin Tex.中)。IL-10还抑制这些细胞产生IL-12。IL-12促进T淋巴细胞活化和Th1淋巴细胞的分化(D’Andrea(1993),J.Exp.Med.,178:1041-1048；Hsieh等人(1993),Science,260:547-549)。此外，IL-10通过抑制IL-2基因转录和这些细胞产生IL-2来直接抑制T淋巴细胞增殖(综述于Interleukin 10(1995),de Vries and de Waal Malefyt,eds.,Landes Co,Austin Tex.中)，并且IL-10自身促进诱导调节性T细胞的抗原呈递细胞(美国专利第6,277,635号)。因此，在一些实施方案中，可以通过测定IL-10的产生来确定无反应性T淋巴细胞的存在，例如通过细胞上清液中的ELISA，或者通过细胞内染色的流式细胞术分析。
在一些实施方案中，免疫调节剂是与靶抗原免疫相互作用的抗原结合分子。在一些实施方案中，靶抗原在疾病或状况中表达，或者由特定病原体表达，对该特定病原体需要增强的免疫应答。在其他实施方案中，与正常状态或者疾病或状况不存在的状态相比，靶抗原在疾病或状况中异常表达，通常处于更高水平。如之前描述的，抗原结合分子与靶抗原合适地相互作用。可用于本发明的许多抗原结合分子是本领域已知的。在结肠癌为治疗的对象的例示性实例中，抗原结合分子与选自Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白的抗原或结肠癌细胞裂解物中存在的抗原免疫相互作用，例如美国专利申请公布号20040176576中公开的。
在一些实施方案中，抗原结合分子是抗体，尤其是完整多克隆抗体。此类抗体可以例如通过将对应于靶抗原的至少一部分的抗原注射到产生物种中来制备，产生物种可以包括小鼠或兔，以获得多克隆抗血清。产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。可以使用的示例性方案描述于例如Coligan等人(1991),Current Protocols in Immunology,(John Wiley&Sons,Inc)，和Ausubel等人(1998，上文)中，特别在第11章第III节中。
代替在产生物种中获得的多克隆抗血清，可以使用如以下描述的标准方法产生单克隆抗体，例如和Milstein(1975,Nature,256:495-497)，或其较新的修改，例如Coligan等人(1991，上文)中描述的，通过将来源于已经接种了一种或更多种如上文描述的抗原的产生物种的脾或其他抗体产生细胞永生化。
本发明还预期作为抗原结合分子的Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段。可选择地，抗原结合分子可以包含合成的稳定化的Fv片段。该类型的示例性片段包括单链Fv片段(sFv，通常称为scFv)，其中使用肽接头来将VH结构域的N末端或C末端分别与VL结构域的C末端或N末端桥接。scFv缺乏完整抗体的所有恒定的部分，并且不能激活补体。可以例如根据Kreber等人(1997,J.Immunol.Methods,201(1):35-55)中概述的方法制备scFv。可选择地，可以通过美国专利第5,091,513号、欧洲专利第239,400号或文章Winter和Milstein(1991,Nature,349:293)和Plückthun等人(1996,In Antibody engineering:A practicalapproach.,203-252)中描述的方法制备scFv。在另一个实施方案中，合成的稳定化的Fv片段包含二硫键稳定化的Fv(dsFv)，其中半胱氨酸残基被引入VH和VL结构域，使得在完全折叠的Fv分子中，两个半胱氨酸残基将在彼此之间形成二硫键。产生dsFv的合适的方法描述于例如Glockscuther等人(1990),Biochem.,29:1362-1367；Reiter等人(1994),J.Biol.Chem.,269:18327-18331；Reiter等人(1994),Biochem.33:5451-5459；Reiter等人(1994),Cancer Res.,54:2714-2718；Webber等人(1995),Mol.Immunol.,32:249-258。
5.LSD1抑制的方法
如上文第4节中描述的，本发明的蛋白质分子在用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答并抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性，包括抑制PD-L1和/或PD-L2的细胞核易位的方法中有用。此外，本发明的蛋白质分子在用于治疗或预防涉及LSD1和/或PKC过表达的状况诸如如癌症的方法中有用。
根据本发明，本发明的蛋白质分子可用于抑制LSD1细胞核易位。因此，本发明的蛋白质分子在用于改变LSD1过表达细胞的形成、增殖、维持、EMT或MET中的至少一种的方法中有用。本发明的蛋白质分子可用于抑制LSD1过表达细胞的增殖、存活或活力。因此，本发明的蛋白质分子可用于在受试者中治疗或预防涉及LSD1过表达的状况，诸如癌症，尤其是乳腺癌。
因此，在本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质分子用于治疗或者在制备用于治疗的药物中的用途。本发明还包括本发明的蛋白质分子，用于在治疗中使用或用于用作药物。
本发明的蛋白质分子可用于抑制LSD1，特别是LSD1的细胞核易位。因此，本发明的蛋白质分子可用于抑制LSD1的活性，诸如LSD1的细胞核易位或LSD1的磷酸化的方法中。
因此，提出本发明的蛋白质分子，由于其对LSD1的抑制作用，将可用于改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的方法中。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子导致：减少、损伤、消除或防止LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT；和/或增强LSD1过表达细胞的(v)MET。
本发明的蛋白质分子可以用于在受试者中治疗或预防癌症，其中该癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。癌症可以包括癌症干细胞肿瘤细胞和非癌症干细胞肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、肝癌或脑癌；尤其是乳腺癌。
在其他实施方案中，本发明的蛋白质分子用于治疗、预防和/或减轻恶性肿瘤、特别是转移性癌症的症状。在优选的实施方案中，本发明的蛋白质分子用于治疗、预防和/或减轻转移性癌症的症状。
合适的类型的转移性癌症包括但不限于转移性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、肝癌或脑癌。在一些实施方案中，脑癌是神经胶质瘤。在优选的实施方案中，转移性癌是转移性乳腺癌。
蛋白质分子可用于涉及LSD1过表达细胞的方法。在特定实施方案中，LSD1过表达细胞选自乳腺细胞、前列腺细胞、睾丸细胞、肺细胞、膀胱细胞、胰腺细胞、结肠细胞、黑素瘤细胞、白血病细胞、视网膜母细胞瘤细胞、肝细胞或脑细胞；尤其是乳腺细胞。在特定实施方案中，LSD1过表达细胞是乳腺上皮细胞，尤其是乳腺导管上皮细胞。
在一些实施方案中，LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；尤其是癌症干细胞肿瘤细胞；最尤其是乳腺癌干细胞肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌症干细胞肿瘤细胞表达CD24和CD44，特别是CD44高、CD24低。
在一些实施方案中，该方法还包括检测从受试者获得的肿瘤样品中LSD1基因的过表达，其中在将本发明的蛋白质分子向受试者施用之前，该肿瘤样品包含癌症干细胞肿瘤细胞和任选地非癌症干细胞肿瘤细胞。
本发明的蛋白质分子适用于治疗已经被诊断出患有癌症、被怀疑患有癌症、已知为易感的和被认为可能发展癌症、或者被认为发展先前治疗过的癌症的复发的个体。癌症可以是激素受体阴性的。在一些实施方案中，癌症是激素受体阴性的，并且因此对激素或内分泌治疗有耐受性。在癌症为乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌是激素受体阴性的。在一些实施方案中，乳腺癌是雌激素受体阴性的和/或孕酮受体阴性的。
存在许多涉及LSD1过表达或活性的状况，其中本发明的蛋白质分子可以是有用的。因此，在本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质分子用于在受试者中治疗或预防涉及LSD1抑制与有效治疗相关的状况的用途。本发明还预期在受试者中治疗或预防涉及LSD1抑制与有效治疗相关的状况的方法。在本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质分子在制备用于在受试者中治疗或预防涉及LSD1抑制与有效治疗相关的状况的药物中的用途。本发明还提供了本发明的蛋白质分子，用于在受试者中治疗或预防涉及LSD1抑制与有效治疗相关的状况中使用。
