CN109414419A

CN109414419A - 通过同时靶向能量代谢和细胞内pH进行癌症治疗

Info

Publication number: CN109414419A
Application number: CN201780036914.5A
Authority: CN
Inventors: 安德烈·格林卡; 斯维特拉纳·梅尔尼克; 德米特罗·德沃尔尼科夫; 克里斯托夫·尼许斯
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2019-03-01
Also published as: US20190321311A1; WO2017216257A1; EP3471713A1

Abstract

本发明涉及用于与质子离子载体使用治疗癌症的线粒体呼吸抑制剂，并涉及用于与线粒体呼吸抑制剂使用治疗癌症的质子离子载体。本发明进一步涉及用于同时，分开或相继使用的组合制剂，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂和(ii)质子离子载体，涉及用于治疗癌症的所述组合制剂，以及相关的试剂盒和方法。

Description

通过同时靶向能量代谢和细胞内pH进行癌症治疗

本发明涉及用于与质子离子载体一起治疗癌症的线粒体呼吸抑制剂，并涉及用于与线粒体呼吸抑制剂一起治疗癌症的质子离子载体。本发明进一步涉及用于同时，分开或相继使用的组合制剂，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂和(ii)质子离子载体，涉及用于治疗癌症的所述组合制剂，以及相关的试剂盒和方法。

癌症是西方国家的第四大死亡原因。随着西方人口的平均年龄稳步上升，与癌症相关的死亡人数也在不断增加，这表明癌症将成为21世纪最常见的死亡原因之一。侵袭性癌细胞表型是多种遗传和表观遗传改变的结果，导致细胞内信号传导途径的失调。癌细胞通常不能经历所谓的“程序性细胞死亡”或“细胞凋亡”，这是一种在预防细胞组织异常生长中起关键作用的信号传导过程。

通常可获得三种癌症治疗模式。治愈性手术试图完全切除肿瘤。只有没有转移，这才有可能。有时手术可能是治疗转移(如果只有少数并且容易接近)的一种选择。放疗使用电离辐射(通常为γ射线)来破坏肿瘤。放疗基于这样的原理：具有高代谢率的肿瘤细胞特别容易受到放射诱导的细胞损伤。放疗的抗肿瘤效果必须针对周围健康组织的损害加以权衡。因此，在某些情况下，由于可能对健康组织造成损害，可能的组织损伤可以排除这种选择。此外，放疗仅限于原发肿瘤尚未扩散或仅存在少量转移的情况。

最常用的-在许多情况下是唯一可用的-癌症的全身治疗是化疗。因此，对于患有白血病或实体瘤转移的患者，化疗是唯一的治疗选择。化疗剂对所有快速分裂的细胞都具有细胞毒性。由于癌细胞通常比体内其他细胞分裂得更快，因此它们优选被这些药剂杀死。常见的化疗剂组是通过干扰有丝分裂纺锤体的形成来抑制细胞分裂的物质或例如通过烷化碱基破坏DNA的试剂。因为所有快速分裂的细胞都被化疗剂靶向，所以它们的副作用通常很严重。根据使用的物质，它们包括器官毒性(例如心脏或肾脏)，免疫抑制，神经毒性和贫血。一些化疗剂组，例如烷化剂，甚至有可能导致癌症。由于这些副作用，有时需要减少剂量或必须完全停止化疗。此外，化疗的副作用通常禁止在患者总体情况不良的情况下治疗患者。除了所有这些问题之外，化疗的疗效往往有限。在某些情况下，化疗从一开始就失败了。在其他情况下，肿瘤细胞在治疗过程中变得耐药。为了对抗抗性肿瘤细胞的出现并限制化疗的副作用，使用具有不同作用模式的不同化合物的组合。然而，化疗的成功受到限制，特别是在实体瘤的治疗中。

最近，已经有药物可用，其作用方式不是基于针对快速分裂细胞的毒性。这些化合物对癌细胞显示出更高的特异性，因此与常规化疗剂相比具有更少的副作用。伊马替尼(Imatinib)用于慢性粒细胞白血病的特异性治疗。该化合物特异性地抑制异常的酪氨酸激酶，该激酶是bcr和abl的融合基因的产物。因为这种激酶不会在非恶性细胞中发生，所以用伊马替尼治疗只有轻微的副作用。然而，伊马替尼不用于治疗除髓性白血病以外的血液癌症。利妥昔单抗(Rituximab)是针对分化簇20(CD20)(其在B细胞上广泛表达)的单克隆抗体。它与常规化疗联合用于治疗B细胞淋巴瘤。

已经进行了靶向癌细胞的能量代谢的尝试，例如，通过使用不可代谢的葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖；然而，这种化合物的临床应用受到其副作用的阻碍(Singh等.，Strahlenther Onkol.2005；181(8)：507-14；Marsh等.，Nutr Metab(Lond).2008；5：33)。

在非癌细胞中，质膜外的pH约为7.4，细胞内pH为7.2。已知癌细胞产生反向pH梯度。癌细胞中的细胞外pH为6.5，然而，细胞内pH维持在7.2-7.4的范围内(M.Damaghi等.(2013)，Frontiers in Physiology v.4，370)。在细胞内酸化达到7.0-6.8的pH的情况下，在细胞中诱导不可逆过程导致其死亡(D Lagadic-Gossmann等.(2004)，Cell Death andDifferentiation 11，953-961)。

二甲双胍(Metformin)是用于治疗全世界数百万II型糖尿病患者的一线口服药物。流行病学研究确定了二甲双胍的摄入与多种类型恶性肿瘤的癌症发病风险之间存在联系(Wu等.(2015)，Scientific reports 5：10147)。尽管进行了大量研究，二甲双胍的抗癌机制仍然难以捉摸。以前的研究表明，AMPK活化介导二甲双胍的抗癌作用(Li等.(2015)，Oncotarget 6：7365；Song等.(2012)，Scientific reports 2：362)。然而，这一概念与越来越多的报告(显示AMPK非依赖性抗癌(Vincent等.(2015)，Oncogene 34(28)：3627-39和二甲双胍的抗糖尿病作用(Foretz等.(2014)，Cell metabolism 20：953))相矛盾。作为替代模型，提出二甲双胍抑制癌细胞的线粒体复合物I(Liu等.(2012)，Oncology reports28：1406)。用二甲双胍治疗癌细胞的重要结果是所有核苷酸三磷酸(NTP)的消耗，包括主要的细胞能量当量ATP(Janzer A.等.，2014，PNAS 111(29)：10574-9)。

鉴于上述情况，本领域需要改进的癌症疗法，特别是靶向癌细胞能量代谢的癌症疗法，其优选地避免或很大程度上避免现有技术的缺点。

可以将基于本发明的技术问题视为提供用于满足上述需求的手段和方法。所述技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案解决。

因此，本发明涉及用于与质子离子载体治疗癌症的线粒体呼吸抑制剂。

如以下所使用的，术语“具有”，“包含”或“包括”或其任何语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语都可以指除了由这些术语引入的特征之外在本上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，并且可以指除了存在一个或多个其他特征的情况。作为一个例子，表述“A具有B”，“A包含B”和“A包括B”可以既指A中除B之外不存在其他要素的情况(即A单独并且排他性地由B组成)并且也指在实体A中除了B之外还在存在一个或多个另外的要素(诸如要素C、要素C和D或甚至其他要素)的情况。

此外，如下文中所使用的，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与任选特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，这些术语引入的特征是任选特征，并不意图以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来执行。类似地，由“在本发明的实施例中”或类似的表述引入的特征旨在作为任选特征，对本发明的其他实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明其他任选的或非任选的特征组合的可能性没有任何限制。而且，如果没有另外指出，则术语“约”与指示值±20％有关。此外，如果效果被称为显著，则该术语涉及统计显著性。

如本文所用，术语“线粒体呼吸”涉及在动物细胞的线粒体中再生能量当量，优选三磷酸核苷酸(NTP)，更优选三磷酸腺苷(ATP)的生化反应。优选地，线粒体呼吸是线粒体氧化磷酸化，即由线粒体的膜结合酶复合物催化的氧化还原当量氧化为H₂O，产生跨线粒体内膜的质子梯度，其可被ATP合成酶用于再生ATP。

