CN113092453A - 敌百虫电致化学发光分子印迹传感器及制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于检测技术领域，提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器及制备方法、应用。敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：制备分子印迹传感器：取邻苯二胺溶液、敌百虫溶液，配成聚膜底液；将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，得到电聚合物；电聚合物用水淋洗，以NaOH与无水乙醇的混合液作为洗脱液，洗脱3～10分钟，用水淋洗电极，即得到分子印迹传感器；制备化学发光底液：以鲁米诺溶液、PBS溶液和3％过氧化氢溶液混匀配制为发光底液。本发明利用敌百虫可对鲁米诺‑H2O2发光体系增强发光效应，将分子印迹技术与电致化学发光结合，得到一种高灵敏、高选择性的检测敌百虫的传感器。

Description

敌百虫电致化学发光分子印迹传感器及制备方法、应用
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器及制备方法、应用。
背景技术
O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)膦酸酯又名敌百虫，是第二大常用有机磷农药磷酸酯，兼具胃毒作用、触杀作用与渗透作用的广谱杀虫剂，常被大量广泛的使用在农田经济作物的害虫防治。由于敌百虫的广泛运用使得土地与水体受到敌百虫的污染，不仅如此敌百虫对人体同样有一定量的伤害。敌百虫能抑制胆碱酯酶，造成神经生理紊乱，短期内接触大量敌百虫可导致头痛、呕吐、腹泻、肌束震颤，严重者出现肺水肿、脑水肿、呼吸中枢麻痹，甚至猝死。国家允许食品中敌百虫最大残留限量为0.20mg/kg，其每日允许摄入量为0.02mg/(kg·bw)。因此对敌百虫进行快速高灵敏的检测变得越来越重要。
目前最常用检测敌百虫的分析方法主要有：气相色谱法、流动注射化学发光法、液质联用法等。以上方法虽有各自长处，但仍有很大的不足之处，液质联用法虽检测精密度较高，但仪器较为昂贵，检测成本非常高昂；气相色谱法需要多次萃取与转换，方法操作极为复杂，且引入较大误差。流动注射化学发光法其检测范围较低，检出限较高，选择性较差。因此有必要发展一种无需复杂样品前处理、制备简单、操作简便、灵敏度高的新方法。
本申请将电化学发光与分子印迹传感器相结合，可高灵敏、高选择性对目标物进行测定。
其中，分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology,MIT)是以一种待测物分子为模板分子，通过聚合对待测物分子有专一选择性的聚合物分子来识别鉴定目标分子的技术。分子印迹传感器是通过以不同比例的模板分子、交联剂、功能单体作为聚膜液，通过电聚合、电沉积或自组装的方式在电极表面修饰一层具有三维立体结构的分子印迹聚合膜。通过使用洗脱剂将分子印迹聚合物中模板分子洗脱，形成立体构型的目标分子孔穴，并利用其特异选择性识别目标分子。
电致化学发光技术是一种将电化学与化学发光相互结合的检测技术，其不仅仅拥有化学发光的灵敏度高，同时集成了电化学分析技术中重现性好、可控性强，又兼具二者相结合而产生的检测区间较广、检测限较低、实验所需成本低廉以及设备结构简洁等其他新优势。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器及制备方法、应用，旨在解决背景技术中指出的现有技术存在的问题。
本发明实施例是这样实现的，敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
制备分子印迹传感器：
将金电极打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入水中清洗表面；
取邻苯二胺溶液、敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，得到电聚合物；
电聚合物用水淋洗，以NaOH与无水乙醇的混合液作为洗脱液，洗脱3～10分钟，用水淋洗电极以彻底清除残留的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
制备化学发光底液：
以鲁米诺溶液、PBS溶液和3％过氧化氢溶液混匀配制为发光底液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，将金电极使用α-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入水中超声振荡3～5分钟清洗表面。