涉及LSD1过表达或活性的状况、和因此LSD1抑制与有效治疗相关的状况的非限制性实例包括癌症；镰状细胞病；病毒感染，诸如HIV感染、单纯疱疹病毒(例如HSV-1或HSV-2)感染、腺病毒感染、人乳头瘤病毒感染、细小病毒感染、天花病毒感染、痘苗病毒感染、嗜肝DNA病毒科病毒感染、多瘤病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒)感染或水痘-带状疱疹病毒感染；炎性状况诸如动脉粥样硬化、呼吸炎性紊乱(例如呼吸窘迫综合征、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管高反应性、支气管收缩、气道炎症、气道重塑或囊性纤维化)、慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性皮肤炎性疾病(例如银屑病或特应性皮炎)、系膜性肾小球肾炎、川崎病、弥散性血管内炎症、卡菲病、双胎反向动脉灌注综合征、过敏性血管炎、关节炎、血管炎、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、移植血管病变、类风湿性关节炎、肝硬化或肾炎；心血管状况诸如血栓形成、巴-希二氏综合征、佩-施二氏病、心肌梗死、冠心病、冠状动脉疾病、中风、心力衰竭或高血压；或神经紊乱诸如精神分裂症、发育障碍、抑郁症、癫痫、药物成瘾或神经退行性疾病(例如帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默病或痴呆)。在特定实施方案中，状况是癌症。
在特定实施方案中，该方法包括施用如上文第3节描述的另一种活性剂，诸如另外的癌症治疗剂和/或抗感染剂。
6.PKC抑制的方法
对应于LSD1的残基108至118的氨基酸序列包含丝氨酸111上的潜在磷酸化位点。不希望受理论束缚，提出本发明的蛋白质分子，其序列对应于包含所述磷酸化位点和周围残基的氨基酸序列，可以结合PKC，尤其是PKC-θ，从而抑制所述PKC的磷酸化活性，并因此抑制LSD1的磷酸化。继而提出LSD1磷酸化的缺乏抑制LSD1的细胞核易位。
因此，本发明的蛋白质分子可用于抑制PKC的磷酸化活性，诸如抑制PKC磷酸化LSD1，并改变PKC过表达细胞的形成、增殖、维持、EMT或MET中的至少一种。此外，本发明的蛋白质分子可用于在受试者中治疗或预防涉及PKC过表达的状况，诸如癌症。
在特定实施方案中，PKC是PKC-θ。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子选择性抑制PKC-θ的磷酸化活性超过至少一种其他PKC酶或亚型，诸如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子选择性抑制PKC-θ的磷酸化活性超过其他10种PKC酶。在一些实施方案中，相对于另一PKC(即PKC-θ以外的PKC，诸如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)的磷酸化活性的抑制，本发明的蛋白质分子显示出大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍的PKC-θ选择性。在其他实施方案中，选择性分子显示出对PKC-θ的抑制比对另一PKC大至少50倍。在另外的实施方案中，选择性分子显示出对PKC-θ的抑制比对另一PKC大至少100倍。在仍另外的实施方案中，选择性分子显示出对PKC-θ的抑制比对另一PKC大至少500倍。在又另外的实施方案中，选择性分子显示出对PKC-θ的抑制比对另一PKC大至少100倍。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子是PKC-θ的磷酸化活性的非选择性抑制剂。
本发明的蛋白质分子在改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的方法中有用。优选地，将细胞与形成调节量、增殖调节量、维持调节量、EMT调节量或MET调节量的本发明的蛋白质分子接触。在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子导致：减少、损伤、消除或防止PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT；和/或增强PKC过表达细胞的(v)MET。
因此，本发明的蛋白质分子可以用于在受试者中治疗或预防癌症，其中该癌症包含至少一种PKC过表达细胞。在优选的实施方案中，PKC是PKC-θ。
癌症可以选自但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、肝癌或脑癌；尤其是乳腺癌。在特定实施方案中，癌症是转移性癌，尤其是转移性乳腺癌。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质分子用于治疗、预防和/或减轻恶性肿瘤、特别是转移性癌症的症状。在优选的实施方案中，本发明的蛋白质分子用于治疗、预防和/或减轻转移性癌症的症状。
在优选的实施方案中，PKC是PKC-θ。合适的PKC-θ过表达细胞可以包括但不限于乳腺细胞、前列腺细胞、肺细胞、膀胱细胞、胰腺细胞、结肠细胞、黑素瘤细胞、肝脏细胞、视网膜细胞或胶质瘤细胞；尤其是乳腺细胞。在特定实施方案中，PKC-θ过表达细胞是乳腺上皮细胞，尤其是乳腺导管上皮细胞。
在特定实施方案中，PKC-θ过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；优选地是癌症干细胞肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌症干细胞肿瘤细胞表达CD24和CD44，特别是CD44高、CD24低。
本发明的蛋白质分子适用于治疗已经被诊断出患有癌症、被怀疑患有癌症、已知为易感的和被认为可能发展癌症、或者被认为发展先前治疗过的癌症的复发的个体。癌症可以是激素受体阴性的。在一些实施方案中，癌症是激素受体阴性的，并且因此对激素或内分泌治疗有耐受性。在癌症为乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌是激素受体阴性的。在一些实施方案中，乳腺癌是雌激素受体阴性的和/或孕酮受体阴性的。
有许多状况涉及PKC过表达，尤其是PKC-θ过表达，其中本发明的蛋白质分子可以是有用的。因此，在本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质分子用于在受试者中治疗或预防涉及PKC抑制与有效治疗相关的状况的用途。本发明还预期在受试者中治疗或预防PKC抑制、特别是PKC-θ抑制与有效治疗相关的状况的方法。在本发明的另一个方面，提供了本发明的蛋白质分子在制备用于在受试者中治疗或预防涉及PKC抑制与有效治疗相关的状况的药物中的用途。本发明还提供了本发明的蛋白质分子，用于在受试者中治疗或预防涉及PKC抑制与有效治疗相关的状况中使用。
涉及PKC过表达或活性，特别是PKC-θ过表达或活性的状况，和因此PKC抑制与有效治疗相关的状况包括但不限于癌症；神经和血管紊乱诸如唐氏综合征、记忆和认知障碍、痴呆、淀粉样神经病、脑炎症、中风、帕金森病、神经和脑创伤、血管淀粉样变性、抑郁症或淀粉样变性脑出血；急性和慢性气道紊乱诸如支气管炎、阻塞性支气管炎、痉挛性支气管炎、过敏性支气管炎、过敏性哮喘、支气管哮喘、肺气肿或慢性阻塞性肺疾病(COPD)；心脏疾病诸如心力衰竭、动脉粥样硬化、心脏纤维化、肥大或缺血性心脏病；皮肤病诸如银屑病、毒性和过敏性接触性湿疹、特应性湿疹、脂溢性湿疹、单纯性苔藓、晒伤、肛门生殖器区域瘙痒、斑秃、肥厚性瘢痕、盘状红斑狼疮、滤泡性脓皮病(follicular pyodermias)和大面积脓皮病、内源性痤疮和外源性痤疮或酒渣鼻(acne rosacea)；关节炎状况诸如类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎或其他关节炎状况；获得性免疫缺陷综合征(AIDS)；HIV感染；感染性休克；成人呼吸窘迫综合征；移植物抗宿主反应；急性或慢性器官或组织同种或异种移植物排斥；克罗恩病；溃疡性结肠炎；炎症性肠病；变应性鼻炎或鼻窦炎；变应性结膜炎；鼻息肉；自身免疫紊乱诸如多发性硬化；肾病；或尿崩症。在特定实施方案中，状况是癌症。
在一些实施方案中，该方法还包括检测从受试者获得的肿瘤样品中PKC基因，尤其是PKC-θ基因的过表达，其中在将本发明的蛋白质分子向受试者施用之前，该肿瘤样品包含癌症干细胞肿瘤细胞和任选地非癌症干细胞肿瘤细胞。
在特定实施方案中，该方法包括施用如上文第3节描述的另一种活性剂，诸如另外的癌症治疗剂和/或抗感染剂。
本领域技术人员将充分知晓用于评价LSD1、PDL-1、PDL-2和/或PKC抑制，诸如细胞核易位和磷酸化活性的抑制的合适的测定，并鉴定为LSD1或PKC抑制剂的蛋白质分子。根据本发明的活性剂的筛选可以通过任何合适的方法来实现。例如，该方法可以包括将表达对应于编码LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2的基因的多核苷酸的细胞与猜想具有抑制活性的剂接触，并筛选LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2的水平或功能性活性的抑制，或筛选由该多核苷酸编码的转录物的水平的降低，或筛选多肽或转录物的下游细胞靶(下文称为靶分子)的活性或表达的抑制。检测此类抑制可以使用包括但不限于以下的技术实现：ELISA、基于细胞的ELISA、抑制ELISA、蛋白印迹、免疫沉淀、免疫荧光、狭线印迹或斑点印迹测定、免疫染色、RIA、闪烁邻近测定、使用抗原结合分子缀合物或诸如荧光素或罗丹明的荧光物质的抗原缀合物的荧光免疫测定、Ouchterlony双向扩散分析、使用亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素检测系统的免疫测定以及包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的核酸检测测定。