根据上文，如本文所用，术语“线粒体呼吸抑制剂”涉及如上文所述的抑制线粒体呼吸的化学化合物。优选地，线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I(NADH-辅酶Q氧化还原酶)的抑制剂，线粒体复合物III(Q-细胞色素c氧化还原酶)的抑制剂，线粒体复合物V(ATP合酶)的抑制剂。线粒体复合物的各种抑制剂是本领域已知的，例如，鱼藤酮(rotenone)(作为复合物I的抑制剂)(参见例如Degli Esposti(1998)，Biochimica et Biophysica Acta1364：222)，抗霉素(antimycin)(作为复合物III的抑制剂)，和寡聚霉素(oligomycins)(作为ATP合酶的抑制剂)。更优选地，线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I的抑制剂；甚至更优选地，线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱(Papaverine)(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(BullatacinA，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)(i)至(xiii)中任一项的衍生物，(xv)(i)至(xiv)中任一项的药学上可接受的盐或(xvi)(i)至(xiii)中任一项的前药。最优选地，线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱(Papaverine)，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素(Annonacin)，(iv)(i)至(iii)中任一项的衍生物，(v)(i)至(iii)中任一项的药学上可接受的盐，或(vi)(i)至(iii)中任一项的前药。在优选的实施方案中，线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(PiericidinA，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(BullatacinA，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)苯乙双胍(Phenformin)(CAS号：114-86-3)，(xv)二甲双胍(CAS号码：657-24-9)，(xvi)丁双胍(Buformin，CAS号：692-13-7)，(xvii)NT1014，(xviii)Bay 87-2243(CAS号：1227158-85-1)，(xix)棉酚(CAS号：303-45-7)，(xx)(i)至(xix)中任一项的衍生物，(xxi)(i)至(xx)中任一项的药学上可接受的盐或(xxii)(i)至(xix)中的任一项的前药。最优选地，线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱(Papaverine)，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素(Annonacin)，(iv)苯乙双胍(Phenformin)，二甲双胍，(v)Bay 87-2243，(vi)棉酚(Gossypol)，(vii)(i)至(vi)中任一项的衍生物，(viii)(i)至(vi)中任一项的药学上可接受的盐，或(ix)(i)至(vi)中任一项的前药。NTl014从Zhang等.，Journal of Hematology&Oncology(2016)9：91是技术人员已知的。

本文使用的术语“离子载体”以其本领域技术人员已知的常规含义使用，并且优选地涉及跨动物细胞的生物膜(优选至少在质膜和/或线粒体内膜)运输离子的化学化合物。更优选地，所述化学化合物可逆地结合并跨生物膜运输离子。因此，如本文所用，术语“质子离子载体”也以其本领域技术人员已知的常规含义使用，并且优选地涉及可逆地结合并跨动物细胞生物膜(优选至少在质膜和/或线粒体内膜)运输质子的化学化合物。根据本发明，不要求质子离子载体是特定的质子离子载体，即不要求质子离子载体仅结合并跨生物膜运输质子。因此，优选地，质子离子载体是进一步结合并运输与质子不同的离子优选碱金属离子的化合物。更优选地，质子离子载体是K⁺/H⁺离子载体，例如，尼日利亚菌素(Nigericin)；或者是Na⁺/H⁺离子载体，例如，莫能菌素(monensin)。优选地，质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素(salinomycin)，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素(Alborixin，CAS：57760-36-8)，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206，CAS 36505-48-3)，(XII)灰争菌素(Grisorixin，CAS：31357-58-1)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。在优选的实施方案中，质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)马杜霉素(Maduramicin)，(V)拉沙里菌素(Lasalocid)，(VI)甲基盐霉素(Narasin)，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素(Alborixin，CAS：57760-36-8)，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206，CAS36505-48-3)，(XII)灰争菌素(Grisorixin，CAS：31357-58-1)，(XIII)生度米星(Semduramicin)，(XIV)(I)至(XIII)中任一项的衍生物，(XV)(I)至(XIII)中任一项的前药，或(XVI)(I)至(XIV)中任一项的药学上可接受的盐。

如本文所用，术语“衍生物”涉及在结构上与其衍生自的化合物相似的化合物。优选地，衍生物是可从目标化合物通过本领域技术人员已知的至多三个，优选至多两个，更优选一个衍生化步骤能获得的化合物。更优选地，衍生物是可从目标化合物通过本领域技术人员已知的选自以下的至多三个，优选至多两个，更优选一个衍生化步骤能获得的化合物：(i)烷基化，优选N-和/或O-烷基化，优选甲基化，乙基化，丙基化或异丙基化；(ii)酯化，优选-COOH和/或-OPO₃H₂基团的酯化，优选乙酰化，丙酰化，异丙酰化或琥珀酰化；(iii)酰胺化，优选乙酰胺化；(iv)还原，优选C＝C，羟基和/或羰基；(v)氧化，优选羟基，C-H和/或C-C基团。更优选地，衍生物是N-甲基或N-乙基衍生物，羧酸乙酸酯或琥珀酸酯，或N-乙酰基衍生物。优选地，前药是如上所述的衍生物。

术语“治疗”是指在显著程度上改善本文提及的疾病或病症或伴随其的症状。如本文所用的所述治疗还包括关于本文提及的疾病或病症的健康的完全恢复。应理解，根据本发明使用的治疗在所有待治疗的受试者中可能无效。然而，该术语应要求，优选地，可以成功治疗患有本文提及的疾病或病症的统计学显著部分的受试者。本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间确定，p值确定，学生t检验，Mann-Whitney检验等等，可以毫不费力地确定所述部分是否具有统计学意义。详细信息见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。p值优选为0.1，0.05，0.01，0.005或0.0001。优选地，本发明设想的概率允许诊断对于给定群组或群体的受试者中的至少60％，至少70％，至少80％或至少90％是正确的。

优选地，治疗是抑制肿瘤和/或转移的生长；更优选地，治疗是使肿瘤和/或转移收缩。还优选地，治疗是防止转移，即，优选地，防止癌细胞在与原发肿瘤的位置不同的身体位置中建立转移。在优选的实施方案中，治疗是诱导癌细胞和/或肿瘤坏死。在进一步优选的实施方案中，治疗包括预防胚胎途径信号传导，优选Wnt和/或TGFbeta信号传导。在进一步优选的实施方案中，治疗包括诱导癌细胞的分化，优选包括诱导癌细胞的干细胞特性的丧失。

在本发明的上下文中，“癌症”是指包括人在内的动物疾病，其特征在于一组体细胞(“癌细胞”)的不受控制的生长。这种不受控制的生长可伴随着对周围组织的侵入和破坏以及可能将癌细胞扩散到体内的其他位置(“转移”)。此外，癌症可以包括在明显地从受试者中移除癌细胞的初始治疗后后癌细胞的再现(“复发”)。优选地，癌细胞是癌症干细胞。优选地，癌症不是胰腺癌。

优选地，癌症选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎瘤，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，脑干性胶质瘤，乳腺癌，伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)，类癌瘤，小脑星形细胞瘤，宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，结肠癌，结直肠癌，颅咽管瘤，子宫内膜癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食管癌，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞瘤，肝外胆管癌，胆囊癌，胃癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路胶质瘤，眼内黑色素瘤，卡波西肉瘤(kaposi sarcoma)，喉癌，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑色素瘤，梅克尔细胞癌(merkelcell carcinoma)，间皮瘤，口腔癌，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤，蕈样真菌病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞瘤，卵巢低恶性潜在肿瘤，乳头状瘤病，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，鼻咽癌，嗜铬细胞瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，sézary综合征，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，华氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)和威尔姆氏瘤(wilms tumor)。更优选地，癌症是肿瘤形成性癌症，即是实体癌症。更优选地，癌症是结肠直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌或肺癌。

优选地，癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。如本文所用，术语“对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症”涉及癌症，其中所述癌症的细胞在用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体治疗后显示出活力的显著降低(用常规活力测定法测定(例如，在″Assay Guidance Manual″，G.S.Sittampalam atal.，Bethesda，version 2016一书中综述的一种测定法)，优选基于ATP测量的活力测定)。最优选地，确定灵敏度，确定如本文实施例中所述的Sox4表达。

更优选地，癌症是Wnt信号传导依赖性癌症。优选地，对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症是Wnt信号传导依赖性癌症。如本文所用，术语“Wnt信号传导依赖性癌症”涉及癌症，其中细胞在细胞核和/或细胞质中产生异常高量的β-连环蛋白。优选地，通过活组织检查更优选地根据Gomez-Millan等.2014，BMC Cancer 14：192.分析鉴定Wnt信号传导依赖性癌症。

在优选的实施方案中，癌症是TGFβ信号传导依赖性癌症。术语“TGFβ信号传导依赖性癌症”是技术人员已知的。在进一步优选的实施方案中，癌症包含具有胚胎特性的癌细胞或由其组成，优选癌症干细胞。癌细胞的胚胎标志物是技术人员已知的。