作为本发明实施例的另一种优选方案，取3～10mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液、1～4.0mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，电聚合过程中：电位范围0.8～0V，扫描速率0.05V/s，扫描段数15～30段。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述的洗脱液浓度为0.10～0.30mol/L，其中，NaOH与无水乙醇的体积比为4:5，洗脱液时间为5分钟。
作为本发明实施例的另一种优选方案，化学发光底液中，采用体积比为20：3的1.0×10-4mol/L鲁米诺溶液与3％过氧化氢溶液。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述方法制备得到的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器在检测敌百虫中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，测量发光强度；
待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
作为本发明实施例的另一种优选方案，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间3～5秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍。
本发明利用敌百虫可对鲁米诺-H2O2发光体系增强发光效应，将分子印迹技术与电致化学发光结合，得到一种高灵敏、高选择性的检测敌百虫的传感器；
通过将敌百虫、邻苯二胺(o-PD)电聚合在金电极表面，以此在金电极表面修饰一层敌百虫-邻苯二胺分子印迹聚合物；将电极表面修饰的分子印迹高聚物中敌百虫分子经洗脱剂去除后，形成具有特异识别能力的印迹孔穴，可利用其形成的印迹孔穴吸附不同浓度的敌百虫分子，引起电化学发光强度的变化，从而检测目标物，可建立一种可分析超痕量浓度敌百虫的方法；由于敌百虫可以增强鲁米诺-H2O2体系发光强度，因而可以有效提升传感器检测敌百虫的灵敏度；
通过实验验证得知，以0.125mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液，洗脱时间5min，重吸附时间10min，在2.0×10-8～1.0×10-12mol/L浓度范围内敌百虫浓度与电化学发光强度呈正相关性，敌百虫检出限为3.9×10-13mol/L，将此传感器应用于蔬菜农药残留检测，进行加标回收，回收率为95.71％～101.43％。
附图说明
图1为敌百虫对鲁米诺增敏效应，其中：a.c敌百虫＝0；b.c敌百虫＝2.0×10-5mol/L；c.c敌百虫＝4.0×10-5mol/L；d.c敌百虫＝6.0×10-5mol/L；
图2为差分脉冲伏安曲线，其中：a.裸电极，b.聚膜后，c.洗脱后，d.重吸附1.0×10-10mol/L，e.重吸附1.0×10-6mol/L；
图3为不同情况下的分子印迹传感器交流阻抗。其中：a.裸电极，b.聚膜后，c.洗脱后，d.重吸附1.0×10-10mol/L，e.重吸附1.0×10-6mol/L；
图4为电聚合邻苯二胺实验结果；
图5为过氧化氢含量对鲁米诺化学发光的影响结果；
图6为洗脱时间影响；其中：a-f.洗脱时间1、2、3、4、5、6分钟；
图7为重吸附时间的影响；其中：a-f.洗脱时间3、6、9、12、15、18分钟；
图8为工作曲线，其中：a-n:(2.0×10-8,1.0×10-8,7.0×10-9,2.0×10-9,1.0×10-9,7.0×10-10,2.0×10-10,1.0×10-10,7.0×10-11,2.0×10-11,1.0×10-11,7.0×10-12,2.0×10-12,1.0×10-12mol/L)；
图9为选择性影响实验结果；
图10为传感器稳定性研究实验结果；
图11为MIP传感器发光强度实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
该实施例提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备分子印迹传感器：
将金电极使用0.3μmα-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入二次水中超声振荡3分钟清洗表面；
取3mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液，1mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，电位范围0.8～0V，扫描速率(can rates)0.05V/s，扫描段数(sweep segments)15～30段，得到电聚合物；