应当理解，LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2由其调节或表达的多核苷酸可以天然存在于作为测试对象的细胞中，或者为了测试的目的多核苷酸可以已经被引入宿主细胞。此外，天然存在或引入的多核苷酸可以被组成性表达，从而提供可用于筛选下调序列的编码产物的表达的剂的模型，其中下调可以在核酸水平或表达产物水平。此外，对于多核苷酸被引入细胞的程度，该多核苷酸可以包含编码LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2的整个编码序列，或者该多核苷酸可以包含该编码序列的一部分(例如LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2的活性位点)或调节编码LSD1、PKC、PD-L1和/或PD-L2的对应基因的表达的部分(例如启动子)。例如，与多核苷酸天然相关的启动子可以被引入到作为测试对象的细胞中。在该情况下，当仅启动子被使用时，检测启动子活性的调节可以实现，例如，通过将启动子可操作地与合适的报告多核苷酸连接，报告多核苷酸包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和儿茶酚胺乙酰转移酶(CAT)。表达的调节可以通过测量与报告多核苷酸相关的活性来确定。
这些方法提供了用于进行高通量筛选推定调节剂的机制，推定抑制剂为诸如包括合成文库、组合文库、化学文库和天然文库的蛋白质剂或非蛋白质剂。这些方法还将促进检测结合编码靶分子的多核苷酸或抑制上游分子的表达的剂，上游分子的表达随后抑制编码靶分子的多核苷酸的表达。因此，这些方法提供了检测直接或间接抑制根据本发明的靶分子的表达或活性的剂的机制。
在可选择的实施方案中，使用商购可得的测定筛选测试试剂，商购可得的测定的例示性实例包括EpiQuik Histone Demethylase LSD1 Inhibitor Screening Assay Kit(Epigentek Group,Brooklyn,USA)、LSD1 Inhibitor Screening Assay Kit(CaymanChemical Company,Ann Arbor,USA)、PKC Kinase Activity Assay Kit(Abcam,Cambridge,United Kingdom)、Protein Kinase C Assay Kit(Panvera Corporation,Madison,USA)和Cell-based Immune-checkpoint Assays(Genscript,Piscataway,USA)。
可以在动物模型中进一步测试化合物，以鉴定那些具有最强的体内作用的化合物。这些分子可以用作药物进一步开发的“先导化合物”，所述进一步开发例如，通过对化合物进行连续修饰、分子建模和合理药物设计中使用的其他常规程序。
另外的合适的测定包括以下中描述的测定：Sutcliffe等人(2012)FrontImmunol,3:260；Ghildyal等人(2009)J Virol,83(11):5353-5362；Riss等人(2013)CellViability Assays,In:Sittampalam等人，Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company and the National Center for Advancing TranslationalSciences，从以下可得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/；US2005222186；Li等人(2011)J Biomol Screen,16(2):141-154；Zhang等人(2010)FEBSLetters,584(22):4646-4654；Johnson和Hunter(2005)Nat Methods,2(1):17-25；Peck(2006)Plant J,45:512-522；Phillips等人(2015)Appl Immunohistochem Mol Morphol.,23(8):541-549；和Satelli等人(2016)Sci Rep,6:28910。
为了可以容易地理解并实践本发明，现在将通过以下非限制性实施例的方式来描述具体的优选实施方案。
实施例
实施例1-肽抑制剂的合成
LSD1肽抑制剂L1、L2和L3(参见表4)使用温和的Fmoc化学方法，使用自动化现代固相肽合成和纯化技术合成，例如如在Ensenat-Waser等人(2002)IUBMB Life,54:33-36和WO2002/010193中描述的。偶合使用标准的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/羟基苯并三唑(HOBt)偶合进行。在脱保护之后，使用自动化准备的反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化肽。使用分析型RP-HPLC和质谱术分析级分。将纯度为98％或更高的级分组合以产生最终产物。
将所有测试的肽通过N-末端氨基酸的N-末端氨基基团肉豆蔻酰化。在肽的脱保护和纯化之前，通过使用如上文描述的标准DIC/HOBt偶合将肉豆蔻酸共价偶合至N-末端残基进行肉豆蔻酰化。
表4：肽抑制剂
肽名称 序列 SEQ ID NO:
L1 肉豆蔻酰基-RRTSRRKRAKV-OH 59
L2 肉豆蔻酰基-RRTARRKRAKV-OH 60
L3 肉豆蔻酰基-RWRRTARRKRAKV-OH 61
实施例2-乳腺癌细胞系中磷酸化的LSD1与PD-L1和PD-L2的相互作用
尽管PD-L1传统上被描述为细胞表面信号传导蛋白，显微镜分析展示了在MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中PD-L1具有清晰的细胞核信号(图1)。PD-L1在间充质MCF7乳腺癌细胞系和更具侵袭性的三阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞系中具有显著更多的细胞核分布。Fn/c(细胞核荧光与细胞质荧光的比率)和TNFI(总细胞核荧光)两者清晰地示出了更多的细胞核存在，连同清晰的细胞质存在(TCFI；总细胞质荧光)。此外，存在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的清晰和几乎完全的细胞核信号，该信号在间充质刺激的MCF7细胞(MCF7ST)和更具侵袭性的细胞系MDA-MB-231(MDA)两者中显著更高。此外，LSD1s111p和PD-L1的PCC(测量细胞的细胞核内两种蛋白的共定位的程度的共定位系数)在上皮未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)中较低，但在间充质MCF7ST中显著增加。最高的PCC是在MDA-MB-231细胞中。该数据表明癌细胞的细胞核中LSD1s111p和PD-L1之间的直接关系。
在MDA-MB-231细胞中，PD-L2示出了微小的细胞核信号，但示出了具有LSD1s111p的阳性PCC(图2)。该数据表明在癌细胞的细胞核中PD-L2的细胞核存在以及LSD1s111p和PD-L2之间的直接关系。
图3A描绘了用PMA或PMA和TGF-β刺激的、用PD-L1染色的可诱导MCF7的FACS图。检查了这些细胞对于PD-L1、PD-L2和CD44的mRNA。与PD-L2相比，PD-L1 mRNA在MCF7细胞中表达更高(图3B)。相反，与PD-L1相比，PD-L2在MDA-MB-231细胞中表达略高。PD-L1和PD-L2两者是在刺激MCF7细胞后诱导的。与MCF7细胞相比，PD-L1和PD-L2在MDA-MB-231细胞中表达显著更高。与粘附群体(AD)相比，PD-L1 mRNA和PD-L2 mRNA与CD44一样在悬浮细胞(SUS)中以更高水平表达，这与FACS结果相反。当用LSD1抑制剂(LSD1siRNA)处理时，发现了PD-L2mRNA和CD44 mRNA表达被LSD1 siRNA下调，而PD-L1表达增加(图3C)。
表5描绘了用Jurkat-T细胞刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞。通过用IFNγ(10μg/mL)、PMA(24ng/mL)或PMA+IFNγ刺激，PD-L1+细胞的频率(％)没有改变。相似地，无论细胞被刺激24小时还是48小时，PD-L1+细胞的频率保持不变。
用单独的IFNγ刺激MDA-MB-231细胞24小时，导致群体改变并且CD44高/CD24低细胞的频率降低至77.7％。刺激组合中无一显著改变CD44高/CD24低PD-L1+MDA-MB-231细胞的频率。细胞的中值荧光强度(MFI)随IFNγ刺激而增加，并且通过单独的PMA刺激降低(表6)。用PMA和IFNγ两者的刺激进一步增加了PD-L1的MFI。
表5：用Jurkat-T细胞刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞(亲本的频率，％)。
表6：用Jurkat-T细胞刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞(Comp太平洋蓝(PacificBlue)-A PD-L1的平均荧光强度)。
该数据表明，在MDA-MB-231细胞的存在下Jurkat细胞的刺激不会改变PD-L1或CD44高/CD24低群体的频率，但可以改变细胞表面上表达的PD-L1的量。