还更优选地，癌症是以下癌症，其中癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后显示未折叠的蛋白质应答。优选地，对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症是以下癌症，其中癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后显示未折叠的蛋白质应答。确定细胞特别是癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后是否显示未折叠的蛋白质应答优选包括使所述细胞与线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体接触并确定未折叠的蛋白质应答的至少一个标志物。更优选地，根据本文上文和实施例中所述的方法，确定细胞特别是癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后是否显示未折叠的蛋白质应答。优选地，未折叠的蛋白质应答的标志物是编码CHOP(优选CHOP10；DDIT3；Gadd153；和/或CEBPZ多肽)的基因的基因产物，例如优选地mRNA或多肽，更优选是编码CHOP多肽的人基因的基因产物，最优选是Genbank AccNo：AAH03637.1 GI：13177718中公开的人CHOP mRNA。还优选地，癌症是以下癌症，其中癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后显示出如本文所述的降低的Sox4表达。

有利地，在基于本发明的工作中发现，线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗癌症具有协同效应，导致改善的癌细胞杀伤。此外，发现通过伴随线粒体呼吸抑制剂的治疗，可以降低质子离子载体的剂量，同时对癌细胞实现相同的杀伤效果，反之亦然。发现在细胞内pH下降，CHOP蛋白/RNA诱导和癌症标志物Sox4的蛋白质/RNA水平降低后不久发生细胞杀伤。

还发现线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗癌细胞对癌细胞中的Wnt信号传导具有强烈的抑制作用。根据本发明的二甲双胍和药物组合阻断了b-连环蛋白下游的Wnt信号传导。这为治疗wnt信号传导依赖性癌症(特别是结肠直肠癌和肺癌，最优选结肠癌)提供了另外的可能性。此外，在基于本发明的工作中令人惊讶地发现，二甲双胍诱导癌细胞中的细胞内酸化，但不诱导非癌细胞中的细胞内酸化。

以上定义比照适用于以下内容。下面进一步做出的另外的定义和解释也适用于本说明书中描述的加上必要的变更的所有实施方案。

本发明进一步涉及用于与线粒体呼吸抑制剂治疗癌症的质子离子载体。

本发明还涉及用于同时，分开或相继使用的组合制剂，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂和(ii)质子离子载体，以及涉及用于治疗癌症的所述组合制剂。

在本申请中提及的术语“组合制剂”涉及在一种制剂中包含本发明的药学活性化合物的制剂。优选地，组合制剂包含在容器中，即优选地，所述容器包含本发明的所有药学活性化合物。优选地，所述容器包含作为单独配制品的本发明的药物活性化合物，即优选一种线粒体呼吸抑制剂配制品和一种质子离子载体配制品。如技术人员将理解的，术语“配制品”涉及化合物的混合物优选药学上可接受的混合物，该混合物包含至少一种本发明的药学活性化合物或由其组成。优选地，组合制剂包含质子离子载体和线粒体呼吸抑制剂，其为单一固体药物形式，例如片剂，其中更优选地，本发明的一种化合物包含在速释或快速释放配制品中，并且本发明的第二化合物包含在缓释或延迟释放配制品中；更优选地，本发明的化合物包含在两种分开的配制品(优选液体的)中；所述分开的液体配制品，优选用于注射，更优选用于受试者身体的不同部位。

优选地，组合制剂用于分开或组合给药。如本文所用，“分开施用”涉及其中至少两种本发明的药学活性化合物经由不同途径和/或在受试者身体的不同部位施用的施用。例如，一种化合物可以通过肠内施用(例如口服)而施用，而第二化合物通过肠胃外施用(例如静脉内)而施用。优选地，分开施用的组合制剂包含至少两种物理分离的制剂用于分开施用，其中每种制剂含有至少一种药学活性化合物；所述替代方案在以下情况下是优选的：例如组合制剂的药学活性化合物必须通过不同途径施用，例如，由于它们的化学或生理学特性，通过肠胃外和口服。相反，“组合施用”涉及本发明的药学活性化合物经由相同途径施用，例如，口服或静脉注射。

还优选地，组合制剂用于同时或顺序施用。如本文所用，“同时施用”涉及本发明的药学活性化合物同时施用，即优选在少于15分钟的时间间隔内施用药学活性化合物，更优选地，在小于5分钟的时间间隔内施用。最优选地，药物活性化合物的施用同时开始，例如，通过吞咽包含药物活性化合物的片剂，或通过吞咽包含一种药物活性化合物的片剂并同时注射第二化合物，或者通过静脉内注射包含一种药物活性化合物的溶液并在身体的不同部分注射第二化合物。相反，如本文所用，“顺序施用”涉及施用引起受试者中药学活性化合物的血浆浓度实现了本发明的协同效应，但是其优选不是如上文所指定的同时施用。优选地，顺序施用是这样的施用，其中药学活性化合物，优选所有药学活性化合物的施用在1或2天的时间间隔内开始，更优选在12h的时间间隔内，更优选在4h的时间间隔内，甚至更优选在1h的时间间隔内，最优选在5分钟的时间间隔内。

优选地，组合制剂是药学上相容的组合制剂。术语“药学上相容的制剂”和“药物组合物”如本文所用涉及包含本发明的化合物和任选一种或多种药学上可接受的载体的组合物。本发明的化合物可以配制成药学上可接受的盐。优选的可接受的盐是乙酸盐、甲酯、HCl、硫酸盐、氯化物等。药物组合物优选局部施用，或更优选全身施用。常规用于药物施用的合适施用途径是口服、静脉内、皮下或肠胃外施用以及吸入。但是，取决于化合物的作用性质和方式，药物组合物也可以通过其他途径施用。而且，所述化合物可以与其它药物组合以普通药物组合物的形式施用或作为如本文别处所述的分开的药物组合物施用，其中所述分开的药物组合物可以以配件试剂盒的形式提供。优选地，组合制剂是关于一种化合物的延长释放制剂，其中术语“延长释放”优选涉及包封在微球中的化合物，所述微球优选基于Medisorb或类似的微球技术(Kim M.R.等.，(2010)，Chem.Comm.(Camb)46：7433)。

优选地，所述化合物按照常规剂型施用，所述常规剂型通过根据常规程序将药物与标准药物载体组合而制备。这些程序可以涉及混合、制粒和压缩或溶解适合所需制剂的成分。应该理解的是，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量。

载体在与配制品的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是可接受的。所用的药物载体可以是例如固体、凝胶或液体。固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸、可降解聚合物例如PLGA(DeYoung at al.(2011)，DIABETES TECHNOLOGY&THERAPEUTICS 13：1145；Ramazani等.，(2016)，Int JPharm.499(1-2)：358-367)等等。示例性液体载体是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、诸如花生油和橄榄油的油、水、乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域公知的延时材料，例如单独的单硬脂酸甘油酯或二单硬脂酸甘油酯或与蜡一起。所述合适的载体包括上面提到的那些和本领域公知的其它载体，参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania.。

选择稀释剂以不影响一种或多种化合物的生物活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液(Ringer′s solutions)、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Hank′ssolution)。此外，药物组合物或配制品还可以包含其他载体、佐剂或无毒的、非治疗性的非免疫原性的稳定剂、活性氧清除剂等。在优选的实施方案中，药物组合物包含诱导宿主细胞优选哺乳动物细胞的cAMP途径的试剂。cAMP途径的诱导物是本领域已知的并且特别包括腺苷酸环化酶的激活剂，优选毛喉素(forskolin)(CAS 66428-89-5)，磷酸二酯酶的抑制剂(例如，咖啡因)，和cAMP类似物，优选8-(4-氯苯硫基)-腺苷-3′，5′-环单磷酸(8-CPT-cAMP，CAS 93882-12-3)或8-溴腺苷3′，5′-环状单磷酸盐(CAS 23583-48-4)。优选地，诱导cAMP途径的药剂是毛喉素或8-CPT-cAMP。

治疗有效剂量是指用于本发明药物组合物中的化合物的量，该量预防、改善或治疗伴随本说明书中提及的疾病或病症的症状。这些化合物的治疗功效和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序，例如ED₅₀(50％群体中治疗有效的剂量)和LD₅₀(50％群体致死剂量)来确定。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀。

剂量方案将由主治医师和其他临床因素确定；优选根据上述任何一种方法。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监测进展情况。典型的剂量可以是，例如，在1至1000μg的范围内；然而，设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。通常，作为药物组合物的常规施用的方案应当在每天1μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则其也应分别在每分钟每千克体重1μg至10mg单位的范围内。优选地，每种药物的延长释放制剂从每1周注射一次至每2个月一次或甚至以更长的间隔注射。可以通过定期评估来监测进展情况。本发明化合物的优选剂量和浓度在本文其他地方说明。