电聚合物用二次水淋洗并静置1分钟，以0.10mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液洗脱3分钟，而后用二次水淋洗电极1分钟以彻底清除残留在传感器表面上的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
(2)制备化学发光底液：
以200μL 1.0×10-3mol/L鲁米诺溶液，6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS溶液，300μL3％过氧化氢，混匀配制为发光底液。
使用时，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间3秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍，测量发光强度；待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
实施例2
该实施例提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备分子印迹传感器：
将金电极使用0.1μmα-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入二次水中超声振荡5分钟清洗表面；
取10mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液，4.0mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，电位范围0.8～0V，扫描速率(can rates)0.05V/s，扫描段数(sweep segments)15～30段，得到电聚合物；
电聚合物用二次水淋洗并静置5分钟，以0.30mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液洗脱10分钟，而后用二次水淋洗电极3分钟以彻底清除残留在传感器表面上的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
(2)制备化学发光底液：
以200μL 1.0×10-3mol/L鲁米诺溶液，6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS溶液，300μL3％过氧化氢，混匀配制为发光底液。
使用时，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间4秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍，测量发光强度；待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
实施例3
该实施例提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备分子印迹传感器：
将金电极使用0.05μmα-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入二次水中超声振荡4分钟清洗表面；
取5mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液，2mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，电位范围0.8～0V，扫描速率(can rates)0.05V/s，扫描段数(sweep segments)15～30段，得到电聚合物；
电聚合物用二次水淋洗并静置2分钟，以0.2mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液洗脱5分钟，而后用二次水淋洗电极2分钟以彻底清除残留在传感器表面上的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
(2)制备化学发光底液：
以200μL 1.0×10-3mol/L鲁米诺溶液，6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS溶液，300μL3％过氧化氢，混匀配制为发光底液。
使用时，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间5秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍，测量发光强度；待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