实施例3-LSD1肽抑制剂对LSD1和PD-L1的表达和细胞核动力学的作用
使用共聚焦激光扫描显微术评价肽抑制剂L1、L2和L3(根据实施例1的方法合成的)对MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中LSD1s111p的表达和细胞核定位的作用(图4)。所有肽抑制剂相对于对照显著消除了刺激的和未刺激的MCF7细胞和MDA-MB-231细胞的LSD1s111p的细胞核表达。因此，明显地，LSD1肽抑制剂抑制LSD1s111p表达和细胞核定位。
在这之后，共聚焦激光扫描显微术确定肽抑制剂L1、L2和L3对MCF7细胞(图5)和 MDA-MB-231细胞(图6)中PD-L1的表达和细胞核定位的作用。所有三种肽都显著抑制了刺激 的MCF7细胞和MDA-MB-231细胞两者中PD-L1的细胞质/表面表达。刺激对照MCF7细胞后，存 在细胞核PD-L1的显著表达以及PD-L1的高水平的细胞核表达。这在MDA-MB-231细胞中也是 明显的。因此，在侵袭性乳腺癌细胞系中PD-L1明显具有较强的细胞核存在。当用L1、L2和L3 处理时，在刺激的间充质MCF7细胞和刺激的MDA-MB-231细胞两者中，细胞核PD-L1的表达被 显著消除。该作用在上皮未刺激的MCF7细胞中减弱。测量细胞核偏向的FN/C比率清晰地表 明，即使在L1、L2和L3处理的样品中存在细胞质PD-L1和细胞核PD-L1的显著消除，然而对于 MCF7细胞和MDA-MB-231细胞的PD-L1定位偏向明显强烈地偏向于细胞核。实施例4-体内小 鼠MDA-MB-231异种移植物和组合治疗对LSD1/PD-L1调节轴的作用
图7描绘了用白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)或多西他赛(10mg/kg)治疗小鼠MDA-MB-231异种移植物的作用，示出了在治疗期间肿瘤体积随时间的变化(图7A)。当使用共聚焦激光扫描显微术分析时，相对于用单独的媒介物治疗的异种移植物MDA-MB-231细胞，白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛治疗的细胞中存活的化疗耐受性MDA-MB-231细胞显示出LSD1s111p[图7B(i)]、EGFR[图7B(ii)]或SNAIL[图7B(iii)]的荧光信号显著增加。
图8描绘了用白蛋白结合型紫杉醇、苯乙肼或其组合治疗对异种移植物MDA-MB-231细胞的作用。评估了组合治疗对组中每一个的肿瘤尺寸和体积随时间的变化的作用。单独的白蛋白结合型紫杉醇治疗或白蛋白结合型紫杉醇与苯乙肼组合治疗导致肿瘤体积的显著减少。如指示的，连同CD44，SNAIL和波形蛋白示出了显著下降。
对用白蛋白结合型紫杉醇、苯乙肼或其组合治疗的MDA-MB-231细胞的LSD1s111p表达的显微术分析发现了相对于对照(组A)，白蛋白结合型紫杉醇治疗的样品(组B-白蛋白结合型紫杉醇60mg/kg)中的LSD1s111p表达显著增加，表明了MDA异种移植物细胞的耐受性群体(图9)。相反地，相对于对照，用苯乙肼(41mg/kg；组C)治疗引起抑制性作用。与组A(对照)和组B相比，在用白蛋白结合型紫杉醇和苯乙肼两者治疗的细胞(组D；白蛋白结合型紫杉醇60mg/kg，苯乙肼41mg/kg)中，LSD1s111p的表达被显著消除。对细胞角蛋白注意到了几乎相同的表达谱，其中通过组B的治疗细胞角蛋白的表达被增加，并且在用苯乙肼以及苯乙肼和白蛋白结合型紫杉醇治疗的细胞中细胞角蛋白的表达被消除。在白蛋白结合型紫杉醇治疗的细胞中，PD-L1在细胞核(TNFI)和细胞质(TCFI)二者中也显著上调，并且观察到更高的细胞核偏向(如通过Fn/c测量的)。用苯乙肼或白蛋白结合型紫杉醇和苯乙肼两者治疗显著消除了细胞核(TNFI)和细胞质(TCFI)两者的PD-L1表达，并且，虽然细胞核偏向(Fn/c)更高，但总PD-L1表达显著降低。
使用共聚焦激光扫描显微术评估了用白蛋白结合型紫杉醇、苯乙肼或两者的组合治疗对异种移植物MDA-MB-231细胞中表皮生长因子受体(EGFR)和细胞表面波形蛋白(CSV)表达的作用(图10)。相对于对照(组A)，在白蛋白结合型紫杉醇治疗的样品(组B；白蛋白结合型紫杉醇60mg/kg)中，EGFR细胞核表达显著增加，表明了MDA-MB-231异种移植细胞的耐受性群体。相反地，相对于对照，用苯乙肼治疗(41mg/kg；组C)引起抑制性作用。与组A(对照)和组B相比，在用白蛋白结合型紫杉醇和苯乙肼两者治疗的细胞(组D；白蛋白结合型紫杉醇60mg/kg，苯乙肼41mg/kg)中，EGFR的细胞核表达被显著消除。对CSV注意到了几乎相同的表达谱，其中在组B细胞中CSV的细胞质表达增加，而在用苯乙肼以及苯乙肼和白蛋白结合型紫杉醇两者治疗的细胞中CSV的细胞质表达被消除。
使用共聚焦激光扫描显微术评估了白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛治疗对异种移植物MDA-MB-231细胞中PD-L2表达和MET(一种间充质标志物)表达的作用(图11)。PD-L2示出了显著的细胞核信号和中等至较强的与MET的PCC(定位得分)，其在白蛋白结合型紫杉醇治疗的细胞中最高。在白蛋白结合型紫杉醇和多西他赛治疗的MDA-MB-231异种移植细胞中，MET细胞核表达也显著增加。
实施例5-从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的循环肿瘤细胞中的在丝氨 酸111处磷酸化的LSD1与PD-L1和PD-L2的相互作用
循环肿瘤细胞(CTC)从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离。分离的CTC的代表性共聚焦激光扫描显微术图像示出于图12中。检测到的标志包括牵涉具有间充质状态的侵袭性癌症的转录因子SNAIL、波形蛋白、细胞角蛋白、LSD1s111p、PD-L1和PD-L2。
在从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC中，当使用共聚焦激光扫描显微术分析时，PD-L1清晰地展示了明确和清晰的细胞核信号(图13)。也可检测到清晰的细胞质/细胞表面信号。此外，在所有患者样品中检测到显著水平的细胞核LSD1s111p。所有细胞的细胞表面波形蛋白(CSV)也呈阳性，CSV是间充质CTC的标志物。总之，患者样品全都显示出细胞核PD-L1信号，且Fn/c示出了对于细胞核的偏向或者在细胞核和细胞质之间信号强度同等。观察到了显著的LSD1s111p和PD-L1阳性PCC，这强烈表明这两种标志物在细胞核中相互作用。
在从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC中，当使用共聚焦激光扫描显微术分析时，PD-L2像PD-L1一样展示了清晰的细胞核信号和细胞质/细胞表面信号(图14)。在所有患者样品中检测到了显著水平的细胞核LSD1s111p，并且所有细胞对CTC标志物细胞角蛋白均呈阳性。观察到了显著的LSD1s111p和PD-L2阳性PCC，这较强地表明这两种标志物在细胞核中相互作用。总之，患者样品全都显示出细胞核PD-L2信号，且Fn/c示出了对于细胞核的偏向或者在细胞核和细胞质之间信号强度同等。
对从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC的细胞表面波形蛋白、SNAIL和PD-L1进行标记，并使用共聚焦激光扫描显微术进行分析。PD-L1清晰地展示出清晰的细胞核和细胞质/细胞表面信号(图15)。在患者1、患者2、患者3和患者4中观察到了增加的细胞核和细胞质信号强度的总体趋势，而患者5和患者6在第一次取样后显示出细胞核(TNFI)和细胞质(TCFI)荧光两者中的减少。总之，患者样品全都显示出细胞核PD-L1信号，且Fn/c示出了对于细胞核的偏向或者在细胞核和细胞质之间信号强度同等。此外，观察到了显著的SNAIL(LSD1调节的靶)和PD-L1阳性PCC，这强烈表明这两种标志物在细胞核中相互作用。
实施例6-LSD1抑制剂对从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC的作用
用LSD1催化抑制剂帕吉林(Parg)或苯乙肼处理从两个转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC(图16)。通过使用共聚焦激光扫描显微术分析LSD1s111p的表达、细胞角蛋白(CTC的标志物)的表达和PD-L2的表达评估LSD1抑制剂的作用。LSD1催化抑制剂帕吉林和苯乙肼都导致LSD1s111p、PD-L2和CTC标志物，细胞角蛋白的显著降低(knockdow)。这强烈证明，LSD1催化抑制剂可以成功地消除LSD1s111p，并且可以降低患者CTC中PD-L2表达和细胞角蛋白表达。
用LSD1催化抑制剂帕吉林(Parg)处理从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC(图17A)。通过使用共聚焦激光扫描显微术分析SNAIL(LSD1调节的靶)的表达、波形蛋白的表达和PD-L1的表达确定了该抑制剂的作用。除一名患者外，帕吉林导致PD-L1表达和SNAIL表达的显著降低。这强烈表明LSD1催化抑制剂可以消除患者CTC中PD-L1表达和SNAIL的表达。
用LSD1催化抑制剂苯乙肼处理从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC(图17B)。通过使用共聚焦激光扫描显微术分析SNAIL的表达和PD-L1的表达确定了该抑制剂的作用。再次地，与帕吉林一样，LSD1催化抑制剂苯乙肼导致除一名患者外的所有患者中PD-L1表达和SNAIL表达的显著下降。该数据强烈表明，LSD1的催化活性的抑制剂可以消除患者CTC中PD-L1表达和SNAIL表达。