举例来说，肿瘤组织中鱼藤酮的最终浓度优选不小于1.25nM。优选地，血液中的鱼藤酮浓度小于1μM。更优选地，鱼藤酮以延长释放配制品施用，特别是以每月或双月剂量5μg/kg至250μg/kg，更优选14μg/kg至125μg/kg的延长释放微球施用。在另一个非限制性实例中，盐酸罂粟碱可以以50mg至150mg，优选80mg的单一口服剂量的罂粟碱施用。也可以将相同剂量作为静脉内注射施用5分钟。罂粟碱的另一优选剂量为1至25mg/kg，更优选2.2至20mg/kg。

在另一个非限制性实例中，肿瘤组织中沙利霉素，莫能菌素和尼日利亚菌素的优选浓度大于1.25nM。沙利霉素优选以每2天静脉注射100至300μg/kg，更优选200μg/kg的剂量(最优选以延长释放配制品施用)施用于人受试者中用于治疗。与沙利霉素相比，尼日利亚菌素的优选剂量低2-3倍。使用延长释放微球的皮下递送，尼日利亚菌素，莫能菌素和沙利霉素的进一步优选剂量为14μg-125μg/kg。

本文提及的药物组合物和配制品例如在延长释放配制品的情况下优选至少施用一次，以治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病症。然而，所述药物组合物可以施用一次以上，例如每天施用一次至四次，直至非限定天数。一些具有短清除时间的化合物可以在血流中作为输注施用，以在长治疗期间在全身中提供有效剂量。

具体的药物组合物以药学领域熟知的方式制备，并包含与药学上可接受的载体或稀释剂混合的或以其他方式关联的至少一种上文提及的活性化合物。为了制备这些特定的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合，或包裹或包封在胶囊，小药囊(sachet)，扁囊剂(cachet)，纸或其它合适的容器或载体中。所得配制品应适于施用方式，即以片剂，胶囊，栓剂，溶液，悬浮液等形式。剂量建议应在开处方者或使用者说明书中说明，以便根据所考虑的接受者预测剂量调整。

本发明还涉及药物，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂，(ii)质子离子载体，和(iii)至少一种药学上可接受的载体；和涉及用于治疗癌症的所述药物。

本领域技术人员理解术语“药物”。将可以理解，上文对术语“组合制剂”给出的定义优选适用于本发明的加以必要的变更的术语药物。

此外，本发明涉及包含线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的试剂盒，优选包含在壳体中。

如本文所用，术语“试剂盒”是指前述组分的集合。优选地，所述组分与另外的组分组合，优选在外容器内。外容器也优选包括用于实施本发明方法的说明书。在本说明书中给出了试剂盒的这种组分及其使用方法的实例。试剂盒优选在即用型配制品中含有上述组分。优选地，试剂盒还包括说明书，例如，关于本发明方法提供的应用，应用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的用户手册。细节可在本说明书的其他地方找到。另外，这样的用户手册可以提供关于正确使用试剂盒的组件的说明书。用户手册可以纸质或电子形式(例如存储在CD或CD ROM上)提供。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。此外，试剂盒还可以使用从患者获得的癌细胞用于细胞活力测定。

此外，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括：

a)向所述受试者施用线粒体呼吸抑制剂，

b)向所述受试者施用质子离子载体，

c)从而治疗所述受试者的癌症。

优选地，本发明的治疗方法是体内方法。此外，除了上面明确提到的步骤之外，它还可以包括步骤。例如，进一步的步骤可以涉及例如诊断步骤a)的癌症，或施用进一步的治疗，例如，在施用步骤a)和b)中的一个或两个之前，同时或之后，手术，放疗和/或施用癌症治疗剂。而且，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。

在优选的实施方案中，根据本发明的受试者是如上文所述的患有癌症的受试者。在进一步优选的实施方案中，受试者是未患II型糖尿病的受试者。

如本文所用，术语“癌症治疗剂”涉及用于治疗癌症的药剂。如本文所用，术语癌症治疗剂不用于线粒体呼吸抑制剂也不用于质子离子载体，尽管这两组化合物适用于癌症治疗。术语癌症治疗剂优选地涉及以下化学物质，所述化学物质已知在通过将所述化学物质应用于需要其的患者的癌症治疗中抑制癌细胞生长，杀死癌细胞或使患者的身体抑制癌细胞生长或杀死癌细胞。更优选地，癌症治疗剂是化疗剂，靶向治疗剂，免疫疗法剂或其任何组合。

如本文所用，术语“化疗”涉及用抗肿瘤剂治疗受试者。优选地，化疗是以下治疗，所述治疗包括烷化剂(例如环磷酰胺)，铂(例如卡铂)，蒽环霉素(例如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)或柔红霉素(daunorubicin))和拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷(etoposide)，伊立替康(irinotecan)，托泊替康(topotecan)，喜树碱(camptothecin)或VP16)，间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂(例如克唑替尼(Crizotinib)或AP26130)，极光激酶抑制剂(例如N-[4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]嘧啶-2-基]硫烷基苯基]环丙烷甲酰胺(VX-680))，抗血管生成剂(例如贝伐单抗(Bevacizumab))或碘131-1-(3-碘苄基)胍(治疗性间碘苄胍)，HDAC8抑制剂，乳酸脱氢酶抑制剂，单独或其任何合适的组合。应理解，优选地，化疗涉及完整的治疗周期，即一系列若干个(例如四个，六个或八个)剂量的抗肿瘤药物应用于受试者的药物，这些应用之间间隔若干天或若干周不应用。

如本文所用，术语“靶向疗法”涉及向患者应用化学物质，所述化学物质已知通过干扰已知对肿瘤发生或癌症或癌细胞生长必需的特定分子阻断癌细胞生长。本领域技术人员已知的实例是小分子，例如，Bcl-2-抑制剂(例如Obatoclax)和PARP-抑制剂(例如Iniparib)，或单克隆抗体，例如利妥昔单抗或曲妥珠单抗(Trastuzumab)。

如本文所用的术语“免疫疗法”涉及通过调节受试者的免疫应答来治疗癌症。所述调节可以是诱导，增强或抑制所述免疫应答。

此外，本发明涉及一种用于确定患有癌症的受试者是否对组合治疗敏感的方法，所述组合治疗包括施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体，所述方法包括：

a)在所述受试者的癌细胞样品中检测所述癌细胞是否对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感，优选在所述受试者的癌细胞样品中检测(i)所述癌症是否为Wnt信号传导依赖性癌症和/或(ii)所述癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后是否显示未折叠的蛋白质应答，和/或是否显示降低的Sox4表达，和

b)基于步骤a)的检测结果，确定所述患有癌症的受试者是否对包括施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感。

用于确定受试者是否对根据本发明的组合治疗的方法优选是体外方法敏感。此外，除了上面明确提到的步骤之外，它还可以包括进一步的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及例如在步骤a)之前从样品获得癌细胞，或者为所检查的受试者提供癌症治疗的推荐。因此，优选地，用于确定受试者是否对组合治疗敏感的方法是用于提供在决定受试者的进一步治疗中有用的信息的方法。如本领域技术人员将理解的，用于确定受试者是否对组合治疗敏感的方法优选地是向医疗从业者提供相关信息的方法，然而，更优选地，不提供诊断和/或治疗决定。

用于确定细胞特别是癌细胞是否对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的手段和方法已在上文中描述，并且优选地包括比较在存在和不存在有效浓度的所述线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的情况下作为所述细胞的ATP水平测量的活力。优选地，在确定细胞具有统计学上显著降低的活力和/或ATP水平的情况下，则确定所述细胞对本文相关的组合治疗敏感。

用于确定癌症是否是Wnt信号传导依赖性癌症的手段和方法已在上文和实施例中描述。优选地，如果细胞与正常细胞的参照相比确定在细胞核和/或细胞质中含有统计学上显著增加量的b-连环蛋白，则确定所述细胞依赖于Wnt信号传导，并且优选地，确定其对与本文涉及的组合治疗敏感。在优选的实施方案中，所述增加的b-连环蛋白表达的测定如Gomez-Millan(2014)，BMC Cancer.14：192所述进行。

用于确定细胞特别是癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后是否显示未折叠的蛋白质应答或Sox4表达降低的手段和方法已在上文和在实施例中描述。优选地，在与未施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的对照相比确定细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后包含增加量的所述未折叠蛋白质应答的标志物的情况下，则确定所述细胞对本文所涉及的组合治疗敏感。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及用于确定包含施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗在患有癌症的受试者中是否有效的方法，其包括

a)在所述受试者的癌细胞样品中检测(i)Wnt途径的活性，(ii)TGFb途径的活性，和/或(iii)癌症干细胞的存在，和

b)基于步骤a)的检测结果，确定所述治疗是否有效。

用于确定组合治疗是否有效的方法优选是体外方法。此外，除了上面明确提到的步骤之外，它还可以包括进一步的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及例如在步骤a)之前获得样品和/或来自样品的癌细胞，或者在所述步骤之前或之后采取进一步的诊断措施。