实施例4
该实施例提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备分子印迹传感器：
将金电极使用0.3μmα-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入二次水中超声振荡3.5分钟清洗表面；
取7mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液，3mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，电位范围0.8～0V，扫描速率(can rates)0.05V/s，扫描段数(sweep segments)15～30段，得到电聚合物；
电聚合物用二次水淋洗并静置3分钟，以0.25mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液洗脱7分钟，而后用二次水淋洗电极1分钟以彻底清除残留在传感器表面上的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
(2)制备化学发光底液：
以200μL 1.0×10-3mol/L鲁米诺溶液，6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS溶液，300μL3％过氧化氢，混匀配制为发光底液。
使用时，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间4秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍，测量发光强度；待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
实施例5
该实施例提供了一种敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备分子印迹传感器：
将金电极使用0.1μmα-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入二次水中超声振荡3.5分钟清洗表面；
取9mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液，3.5mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，电位范围0.8～0V，扫描速率(can rates)0.05V/s，扫描段数(sweep segments)15～30段，得到电聚合物；
电聚合物用二次水淋洗并静置4分钟，以0.22mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液洗脱9分钟，而后用二次水淋洗电极2分钟以彻底清除残留在传感器表面上的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
(2)制备化学发光底液：
以200μL 1.0×10-3mol/L鲁米诺溶液，6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS溶液，300μL3％过氧化氢，混匀配制为发光底液。
使用时，将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间5秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍，测量发光强度；待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
实施例6
在实施例3的基础上，本实施例中：
制备敌百虫溶液：称取0.0257g敌百虫，用0.6mol/L盐酸将敌百虫溶于烧杯中，将烧杯中溶液转移至清洗过的100mL容量瓶中，以0.6mol/L盐酸定容至刻度线配成1.0×10- 3mol/L，并放置于阴暗处储存。
制备鲁米诺溶液：取0.0177g鲁米诺，称取0.0080g NaOH，放入经二次水清洗过的烧杯中，溶解，按规范用玻棒转移至100mL容量瓶中利用二次水定容。即可获得1.0×10- 3mol/L鲁米诺溶液。
制备邻苯二胺溶液：取0.0108g邻苯二胺用0.20mol/L pH＝7.0的PBS缓冲液配制为1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液。取4.3701g磷酸氢二钠，1.2172g磷酸二氢钠，0.80g氯化钾配制0.20mol/L pH＝7.0PBS缓冲溶液，按上述方法配制0.20mol/L pH＝7.4PBS缓冲液。