实施例7-CDK和LSD1抑制剂对从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC的 作用
图18A和18B使用FACS示出了细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂帕博西尼和瑞博西尼以及LSD1催化功能的抑制剂苯乙肼及其组合对从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离的CTC的作用。
关于患者A，9.26％的CD45-细胞是CD45-CK+(细胞角蛋白阳性)CTC。然而，没有检测到CD45-EpCAM+细胞。所有测试的剂及其组合抑制了CD45-CK+CTC中PD-L1细胞核(nPD-L1)的表达和表面/细胞质(sPD-L1)的表达(图18A)。瑞博西尼以及苯乙肼和瑞博西尼的组合展示了对细胞核PD-L1的最大抑制。
转向患者B，从相当于2mL血液中提取的PBMC中检测到大约14000个CD45-EpCAM+CTC。22.8％的CD45-细胞是CD45-CK+CTC。再次地，所有测试的剂及其组合抑制了CD45-CK+CTC中PD-L1核表达(图18B)。然而，只有瑞博西尼抑制了PD-L1的细胞核表达和表面/细胞质表达两者。
实施例8-LSD1肽抑制剂对MDA-MB-231细胞中LSD1细胞核易位的作用
使用共聚焦激光扫描显微术评价了三种肽LSD1抑制剂L1、L2和L3(根据实施例1合成的)对MDA-MB-231细胞中LSD1的细胞核易位的作用。L1、L2和L3抑制了MDA-MB-231细胞中LSD1的细胞核易位(图19)。
实施例9-LSD1肽抑制剂对CD44高CD24低癌症干细胞形成的作用
使用FACS评价了三种肽LSD1抑制剂L1、L2和L3(根据实施例1合成的)对PMA刺激的MCF7细胞中CD44高CD24低癌症干细胞形成的作用。L1和L2抑制了MCF7细胞中癌症干细胞的形成(图20)。当L3以50μM的浓度施加时抑制了大约20％的癌症干细胞形成。
还测试了L1、L2和L3MDA-MB-231细胞中抑制癌症干细胞形成的能力。100μM L1、L2和L3引起了MDA-MB-231细胞中癌症干细胞形成的显著减少，而在50μM的浓度只有L1和L2抑制了至少30％的癌症干细胞形成(图21)。
实施例10-LSD1肽抑制剂对PD-L1、EGFR和MET表达的作用
使用共聚焦激光扫描显微术确定了肽抑制剂调节MDA-MB-231细胞中PD-L1表达、EGFR表达和MET表达的能力。与对照相比，L1、L2和L3(根据实施例1合成的)消除了PD-L1的细胞核表达(图22)。与对照细胞相比，用L1处理导致EGFR细胞核表达的显著消除(图12)。L2和L3处理也导致EGFR细胞核表达减少，虽然这比L1程度小(图23)。所有三种肽都引起MET核表达的显著消除，L2和L3具有最明显的作用(图24)。
实施例11-在乳腺癌细胞内LSD1和PKC-Θ的定位
使用共聚焦激光扫描显微术确定了用单独的媒介物或PMA处理60小时的MDA-MB-231细胞或MCF7细胞中PKC-θ和LSD1的存在(图25)。LSD1和PKC-θ两者存在于所有细胞的细胞核中，它们在刺激的MCF7细胞(MCF7ST)中、漂浮性MCF7细胞(MCF7 FLT)中和MDA-MB-231细胞中的细胞核表达与未刺激的MCF7细胞(MCF7NS)相比增加。在侵袭性乳腺癌细胞和间充质乳腺癌细胞的细胞核中都观察到了PKC-θ和LSD1之间强烈的共定位相关(PCC)。
实施例12-LSD1的磷酸化在细胞核定位中的作用
使用用单独的媒介物或PMA处理60小时并随后用PKC-θ抑制剂C27(PKC-θ特异性抑制剂)或BIM(泛PKC抑制剂)处理的MDA-MB-231细胞或MCF7细胞的共聚焦激光扫描显微术评估了LSD1的磷酸化在细胞核定位中的作用(图26)。确定了在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的表达。在侵袭性乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)和间充质乳腺癌细胞(MCF7细胞)中LSD1s111p的表达增加。此外，发现了磷酸化的蛋白质的荧光信号完全是细胞核信号。PKC-θ抑制剂C27或BIM显著消除了两个细胞系中的LSD1磷酸化。因此，该数据表明PKC，尤其是PKC-θ，参与LSD1在丝氨酸111处的磷酸化，并且此类磷酸化对于细胞核定位是重要的。
实施例13-化学治疗耐受性细胞中磷酸化的LSD1的表达
使用共聚焦激光扫描显微术对用单独的媒介物或化学治疗剂白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛治疗的异种移植的MDA-MB-231细胞评价化学治疗耐受性细胞中磷酸化的LSD1的表达(图27)。当与用单独的媒介物治疗的细胞相比时，用白蛋白结合型紫杉醇或多西他赛治疗的存活的化学治疗耐受性MDA-MB-231细胞显示出磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的细胞核荧光信号显著增加。
实施例14-LSD1催化抑制剂对LSD1细胞核定位的作用
使用共聚焦激光扫描显微术研究了LSD1 siRNA或LSD1催化抑制剂NCD36(盐酸2-[N-(4-苯基苯羰基)]氨基-6-(反式-2-苯基环丙烷-1-氨基)-N-(3-甲基苄基)己酰胺；参考EP 2927212 A1)或帕吉林(Parg)对用单独的媒介物处理或用PMA刺激60小时的MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中的LSD1和SNAIL的细胞核定位的作用。在刺激的MCF7细胞中，发现细胞核的SNAIL和LSD1增加(图28和29)。然而，用LSD1 siRNA、NCD36和帕吉林处理显著消除了SNAIL和LSD1的细胞核荧光信号，表明LSD1的催化活性还促进LSD1的细胞核定位并且对于SNAIL表达是关键的。
发现在MDA-MB-231细胞中，细胞核SNAIL和LSD1增加(图30)。然而，用LSD1 siRNA、NCD36和帕吉林处理显著消除了SNAIL和LSD1的细胞核荧光信号。再次地，这表明LSD1的催化活性促进LSD1和SNAIL的细胞核表达。
还评估了肽抑制剂L1、L2和L3(根据实施例1合成的)在MDA-MB-231细胞中的效力。与LSD1催化抑制剂相似，L1、L2和L3清晰地消除了MDA-MB-231细胞中LSD1的细胞核易位(图31)。
材料和方法
除非另外指示，所使用的所有材料和试剂都可以从诸如Sigma-Aldrich、SantaCruz Biotechnology、Abcam等商业来源容易地获得。
细胞培养
MCF7和MDA-MB-231细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得。细胞被培养于补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素-新霉素的DMEM(Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,CA)中。用1.32ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)或5ng/ml重组TGF-β1(R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激MCF7细胞60h。对于共培养测定，用Jurkat T细胞以定义的比率刺激MDA-MB-231细胞。
循环肿瘤细胞的免疫荧光分析
通过与2％Triton X-100孵育20分钟来透化细胞。用针对LSD1s111p(MerckABE1462)、EGFR(AB2430)、MET(ab51067)、PD-L1(sc-50298)的兔抗体、针对PD-L1(sc-19091)、(SC-14033)、(sc-19096)的山羊抗体、针对细胞角蛋白(Miltenyi 130-090-866)、CSV(Abnova H00007431-M08)、波形蛋白(SC-6260)的小鼠抗体探测细胞，随后用抗小鼠Alexa-Fluor 568二抗(A10037)、抗兔Alexa-Fluor 488二抗(A21206)或抗山羊Alexa-Fluor 633二抗(A21082)观察。用ProLong Diamond 试剂(Life Technologies)将盖玻片封固在显微镜玻璃载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微术定位抗体染色。在运行NIS-Elements AR 3.2软件的Nikon C1plus共聚焦系统上，使用Nikonx60油浸透镜获得单个的0.5μM截面。最终图像通过将同一截面的四幅连续图像取平均来获得。使用ImageJ软件(ImageJ,NIH,Bethesda,MD,USA)分析数字共聚焦图像，以使用如下等式确定细胞核/细胞质荧光比率(Fn/c)：Fn/c＝(Fn-Fb)/(Fc-Fb)，其中Fn是细胞核荧光，Fc是细胞质荧光，并且Fb是背景荧光或总细胞核荧光(TNFI)、总细胞质荧光(TCFI)或总细胞荧光。使用具有自动取阈值的ImageJ软件和特别为细胞核手动选择的感兴趣的区域(ROI)以计算每对抗体的Pearson相关系数(PCC)。PCC值范围在从:-1＝相反的共定位(inverse of co-localization)，0＝无共定位，+1＝完全的共定位。对于每个样品集，还在最少n＝10个细胞中测量荧光强度。使用Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism,GraphPad Software,San Diego,CA)确定数据集之间的显著差异。
