CN110475773A - 8-苯基异喹啉及其医药组合物用于治疗肠易激综合征 - Google Patents

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Abstract

一系列的8‑苯基‑异喹啉衍生物（I）对5‑HT7受体（5HT7R）展示出高的结合亲和力，并且在通过腹腔注射（i.p.）或通过灌胃给药（p.o.）的肠易激综合症（IBS）的两种动物模型中显示出潜在的镇痛活性。这些5‑HT7受体拮抗剂是一类用于治疗IBS的新型治疗剂。

Description

8-苯基异喹啉及其医药组合物用于治疗肠易激综合征
技术领域
本发明是关于用于治疗肠易激综合征(IBS)的一系列8-苯基异喹啉衍生物。
背景技术
5-HT7受体(5-HT7R)是5-HT受体家族的14个亚型中的最新成员。其广泛分布于中枢神经系统(CNS)(在下视丘、视丘、海马回、及皮质中含量最丰富)以及周边器官(例如脾、肾、肠、心脏及冠状动脉)中，这意味着其在各种生理功能及病理过程中具有作用。5-HT7R与腺苷酸环化酶正向偶合，且与其他5-HT受体亚型具有低的序列同源性(低于40％)。基于使用选择性5-HT7R配体及敲除(knock-out)小鼠模型进行的研究，5-HT7R参与昼夜节律调节、体温调节、睡眠障碍、情感疾患、疼痛、学习及记忆。因此，5-HT7R配体是治疗各种5-HT7R相关疾病及失调的潜在治疗剂。5-HT7R拮抗剂可能是抑郁、焦虑、精神分裂症、及失智症的有效治疗剂，而5-HT7R激动剂可能是疼痛及疼痛症状(特别是神经性病变疼痛及发炎性疼痛)的潜在治疗剂。
此外，5-HT7R也是偏头痛(WO2009029439A1)、高血压、各种黏膜发炎(WO2012058769A1)(诸如肠易激综合征)、及尿失禁的潜在药物标靶，其分别透过对中枢及周边血管以及肠、结肠、及膀胱组织的有效平滑肌松弛作用。几种治疗剂(诸如三环抗郁剂、典型和非典型抗精神病药物及一些5-HT2受体拮抗剂)被发现对5-HT7R表现出中度至高度的亲和力。
考虑到5-HT7R配体的多种治疗潜力，已经有许多努力集中在选择性5-HT7R激动剂及拮抗剂的发现和开发上。不同结构类型的5-HT7R配体已被报导，包括5-HT7R激动剂(诸如AS-19、LP-44、LP-12、LP-211、及E-55888)以及5-HT7R拮抗剂(诸如SB-258719、SB-269970、SB-656104、DR-4004及JNJ-18038683)。尽管有许多的努力，但仍然需要进一步开发具有适当物理化学和药物动力学性质的新型5-HT7R配体作为用于治疗5-HT7R相关疾病及失调的潜在治疗剂。
肠易激综合征(IBS)主要特征为在没有可识别的器官原因或外观损伤的情况下，与排便习惯改变相关的复发性腹痛。在亚洲和西方国家的肠胃科门诊病人中，约有10至15％与IBS有关。严重的腹痛是IBS的临床特征，其是最可能导致医疗咨询的症状。IBS的亚型包括以腹泻为主的IBS-D、以便秘为主的IBS-C、或交替的IBS-A。IBS病症的发展被认为与脑肠轴(brain-gut axis)紊乱有关；然而，发病机制仍然知之甚少。
患者中肠血清素(serotonin(5-HT))水平的改变是经验证的IBS生物标记。然而，以5-HT受体为标靶用于IBS治疗的临床药物目前是有限的，只有在紧急研究药物方案(emergency investigational drug protocol)下才能开此药方。阿洛司琼(alosetron)(一种用于治疗IBS-D的5-HT3R拮抗剂)已因为严重的副作用(例如缺血性结肠炎、脑血管或心血管缺血)被FDA撤回，之后重新引入仅限用于症状严重的女性。其他可用的症状缓解剂(例如解痉药、止泻药、渗透剂、镇静剂、抗忧郁剂等)对于患者而言并不是广泛有效的。IBS发病机制的医学研究很大程度上依赖于患者切片检体的分析。具有内脏高敏感性的动物模型已被建立，虽然每种模型都有其对IBS转译价值的弱点和优势。因此，IBS治疗发展的进展受到阻碍。迄今为止，用于IBS临床治疗的新型靶向药物开发是非常需要的。
已经发现包括心理应激、肠感染、免疫和发炎反应、遗传易感性(geneticpredisposition)、及肠道微生物相变化的多种危险因素会促成IBS症状发展。有高比率的IBS患者报告过去在儿童期或成年期的创伤事件。IBS症状可能在传染性胃肠炎发作之后开始，称为感染后(PI)-IBS。挪威水传播梨形鞭毛虫病疫情(waterborne giardiasisoutbreak)的后续研究报告指出，超过40％的患者在急性梨形鞭毛虫(Giardia lamblia)感染后经历类IBS(IBS-like)症状持续三年。该感染后症状的恶化与身体或精神应激的经历相关。病原体感染清除后及化学诱导性小肠结肠炎解除后的实验模型表现出肠道痛觉过敏。此外，受到心理应激的动物也表现出对结直肠扩张(colorectal distension)的内脏高敏感性。使用具有类IBS内脏高敏感性的两种小鼠模型(包括以梨形鞭毛虫感染后(Giardiapostinfection)结合心理应激双重刺激，以及在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎解除后)来测试新颖5-HT7R配体的镇痛作用。
在5-HT受体亚型中，5-HT7R是最新发现的家族成员，具有未知的病理生理作用。5-HT7R的刺激引起圆形平滑肌的过度放松，其意味着无效的气体推进及腹胀。已经在结肠中的肠神经元(即肠肌传入神经元(myenteric afferent neuron)及黏膜神经纤维)、平滑肌、及树突细胞中，以及腰背根神经节(lumbar dorsal root ganglion)及脑中鉴定出5-HT7R的表达。本发明证实了一系列8-苯基异喹啉衍生物在两种IBS动物模式中减轻肠痛的作用。
发明内容
本发明是关于一种具有下列通式的新颖化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1选自氢、C1-10直链烷基、C1-10支链烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12及(CH2)nArR10R11R12，其中n是0至6的整数、Hete是芳香杂环基、Ar芳香环基、且R10、R11及R12独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基及C1-6直链饱和卤代烷基；R2是氢或C1-6直链饱和烷基；及X1、X2、X3、X4及X5独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6支链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基、C1-6支链饱和烷氧基、C1-6直链饱和烷硫基、C1-6支链饱和烷硫基、C1-6直链饱和卤代烷基及C1-6支链饱和卤代烷基。
本发明亦关于一种医药组合物，其包含药学上可接受的载体及治疗有效量的此新颖化合物或其药学上可接受的盐。此外，本发明关于一种使用上述医药组合物治疗肠躁症候群的方法。
附图说明
图1、8-苯基异喹啉新衍生物的合成方案1。
图2、8-苯基异喹啉新衍生物的合成方案2。
图3、8-苯基异喹啉新衍生物的合成方案3。
图4、8-苯基异喹啉新衍生物的合成方案4。