制备过氧化氢溶液：将30％过氧化氢加入二次水稀释制成3％过氧化氢溶液。
实验例1体系增强原理论证
样品处理：分别于市场购买胡萝卜、上海青。将其分别榨汁并加入50.0mL甲醇、20.0mL水萃取敌百虫，以4000r/s离心5分钟后取上清液，将清液蒸发至20.0mL，以此作为待测液冷藏备用。
将电极底面打磨至光滑镜面洗净待用。首先测定底液中未加入敌百虫发光(以0.2mL 1.0×10-3mol/L鲁米诺、0.3mL 3％过氧化氢溶液、6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS缓冲液混合制备的发光底液)，随后逐级加入0.20mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液并测定发光值。
实验原理：利用电化学发光对敌百虫增强鲁米诺-过氧化氢体系发光进行了研究。鲁米诺发光反应可分为两步，首先鲁米诺与氢氧根反应生成中间体(式1)。中间体通过与过氧化氢反应生成高能态3-氨基邻苯二甲酸盐，高能态邻苯二甲酸盐跃迁至低能态释放出光子产生发光现象。敌百虫可催化第一步反应，使得中间体浓度升高，因此中间体与过氧化氢反应生成高能3-氨基邻苯二甲酸盐量增多，跃迁后释放出的光子增多，达到增强发光的效果。
Figure BDA0003018208820000111
实验结果：
图1所示，在未加入敌百虫时(曲线a)发光强度最低，逐级加入敌百虫溶液后发光强度逐渐上升，曲线b、曲线c、曲线d分别代表加入0.20mL、0.40mL、0.60mL浓度为1.0×10- 3mol/L敌百虫溶液后，测定得到发光值。
由图1结果可表明，在鲁米诺、过氧化氢浓度不变时，鲁米诺-H2O2体系发光强度随着敌百虫浓度升高而升高，由图1也可清晰的表明敌百虫对鲁米诺-过氧化氢发光体系有增强发光的作用。
实验例2差分脉冲伏安与交流阻抗表征
1、差分脉冲伏安法表征
利用差分脉冲伏安法对电极上是否成功将分子印迹膜聚上进行研究，以8.0mL0.05mol/L铁氰化钾溶液作为底液，将工作电极接入三电极体系进行差分脉冲伏安法测定。
如图2所示，裸电极在铁氰化钾测试底液中的还原峰电流值最大(曲线a，1.63×10-4A)。在电极表面聚上一层分子印迹膜之后由于聚合物导电能力较差，使得电子通过分子印迹聚合物的速率降低(曲线b，2.38×10-6A)，因此还原峰电流强度急剧下降。将聚膜后的电极经0.125mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液洗脱5分钟后，分子印迹膜上模板分子被洗脱液洗脱离开印迹膜(曲线c，1.19×10-4A)，由此形成了具有特异选择性的印迹孔穴，为探针提供电子传递通道，使得响应电流大大提升。但又因聚合物还存在于电极表面，使得响应电流仍旧小于裸电极响应电流。将洗脱后的电极置于1.0×10-10mol/L敌百虫重吸附液中重吸附(曲线d，9.44×10-5A)，由于敌百虫分子被重新吸附至印迹孔穴之中，使得响应电流降低。将传感器重吸附1.0×10-6mol/L敌百虫(曲线d，5.71×10-5A)，被印迹孔穴吸附的敌百虫分子不断增多，使得电子传递通道大量被敌百虫分子堵塞，响应电流再次降低。
2、交流阻抗表征
为验证传感器对敌百虫具有特异性吸附作用，以10.0mL 0.05mol/L铁氰化钾溶液为探测底液，测定电极交流阻抗并运用Zview软件进行拟合。
如图3所示，裸电极(曲线a，“136.743Ω”)由于表面光滑未附着任何其他物质，其阻抗为最小值。聚膜后(曲线b，“11437.4Ω”)电极表面附着了一层极厚且导电能力极差的分子印迹聚合物导致传感器阻抗达到11.44kΩ。当修饰电极使用洗脱液洗脱(洗脱时间为5分钟)敌百虫模板分子后(曲线c，“1140.2Ω”)，印迹孔穴形成，电极阻抗下降。当印迹传感器重吸附浓度为1.0×10-10mol/L敌百虫重吸附液(曲线d，“1443.68Ω”)后，由于附着在电极表面的分子印迹膜特异选择性吸附敌百虫分子，使得印迹孔穴部分被敌百虫分子堵塞，电极阻抗随之上升。且随着重吸附浓度升高，阻抗值越大。由此可判断传感器对敌百虫具有特异识别能力。
实验例3分子印迹聚合物配比与发光底液配比优化
聚膜液中的模板分子与功能单体配比能够直接影响分子印迹聚合物的性能与机械强度。而聚合时的扫描段数，扫描速率，聚膜电位，会对分子印迹聚合物的厚度与致密性产生巨大的影响，若聚膜条件未优化完全，可对分子印迹膜的洗脱与重吸附实验产生及巨大的影响。根据印迹膜洗脱效果，洗脱过程中塌陷、脱落情况，重吸附效果进行判断，得到最优的聚膜液配比为敌百虫比邻苯二胺1:7。聚膜电位为0-0.8V，扫描速率为0.05mV，聚膜段数为20段。
由图4可知，在0.35V，0.48V处出现邻苯二胺双氧化峰，随着扫描圈数逐渐多，氧化峰电流强度随之降低，敌百虫与邻苯二胺分子也不断聚集至电极表面，当扫描圈数增加至20圈时，氧化峰趋于平稳，由此表明，电极表面已成功聚合上一层致密且导电性较差的分子印迹膜。