MDA-MB-231小鼠异种移植物模型
五周龄雌性裸鼠从Animal Resources Centre(Perth)获得，并且在进行任何实验之前，允许它们在John Curtin School of Medical Research(JCSMR)的动物设施中适应一周。所有实验程序都被Australian National University Animal ExperimentalEthics Committee(ANU AEEC)批准。将MDA-MB-231人类乳腺癌细胞皮下注射到右乳腺中(25μL PBS中的2x106个细胞在与25μL BD Matrigel Matrix混合)。肿瘤使用外部卡尺测量，并使用改进的椭球公式1/2(a/b 2)计算，其中a＝最长直径，且b＝短直径。在治疗开始之前，肿瘤被允许生长到大约50mm3(大约15天)。所有治疗被腹膜内给予。
来自肿瘤单细胞悬浮液和流式细胞术染色
将肿瘤切下并收集于补充有2.5％FCS的冰冷(ice-cold)DMEM中。然后将肿瘤用手术刀片在培养皿中精细切碎，并在补充有4型胶原酶(Worthington-Biochem,USA)(1mg胶原酶/1g肿瘤)的DMEM 2.5％FCS中在37℃摇动培养1小时。将消化的肿瘤离心(spin)并重悬于DMEM 2.5％FCS中，然后通过0.2μm过滤器到50ml试管中。然后使用台盼蓝计数存活细胞。总数2×105个细胞被用于CD44-APC、CD24-PE和Hoescht染色。使用LSR II进行流式细胞术采集。使用FlowJo软件进行流式细胞术染色的分析。
从转移性乳腺癌患者液体活组织检查分离PBMC和CTC
将全血储存在EDTA试管中，用于循环肿瘤细胞鉴定。使用RosetteSepTM人CD45耗尽混合物(Depletion Cocktail)以通过耗尽CD45+细胞从全血中富集肿瘤细胞(CTC)。用识别血红细胞(RBC)上的CD45、CD66b和血型糖蛋白A的四聚体抗体复合物将不需要的细胞靶向耗尽。然后通过跨浮力密度培养基LymphoprepTM(目录#07801)离心去除不需要的细胞。然后从血浆和浮力密度培养基之间的界面将纯化的上皮肿瘤细胞提取为高度富集的群体，并收集到含20％FBS的PBS中。外周血单核细胞(PBMC)也被分离。用CD28和P/I刺激PBMC 4小时，随后在具有/没有感兴趣的抑制剂的情况下，与纯化的CD45耗尽的细胞共培养12小时。
循环肿瘤细胞(CD45-EpCAM+/CD45-EpCAM+CK+)和MB-MDA-231细胞的流式细胞术 分析(仪器：BD LSR II流式细胞仪)
将分离的PBMC和CTC用CD45-APC、泛细胞角蛋白(CK)-FITC、EpCAM-Percp-Cy5.5和PD-L1-BV421抗体染色。将共培养的MDA-MB-231细胞用CD44、CD24和PD-L1染色。使用BD LSRII流式细胞仪对单细胞悬浮液进行流式细胞分析。
MDA-MB-231细胞或MCF7细胞中响应于L1、L2和L3处理的PD-L1、LSD1、EGFR或MET表 达的免疫荧光分析
将MDA-MB-231细胞或MCF7细胞用L1、L2或L3中的一种和对照处理。然后将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后用针对LSD1的小鼠一抗或针对PD-L1、EGFR或MET的兔一抗探测细胞，随后用针对小鼠或兔免疫球蛋白的与Alexa-Fluor 488缀合的山羊二抗观察。使用共聚焦激光扫描显微术以用Fiji-imageJ测量LSD1的Fn/c(细胞核与细胞质荧光强度的比率)比率或测量PD-L1、EGFR或MET的总细胞核荧光。对值绘图，带有使用Mann-Whitney T检验指示的显著差异，每个样品计数至少20个细胞。示出了每种处理的代表性图像。
MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中响应于L1、L2和L3处理的CSC形成的流式细胞术分 析
将5x104个MCF7细胞或MDA-MB-231细胞用1mL完全DMEM接种到12孔板中过夜。然后用LSD1肽抑制剂L1、L2和L3(50μM和100μM测试浓度)处理MCF7细胞24小时，并用PMA刺激60小时。然后用L1、L2和L3(50μM和100μM测试浓度)处理MDA-MB-231细胞48小时。通过胰蛋白酶消化收集样品，随后用含有2％HI-FBS的DPBS洗涤。使用抗人类CD44-APC抗体、抗人类CD24-PE抗体、Hoechst和抗人类EpCAM抗体混合物进行FACS染色。从BD FACSLSR-II流式细胞仪收集数据。使用Treestar FlowJo用于数据分析。
单独的MDA-MB-231细胞或MCF7细胞和用PKC抑制剂处理的MDA-MB-231细胞或MCF7 细胞中PKC-θ表达和LSD1表达的免疫荧光分析
对用单独的媒介物处理60小时的MDA-MB-231细胞或用单独的媒介物或PMA处理60小时的MCF7细胞进行共聚焦激光扫描显微术。为了评估PKC抑制剂C27(化合物27；(R)-2-((S)-4-(3-氯-5-氟-6-(1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)吡啶-2-基)哌嗪-2-基)-3-甲基丁烷-2-醇；参见Jimenez等人(2013)J.Med.Chem.,56(5):1799-1810)或双吲哚基马来酰亚胺(BIM)的作用，然后用C27、BIM或媒介物处理细胞。将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后分别用针对PKC-θ的兔一抗和针对LSD1或在丝氨酸111处磷酸化的LSD1(LSD1s111p)的小鼠一抗，随后用与Alexa-Fluor 488或Alexa-Fluor 568缀合的相应二抗探测细胞。计算了未刺激的和刺激的MCF7和MDA-MB-231细胞的总细胞核荧光(TNFI)值。示出的数据代表平均值±SE。ImageJ的绘图谱特征被用于绘制荧光信号强度沿跨越细胞核的单线的图(n＝每个细胞核5条线，5个单独的细胞)。为线上的每一点绘制了所指示的抗体对的具有SE的平均荧光信号强度。对信号绘图以比较与相对抗体相比每种抗体的信号如何变化。为每个绘图谱确定了PCC，该绘图谱表明至少20个单独的细胞的两种荧光染料信号之间的关系的强度±SE。来自代表性图像的颜色对应于绘图谱。
MDA-MB-231细胞或MCF7细胞中响应于用LSD1抑制剂处理的LSD1表达和SNAIL表达 的免疫荧光分析
用单独的媒介物处理60小时的MDA-MB-231细胞或用单独的媒介物或PMA处理60小时的MCF7细胞，随后用测试抑制剂或单独的媒介物处理，对以上细胞进行了共聚焦激光扫描显微术。测试抑制剂包括LSD1 siRNA或LSD1催化抑制剂NCD36(盐酸2-[N-(4-苯基苯羰基)]氨基-6-(反式-2-苯基环丙烷-1-氨基)-N-(3-甲基苄基)己酰胺)或帕吉林(Parg)。将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后分别用针对LSD1的小鼠一抗和针对SNAIL的山羊一抗，随后分别用与Alexa-Fluor 488和Alex-Fluor 563缀合的相应二抗探测细胞。计算了MDA-MB-231细胞、未刺激的MCF7细胞和刺激的MCF7细胞的TNFI值。示出的数据代表至少20个单独的细胞的平均值±SE。
MDA-MB-231细胞响应于用LSD1肽抑制剂处理的LSD1表达的免疫荧光分析
对用LSD1肽抑制剂L1、L2或L3或单独的媒介物处理的MDA-MB-231细胞进行共聚焦激光扫描显微术。将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后用针对LSD1的小鼠一抗，随后用与Alexa-Fluor 488缀合的相应二抗探测细胞。使用共聚焦激光扫描显微术以用image-J确定LSD1的Fn/c比率。对值绘图，带有指示的显著差异。示出的数据代表至少20个单独的细胞的平均值±SE。
用化学治疗剂治疗的异种移植的MDA-MB-231细胞中磷酸化的LSD1表达的免疫荧 光分析
使用共聚焦激光扫描显微术测量用单独的媒介物或白蛋白结合型紫杉醇(60mg/kg)或多西他赛(10mg/kg)治疗的异种移植的MDA-MB-231细胞中LSD1s111p的细胞核强度。将细胞用3.7％甲醛固定并用2％Triton-X-100透化，然后用针对LSD1s111p的小鼠一抗，随后用与Alexa-Fluor 488缀合的相应二抗探测细胞。计算了异种移植的MDA-MB-231细胞的总细胞核荧光(TNFI)值。示出的数据代表至少20个单独的细胞的平均值±SE。
本文引用的每个专利、专利申请和公开物的公开内容通过引用以其整体特此并入本文。
遍布本说明书，目的是描述本发明的优选的实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，鉴于本公开内容，可以在所示例的特定实施方案中进行不脱离本发明的范围的各种修改和改变。所有此类修改和改变被意图包括于所附权利要求书的范围内。

Claims (93)

1.赖氨酸特异性组蛋白脱甲基化酶-1(LSD1)抑制剂用于抑制受试者中的程序性死亡配体1(PD-L1)活性和/或程序性死亡配体2(PD-L2)活性的用途。