用于确定Wnt途径活性的方法是本领域技术人员已知的并且在本文其他地方描述。优选地，确定Wnt途径活性包括确定Axin2表达。用于确定TGFβ途径活性的方法也是本领域技术人员已知的并且在本文其他地方描述。优选地，确定TGFβ途径活性包括确定SKIL表达。确定癌症干细胞存在的方法也是技术人员已知的。优选地，确定癌症干细胞的存在包括确定LGR5表达。优选地，通过检测基因产物(优选至少一种前述基因的RNA)确定上述Wnt途径活性，TGFβ活性和/或癌症干细胞存在。因此，确定组合治疗是否有效的方法优选包括确定Axin2表达，优选Axin2 RNA表达；包括确定SKIL表达，优选SKIL RNA表达；和/或包括确定LGR5表达，优选LGR5 RNA表达。在优选的实施方案中，所述确定RNA表达包括进行定量PCR。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及用于确定包含施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗在患有癌症的受试者中是否有效的试剂盒，其包括

(i)用于检测癌细胞样品中Wnt途径活性的试剂，(ii)用于检测癌细胞中TGFb途径活性的试剂，和/或(iii)用于检测癌症干细胞的存在的试剂。

优选地，用于检测用于确定组合治疗是否有效的试剂盒的试剂是多核苷酸，更优选是与上文所述的基因之一特异性杂交的寡核苷酸。优选地，试剂盒包含本文其他地方描述的试剂盒的其他特征。

此外，本发明涉及用于治疗Wnt信号传导依赖性癌症的二甲双胍。

鉴于以上所述，特别设想了以下实施方案：

1.线粒体呼吸抑制剂，其用于与质子离子载体一起治疗癌症。

2.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

3.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1或2的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

4.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至3中任一项的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(Bullatacin A，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)(i)至(xiii)中任一项的衍生物，(xv)(i)至(xiv)中任一项的药学上可接受的盐或(xvi)(i)至(xiii)中任一项的前药。

5.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至4中任一项的用途，其中所述质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206)，(XII)灰争菌素(Grisorixin)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。

6.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至5中任一项的用途，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，皮肤癌或前列腺癌。

7.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至6中任一项的用途，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。

8.线粒体呼吸抑制剂，其用于用于实施方案1至7中任一项的用途，其中所述对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症是在有效浓度的线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体治疗后显示活力降低至少25％的癌症。

9.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至8中任一项的用途，其中所述癌症治疗是预防转移。

10.质子离子载体，其用于与线粒体呼吸抑制剂一起治疗癌症。

11.质子离子载体，其用于实施方案10的用途，其中所述质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206)，(XII)灰争菌素(Grisorixin)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。

12.质子离子载体，其用于实施方案10或11的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

13.质子离子载体，其用于实施方案10至12中任一项的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

14.质子离子载体，其用于实施方案10至13中任一项的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(Bullatacin A，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)(i)至(xiii)中任一项的衍生物，(xv)(i)至(xiv)中任一项的药学上可接受的盐或(xvi)(i)至(xiii)中任一项的前药。

15.质子离子载体，其用于实施方案10至14中任一项的用途，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌或结肠直肠癌。

16.质子离子载体，其用于实施方案10至15中任一项的用途，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。

17.质子离子载体，其用于实施方案10至16中任一项的用途，其中所述对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症是在有效浓度的线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体治疗后显示活力降低至少25％的癌症。

18.质子离子载体，其用于实施方案10至17中任一项的用途，其中所述癌症治疗是预防转移。

19.用于同时，分开或相继使用的组合制剂，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂和(ii)质子离子载体。

20.实施方案19的组合制剂，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

21.实施方案19或20的组合制剂，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

22.实施方案19至21中任一项的组合制剂，其中所述线粒体呼吸抑制剂是(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(Bullatacin A，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)(i)至(xiii)中任一项的衍生物，(xv)(i)至(xiv)中任一项的药学上可接受的盐或(xvi)(i)至(xiii)中任一项的前药。

23.实施方案19-22中任一项的组合制剂，其中所述质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206)，(XII)灰争菌素(Grisorixin)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。

24.实施方案19至23中任一项的组合制剂，其用于治疗癌症。

25.组合制剂，其用于实施方案24的用途，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌或结肠直肠癌。

26.组合制剂，其用于实施方案24或25的用途，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。

27.组合制剂，其用于实施方案24至26中任一项的用途，其中所述对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症在有效浓度的线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体治疗后显示活力降低至少25％。

28.组合制剂，其用于实施方案24至27的用途，其中所述癌症治疗是预防转移。

29.组合制剂，其用于实施方案24至28的用途，其中所述组合制剂包含鱼藤酮和尼日利亚菌素或包含沙利霉素和罂粟碱。

30.药物，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂，(ii)质子离子载体，和(iii)至少一种药学上可接受的载体。

31.实施方案30的药物，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

32.实施方案30或31的药物，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

33.实施方案30至32中任一项的药物，其中所述线粒体呼吸抑制剂是(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(Bullatacin A，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)(i)至(xiii)中任一项的衍生物，(xv)(i)至(xiv)中任一项的药学上可接受的盐或(xvi)(i)至(xiii)中任一项的前药。

34.实施方案30至33中任一项的药物，其中所述质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206)，(XII)灰争菌素(Grisorixin)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。

35.实施方案30至34中任一项的药物，其用于治疗癌症。

36.药物，其用于实施方案35的用途，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌或结肠直肠癌。

37.药物，其用于实施方案35或36的用途，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。

38.实施方案35至37中任一项的药物，其中所述癌症治疗是预防转移。

39.试剂盒，其包含线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体，优选包含在壳体中。

40.实施方案39的试剂盒，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

41.实施方案39或40的试剂盒，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

42.实施方案39至41中任一项的试剂盒，其中所述线粒体呼吸抑制剂是(i)罂粟碱(Papaverine)，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素(Annonacin)，(iv)(i)至(iii)中任一项的衍生物，(v)(i)至(iii)中任一项的药学上可接受的盐，或(vi)(i)至(iii)中任一项的前药。

43.实施方案39至42中任一项的试剂盒，其中所述质子离子载体是(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)二甲双胍，(V)苯乙双胍，(VI)丁双胍，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206)，(XII)灰争菌素(Grisorixin)，(XIII)(I)至(XII)中任一项的衍生物，(XIV)(I)至(XII)中任一项的前药，或(XV)(I)至(XIII)中任一项的药学上可接受的盐。

44.实施方案39至43中任一项的试剂盒，其进一步包含关于施用所述线粒体呼吸抑制剂疗法的说明书，关于施用质子离子载体疗法的说明书和/或关于施用组合的线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体疗法的的说明书。

45.治疗受试者的癌症的方法，其包括

a)向所述受试者施用线粒体呼吸抑制剂，

b)向所述受试者施用质子离子载体，

c)从而治疗所述受试者的癌症。

46.实施方案45的方法，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌，皮肤癌，前列腺癌或结肠直肠癌。

47.实施方案45或46的方法，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症。

48.实施方案45至47中任一项的方法，其中所述治疗癌症是预防转移。

49.用于确定患有癌症的受试者是否对组合治疗敏感的方法，所述组合治疗包括施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体，所述方法包括：

a)在所述受试者的癌细胞样品中检测所述癌细胞是否对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感，优选在所述受试者的癌细胞样品中检测(i)所述癌症是否为Wnt信号传导依赖性癌症和/或(iii)所述癌细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后是否显示未折叠的蛋白质应答，和

50.实施方案49的方法，其中在步骤a)中所述癌症被检测是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症的情况下，确定所述受试者对包括施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感。