图5、在类IBS小鼠模型中以梨形鞭毛虫(Giardia)结合应激进行双重刺激所观察到的内脏高敏感性。(A)将对结直肠扩张的内脏运动反应(visceromoter response(VMR))表示为曲线下面积(AUC)并在每只小鼠中测定以作为肠痛指标。(B)PN和GW小鼠中结肠组织学的代表性图像。(C)PN和GW小鼠结肠组织中的免疫染色的5-HT7R的代表性图像(a小图)以及肌肉/神经及黏膜层中的5-HT7R免疫反应性的定量(b小图及c小图)。(D)蛋白免疫印迹；(Western blotting)结果显示GW小鼠中5-HT7R蛋白水平增加。
图6、在TNBS诱导的结肠炎解除后在类IBS小鼠模型中注意到的内脏高敏感性。(A)将对结直肠扩张的内脏运动反应(visceromoter response(VMR))表示为曲线下面积(AUC)并在每只小鼠中测定以作为肠痛指标。(B)检验肠的髓过氧化物酶(myeloperoxidase(MPO))活性作为炎症性白细胞活化的指标。(C)小鼠结肠组织的组织病理学评分。(D)在假手术(sham)和TNBS小鼠中的结肠组织学的代表性图像。(E)在假手术(sham)和TNBS-d24小鼠的结肠组织中的5-HT7R的免疫染色。5-HT7R染色的代表性图像(a小图)以及肌肉/神经及黏膜层中的5-HT7R免疫反应性的定量(b小图及c小图)。(F)5-HT7R在小鼠结肠中的蛋白质水平。(G)5-HT7R在小鼠结肠中的转录水平。
图7、5-HT7R拮抗剂SB269970(SB7)在类IBS小鼠模型中的止痛作用。
图8在GW小鼠中口服给药新颖8-苯基异喹啉衍生物的镇痛作用。
图9、化合物8在GW小鼠肠痛中的剂量与时间反应。(A)在疼痛分析之前90分钟以各种剂量腹腔内给药化合物8。(B)在疼痛分析之前90分钟以各种剂量口服给药化合物8。(C)在疼痛分析之前1.5、4或12小时口服给药化合物8(5mg/Kg)。(D)在一个10天的疗程中在疼痛分析之前以多剂量(m.d.)重复地口服给药化合物8(3mg/Kg)。
图10、8-苯基异喹啉衍生物在TNBS小鼠中的止痛作用。
图11、GW和TNBS小鼠中化合物8与参考标准物的镇痛作用及不良反应的比较。(A)GW小鼠的肠痛水平。(B)TNBS小鼠的肠痛水平。(C)每个处理组的结肠组织学的代表性光学图像。在ALN组中观察到充血(*)及颗粒性白细胞浸润(箭头)，但在其他组中则没有观察到。
发明详述
本发明提供一种具有下列通式的新颖化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1选自氢、C1-10直链烷基、C1-10支链烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12及(CH2)nArR10R11R12，其中n是0至6的整数、Hete是芳香杂环基、Ar芳香环基、且R10、R11及R12独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基及C1-6直链饱和卤代烷基；
R2是氢或C1-6直链饱和烷基；及
X1、X2、X3、X4及X5独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6支链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基、C1-6支链饱和烷氧基、C1-6直链饱和烷硫基、C1-6支链饱和烷硫基、C1-6直链饱和卤代烷基及C1-6支链饱和卤代烷基。
在本发明的一个实施例中，该新颖化合物的卤代基选自氟、氯、溴及碘。在本发明的另一个实施例中，该新颖化合物的芳香杂环基选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并恶唑基及苯并噻唑基。
在本发明的一较佳实施例中，该新颖化合物选自6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(4-硝苯基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇(化合物7)、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇(化合物8)、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-3-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇(化合物9)、及6,7-二甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(化合物10)的化合物、或其药学上可接受的盐。在本发明的一更佳实施例中，该新颖化合物是6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇(化合物8)或其药学上可接受的盐。
本发明进一步提供一种医药组合物，其包含药学上可接受的载体及治疗有效量的下列通式的新颖化合物：
其中R1选自氢、C1-10直链烷基、C1-10支链烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12及(CH2)nArR10R11R12，其中n是0至6的整数、Hete是芳香杂环基、Ar是芳香环基、且R10、R11及R12独立选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基及C1-6直链饱和卤代烷基；
R2是氢或C1-6直链饱和烷基；及
X1、X2、X3、X4及X5独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6支链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基、C1-6支链饱和烷氧基、C1-6直链饱和烷硫基、C1-6支链饱和烷硫基、C1-6直链饱和卤代烷基及C1-6支链饱和卤代烷基。
在本发明的一个实施例中，该医药组合物的新颖化合物的卤代基选自氟、氯、溴及碘。在本发明的另一个实施例中，该医药组合物的新颖化合物的芳香杂环基选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并恶唑基及苯并噻唑基。
在本发明的一较佳实施例中包含药学上可接受的载体及治疗有效量的6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇(化合物8)或其药学上可接受的盐。
“药学上可接受的载体”或“赋形剂”或“药学上可接受的载体或赋形剂”或“生物可利用的(bioavailable)载体”或“生物可利用的载体或赋形剂”包括但不限于为了保存的溶剂、分散剂、包衣、抗微生物剂、抗真菌剂或为了制备配方的延迟吸收剂及任何其他已知的化合物。一般而言，这些载体或赋形剂本身不具有治疗疾病的活性。通过使用本发明中公开的新颖化合物或其衍生物结合药学上可接受的载体或赋形剂而制备的医药组合物或配方不会引起动物或人类的副作用、过敏或其他不适当的反应。因此，本发明中公开的新颖化合物或其衍生物与药学上可接受的载体或赋形剂的组合可应用于人类临床。包含本发明的新颖化合物或其衍生物的医药组合物或配方可透过静脉注射、口服、吸入或透过鼻、直肠、阴道或舌下的局部施用来达到治疗效果。在一个实施例中，每天将0.1mg至100mg的化合物的活性成分施用患有不同疾病的患者。