2.一种抑制受试者中的PD-L1活性和/或PD-L2活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。
3.LSD1抑制剂用于增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答的用途。
4.一种增强受试者中经由免疫调节剂的对靶抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法或用途，其中所述免疫调节剂选自对应于所述靶抗原的至少一部分的抗原、与所述靶抗原免疫相互作用的抗原结合分子和调节对所述靶抗原的免疫应答的免疫调节细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者具有升高的PD-L1活性和/或PD-L2活性。
7.根据权利要求6所述的方法或用途，其中所述受试者患有转移性癌症或感染。
8.根据权利要求7所述的方法或用途，其中所述转移性癌症是转移性乳腺癌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是LSD1的细胞核易位的抑制剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是LSD1的催化活性的抑制剂。
11.根据权利要求9所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
12.根据权利要求11所述的方法或用途，其中所述分离或纯化的蛋白质分子是分离或纯化的由式I表示的蛋白质分子：
Z1RRTX1RRKRAKVZ2 (I)
其中：
“Z1”和“Z2”独立地不存在或独立地选自包含从约1个至约50个氨基酸残基(和其间的所有整数个残基)的蛋白质部分和保护部分中的至少一种；且
“X1”选自包括S、T、A、G及其修饰形式的小氨基酸残基。
13.根据权利要求12所述的方法或用途，其中“X1”选自S和A。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法或用途，其中“Z1”是由式II表示的蛋白质分子：
X2X3X4 (II)
其中：
“X2”不存在或为保护部分；
“X3”不存在或选自任何氨基酸残基；且
“X4”选自任何氨基酸残基。
15.根据权利要求14所述的方法或用途，其中“X3”选自包括R、K及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法或用途，其中“X4”选自包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法或用途，其中“Z2”不存在。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法或用途，其中分离或纯化的式I的蛋白质分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成或主要由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成：
RRTSRRKRAKV[SEQ ID NO:1]；
RRTARRKRAKV[SEQ ID NO:2]；
或
RWRRTARRKRAKV[SEQ ID NO:3]。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法或用途，其中所述式I的蛋白质分子还包含至少一个膜渗透部分。
20.根据权利要求19所述的方法或用途，其中所述膜渗透部分是脂质部分。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法或用途，其中所述膜渗透部分是肉豆蔻酰基基团。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法或用途，其中所述膜渗透部分与所述式I的蛋白质分子的N-末端或C-末端氨基酸残基缀合。
23.一种抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性的方法，所述方法包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。
24.LSD1抑制剂用于抑制PD-L1活性和/或PD-L2活性的用途，包括将PD-L1和/或PD-L2过表达细胞与LSD1抑制剂接触。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法或用途，其中所述PD-L1和/或PD-L2过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
26.根据权利要求25所述的方法或用途，其中所述PD-L1和/或PD-L2过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是LSD1的细胞核易位的抑制剂。
28.根据权利要求23-26中任一项所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是LSD1的催化活性的抑制剂。
29.根据权利要求27所述的方法或用途，其中所述LSD1抑制剂是分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
30.根据权利要求29所述的方法或用途，其中所述分离或纯化的蛋白质分子是如权利要求12-22的任一项中定义的分离或纯化的由式I表示的蛋白质分子。
31.一种抑制蛋白激酶C(PKC)的磷酸化活性的方法，所述方法包括将PKC过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
32.一种改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)、或(v)间充质细胞向上皮细胞转化(MET)中的至少一种的方法，所述方法包括将所述PKC过表达细胞与形成调节、增殖调节、维持调节、EMT调节或MET调节的量的分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
33.一种治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述癌症包括至少一种PKC过表达细胞，所述方法包括向所述受试者施用分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述PKC是PKC-θ。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述PKC过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述PKC过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
37.一种抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的方法，所述方法包括将所述LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述PKC是PKC-θ。
39.一种抑制LSD1活性的方法，所述方法包括将LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
40.一种抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的方法，所述方法包括将所述LSD1过表达细胞与分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
41.一种改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的方法，所述方法包括将所述LSD1过表达细胞与形成调节、增殖调节、维持调节、EMT调节或MET调节的量的分离或纯化的蛋白质分子接触，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
42.一种治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述癌症包括至少一种LSD1过表达细胞，所述方法包括向所述受试者施用分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
45.根据权利要求31-44中任一项所述的方法，其中所述分离或纯化的蛋白质分子是如权利要求12-22的任一项中定义的分离或纯化的由式I表示的蛋白质分子。
46.分离或纯化的蛋白质分子用于抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
47.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
48.分离或纯化的蛋白质分子用于改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
49.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
50.分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中所述癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
51.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中所述癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