51.二甲双胍，其用于治疗Wnt信号传导依赖性癌症。

52.用于实施方案1至3中任一项的用途的线粒体呼吸抑制剂，用于实施方案10至13中任一项的用途的质子离子载体，实施方案19至21中任一项的组合制剂，实施方案30至32中任一项的药物，或实施方案39至41中任一项的试剂盒，其中所述线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱(CAS号：61-25-6)，(ii)鱼藤酮(CAS号：83-79-4)，(iii)番荔素(CAS号：111035-65-5)，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(CAS号23007-85-4)，(v)3-硝基丙酸(CAS号：504-88-1)，(vi)杀粉蝶菌素A(Piericidin A，CAS号2738-64-9)，(vii)布拉它辛A(Bullatacin A，CAS号123123-32-0)，(viii)Rolliniastatin-1((2S)-4-[(2R，13R)-2，13-二羟基-13-[(5S)-5-[(2S)-5-[(1S)-1-羟基十一烷基]氧杂环戊烷-2-基]十三烷基]-2-甲基-2H-呋喃-5-酮)，(ix)Phenoxan(CAS号134332-63-1)，(x)Thiangazole(CAS号138667-71-7)，(xi)艾地苯醌(Idebenone，CAS号58186-27-9)，(xii)金链菌素(Aureothin，CAS号2825-00-5)，(xiii)β-拉帕醌(β-lapachone)，(xiv)苯乙双胍(CAS号：114-86-3)，(xv)二甲双胍(CAS号码：657-24-9)，(xvi)丁双胍(Buformin，CAS号：692-13-7)，(xvii)NT1014，(xviii)Bay 87-2243(CAS号：1227158-85-1)，(xix)棉酚(CAS号：303-45-7)，(xx)(i)至(xix)中任一项的衍生物，(xxi)(i)至(xx)中任一项的药学上可接受的盐和(xxii)(i)至(xix)中的任一项的前药。

53.用于实施方案1至3中任一项的用途的线粒体呼吸抑制剂，用于实施方案10至13中任一项的用途的质子离子载体，实施方案19至21中任一项的组合制剂，实施方案30至32中任一项的药物，或实施方案39至41中任一项的试剂盒，其中所述线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素，(iv)苯乙双胍，(v)Bay 87-2243，(vi)棉酚，(vii)(i)至(vi)中任一项的衍生物，(viii)(i)至(vi)中任一项的药学上可接受的盐，和(ix)(i)至(vi)中任一项的前药。

54.用于实施方案1至4中任一项的用途的线粒体呼吸抑制剂，用于实施方案10的用途的质子离子载体，实施方案19至22中任一项的组合制剂，实施方案30至33中任一项的药物，或实施方案39至42中任一项的试剂盒，其中所述质子离子载体选自由以下组成的列表：(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)马杜霉素(Maduramicin)，(V)拉沙里菌素(Lasalocid)，(VI)甲基盐霉素(Narasin)，(VII)离子霉素(ionomycin)，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素(Alborixin，CAS：57760-36-8)，(XI)去甲基白霉菌素(Desmethylalborixin，X-206，CAS36505-48-3)，(XII)灰争菌素(Grisorixin，CAS：31357-58-1)，(XIII)生度米星(Semduramicin)，(XIV)(I)至(XIII)中任一项的衍生物，(XV)(I)至(XIII)中任一项的前药，和(XVI)(I)至(XIV)中任一项的药学上可接受的盐。

55.用于确定包含施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗在患有癌症的受试者中是否有效的方法，其包括

b)基于步骤a)的检测结果，确定所述治疗是否有效。

56.用于确定包含施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗在患有癌症的受试者中是否有效的试剂盒，其包括

本说明书中引用的所有参考文献关于其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。

图1：二甲双胍和组合制剂的治疗导致癌细胞系中的细胞内pH下降。在表达pH敏感的GFP变体(EC-GFP)的细胞中进行细胞内pH测量。活细胞在405nm和488nm激发波长下成像，以相应地记录对照和pH敏感的发射。每次处理进行8个生物学重复。误差棒对应于平均值±s.d.；P≤0.0001。a.二甲双胍导致癌细胞(H1975)中的细胞内酸化，但不导致非癌细胞(HEK293)中的细胞内酸化。用二甲双胍处理48小时的表达EC-GFP的H1975和HEK293活细胞的共聚焦显微镜检查。为了排除GFP信号褪色是由于降解的可能性，在暴露于药物后，将细胞转移至补充有5μM Nickricin的pH 8.8的培养基中30分钟，然后再重新成像(二甲双胍pH8.8拯救)。b，c.离子载体药物和线粒体复合物I抑制剂对H1975(b)和DLD1(c)细胞中细胞内pH下降的协同作用。如图所示，在单独或与鱼藤酮或/和尼日利亚组合，和与罂粟碱或/和沙利霉素组合在pH6.5缓冲液中处理细胞27或48小时后进行细胞内pH测量。

图2：二甲双胍抑制癌细胞系中一般癌症标志物基因Sox4的表达，并且对非癌细胞没有影响。Western印迹和qRT-PCR分析。a.二甲双胍抑制Wnt诱导的Sox4。用Wnt3a条件培养基刺激H1703和H1299细胞48小时，并用二甲双胍处理72小时。显示了用作H1703细胞的上样对照的非特异性条带的位置。b.二甲双胍抑制内源性Sox4的表达。用二甲双胍处理DLD1和HCT116细胞72小时。c.二甲双胍抑制H1975细胞内源性Sox4的表达，对非恶性细胞系HEK293t的Sox4无影响。如图所示，用二甲双胍处理H1975和HEK293t细胞72小时。

图3：组合制剂抑制癌细胞系中癌症标志物基因Sox4的蛋白质表达，并且对非癌细胞没有影响。a.离子载体药物和线粒体复合物I抑制剂之间的合作引起Sox4抑制。如图所示，用增加浓度的尼日利亚菌素与5nM的鱼藤酮组合处理48小时的细胞系的WB。对于所有测试的癌细胞系，培养基中的pH在实验开始时为6.8，并且在非癌HEK293t细胞系的情况下，pH为7.4。类似地，用递增浓度的沙利霉素与0.5μM罂粟碱组合处理细胞48小时。

图4.神经保护剂(ROS清除剂)不会通过癌细胞系中的组合制剂干扰Sox4蛋白的消除。a.如图所示，在加入或不加入NAC(N-乙酰半胱氨酸)1mM，DOX(多西环素(Doxycycline))和米诺环素(Minocycline)20μM，Trolox 100μM的情况加，如在实施例4中用本发明的药物组合(尼日利亚菌素10nM，鱼藤酮5nM，罂粟碱HCl 1μm；沙利霉素10nM)处理指示的细胞系。

图5.组合制剂的治疗抑制Wnt信号传导途径。在药物组合存在下用Wnt3a条件培养基诱导48小时的H1299细胞的Western印迹和qRT-PCR分析：10nM沙利霉素和1μM罂粟碱，或3nM尼日利亚菌素和5nM鱼藤酮。

图6：尼日利亚菌素和鱼藤酮在肿瘤异种移植物中协同降低ph_i(实施例7)。如图1所述按所示处理进行细胞内pH(y-轴)测量，以5μg/mg使用尼日利亚菌素，以20μg/mg使用鱼藤酮。

图7：莫能菌素和苯乙双胍共同降低小鼠肿瘤异种移植物的生长速率(实施例8)。测量实施例8的异种移植物的肿瘤生长速率(y轴)；莫能菌素以1.14mg/kg使用，苯乙双胍以100mg/kg使用。

图8：如实施例9中所述的处理对肿瘤细胞中标志物基因表达的影响。

图9：通过实施例10中规定的处理诱导坏死。

以下实例仅将说明本发明。无论如何，它们不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1

在细胞培养实验中评估癌细胞活力。使用各种癌细胞系对尼日利亚菌素/鱼藤酮处理的实例显示所选择的药物对尼日利亚菌素/鱼藤酮在肿瘤微环境(表1-6)的条件下或莫能菌素/鱼藤酮(表7)杀死癌细胞的协同(协作)作用。表1-5显示了对发明的治疗敏感的代表性细胞系。为了比较，表6显示了治疗有效的细胞系的特殊实例，但协同效应不明显。表8显示增加cAMP水平的药物增强了本发明的组合。

细胞活力测定

用指定的药物组合或如所示在模拟肿瘤环境(补充有10％FCS和20mM PIPES的RPMI，调节至pH 6.5)的条件下处理指示的细胞48小时。处理后，分析细胞的细胞活力：

-根据制造商的建议，使用CellTiter-细胞活力测定，Promega。对于每个处理，指示活细胞的比例(％)。未处理的活细胞设定为100％。提供了2个独立实验的平均数据。每个独立实验包含每种条件的4个生物学重复。

-根据制造商的建议，使用CellTiter-细胞活力测定，Promega。对于每个处理，指示活细胞的比例(％)。未处理的活细胞设定为100％。每个测量值代表每种条件下4个生物学重复的平均值。