将被使用的载体根据要制备的医药组合物或配方而不同。无菌注射用组合物可混悬在无菌静脉内注射稀释剂或溶剂中，例如1,3-丁二醇。可接受的载体可以是甘露醇或水。此外，油固定或合成的单甘油酯/双甘油酯混悬介质是常用的溶剂。脂肪酸(诸如油酸、橄榄油、蓖麻油、甘油酯衍生物，特别是聚氧乙烯化形式)可被制备用于注射及天然的药学上可接受的油。这些油溶液或混悬液包括长链醇稀释剂、分散剂、羧甲基纤维素或类似的分散剂。常用的其它表面活性剂包括Tween、Spans、其他类似的乳化剂、用于制药工业的药学上可接受的固体、液体、或其它用于开发配方的生物可利用的增强剂。
将用于口服给药的组合物调整为口服可接受的组合物或配方，其中该类型包括胶囊、口含锭(lozenge)、锭剂(troche)、乳化剂、液体混悬液、分散剂及溶剂。用于口服给药(诸如口含锭)的常用载体可为例如作为基本添加剂的乳糖、玉米淀粉、润滑剂、硬脂酸镁。用于胶囊的稀释剂包括乳糖、干玉米淀粉。液体混悬液或乳化剂配方的配制是通过结合乳化剂或混悬剂的油界面来混悬或溶解活性成分。还可包括甜味剂、调味剂或着色剂。
用于口服使用的气溶胶喷雾剂或吸入组合物是由已知的配方技术制备。例如，将组合物溶解于生理食盐水中，加入苯甲醇、其他合适的防腐剂或促吸收剂(absorbefacient)以增强生物可利用性。本发明所提供的化合物的组合物也可制成透过直肠或阴道给药的栓剂。
注射包括皮下、腹腔、静脉、肌肉、关节腔、颅内、滑液、鞘内注射、主动脉注射、胸腔注射、病灶注射或其他合适的给药技术。
此外，本发明提供了一种用于治疗肠易激综合征的方法，其包含步骤如下：向需要该治疗的患者施用有效量的上述医药组合物。在本发明的一个实施例中，该医药组合物的卤代基选自氟、氯、溴及碘。在本发明的另一个实施例中，该医药组合物的芳香杂环基选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并恶唑基及苯并噻唑基，其提供了对5-HT7受体的拮抗作用。
在本发明的另一个实施例中，该肠易激综合征是通过提供对5-HT7受体的拮抗作用来治疗。在本发明的又一个实施例中，该肠易激综合征包含由感染及之后的应激所引起的疼痛，以及由化学诱导的发炎所引起的疼痛。
在本发明的又一个实施例中，该肠易激综合征是通过抑制由感染及之后的应激所引起的疼痛来治疗。在本发明的另一个实施例中，该肠易激综合征是通过抑制由化学诱导的发炎所引起的疼痛来治疗。
在检阅详细描述及附图之后，本发明的上述方面及优点对所属技术领域中的普通技术人员而言将变得显而易见。
实施例
现在将参考下列实例更具体地描述本发明。应该注意的是，在此仅出于说明和描述的目的而呈现本发明的下列描述；并非意欲穷举或限于所公开的确切形式。
本发明提供8-苯基异喹啉的新衍生物文库。合成包括以下4个方案。
方案1(如图1所示)：如图1所描绘，从市售的7-羟-6-甲氧-3,4-二氢异喹啉(化合物20)开始合成N-苯乙基取代的8-苯基四氢异喹啉-7-醇衍生物。以溴苯乙烷(phenylethylbromide)将化合物20N-烷基化，然后用NaBH4还原，得出胺21。将苯乙胺21以Pb(OAc)4处理，然后用HBr进行芳族取代，产出8-溴四氢异喹啉22。然后使用各种经取代的芳基硼烷(arylborane)，利用铃木(Suzuki)偶合反应条件从22合成中等产率的所期望的目标化合物29至45。
方案2(如图2所示)：如方案2所示，仍从市售的化合物20开始制备N-取代的8-(2,4-二甲氧苯基)-四氢异喹啉-7-醇。用各种卤化物处理化合物20，然后用NaBH4还原，产出N-取代的四氢异喹啉-7-醇11及61至75。使用Pb(OAc)4在乙酸中氧化化合物11及61至75，然后用1,3-二甲氧苯进行TFA催化的芳族取代，分别得到相应的N-取代的8-(2,4-二甲氧苯基)-6-甲氧基四氢异喹啉-7-醇6及101至125。
方案3(如图3所示)：如方案3所描绘，用各种3-芳基丙基溴处理化合物20，然后用NaBH4还原，得到相应的N-3-芳基丙基取代的四氢异喹啉-7-醇衍生物12至14及78。用Pb(OAc)4处理化合物12至14及78，然后分别用HBr进行芳族取代，得到溴化物15至17及98。在NaH的存在下用碘甲烷进行酚16的O-甲基化，产出6,7-二甲氧基四氢异喹啉18。在铃木(Suzuki)反应条件下用各种经取代的芳基硼烷进行化合物15至18及98的芳基偶合反应，分别得到中等产率的N-3-芳基丙基取代的6-甲氧-8-苯基四氢异喹啉-7-醇7至10及142。
方案4(如图4所示)：如方案4所描绘，使用N-苯乙基取代的8-溴-6-甲氧基四氢异喹啉-7-醇60至96制备N-苯乙基取代的6,7-二甲氧-8-苯基四氢异喹啉衍生物157至173。在NaH的存在下用碘甲烷进行酚60至96的O-甲基化，分别得出6,7-二甲氧基四氢异喹啉150至154。在铃木(Suzuki)反应条件下，化合物150至154与各种经取代的芳基硼烷的芳基偶合反应分别提供了6,7-二甲氧-8-苯基四氢异喹啉157至173。
上述方案1至4中描述的那些化合物的具体合成步骤如下：
化合物21：将化合物20(100mg,0.56mmol)、2-溴苯乙烷(311mg,1.68mmol)、与2-丙醇(3.5mL)的混合物回流15小时。将所得溶液浓缩并加入MeOH(5mL)以溶解残余物。将该溶液在冰浴中冷却，然后在N2下缓慢加入NaBH4(49mg,1.29mmol)。将该混合物再搅拌10分钟，然后浓缩。将残余物用H2O(20mL)及CHCl3(20mL)处理，然后将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，MeOH/CH2Cl2＝1/100)以得出呈白色固体的化合物21(146mg,0.52mmol,92％)。
化合物30：在10-mL厚壁Pyrex反应容器中，在C18H20BrNO2(50mg,0.14mmol)于2-丙醇(2.0mL)中的溶液中加入4-甲氧苯基硼酸(26mg,0.19mmol)。搅拌30分钟后，加入Pd(OAc)2(1.3mg,0.006mmol)、PPh3(4.7mg,0.02mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.09mL,0.17mmol)、及H2O(0.1mL)。接着将该混合物在微波合成器中于140℃加热10分钟，加入H2O(0.35mL)，然后冷却至室温。将所得溶液用H2O(5mL)稀释并用EtOAc(5mL)萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)及盐水洗涤。将有机溶液用Darco G-60(100mg)处理并在室温下搅拌30分钟，然后用MgSO4干燥，过滤(将烧结的玻璃漏斗装入硅藻土(Celite)至1cm的深度，并将Florisil均匀涂布在硅藻土的顶部)并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝2/1)以得出橙色油状物(40mg,0.10mmol,73％)。