52.根据权利要求46-51中任一项所述的用途，其中所述PKC是PKC-θ。
53.根据权利要求46-52中任一项所述的用途，其中所述PKC过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
54.根据权利要求53所述的用途，其中所述PKC过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
55.分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
56.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的用途，其中所述PKC是PKC-θ。
58.分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1的活性的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
59.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1的活性的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
60.分离或纯化的蛋白质分子用于抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
61.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
62.分离或纯化的蛋白质分子用于改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
63.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成。
64.分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中所述癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
65.分离或纯化的蛋白质分子在制备用于治疗或预防受试者中的癌症的药物中的用途，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，其中所述癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
66.根据权利要求55-65中任一项所述的用途，其中所述LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述LSD1过表达细胞是癌症干细胞肿瘤细胞。
68.根据权利要求46-67中任一项所述的用途，其中所述分离或纯化的蛋白质分子是如权利要求12-22的任一项中定义的分离或纯化的由式I表示的蛋白质分子。
69.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制PKC过表达细胞中PKC的磷酸化活性中使用。
70.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在改变PKC过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种中使用。
71.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症中使用，其中所述癌症包含至少一种PKC过表达细胞。
72.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1过表达细胞中PKC磷酸化LSD1中使用。
73.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1的活性中使用。
74.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在抑制LSD1过表达细胞中LSD1的细胞核易位中使用。
75.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在改变LSD1过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT或(v)MET中的至少一种中使用。
76.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子包含对应于LSD1的残基108至118的序列、由对应于LSD1的残基108至118的序列组成或主要由对应于LSD1的残基108至118的序列组成，所述分离或纯化的蛋白质分子用于治疗或预防受试者中的癌症中使用，其中所述癌症包含至少一种LSD1过表达细胞。
77.根据权利要求69-76中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述分离或纯化的蛋白质分子是如权利要求12-22的任一项中定义的分离或纯化的由式I表示的蛋白质分子。
78.一种分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子由式I表示：
Z1RRTX1RRKRAKVZ2(I)
其中：
“Z1”和“Z2”独立地不存在或独立地选自包含从约1个至约50个氨基酸残基(和其间的全部整数个残基)的蛋白质部分和保护部分中的至少一种；且
“X1”选自包括S、T、A、G及其修饰形式的小氨基酸残基；
其中所述蛋白质分子不同于由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白质分子：
EGRRTSRRKRAKVE[SEQ ID NO:4]。
79.根据权利要求78所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中“X1”选自S和A。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中“Z1”是由式II表示的蛋白质分子：
X2X3X4(II)
其中：
“X2”不存在或为保护部分；
“X3”不存在或选自任何氨基酸残基；且
“X4”选自任何氨基酸残基。
81.根据权利要求80所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中“X3”选自包括R、K及其修饰形式的碱性氨基酸残基。
82.根据权利要求80或权利要求81所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中“X4”选自包括F、Y、W及其修饰形式的芳香族氨基酸残基。
83.根据权利要求78-82中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中“Z2”不存在。
84.根据权利要求78-83中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述分离或纯化的式I的蛋白质分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列、由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成或主要由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成：
RRTSRRKRAKV[SEQ ID NO:1]；
RRTARRKRAKV[SEQ ID NO:2]；
或
RWRRTARRKRAKV[SEQ ID NO:3]。
85.根据权利要求78-84中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述式I的蛋白质分子还包含至少一个膜渗透部分。
86.根据权利要求85所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述膜渗透部分是脂质部分。
87.根据权利要求85或权利要求86所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述膜渗透部分是肉豆蔻酰基基团。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，其中所述膜渗透部分与所述式I的蛋白质分子的N-末端或C-末端氨基酸残基缀合。
89.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求78-88中任一项所述的蛋白质分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
90.根据权利要求78-88中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子用于治疗的用途。
91.根据权利要求78-88中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子在制备用于治疗的药物中的用途。
92.根据权利要求78-88中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，所述分离或纯化的蛋白质分子用于在治疗中使用。
93.根据权利要求78-88中任一项所述的分离或纯化的蛋白质分子，用于作为药物使用。
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