CN110487780A - 一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法 - Google Patents
一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法。步骤包括:将Ru(bpy)3 2+@Tb‑GMP ICPn纳米复合材料修饰的电极作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,确定HA的浓度范围,浓度越高,鱼产品越不新鲜。本发明合成的纳米复合材料低毒无污染、成本低、简单易得,用于检测HA,具有灵敏度高,抗干扰能力强,方法简便易操作以及可实现快速检测等优点,可以准确快速的实现鱼肉中组胺量的检测,并以此作为鱼鲜度的评价指标。
Description
技术领域
本发明涉及食品质量分析领域,具体涉及一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法。
背景技术
鱼肉是人们喜爱的一种食品,其种类繁多又营养丰富,但鱼肉不宜保存,变腐后的肉质化学成分改变,极易产生组胺。组胺(HA),又叫做:组胺双盐酸盐,组织胺等,分子式为:C5H9N3。组胺是一种自体活性物质,同时也是众多生物胺中的一种,在生命体中可以通过组氨酸脱羧基后形成。组胺的产生同鱼肉的腐败过程紧密相关。组胺为一种生物胺,有毒性,食入大量的HA会引起毛细血管扩张,支气管收缩进而导致一系列疾病的发生,如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应。
HA的检测方法很多,如:荧光光度法,酶联免疫法,薄层色谱,高效液相色谱,高效毛细管泳等。但这些传统的检测方法要求对样品进行严格的前处理,并且前处理的效果直接关系到检测的结果,同时检测仪器一般价格比较昂贵,需要具有较高专业水平的操作人员。所以需要研制一种便捷、快速、灵敏度高、费用低的方法,应用于组胺的检测。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明提供一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法。该方法具有灵敏度高,抗干扰能力强,方法简便易操作以及可实现快速检测等优点。
一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法,步骤包括:
(1)无定型聚合纳米材料包裹的吡啶钌纳米复合材料Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn的制备:移液枪移取0.5mL-1ml的10mM Tb3+溶液于离心管中,依次加入0.5 mL-1ml 的0.1 MTris-HCl(pH 7.40)溶液、10mM-20mM的鸟苷单磷酸二钠盐GMP、吡啶钌粉末,然后水洗离心2-5次,得到所述Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料;
(2)将步骤(1)得到的所述Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料,滴涂到打磨好的玻碳电极GCE上,在空气中自然晾干,得到纳米复合材料修饰的电极。
(3)将鱼肉经破碎、调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容后,以8000转/min离心5 min,滤膜过滤后获得上清液;
(4)将步骤(1)得到的所述纳米复合材料修饰的电极作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,将所述三电极体系与电致化学发光工作站相连,以含有不同浓度的组胺HA溶液为共反应剂,构成用于组胺检测的电致化学发光传感器;在光电倍增管PMT设置为600的时候测定其电致化学发光强度,并将发光强度值代入线性关系式,确定HA的浓度范围;
(5)根据HA的浓度大小判断鱼的新鲜度:浓度越高,鱼产品越不新鲜。
进一步的,步骤(1)中所述Tb3+和 GMP 的摩尔质量比为(1-2):1000。
进一步的,步骤(1)中所述加入吡啶钌的物质的量浓度为0.0286μM-0.286mM。
进一步的,所述的鱼为海水鱼或淡水鱼。
进一步的,所述的线性关系式的获得为:分别取8 mL的0-200μM不同浓度的组胺Tris -HCl缓冲溶液分别加入到发光池中,设置光电倍增管为600,扫速为0.1V/s,电位范围为0-+1.15V,测得电致化学发光强度,并将得到的实验数据整理作图获得线性方程,线性关系为 I = 1067.6 lgc + 7478.4;I为的电致化学发光强度;线性相关系数R2=0.9804。
进一步的,所述0-200μM不同浓度HA水溶液浓度分别为0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10,50, 100, 150, 200 μM。
进一步的,所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.1M,pH=7.4。
有益效果:
本发明提供的组胺电致化学发光检测法不需复杂的前处理,检测范围宽,灵敏度高,选择性强,实验条件要求较低,在正常环境下就可以实现组胺的快速、准确检测。
附图说明
图1为本发明提供的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料制备以及电致化学发光法检测组胺(HA)的机理图。
图2为本发明实施例合成的(A)Tb-GMP ICPn和(B)Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的扫描电镜图(SEM)以及(C)Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的X射线能谱图。
图3为本发明实施例提供的Tb-GMP ICPn和Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的电致化学发光对比图。内图为相对应的循环伏安图。
图4为本发明实施例提供的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的电致化学发光发光稳定性图。
图5(A)为本发明实施例提供的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极对应不同浓度HA含量的电致化学发光发光强度图。(B)为不同浓度HA含量检测对应的标准曲线。
图6 为本发明实施例提供的检测HA的选择性对比图。
图7为本发明实施例中检测新鲜程度不同的鱼产品中HA含量的电致化学发光强度对应图。
具体实施方式
本发明一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法,是基于无定型聚合纳米材料包裹的吡啶钌(Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn)制备而成。以Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,构成三电极系统。以组胺(HA)为共反应剂通过测定其电致化学发光强度,并将强度值代入线性方程,确定HA的浓度范围。
下面通过具体实施例进行进一步阐述。
实施例1:
一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法,步骤包括:
(1)样品预处理:将新鲜的鱼产品(鲅鱼和草鱼)清洗干净,取肉质各2 g于50 mL离心管中,加入预冷的20 mL高氯酸溶液(10%),用玻璃棒将大块的肉质预先捣散,然后在冰浴条件下放入超声细胞破碎仪中裂解提取5 min,然后迅速以8000转/min离心5 min;得到的上清液用10 M KOH溶液调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容至50 mL,接着以8000转/min离心5min,并用0.45 μm的滤膜过滤此处获得的上清液,得到经预处理后的样品,备用。
(2)用Tris-HCl(pH 7.4)配置不同浓度的HA溶液,取8ml配置好的溶液放入电致化学发光池中,利用电致化学发光工作站(MPI-E)采用三电极系统测定其电致化学发光强度。Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为辅助电极。
(3)通过测定其电致化学发光强度,并将强度值代入线性方程,确定HA检测的浓度范围。其中,线性方程的获得是,取8 mL含有不同浓度的(0-200μM)HA溶液分别加入发光池中,室温下,采用MPI-E电致化学发光工作站测定其发光强度,光电倍增管设置为600V,扫描电位为0-+1.15V,扫描速度为100mV/s并将得到的实验数据整理作图获得线性方程。
图6为本实施例1中所述的选择性实验,在浓度为100μMHA溶液中分别加入其浓度200倍的金属离子(K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Zn2+)或其浓度100倍的生物分子(半胱氨酸(Cys),谷胱甘肽(GSH),组氨酸(His),均苯三甲酸(BTC),牛血清蛋白(BSA),酪氨酸(Tyr),精氨酸(Arg),考察其发光强度的改变,发现这些物质的加入没有明显改变HA溶液的电致化学发光强度,不会干扰HA的测定。
图5(A)为本发明实施例提供的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极对应不同浓度HA含量(加入 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200 μM的HA)的电致化学发光发光强度图。(B)为在0.1-200 μM不同浓度HA含量检测对应的标准曲线。从图中可见该纳米复合材料电极的电致化学发光强度会随着HA浓度的增加而增加,和HA的浓度的对数成良好的线性相关,线性关系为 I = 1067.6 lgc + 7478.4,I为的电致化学发光强度;线性相关系数R2=0.9804。
越新鲜的组胺含量就越少,组胺的含量与鱼的新鲜程度成反比。如图所示,随着鱼肉放置时间越长,鱼体内检测出的HA含量越高,表明鱼的鲜度越差。
作为本发明的一个实施例,上述Tris-HCl缓冲液的配制,步骤包括:
①准确称取1.2114 g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)于盛有50 mL超纯水的烧杯中,超声溶解,备用;
②取1 mL的HCl(12 mol/L)溶液稀释至120 mL,即得浓度为0.1 mol/L的HCl溶液;
③将上述50 mL的Tris溶液与42 mL的HCl(0.1 mol/L)溶液混合,再加入8 mL的超纯水,调节pH至7.4即得Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的一个实施例,无定型Tb-GMP ICPn纳米复合材料的制备,步骤包括:移液枪移取0.5mL-1ml的10mM Tb3+溶液于离心管中,依次加入0.5 mL-1ml 的0.1 MTris-HCl(pH 7.40)溶液、10mM-20mM的鸟苷单磷酸二钠盐GMP然后水洗离心2-5次,得到所述Tb-GMP ICPn纳米复合材料;
作为本发明的一个实施例,上述Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的制备,步骤包括:
①Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的制备:移液枪移取0.5mL-1ml的10mM Tb3+溶液于离心管中,依次加入0.5 mL-1ml 0.1 M的Tris-HCl(pH 7.40)溶液、10mM-20mM鸟苷单磷酸二钠盐(GMP)、吡啶钌材料粉末,然后水洗离心2-5次。
②玻碳电极的预处理:将玻碳电极(以下简称GCE)分别用粒径为0.5 μm和0.03 μmAl2O3粉末在鹿皮上打磨抛光。将抛光完成的GCE用超纯水超声清洗三次,每次5 min。超声清洗完成后,在含有1 mmol/L K3[Fe(CN)6] 的0.1 mol/L KCl 溶液中进行循环伏安扫描,扫描电位设置为-0.2 - 0.6 V,当氧化峰电势和还原峰电势差值在80 mV内时,电极打磨合格。
③Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的制备:取上述合成的pH=7.4的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料10μM滴涂到直径3mm的处理干净玻碳电极表面,自然晾干,获得(Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn/GCE)纳米复合材料修饰电极,放置备用。
图2为本发明实施例合成的(A)Tb-GMP ICPn和(B)Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的扫描电镜图(SEM)以及(C)Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的X射线能谱图(EDX)。通过上图可知,掺杂Ru(bpy)3 2+后没有改变其多孔结构,其无定型材料的多孔结构也有利于Ru(bpy)3 2+的固定。从EDX图中可以看出Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料含有Tb、Ru、P这些元素,表明成功的合成了Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料。
图3为本发明实施例提供的Tb-GMP ICPn和Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的电致化学发光对比图。内图为相对应的循环伏安图。从图中可见,Tb-GMP ICPn本身不具有发光性能,负载了吡啶钌后产生了明显的电致化学发光。
图4为本发明实施例提供的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极的电致化学发光发光稳定性图。从图中可见制备的复合材料修饰电极能够产生强而稳定的电致化学发光。
如图1所示,本发明利用HA可以作为吡啶钌的电致化学发光的共反应剂的原理,在正电位下吡啶钌失去电子生成的Ru(bpy)3 3+可以和HA失去电子生成的 HA•+ 作用,生成吡啶钌自由基 Ru(bpy)3 2+*,该自由基不稳定,会有激发态返回基态产生电致化学发光。发光强度和HA的浓度呈正比。可以用本方法来检测HA,该方法具有灵敏度高(检出限为0.1 μM),选择性好,实验简便易操作,变化直观,可实现待测样品的快速灵敏检测等。
本发明所述的无定型聚合纳米材料可以将吡啶钌试剂包裹,然后采用滴涂的方式将制得的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰到电极表面,使电致化学发光反应局限在电极表面进行,实现了对电致化学发光反应的空间控制。由于 Ru(bpy)3 2+在电致化学发光反应过程中能循环再生,所以通过固定试剂可制成可再生的电致化学发光传感器,这样可以节省试剂,简化流路,使分析仪器微型化。