化合物29及31至40：表1为参数表。将“参数1”加入反应容器中进行微波辅助加热，并用“参数2”mL 2-丙醇溶解。该溶液外观为“参数3”，在其中加入试剂“参数4”，并搅拌“参数5”分钟。所得到的溶液的外观为“参数6”。加入Pd(OAc)2“参数7”、PPh3“参数8”、2M Na2CO3(aq)“参数9”及“参数10”mL H2O并以“参数11”的条件加热。在该溶液温度降低之前加入“参数12”mL H2O，在空气中搅拌直至达到室温，用“参数13”mL EtOAc稀释，并用“参数14”mL H2O萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)洗涤，用盐水洗涤，加入“参数15”mg Darco G-60，搅拌“参数16”分钟，加入MgSO4以干燥，搅拌“参数17”分钟，用覆盖有约1cm硅藻土(Celite)及Florisil薄层的烧结玻璃漏斗过滤，浓缩干燥并通过快速柱层析(flash columnchromatography)(硅胶，“参数18”)纯化以获得“参数19”。
表1：用于合成化合物29及31至40的参数表
化合物44：向在10-mL厚壁Pyrex反应容器中的C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)于2-丙醇(1.5mL)中的溶液中加入3,5-二甲氧苯硼酸(62mg,0.34mmol)。搅拌30分钟后，加入Pd(OAc)2(2.2mg,0.01mmol)、PPh3(8.0mg,0.03mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.17mL,0.34mmol)、及H2O(0.7mL)。接着将该混合物在微波合成器中于140℃加热10分钟，加入H2O(0.35mL)，然后冷却至室温。将所得溶液用H2O(10mL)稀释并用EtOAc(10mL)萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)(10mL)及盐水洗涤。将有机溶液用Darco G-60(100mg)处理并在室温下搅拌30分钟，然后用MgSO4干燥，过滤(将烧结的玻璃漏斗装入硅藻土(Celite)至1cm的深度，并将Florisil均匀涂布在硅藻土的顶部)并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/1)以得出黄色油状物(76mg,0.18mmol,65％)。
化合物45：在10-mL厚壁Pyrex反应容器中，在C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)于2-丙醇(2.0mL)中的溶液中加入2,3-二甲氧苯基硼酸(62mg,0.34mmol)。搅拌30分钟后，加入Pd(OAc)2(2.0mg,0.009mmol)、PPh3(3.7mg,0.014mmol)、2M Na2CO3(aq)(0.18mL,0.36mmol)、及H2O(0.2mL)。接着将该混合物在微波合成器中于120℃加热10分钟，加入H2O(0.7mL)，然后冷却至室温。将所得溶液用H2O(5mL)稀释并用EtOAc(5mL)萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)(5mL)及盐水洗涤。将有机溶液用Darco G-60(100mg)处理并在室温下搅拌30分钟，然后用MgSO4干燥，过滤(将烧结的玻璃漏斗装入硅藻土(Celite)至1cm的深度，并将Florisil均匀涂布在硅藻土的顶部)并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/1)以得出黄色油状物(82mg,0.20mmol,71％)。
化合物15、60、85、95至96、及98：表2是参数表。在N2下于室温将起始材料“参数1”加入到反应烧瓶中，并在其中加入“参数2”mL HOAc。加入Pb(OAc)4“参数3”，然后该溶液是“参数4”，倒入锥形瓶中并缓慢加入“参数5”mL Na2CO3(sat)。该水层的pH值是碱性的(pH＝“参数6”)。过滤中和所产生的固体。用CH2Cl2洗涤滤饼。将滤液用“参数7”mL CH2Cl2萃取。将有机层用盐水洗涤，加入MgSO4以干燥，搅拌5分钟，用烧结的玻璃漏斗过滤并浓缩干燥以得到“参数8”产物。将该粗产物用于下面的反应而不再进一步纯化。
在室温空气中在该溶液中加入HBr“参数9”且该溶液的外观是“参数10”。在搅拌“参数11”小时之后，将“参数12”mL Na2CO3(sat)及“参数13”mL CH2Cl2缓慢加入到该溶液中。该水层的pH是碱性的(pH＝“参数14”)，然后加入“参数15”mL CH2Cl2及“参数16”mL H2O用于萃取。将有机层用盐水洗涤，加入MgSO4以干燥，搅拌5分钟，用烧结的玻璃漏斗过滤并浓缩干燥以得到粗产物“参数17”mg。在快速管层析(硅胶，“参数18”)之后得出“参数19”。
表2：用于合成化合物15、60、85、95至96、及98的参数表
化合物11至12、63至67、67至70、74至75、及78：表3为参数表。在N2下于室温将起始材料“参数1”加入到一烧瓶中，然后在其中加入“参数2”mL IPA及“参数3”。该起始材料在“参数4”℃溶解。反应溶液的外观在约“参数6”分钟时为“参数5”及“参数7」，然后将该溶液在110至120℃加热“参数8」小时并在室温下浓缩。加入“参数9”mL MeOH并将所得的混合物搅拌“参数10”分钟。向在冰浴中为“参数11”的溶液中在N2下缓慢加入NaBH4(s)“参数12”并搅拌“参数13”分钟。将为“参数14”的该溶液加入“参数15”mL H2O并用“参数16”mL CHCl3萃取。将有机层加入MgSO4以干燥，搅拌“参数17”分钟，过滤并浓缩以得到“参数18”。在快速柱层析(硅胶，“参数19”)之后得出“参数20”。
表3：用于合成化合物11至12、63至67、67至70、74至75、及78的参数表
化合物68：将C10H11NO2(300mg,1.69mmol)、C8H8Br2(1.00g,3.79mmol)、与2-丙醇(10mL)的混合物加热至回流持续23小时。将所得溶液冷却至室温并蒸发。将该粗制物溶解于MeOH(15mL)中，在冰浴中冷却至0℃，然后在N2下分批加入NaBH4(420mg,11.1mmol)。将该混合物再搅拌20分钟，然后浓缩。将残余物用CHCl3(30mL)及H2O(30mL)处理，然后将有机层用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过沉淀法进行纯化。将粗产物用5mL的EtOAc溶解，然后用10mL的正己烷沉淀出产物以得出米色固体(620mg,1.71mmol)。