表1：协同杀死H1975细胞。CellTiter-检测

表2：协同杀死MDA-MB-231细胞。CellTiter-检测。

表3：协同杀死结肠癌细胞。CellTiter-检测。

表4：协同杀死黑色素瘤细胞。CellTiter-检测。

表5：协同杀死前列腺癌细胞。CellTiter-检测。

表6：对胰腺癌细胞没有协同作用。CellTiter-检测。

表7：协同杀死DLD1细胞。CellTiter-检测

表8：细胞内cAMP增加药物增强本发明组合的癌细胞杀伤作用。值是通过CellTiter-检测细胞活力获得的相对值。

表9：协同杀死DLD1细胞。CellTiter-检测

表10：协同杀死B16F10细胞。CellTiter-检测

表11：协同杀死B16F10细胞。CellTiter-检测

表12：协同杀死B16F10细胞。CellTiter-检测

表10：协同杀死H1975细胞。CellTiter-检测

实施例2

在各种癌细胞系和非癌293T细胞中评估细胞内pH的变化。该实施例表明，本发明的组合处理使得在肿瘤微环境条件下在癌细胞中的细胞内pH下降。出人意料的是，发现单独的二甲双胍能够诱导癌细胞(H1975)中的pH下降，但不能诱导非癌HEK293细胞中的pH下降(图1a)。药物的组合对细胞内pH产生协同作用(图1b，1c)。

细胞内pH测量测定

使用稳定表达pH敏感性EC-GFP的细胞系在两种不同激发波长下测量指示的癌细胞系和非癌293T细胞中的细胞内pH，以获得488nm/405nm比率。可以使用标准曲线将该比率转换成细胞内pH值(G等.(1998)，Nature 394(6689)：192-5)。对于实验，将细胞密集接种在96孔平底板(BD 353376)上。从第二天开始，用指定的药物组合在模拟肿瘤环境(补充有10％FCS和20mM PIPES的RPMI，调节至pH 6.5)的条件下处理指示的细胞48小时。对于非癌293T细胞，使用补充有10％FCS的正常，未经修饰的RPMI培养基。使用配备有ECPlan-Neofluar DIC 10x/0.3NA物镜(Carl Zeiss)的LSM710共聚焦显微镜(Carl Zeiss)对活细胞成像。对于每个孔，获得4个视野。使用405nm和488nm激光进行激发，并且对于每个激光使用535/50滤光器收集发射光。使用ImageJ(NIH)软件量化488/405比率。

实施例3

Sox4是在胚胎细胞中表达的转录因子，并且它也经常在癌细胞中表达(Lin C.M.等.，(2013)PloS One 8：e67128)。它也被证明是乳腺癌的癌症干细胞标志物(Zhang J.，等.(2012)Cancer Res.72：4597).此外，Sox4的表达与癌细胞的侵袭性和转移能力相关(Song G.D.，等.(2015)Tumor Biology 36：4167)。

使用Sox4 mRNA和蛋白质的检测，在不同癌细胞系和非癌HEK293T细胞中用二甲双胍处理后评估癌症标志物Sox4表达的变化。此外，测量了wnt信号传导标志物Axin2和对照基因GAPDH的mRNA水平。对于蛋白质表达，测量了wnt信号传导标志物b-连环蛋白和对照蛋白质微管蛋白的细胞质水平。该实施例表明，二甲双胍治疗导致癌症标志物Sox4的强烈减少。它还表明二甲双胍是癌细胞系中的wnt信号传导抑制剂(图2A)。

mRNA和蛋白质测量测定

对于基因表达测量，将细胞接种在6孔板中。第二天，在补充有10％FCS的正常RPMI培养基中，用6mM二甲双胍处理细胞48小时。使用胰蛋白酶/EDTA收获细胞，并分成最多3个等分试样。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)将第一等分试样用于RNA制备，随后使用LC480LightCycler(Roche)进行定量逆转录-PCR(qRT-PCR)分析。用皂苷缓冲液(0.05％皂苷，1mMMgCl₂，1X TBS，2mM ME，1X蛋白抑制剂混合物(Roche))提取第二等分试样，以获得细胞质蛋白质级分。该级分用于b-连环蛋白检测。用Triton裂解缓冲液((TBS(50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，2.7mM Kcl)，1％Triton X-100，2mM β-巯基乙醇(ME)，1mM MgCl₂，10mM焦磷酸钠，10mM NaF，1X蛋白酶抑制剂混合物)提取第三等分试样。该等分试样用于Sox4和α-微管蛋白(对照)蛋白质检测。对于第二和第三等分试样，20-35μl缓冲液用于500,000个细胞。离心后，将提取物用于Western印迹分析。

实施例4

使用Sox4蛋白质的检测，在不同癌细胞系和非癌HEK293T细胞中用组合制剂处理后评估癌症标志物Sox4表达的变化。该实施例表明，组合制剂在肿瘤微环境条件下导致癌细胞中癌症标志物Sox4蛋白水平下降，并且对非癌细胞没有影响。药物组合对Sox4消除产生协同作用。

如实施例3进行实验。将细胞密集接种在6孔板上。从第二天开始，在模拟肿瘤环境的条件(补充10％FCS和20mM PIPES的RPMI，调节至pH6.5)下，用指定的药物组合处理细胞48小时。对于非癌HEK293T细胞，使用补充有10％FCS的未经修饰的RPMI培养基。仅在Triton裂解缓冲液中提取细胞(如实施例3)并在Western印迹中分析。

实施例5

在存在神经保护药物-活性氧(ROS)清除剂的情况下，在各种癌细胞系中用组合制剂处理后评估癌症标志物Sox4表达的变化。通过组合制剂治疗获得的对癌症标志物Sox4的影响不能用众所周知的神经保护药物来拯救。这表明神经保护药物可以包含在药物配制品中而不会降低治疗效果。

如实施例3进行实验。在加入或不加入NAC(N-乙酰半胱氨酸)1mM，DOX(多西环素)和米诺环素20μM，Trolox(维生素E的可溶形式)100μM的情况下，用组合制剂(尼日利亚菌素10nM，鱼藤酮5nM，罂粟碱HC1 1μm；沙利霉素10nM)处理细胞。

实施例6

评估了组合制剂抑制wnt信号传导的能力。该实施例显示组合制剂阻断通过应用含有Wnt3a蛋白的条件培养基在肺癌细胞系中诱导的wnt信号传导。作为wnt信号传导诱导的读数，监测了wnt靶基因Sox4和Axin2的表达。在Sox4和Axin2抑制的同时，CHOP基因由于用组合制剂处理而被激活。注意，细胞质b-连环蛋白水平不受所述处理的影响，证实信号抑制作用发生在b-连环蛋白的下游。该结果为在由APC或b-连环蛋白突变引起的wnt依赖性癌症中使用组合制剂提供了支持。

如实施例3进行实验。接种后一天，在Wnt3a条件培养基或对照培养基中用组合制剂组合(尼日利亚菌素3nM，鱼藤酮5nM，罂粟碱HCl 1μm；沙利霉素10nM)处理细胞48小时。在Triton裂解缓冲液提取物中检测到CHOP蛋白。

实施例7

评估了组合制剂降低体内细胞内pH的能力。该实施例表明，组合制剂能够以协作的方式降低小鼠肿瘤异种移植模型中的细胞内pH。使用IVIS Lumina III(Perkin Elmer)系统进行体内肿瘤成像，其中使用460nm激发和520nm发射滤光器测量pH敏感的EC-GFP信号，使用580nm激发和580nm发射滤光器测量mCherry(标准化信号)。用LivingImage软件V4.4(Caliper Life Sciences)量化图像，并计算EC-GFP与mCherry信号的比率作为细胞内pH变化的读数(类似于实施例2)。该实验提供了证据，即组合制剂以与使用细胞培养物检测的相同方式引起体内细胞内pH下降。

将5至6周龄雌性NMRI裸鼠(nu/nu)(购自Charles River，Sulzfeld，Germany)皮下注射重悬于100μl PBS中的2X10⁶ DLD1_EC-GFP/mCherry结肠癌细胞。在任一方向上肿瘤大小达到5mm后，对小鼠成像，并测量移植肿瘤中的初始对照GFP/mCherry比率。将动物分成四个随机组，每组5只小鼠，并且每周两次腹膜内注射含有尼日利亚菌素5μg/mg或鱼藤酮20μg/mg或两种药物的5mg PLGA微球制剂。对照治疗组注射没有药物的PLGA微球珠。一周后，再次对动物进行成像。在标准化至对照处理和初始信号后，使用GraphPad软件使用非参数t-检验评估EC-GFP/mCherry值。误差棒表示组中5只动物的标准偏差值。**p值＜0.01。结果如图6所示。

实施例8

评估了组合制剂在体内减少肿瘤生长的能力。该实施例表明，组合制剂能够以协作的方式降低小鼠肿瘤异种移植模型中肿瘤生长的速率。该实验提供了组合制剂显著影响体内肿瘤细胞生长速率的证据，类似于使用细胞培养物在实施例1中证明的效果。