鲁米诺-H2O2发光体系中的过氧化氢与鲁米诺的配比对发光具有极大的影响，而过氧化氢对敌百虫增强鲁米诺发光同样具有一定的影响。取2.0mL 1.0×10-4mol/L鲁米诺，6.0mL 0.20mol/L PSB(pH＝7.4)溶液与3％过氧化氢溶液混合制成发光底液，3％过氧化氢溶液分别取100μL、200μL、300μL、400μL。使用裸电极测定发光强度，加入50μL 0.70×10- 3mol/L敌百虫储备液(发光底液中含敌百虫浓度约为4.4×10-6mol/L)并使用裸电极测定发光强度。
如图5所示，当过氧化氢逐级增加时，敌百虫催化发光效果逐渐增强，而过氧化氢添加至300μL时，随着过氧化氢浓度的增加，敌百虫被氧化量也随之增加，增敏效果也随之降低，使得其增敏作用小于过氧化氢增强发光作用。在1.0×10-4mol/L鲁米诺与3％过氧化氢溶液体积比为20：3的条件下敌百虫催化发光发光效果最好。
实验例4洗脱液与洗脱时间优化
洗脱液的种类直接关系到模板分子的洗脱效果，对分子印迹膜是否友好，洗脱剂若洗脱效果过强则会导致分子印迹膜脱落，破坏分子印迹传感器。洗脱效果太弱又会导致目标分子无法脱离印迹膜表面，使得传感器无法对目标分子进行吸附。
对此研究了以甲醇、乙醇、甲醇比乙酸(8:1,V:V)、乙醇比乙酸(8:1,V:V)、乙醇比乙酸(5:3,V:V)、乙酸比乙醇比水(1:1:1,V:V:V)、硝酸比甲醇(1:8,V:V)、硝酸比甲醇(1:10,V:V)、硝酸比乙醇(1:8,V:V)、硝酸比乙醇(1:10,V:V)、0.5mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L氢氧化钠溶液、0.25mol/L氢氧化钠比乙醇(4:5,V:V)为洗脱液对传感器上分子印迹聚合物中的敌百虫进行洗脱。每隔一分钟对传感器测定一次发光值，直到测量数值达到稳定。
实验结果表明，采用0.125mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液洗脱效果最好。
洗脱时间过长会导致膜稳定性下降，极其容易脱落，洗脱时间过短则无法彻底洗脱目标分子，甚至会导致膜上印迹孔穴坍塌使传感器失去特异选择性。为了确保印迹膜具有最佳的工作能力，确定最优洗脱时间，使用0.125mol/L NaOH-无水乙醇(4:5，V:V)混合液作为洗脱液对分子印迹传感器进行洗脱，以考察不同的洗脱时间对传感器洗脱效果的影响。将电极置于配制好的洗脱液当中，每隔一分钟将电极置于以2.0mL 1.0×10-4mol/L鲁米诺、0.30mL 3％过氧化氢溶液、6.0mL 0.20mol/L pH＝7.4PBS缓冲液混合制备的发光底液中测定并记录发光值。
实验结果如图6所示，随着时间增长，目标分子逐渐从分子印迹聚合物中脱离，分子印迹聚合物上不断形成印迹孔穴增大电流，使得电化学发光增强，出现发光上升的趋势。随着敌百虫分子的不断脱离，电化学发光作用逐渐降低，随着敌百虫分子脱离，体系发光逐渐降低，敌百虫脱离至洗脱剂可吸附上限后，化学发光趋于平稳。
实验例5重吸附优化实验
重吸附时间的不同传感器吸附上的目标分子的量也不同，重吸附时间过短会导致吸附未达到饱和，使得检测效果大打折扣，若重吸附时间过长会使得传感器通过物理吸附其他干扰物，使得检测效果大打折扣。因此确定合适的重吸附时间对检测目标物具有极大的意义。将经过制备好的分子印迹传感器放入1.0×10-9mol/L的敌百虫溶液中，每隔3分钟使用新配制的发光底液进行电化学发光测定。
测定结果如图7所示，随着时间增加，敌百虫逐渐被吸附至印迹孔穴中，使得化学发光逐渐增强(曲线a至曲线c)，由于印迹孔穴被逐渐堵塞，电流变小使得电化学发光逐渐变小。选择发光强度最高的重吸附时间能避免过多吸附其他干扰物，因此选择9分钟作为最佳重吸附时间。
实验例6绘制工作曲线
在最优条件下，将修饰分子印迹聚合物的电极放入洗脱液中洗脱5分钟后，分别放入不同浓度敌百虫中重吸附9分钟，再将电极置于发光底液中测发光强度。
结果如图8所示，随着重吸附液中敌百虫浓度的升高，发光信号也随之增强，且发光信号强度与敌百虫浓度的对数在2.0×10-8～1.0×10-12mol/L之间呈现较为良好的线性关系。
工作曲线线性回归方程为ΔI＝795.42248(lgC，mol/L)+12297.994，相关系数r为0.99027，检出限为3.9×10-13mol/L。
实施例7
选择性影响实验
为了考察乙烯利、草甘膦、百菌清、阿特拉津、百草枯、敌草隆对传感器选择性的影响，以1.0×10-8mol/L的敌百虫发光值作为参比，对以上6种农药以印迹传感器分别平行测定3次。
结果如图9所示，由于传感器上无干扰物的空间识别孔穴，使得传感器对乙烯利(2.0×10-8mol/L)、百菌清(1.0×10-8mol/L)、阿特拉津(1.0×10-8mol/L)、百草枯(1.0×10-8mol/L)、敌草隆(1.0×10-8mol/L)、草甘膦(1.0×10-9mol/L)识别性较差，说明了该传感器选择性极好。