化合物121：在C19H23NO2(250mg,0.84mmol)于HOAc(4.2mL)中的溶液中加入Pb(OAc)4(579mg,1.31mmol)并将该混合物在N2下于室温搅拌15分钟。用CH2Cl2稀释该反应混合物并缓慢加入Na2CO3(sat)(20mL)。将中和所形成的固体通过过滤除去并用CH2Cl2洗涤。将合并的滤液用CH2Cl2(35mL)萃取，然后将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发以得出棕色油状物(480mg,1.35mmol)，将其不经进一步纯化即用于下面的反应中。在该粗制油状物于CH2Cl2(17mL)中的溶液中加入1,3-二甲氧苯(0.17mL,1.3mmol)及三氟乙酸(0.84mL)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，然后缓慢加入Na2CO3(sat)(20mL)。将所得溶液用CH2Cl2(18mL)萃取，然后将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，MeOH/CH2Cl2＝1/10)以得出红棕色油状物(214mg,0.49mmol,59％)。
化合物6、105至110、114至115、120、122、123及125：表4是参数表。在N2下于室温将起始材料“参数1”加入到烧瓶中并用“参数2”mL HOAc溶解。在为“参数3”的该溶液中加入Pb(OAc)4“参数4”，然后将为“参数5”的所得溶液搅拌“参数6”分钟，倒入125mL的锥形瓶中，搅拌并缓慢加入“参数7”mL Na2CO3(sat)。该水层的pH值是碱性的(pH＝8至9)。过滤中和所产生的固体并用CH2Cl2洗涤。将滤液用“参数8”mL CH2Cl2萃取。将有机层用盐水洗涤，加入MgSO4以干燥，搅拌5分钟，过滤并浓缩以得出”参数9”。将该粗产物用于下面的反应而不再进一步纯化。
将该粗产物在N2下于室温溶解于“参数10”mL CH2Cl2中。在为“参数11”的该溶液中加入1,3-二甲氧基苯“参数12”及三氟乙酸“参数13”。该溶液的颜色变成“参数14”。在搅拌该溶液“参数15”分钟后，缓慢加入“参数16”mL Na2CO3(sat)。该水层的pH是碱性的(pH＝8至9)，加入“参数17”mL CH2Cl2以萃取。将有机层用盐水洗涤，加入MgSO4以干燥，搅拌5分钟，过滤并浓缩以得出“参数18”mg粗产物。在快速柱层析(硅胶，“参数19”)之后得出“参数20”。
表4：用于合成化合物6、105至110、114至115、120、122、123及125的参数表
化合物7及142：表5是参数表。向反应容器中加入“参数1”及2-甲氧苯基硼酸(46mg,0.30mmol)进行微波辅助加热并用2-丙醇(2mL)溶解，搅拌30分钟。加入Pd(OAc)2“参数2”、PPh3“参数3”、2M Na2CO3(aq)(0.14mL,0.28mmol)、及H2O(0.2mL)，并使用微波合成器将该混合物于120℃加热20分钟。在该溶液温度降低之前在该溶液中加入H2O(0.7mL)，在空气中搅拌直至达到室温，用10mL的EtOAc稀释，并用10mL的H2O萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)洗涤，用盐水洗涤，加入“参数4”mg Darco G-60，搅拌10分钟，加入MgSO4以干燥，搅拌10分钟，用覆盖有约1cm硅藻土(Celite)及Florisil薄层的烧结玻璃漏斗过滤并浓缩。将该粗产物通过快速柱层析(硅胶，“参数5”)纯化以获得黄色油状物“参数6”。将游离碱“参数7”溶解于CH2Cl2中，然后加入HCl于CH2Cl2中的溶液直至pH＝1。将所得混合物浓缩以获得盐酸盐“参数8”。
表5：用于合成化合物7及142的参数表
化合物150：在C18H20BrNO2(100mg,0.28mmol)于DMF(2mL)中的溶液中，加入三甲基苯基氯化铵((CH3)3PhNCl,102mg,0.59mmol)及t-BuOK(67mg,0.60mmol)。在N2下将该混悬液加热至60℃持续3.5小时，然后加入(CH3)3PhNCl(102mg,0.59mmol)并加热至70℃持续4.5小时。在冷却至室温后，将该反应混合物用CHCl3(10mL)及5％NaOH(aq)(20mL)处理。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/4)以得出黄色固体(83mg,0.22mmol,79％)。
化合物152：在冷却至0℃并除气的C18H19BrN2O4(406mg,1.00mmol)于DMF(9mL)中的溶液中，加入于DMF(1mL)中的NaH(40mg,1.67mmol)及CH3I(0.06mL,0.98mmol)。搅拌10分钟后，加入NH4Cl(111mg,2.08mmol)，然后将该反应混合物用乙醚(100mL)及H2O(100mL)处理。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/2)以得出黄色固体(123mg,0.29mmol,30％)。
化合物153：在C18H19BrClNO2(300mg,0.75mmol)于DMF(6mL)中的溶液中，加入(CH3)3PhNCl(542mg,3.16mmol)及t-BuOK(333mg,2.97mmol)。在N2下将该混悬液加热至60℃持续16小时，然后加热至70℃持续1小时。在冷却至室温后，将该反应混合物用Et2O(100mL)及H2O(100mL)处理。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/4)以得出白色固体(189mg,0.46mmol,61％)。
化合物154：在C18H19BrFNO2(400mg,1.05mmol)于DMF(8mL)中的溶液中，加入(CH3)3PhNCl(727mg,4.23mmol)及t-BuOK(468mg,4.17mmol)。在N2下将该混悬液加热至70℃持续16小时。在冷却至室温后，将该反应混合物用Et2O(100mL)及H2O(100mL)处理。将有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物进行层析(硅胶，EtOAc/正己烷＝1/4)以得出白色固体(247mg,0.63mmol,60％)。
化合物157至159、165-168及171-173：表6为参数表。将“参数1”加入反应容器中进行微波辅助加热，并用“参数2”mL 2-丙醇溶解。在其中加入“参数3”并搅拌30分钟。加入Pd(OAc)2“参数4”、PPh3“参数5”、2M Na2CO3(aq)“参数6”及“参数7”mL H2O并使用微波合成器将其加热至120℃持续20分钟。在该溶液温度降低之前加入“参数8”mL H2O，然后冷却至室温，用10mL EtOAc稀释，并用10mL H2O萃取。将有机层用5％NaHCO3(aq)洗涤，再用盐水洗涤，加入”参数9”mg Darco G-60，搅拌10分钟，用覆盖有约1cm硅藻土(Celite)及Florisil薄层的烧结玻璃漏斗过滤，浓缩并通过快速柱层析(硅胶，“参数10”)纯化以获得“参数11”。
表6：用于合成化合物157至159、165至168及171至173的参数表
表7：本发明化合物的分析数据
化合物6至10的5-HT7受体亲和力、5-HT2A受体亲和力、及log D数据被显示于表8中。
表8：化合物6至10的受体亲和力及log D
动物
使用从台湾大学动物中心获得的无特定病原体C57BL/6小鼠(4至6周龄)进行研究。将动物饲养在12/12小时光暗循环的温度控制室(20±2℃)中，并以任意采食(adlibitum)方式喂以普通小鼠饲料及水。所有实验程序均经台湾大学实验动物照护及使用委员会批准。
试剂