将5至6周龄的雌性NSG白化小鼠(NOD scid gamma(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，购自Charles River，Sulzfeld，Germany)皮下注射重悬于100μl PBS的2×106DLD1_EC-GFP/mCherry结肠癌细胞。在任一方向上肿瘤大小达到5mm后，将小鼠分成四个随机化治疗组，每组6或7只小鼠，并且每周两次用5mg/100μl对照PLGA微球制剂或含有莫能菌素(20μg/mg)的PLGA制剂进行腹膜内注射。另外，给予小鼠饮用水或含有苯乙双胍(100mg/kg)的饮用水。每周监测肿瘤生长两次，直至其在任一方向上达到15mm，此时小鼠被安乐死。使用单向ANOVA Dunnett多重比较检验评估肿瘤生长速率。误差条表示组中6(PLGA)或7(所有其他组)个动物的标准误差值。***p值＜0.001.结果如图7所示。

实施例9

评估了组合制剂在体内抑制多能性信号传导途径(Wnt和TGFβ)的能力。所述实施例表明，组合制剂能够以协作的方式抑制来自实施例8中所示的实验中的经处理的小鼠的肿瘤异种移植组织中AXIN2，Wnt信号传导靶基因，SKIL，TGFβ信号传导靶基因和LGR5(干细胞标志物基因)的mRNA表达。该实验提供了证据，即组合制剂显著影响体内与高多能性相关的信号传导途径，包括Wnt和TGFβ信号传导途径，这类似于使用细胞培养物在实施例3中证明的效果。此外，真正的癌症干细胞标志物基因LRG5也受到影响。

将5至6周龄的雌性NSG白化小鼠(NOD scid gamma(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，购自Charles River，Sulzfeld，Germany)皮下注射重悬于100μl PBS的2×106DLD1_EC-GFP/mCherry结肠癌细胞。在任一方向上肿瘤大小达到5mm后，将小鼠分成四个随机化治疗组，每组6(对照)或7个小鼠(所有其他组)，并且每周两次用5mg/100μl对照PLGA微球制剂或含有莫能菌素(20μg/mg)的PLGA制剂进行腹膜内注射。另外，给予小鼠饮用水或含有苯乙双胍(100mg/kg)的饮用水。切除肿瘤组织并在液氮中快速冷冻。使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据制造商的说明分离总RNA，其中包括DNaseI处理步骤。使用LC480 LightCycler(Roche)，使用UPL探针(Roche)使用定量RT-PCR测量相对mRNA表达。将mRNA值标准化为管家基因GAPDH，并使用单向ANOVA Dunnett多重比较检验评估数据的统计学显著性。误差棒表示组中6(对照)或7(所有其他组)个动物的中值的标准误差值。*p值＜0.02。结果显示在图8中。

实施例10

评估了组合制剂影响肿瘤生长和体内诱导坏死的能力。该实施例表明，组合制剂显着诱导实施例8和9中所示的实验中的经处理的小鼠中受影响的肿瘤异种移植组织的坏死。

将5至6周龄的雌性NSG白化小鼠(NOD scid gamma(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，购自Charles River，Sulzfeld，Germany)皮下注射重悬于100μl PBS的2X10⁶ 6DLD1_EC-GFP/mCherry结肠癌细胞。在任一方向上肿瘤大小达到5mm后，将小鼠分成四个随机化治疗组，每组6(对照)或7个小鼠(所有其他组)，并且每周两次用5mg/100μl对照PLGA微球制剂(对照)或含有莫能菌素(20μg/mg)的PLGA制剂进行腹膜内注射。另外，给予小鼠饮用水或含有苯乙双胍(100mg/kg)的饮用水。切除肿瘤组织，并将肿瘤尸检在4％多聚甲醛/PBS中固定16小时并包埋在石蜡中。根据常规程序，用苏木精和伊红染色5μm样本。通过Zeiss Axioskop获取图像并用ImageJ软件处理以评估坏死面积表面。对于每个肿瘤异种移植物，制备4片样品并进行评估。使用单向ANOVA Dunnett的多重比较测试评估数据的统计显著性。误差棒表示组中6(对照)或7(所有其他组)个动物的中值的标准误差值。*p值＝0.025。结果如图9所示。

Claims

2.线粒体呼吸抑制剂，其用于权利要求1的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体ATP产生抑制剂。

3.线粒体呼吸抑制剂，其用于权利要求1或2的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂是线粒体复合物I抑制剂。

4.线粒体呼吸抑制剂，其用于权利要求1至3中任一项的用途，其中所述线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6四氢吡啶，(v)3-硝基丙酸，(vi)杀粉蝶菌素A，(vii)布拉它辛A，(viii)Rolliniastatin-1，(ix)Phenoxan，(x)Thiangazole，(xi)艾地苯醌，(xii)金链菌素，(xiii)β-拉帕醌，(xiv)苯乙双胍，(xv)二甲双胍，(xvi)丁双胍，(xvii)NT1014，(xviii)Bay87-2243，(xix)棉酚，(xx)(i)至(xix)中任一项的衍生物，(xxi)(i)至(xx)中任一项的药学上可接受的盐和(xxii)(i)至(xix)中任一项的前药。

5.线粒体呼吸抑制剂，其用于权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述质子离子载体选自由以下组成的列表：(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)马杜霉素，(V)拉沙里菌素，(VI)甲基盐霉素，(VII)离子霉素，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素，(XII)灰争菌素，(XIII)生度米星，(XIV)(I)至(XIII)中任一项的衍生物，(XV)(I)至(XIII)中任一项的前药，和(XVI)(I)至(XIV)中任一项的药学上可接受的盐。

6.线粒体呼吸抑制剂，其用于用于实施方案1至5中任一项的用途，其中所述癌症是肺癌，乳腺癌或结肠直肠癌。

7.线粒体呼吸抑制剂，其用于实施方案1至6中任一项的用途，其中所述癌症是对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感的癌症，优选是Wnt信号传导依赖性癌症和/或是以下癌症，其中所述癌症的细胞在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后显示出未折叠的蛋白质应答。

8.质子离子载体，其用于与线粒体呼吸抑制剂一起治疗癌症。

9.用于同时，分开或相继使用的组合制剂，其包含(i)线粒体呼吸抑制剂和(ii)质子离子载体。

10.权利要求9的组合制剂，其中所述线粒体呼吸抑制剂选自由以下组成的列表：(i)罂粟碱，(ii)鱼藤酮，(iii)番荔素，(iv)1-甲基4-苯基1，2，3，6四氢吡啶，(v)3-硝基丙酸，(vi)杀粉蝶菌素A，(vii)布拉它辛A，(viii)Rolliniastatin-1，(ix)Phenoxan，(x)Thiangazole，(xi)艾地苯醌，(xii)金链菌素，(xiii)β-拉帕醌，(xiv)苯乙双胍，(xv)二甲双胍，(xvi)丁双胍，(xvii)NT1014，(xviii)Bay87-2243，(xix)棉酚，(xx)(i)至(xix)中任一项的衍生物，(xxi)(i)至(xx)中任一项的药学上可接受的盐，和(xxii)(i)至(xix)中任一项的前药。

11.权利要求9或10的组合制剂，其中所述质子离子载体选自由以下组成的列表：(I)尼日利亚菌素，(II)沙利霉素，(III)莫能菌素，(IV)马杜霉素，(V)拉沙里菌素，(VI)甲基盐霉素，(VII)离子霉素，(VIII)羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)，(IX)羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，(X)白霉菌素，(XI)去甲基白霉菌素，(XII)灰争菌素，(XIII)生度米星，(XIV)(I)至(XIII)中任一项的衍生物，(XV)(I)至(XIII)中任一项的前药和(XVI)(I)至(XIV)中任一项的药学上可接受的盐。

12.权利要求9至11中任一项的组合制剂，其用于治疗癌症。

13.试剂盒，其包含线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体，优选包含在壳体中。

14.用于确定患有癌症的受试者是否对组合治疗敏感的方法，所述组合治疗包括施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体，所述方法包括：

a)在所述受试者的癌细胞样品中检测所述癌细胞是否对线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体的组合治疗敏感，优选在所述受试者的癌细胞样品中检测(i)所述癌症是否为Wnt信号传导依赖性癌症和/或(iii)在施用线粒体呼吸抑制剂和质子离子载体后所述癌细胞是否显示未折叠的蛋白质应答和/或所述癌细胞是否显示Sox4表达降低，和

15.二甲双胍，其用于治疗Wnt信号传导依赖性癌症。