实验例8稳定性与重现性实验
对同一支分子印迹传感器重吸附2.0×10-8mol/L敌百虫后连续进行7次发光强度测定(图10)，其相对标准偏差为0.85％，取同一批次的5支分子印迹传感器(图11)，分别重吸附2.0×10-8mol/L敌百虫后测定其发光强度，相对偏差3.95％，由此表明，所制备的分子印迹传感器具有较好的重现性。
通过长时间放置对传感器的稳定性进行研究，令传感器重吸附2.0×10-8mol/L敌百虫10分钟后，使其保持湿润，存放至4℃的冰箱中，15天后取出测定电化学发光强度(ECL＝6330)与之前(ECL＝6605)对比，相对偏差为4.16％符合预期要求。
实验例9样品测定实验
取制备好的传感器置入待测液中重吸附9分钟后，使用刚配制好的发光底液，测定传感器电化学发光强度并对样本进行加标回收。将原样品以高效液相色谱法同步测定。高效液相色谱参数设定，流动相：水：甲醇：乙酸(3:6:1,V:V:V),柱温：25℃，检测波长210nm，流速：1mL/min。
结果如表1所展示，方法的回收率在95.71％-101.43％，相对标准偏差小于3.98％，传感器测定结果与高效液相色谱法测定结果一致。
表1蔬菜中敌百虫检测结果
Figure BDA0003018208820000171
本申请实验仪器：MIP-E型电致化学分析系统多功能发光检测仪(西安迈瑞分析仪器有限公司)；三电极体系：工作电极：分子印迹膜修饰电极，参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：铂丝电极。电化学工作站、KQ3200DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备分子印迹传感器：
将金电极打磨、抛光、清洗；
取邻苯二胺溶液、敌百虫溶液，配成聚膜底液；
将清洗完毕的金电极放入聚膜底液中，通过循环伏安法电聚合，得到电聚合物；
电聚合物用水淋洗，以NaOH与无水乙醇的混合液作为洗脱液，洗脱3～10分钟，用水淋洗电极以彻底清除残留的敌百虫分子，即得到对敌百虫具有特异识别性能力的分子印迹传感器；
制备化学发光底液：
以鲁米诺溶液、PBS溶液和3％过氧化氢溶液混匀配制为发光底液。
2.根据权利要求1所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，将金电极使用α-氧化铝在麂皮上打磨抛光至表面呈镜面，将金电极放入水中超声振荡3～5分钟清洗表面。
3.根据权利要求1所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，取3～10mL 1.0×10-3mol/L邻苯二胺溶液、1～4.0mL 1.0×10-3mol/L敌百虫溶液，配成聚膜底液。
4.根据权利要求1所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，电聚合过程中：电位范围0.8～0V，扫描速率0.05V/s，扫描段数15～30段。
5.根据权利要求1所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，所述的洗脱液浓度为0.10～0.30mol/L，其中，NaOH与无水乙醇的体积比为4:5，洗脱液时间为5分钟。
6.根据权利要求1所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，化学发光底液中，采用体积比为20：3的1.0×10-4mol/L鲁米诺溶液与3％过氧化氢溶液。
7.一种如权利要求1～6任一所述的方法制备得到的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器。
8.一种如权利要求7所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器在检测敌百虫中的应用。
9.根据权利要求8所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器在检测敌百虫中的应用，其特征在于，包括：
将分子印迹传感器重吸附不同浓度敌百虫后，浸入化学发光底液中，使用循环伏安法，测量发光强度；
待出现连续三个发光峰平稳时即可停止测定，取两平稳发光峰相间的发光峰峰值为发光值。
10.根据权利要求8所述的敌百虫电致化学发光分子印迹传感器在检测敌百虫中的应用，其特征在于，电位范围-0.2～0.6V，扫描速度100mV/s，扫描方向正向，静止时间3～5秒，光电倍增管高压500V放大倍数2倍。
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