新颖的8-苯基异喹啉衍生物通过下述程序制备。将SB-269970盐酸盐(SB7)(一种5-HT7R拮抗剂，Sigma#S7389)、阿洛司琼(alosetron)盐酸盐(ALN)(一种5-HT3R拮抗剂，Sigma#SML0346)、及洛哌丁胺(loperamide)盐酸盐(LPM)(一种μ型类鸦片受体(μ-opioidreceptor)激动剂；Sigma#L4762)以单剂量或多剂量腹腔内(i.p.)或口服(p.o.)给药至小鼠以分析肠痛。
两种内脏高敏感性的实验模型
(1)梨形鞭毛虫感染后结合避水应激(water avoidance stress)的双重刺激
在该研究中使用两种表现出内脏高敏感性的IBS动物模型，包括感染后结合心理应激的双重刺激，以及发炎后。在第一个模型中，将小鼠分成两组，其中一组接受梨形鞭毛虫感染后及避水应激的双重刺激(GW)，而另一组则以生理盐水对饲育(pair-fed)且未经处理(PN)以作为未感染无应激的正常对照组。体外(in vitro)培养Axenic梨形鞭毛虫(Giardia lamblia)滋养体(品系GS/M，ATCC 50581)并在对数期收获，如Singer等人(T-cell-dependent control of acute Giardia lamblia infections inmice.Infect.Immun.2000；68:170-175)及Davids等人(Polymeric immunoglobulinreceptor in intestinal immune defense against the lumen-dwelling protozoanparasite Giardia.J Immunol2006；177:6281-6290)所述。将小鼠经口灌胃(gavage)混悬于0.2ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的107个梨形鞭毛虫滋养体，或以相同体积的PBS对饲育。在4至7天后，通过遵循冷休克方案(cold-shock protocol)在小肠中计数能动的滋养体来验证梨形鞭毛虫感染的状态(公开于Scott KG,Yu LCH,Buret AG.Role of CD8+and CD4+ T lymphocytes in jejunal mucosal injury during murinegiardiasis.Infect.Immun.2004；72:3536-3542及Scott KG,Meddings JB,Kirk DR,etal.Intestinal infection with Giardia spp.reduces epithelial barrier functionin a myosin light chain kinase-dependent fashion.Gastroenterology 2002；123:1179-1190)。在小肠中未能检测到滋养体的感染后第六周(清除后阶段)，使小鼠受到慢性心理应激。WAS的程序包括将小鼠放置在具有3cm(垂直高度)室温水的容器(56x 50cm)的中心平台(3x 6cm)上。将小鼠留在该平台上1小时，以避免浸水作为一种心理应激，没有身体上的伤害。连续10天进行该1小时的应激时间以模拟慢性重复应激，并在9:00至12:00之间进行以使昼夜节律的影响最小化。将未感染及无应激的未处理动物作为正常对照组饲养在笼中。在该应激时间的最后一天，在小鼠中测量肠痛。
为了测试GW模型中的止痛作用，在测量肠痛之前90或240分钟以单剂量向小鼠施用新的5-HT7R配体。在另外的设置中，在每次应激时间开始之前30分钟，连续10天重复施用该新配体，并且在最后一次压力时间之后立即测量肠痛。
(2)发炎后模型
在第二个模型中，透过22口径(22-gauge)喂食针结肠内给药于0.2ml 50％乙醇中的10％2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)以诱导肠道发炎。给予假手术对照组相同体积的PBS。在施用TNBS后于各种不同的时间点测量肠道发炎参数及疼痛水平。
为了测试该TNBS后模型中的止痛作用，在90或240分钟之前向小鼠施用单剂量的新颖5-HT7R配体或在测量肠痛之前连续10天重复施用多剂量的新颖5-HT7R配体。
对结直肠扩张的痛觉评估
依照先前描述的方法加上些微修改，由小鼠中对结直肠扩张(CRD)的内脏运动反应(VMR)来测量腹痛(Lu CL,Hsieh JC,Dun NJ,et al.Estrogen rapidly modulates 5-hydroxytrytophan-induced visceral hypersensitivity via GPR30 inrats.Gastroenterology 2009；137:1040-1050；Hong S,Zheng G,Wu X,etal.Corticosterone mediates reciprocal changes in CB 1and TRPV1 receptors inprimary sensory neurons in the chronically stressed rat.Gastroenterology2011；140:627-637e4)。简言之，在VMR实验前至少15天将由Teflon涂覆的不锈钢丝制成的电极(A-M systems,Carlsborg,WA)植入小鼠的腹部外斜肌中。将该电极外露到颈部的背面。在VMR实验之前，使小鼠习惯处于塑料玻璃圆筒中，每天30分钟连续3天。在CRD实验期间，该圆筒被用于部分限制清醒的小鼠。为了记录，将电极连接到肌电图采集系统(electromyogram acquisition system)(AD instruments,New south wales,Australia)。将插入肛门内使其在靠近肛门1.5cm处终止的气球导管充气以扩张结肠。使小鼠接受四次10秒的扩张(15、40及65mmHg)，休息间隔为3分钟。使用连接到P511 AC放大器(Grass instruments,CA,USA)的变换器(AD instruments)及Powerlab装置，以Chart 5软件(AD instruments)放大并数字化肌电图(EMG)活动。矫正EMG活动，并将反应记录为CRD期间EMG振幅的曲线下面积(AUC)相对于基线期间的增加。
组织病理学检查
将肠组织固定于4％多聚甲醛(PFA)中，并且包埋在石蜡中使腺窝绒毛轴(cryptto villus axis)适当定向，然后进行切片。将5-μm厚的切片用二甲苯及分级乙醇去石蜡，用苏木精及伊红(H&E)染色，并在光学显微镜下观察。
反转录聚合酶连锁反应