鱼类是食物中组胺的最主要的来源,HA属于一种生物胺。鱼肉中的HA是由细菌分泌的组氨酸脱羧酶将鱼体内的游离组氨酸降解产生。鱼类与畜禽肉相比更易腐败变质,鱼类一旦死亡,其组织中含有的酶就会使鱼体发生自溶作用,细菌迅速繁殖。其中某些细菌分泌的脱羧酶可使氨基酸脱羧基产生生物胺类物质,HA便是这些生物胺里毒性较强的一种。HA含量和鱼的新鲜程度有关,鱼体不新鲜或腐败时,鱼体污染的细菌增多,产生HA往往也较多。表1为本发明所述的Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料修饰电极对室温下放置不同时间鱼体内的HA含量检测值。结果表明,随着放置时间的延长,鱼肉中HA含量均上升。本申请Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料的电致化学发光传感可用于检测鱼肉中HA的含量,可作为鱼肉品质鲜度评价的新方法。本发明基于HA可作为Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn复合材料的电致化学发光的共反应剂,产生强而稳定的电致化学发光,发光强度和HA的浓度正相关。本检测方法具有灵敏度高,抗干扰能力强,易于操作,可实现待测样品的快速检测等优点。
表1 不同时间鱼产品体内的HA含量检测值
图7为本发明实施例中检测新鲜程度不同的鱼产品中HA含量的电致化学发光强度对应图。从图中可见随着鱼放置时间的增加,鲳鱼和草鱼体内的HA的含量都增加,且海水鱼体内HA的含量高于淡水鱼。本发明侧重于在食品中的应用,为食品质量分析提供一种新的评价方法,尤其是在鱼类鲜度的评估中。鱼肉中的蛋白质极易分解,分解产物中重要的且毒性较大者就是组胺,所以经常用组胺的含量来衡量鱼的新鲜程度。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此,无论从哪一点来看,本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明,权利要求书指出了本发明的范围,而上述的说明并未指出本发明的范围,因此,在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (7)
1.一种组胺电致化学发光法检测鱼新鲜度的方法,其特征在于,步骤包括:
(1)无定型聚合纳米材料包裹的吡啶钌纳米复合材料Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn的制备:移液枪移取0.5mL-1ml的10mM Tb3+溶液于离心管中,依次加入0.5 mL-1ml 的0.1 MTris-HCl(pH 7.40)溶液、10mM-20mM的鸟苷单磷酸二钠盐GMP、吡啶钌粉末,然后水洗离心2-5次,得到所述Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料;
(2)将步骤(1)得到的所述Ru(bpy)3 2+@Tb-GMP ICPn纳米复合材料,滴涂到打磨好的玻碳电极GCE上,在空气中自然晾干,得到纳米复合材料修饰的电极;
(3)将鱼肉经破碎、调pH至7.4,Tris-HCl缓冲液定容后,以8000转/min离心5 min,滤膜过滤后获得上清液;
(4)将步骤(2)得到的所述纳米复合材料修饰的电极作为工作电极,Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝电极作为辅助电极,构成三电极体系,将所述三电极体系与电致化学发光工作站相连,以含有不同浓度的组胺HA溶液为共反应剂,构成用于组胺检测的电致化学发光传感器;在光电倍增管PMT设置为600的时候测定其电致化学发光强度,并将发光强度值代入线性关系式,确定HA的浓度范围;
(5)根据HA的浓度大小判断鱼的新鲜度:浓度越高,水产品越不新鲜。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述Tb3+和 GMP 的摩尔质量比为(1-2):1000。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述加入吡啶钌的物质的量浓度为0.0286μM-0.286mM。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的鱼为海水鱼或淡水鱼。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的线性关系式的获得为:分别取8 mL的0-200μM不同浓度的组胺Tris -HCl缓冲溶液分别加入到发光池中,设置光电倍增管为600,扫速为0.1V/s,电位范围为0-+1.15V,测得电致化学发光强度,并将得到的实验数据整理作图获得线性方程,线性关系为 I = 1067.6 lgc + 7478.4;I为的电致化学发光强度;线性相关系数R2=0.9804。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述0-200μM不同浓度HA水溶液浓度分别为0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200 μM。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.1M,pH=7.4。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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