根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen)从组织样本中提取出全部的RNA。在20μL反应体积中，使用RevertAidTM First Strant cDNA合成套组(Thermo)将RNA(2μg)以寡(dT)15反转录。接着将所得的对应于0.1μg初始RNA的cDNA进行PCR，加入含有1X PCR缓冲液、1U DreamTaqTM DNA聚合酶、0.2mM dNTP混合物、0.4μM上游引物、及0.4μM下游引物的混合试剂(master mix)。PCR反应的特异性引物对如下：小鼠5-HT7R(正向：5’-TCTTCGGATGGGCTCAGAATGT-3’及反向：5’-AACTTGTGTTTGGCTGCGCT-3’)以及β-肌动蛋白(正向：5’-GGGAAATCGTGCGTGAC-3’及反向：5’-CAAGAAGGAAGGCTGGAA-3’)(如Forcen R,LatorreE,Pardo J,et al.Toll-like receptors 2and4modulate the contractile responseinduced by serotonin in mouse ileum:analysis of the serotonin receptorsinvolved.Neurogastroenterol Motil 2015；27:1258-66中所公开者)。编程DNA热循环仪以执行如下方案：95℃持续3分钟1个循环；95℃持续30秒(变性(denaturation))、55℃持续30秒(退火(annealing))、及72℃持续30秒(延长(extension))30个循环；以及72℃持续7分钟进行最后的延长。用未反转录的缺乏cDNA的样本进行阴性对照。接着将RT-PCR产物在0.5μg/mL溴化乙锭存在下于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，用紫外透射仪(ultraviolettransilluminator)显现，并拍摄照片。使用Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析DNA条带(band)的强度。
5-HT7R的免疫荧光染色
将去石蜡的组织切片以含有0.05％Tween-20的10mM柠檬酸三钠缓冲液(pH 6.0)培养并在微波中煮沸。将切片置于室温下冷却。在室温下用于PBS中的1mg/ml NaBH4(pH8.0)淬熄终止反应15分钟后，在室温下用1％牛血清白蛋白封闭组织2小时。将组织切片以一级抗体、兔多株抗5-HT7R(1:300,Abcam)、兔PGP9.5抗体(1:250,GeneTex)或同型对照在4℃培养整夜。用PBS洗涤该切片并以接合至Alexa Fluor 488(1:250,Molecular Probes)的二级山羊抗兔IgG在室温下培养一小时。接着将该组织以Hoechst染料(1μg/ml于PBS中)(Sigma)另外培养30分钟。在荧光显微镜下观察载玻片并拍摄图像。
蛋白免疫印迹(Western Blotting)
用完整的放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液提取肠黏膜蛋白质并进行SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(4至13％聚丙烯酰胺)(如Kuo WT,Lee TC,Yang HY,et al.LPS receptorsubunits have antagonistic roles in epithelial apoptosis and coloniccarcinogenesis.Cell Death Differ 2015；22:1590-1604；Wu LL,Peng WH,Kuo WT,etal.Commensal Bacterial Endocytosis in Epithelial Cells Is Dependent on MyosinLight Chain Kinase-Activated Brush Border Fanning by Interferon-gamma.Am JPathol 2014；184:2260-2274；及Yu LC,Shih YA,Wu LL,et al.Enteric dysbiosispromotes antibiotic-resistant bacterial infection:systemic dissemination ofresistant and commensal bacteria through epithelial transcytosis.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 2014；307:G824-35中所述)。接着在半干式转膜仪(semi-dry blotter)中将解析出的蛋白质电性转印(electrotransfer)到PVDF或硝化纤维素膜上。将印迹用于Tris缓冲盐水(TBS)中的5％(w/v)脱脂奶粉或于含有Tween 20的TBS(TBS-T；0.1％(v/v)Tween-20于TBS中)中的5％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时，用TBS-T洗涤，并以一级抗体在4℃孵育整夜。洗涤该膜并用二级抗体孵育1小时。洗涤后，将该膜以化学发光溶液孵育并检测信号。使用的一级抗体包括兔多株抗5-HT7R(1:500,Abcam)及抗β-肌动蛋白(1:10000,Sigma)。使用的二级抗体是与山葵过氧化酶(horseradish peroxidase)接合的山羊抗兔IgG(1:1000,Cell Signaling)。
统计分析
所有数值均以平均值SEM表示，并通过配对Student t检定进行比较。显著性建立在P<0.05。在两个类IBS小鼠模型中，肠的痛觉高敏感性(hypernociception)与结肠5-HT7R表达的上调相关
利用类IBS内脏高敏感性的两种动物模型来检查一系列为新颖5-HT7R配体的8-苯基异喹啉衍生物的止痛作用。将小鼠分成两组，一组接受梨形鞭毛虫感染后及避水应激(GW)，另一组则对饲育(pair-fed)且未经处理(PN)以作为未感染无应激的正常对照组。将对结直肠扩张的内脏运动反应(visceromoter response(VMR))表示为曲线下面积(AUC)并在每只小鼠中测定以作为肠痛指标。
在第一个模型中，通过梨形鞭毛虫感染后结合心理应激(GW)的双重刺激，与正常对照组相比观察到增加的腹痛(图5(A))。图5B显示PN及GW小鼠中结肠组织学的代表性图像。GW小鼠与正常对照组之间的结肠形态相似(图5(B))。将PN及GW小鼠的结肠组织中的5-HT7R免疫染色。图5(C)显示5-HT7R染色的代表性图像(a小图)以及肌肉/神经及黏膜层中的5-HT7R免疫反应性的定量(b小图及c小图)。图5(D)显示蛋白质免疫印迹(Westernblotting)的结果，其显示GW小鼠中5-HT7R蛋白水平增加。在GW小鼠的结肠组织中观察到5-HT7R的表达上调(图5(C)及图5(D))，在平滑肌、肠神经、及黏膜区域有较高的水平(图5(C))。
在第二个模型中，在第0天结肠内施用小鼠一推注(bolus)的致结肠炎化学物质(colitogenic chemical)TNBS或PBS，并且在各种不同的天数检查及测量肠道发炎及疼痛。这些动物在给予TNBS后的第7、14及24天表现出增加的腹痛(图6(A))。然而，结肠发炎指数(诸如髓过氧化酶活性)及组织病理学评分在第2天达到高峰，并在第7天显示消除(图6B至图6D)。因此，将给予TNBS后的第24天用作检查类IBS内脏高敏感性的时间点。在TNBS小鼠的结肠组织中观察到5-HT7R的表达上调，在平滑肌、肠神经、及黏膜区域有较高的水平(图6E及图6F)。
5-HT7R活化参与IBS模型中的内脏高敏感性
为了验证5-HT7R对于内脏高敏感性的作用以进行概念验证(proof-of-concept)，将一种推定的用于研究的5-HT7R拮抗剂(SB-269970)腹腔内(i.p.,0.5mg/Kg)注射到该动物模型中并通过VMR测量肠痛。透过腹腔内施用SB7显著地抑制了小鼠的肠痛水平(图7)。
新颖5-HT7R配体的止痛作用
合成具有高结合亲和力及水溶性的靶向5-HT7R的新颖8-苯基异喹啉衍生物(化合物I)(化合物6至10，显示于表8中)。在最初的实验中，将化合物6至10(5-HT7R配体)以5mg/kg口服(p.o.)给药至GW小鼠以评估对腹痛的抑制作用。在VMR分析之前90分钟施用5mg/Kg的单剂量。所有测试的化合物均显示出止痛作用，其中化合物8表现出相对于基线水平最强的肠痛抑制(图8)。
为了检查对止痛作用的剂量反应，将化合物8以0.05及0.5mg/kg腹腔内(i.p.)注射、或以1.5及5mg/kg口服(p.o.)注射到GW小鼠。在GW小鼠中观察到化合物8有剂量依赖性镇痛作用(图9A及图9B)。为了验证该镇痛作用是否持久，在疼痛测量之前1.5、4、或12小时向GW小鼠口服给药5mg/kg的CYY1005。在三个时间点观察到疼痛水平降低(图9C)。此外，重复给药化合物8(多剂量)也以剂量依赖的方式降低了GW小鼠的肠痛(图9D)。
向TNBS小鼠口服(p.o.)注射载体(vehicle)或新颖的5-HT7R配体以评估对腹痛的抑制作用。在VMR分析之前90分钟施用5mg/kg的单剂量。在这些TNBS小鼠中，以单剂量口服给药这些新颖5-HT7R配体可减轻肠痛(图10(A))。类似地，以多剂量重复给药化合物8也降低了TNBS小鼠的肠痛(图10(B))。
比较新颖8-苯基异喹啉衍生物与参考标准物之间的镇痛作用及不良反应
在两种动物模型中口服给药化合物I(化合物6至10)与参考标准物以比较它们的止痛效力。这些化合物及参考标准物包括SB7(一种5-HT7R拮抗剂)、阿洛司琼(alosetron)(ALN，一种5-HT3R拮抗剂)、及洛哌丁胺(loperamide)(LPM，一种μ型类鸦片受体(μ-opioidreceptor)激动剂)，将它们在疼痛分析前90分钟以5mg/Kg给药。在GW小鼠中，口服给药ALN减少了肠痛，但与GW小鼠中的化合物8相比效率较低(图8(A))。另一方面，口服给药SB7及LPM对GW小鼠的肠道痛觉没有影响(图11(A))。在第二种动物模型中，施用ALN、SP7、或LPM对TNBS小鼠的肠痛没有影响(图11(B))。
所有给药载体或化合物的小鼠均显示出正常的结肠组织学，除了给药ALN的那些小鼠。在14只给药ALN的小鼠中，有2只(14％)在结肠组织中观察到充血及颗粒性白细胞浸润(图11(C))。
新近FDA批准的药物eluxadoline(一种混合的μ型类鸦片激动剂)及rifamixin(一种不可吸收的肠道特异性抗生素)在最近已被加入到IBS-D的治疗选择。这些药剂代表不同于5-HT7R标靶的分子机制或环境因素。值得注意的是，任何类鸦片激动剂在长期治疗后都会造成药物成瘾的风险。与传统止痛药(例如非类固醇抗消炎药及抗胆碱剂)或抗腹泻类鸦片激动剂(例如洛哌丁胺(loperamide))相比，此系列8-苯基异喹啉衍生物(即5-HT7R拮抗剂)是更有利的，因为它们可能外周选择性地作用于痛觉过敏的肠。
在本发明中，IBS动物模型中的8-苯基异喹啉衍生物(I)(化合物6至10)与阿洛司琼相比表现出更强的镇痛作用而没有副作用，因此它们适用于男性及女性患者，作为IBS治疗的新选择。
参考文献
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Claims (10)

1.一种下列通式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1选自氢、C1-10直链烷基、C1-10支链烷基、(CH2)n(Hete)R10R11R12 及(CH2)nArR10R11R12，其中该n是0至6的整数，Hete是芳香杂环基、Ar是芳香环基，并且R10、R11及R12独立选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6直链饱和烷氧基及C1-6直链饱和卤代烷基；
R2是氢或C1-6直链饱和烷基；以及
X1、X2、X3、X4及X5独立地选自氢、卤代基、硝基、胺基、氰基、乙酰基、C1-6直链饱和烷基、C1-6支链饱和烷基、C1-6 直链饱和烷氧基、C1-6支链饱和烷氧基、C1-6直链饱和烷硫基、C1-6支链饱和烷硫基、C1-6直链饱和卤代烷基及C1-6支链饱和卤代烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述卤代基选自氟、氯、溴及碘。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述芳香杂环基选自吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并恶唑基及苯并噻唑基。
4.如权利要求1所述的化合物，其选自6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(4-硝苯基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇（化合物7）、6-甲氧-8- (2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇（化合物8）、6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-3-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇（化合物9）、及6,7-二甲氧-8-(2-甲氧苯基) -2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉（化合物10）、或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1所述的化合物，其是6-甲氧-8-(2-甲氧苯基)-2-(3-(吡啶-4-基)丙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-醇（化合物8）或其药学上可接受的盐。
6.一种医药组合物，其包含药学上可接受的载体及治疗有效量的如权利要求1、2、3、4、或5所述的化合物或其药学上可接受的盐。
7.一种用于治疗肠易激综合征的方法，其包含步骤如下：向需要其的对象施用有效量的如权利要求6所述的医药组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述肠易激综合征是通过提供对5-HT7受体的拮抗作用来治疗。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述肠易激综合征是通过抑制由感染及之后的应激所引起的疼痛来治疗。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述肠易激综合征是通过抑制由化学诱导的发炎所引起的疼痛来治疗。
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