CN110423834A - 一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用，试剂盒包括检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的引物探针组，该引物探针组包括FU引物对、FU探针、EC引物对、EC探针、MY引物对、MY探针、CH引物对和CH探针。本发明所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒具有良好的扩增，灵明度高，已经测试的标本中可低至2000copy/ml。

Description

一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用。
背景技术
细胞治疗制剂在回输病人体内之前，通常应鉴定其是否安全。目前常用的测试方案是利用菌平皿涂布的方式测定是否有大肠杆菌等原核生物的污染。用这一方法检测有着明显的缺陷：1、测定周期长，通常需要培养过夜；2、观测的指标有限，仅测定细菌的污染，而支原体、衣原体、真菌等均被忽视。
现在临床多采用的菌落平板计数法是这样的：将待测样品制成均匀的系列稀释液，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内37℃培养过夜，次日根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞，来判定是否有细菌污染。该方法周期长，不利于长期检测。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用，试剂盒良好扩增，灵明度高。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒，该试剂盒包含检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的引物探针组。
进一步，所述的引物探针组分为四组，分别为真菌/支原体组、真菌/衣原体组、原核菌/支原体组、原核菌/衣原体组；
所述的真菌/支原体组包括FU引物对、FU探针、MY引物对和MY探针，
所述的真菌/衣原体组包括FU引物对、FU探针、CH引物对和CH探针，
所述的原核菌/支原体组包括EC引物对、EC探针、MY引物对和MY探针，
所述的原核菌/衣原体组包括EC引物对、EC探针、CH引物对和CH探针。
进一步，所述的试剂盒上设有4个试孔，所述的真菌/支原体组、真菌/衣原体组、原核菌/支原体组、原核菌/衣原体组分别位于对应的试孔中。
进一步，每种引物的反应终浓度为200-300nM，每种探针的反应终浓度为80-120nM。
一种检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的引物探针组，该引物探针组包括FU引物对、FU探针、EC引物对、EC探针、MY引物对、MY探针、CH引物对和CH探针；
其中，所述的FU引物对包括FU正向引物与FU反向引物：
FU正向引物序列：ACAGAGTTCATGCCCTCACG，
FU反向引物序列：TTTGGGTTTCCTCTGGCAGG；
所述的FU探针序列：fam-GCTTTGGCAGGCCGTGGAAACAC-tamra；
所述的EC引物对包括EC正向引物与EC反向引物：
EC正向引物序列：GGCGCATACAAAGAGAAGCG，
EC反向引物序列：CTCCAATCCGGACTACGACG；
所述的EC探针序列：fam-TCGCGAGAGCAAGCGGACCT-tamra；
所述的MY引物对包括MY正向引物与MY反向引物：
MY正向引物序列：GCCTTGACGGTACCTTGTCA，
MY反向引物序列：GCCCCAAGTTTTAACGCCAG；
所述的MY探针序列：cy3-GCAACGGCTAACTATGTGCCA-BHQ3；
所述的CH引物对包括CH正向引物与CH反向引物：
CH正向引物序列：AAGAAGCACCGGCTAACTCC，
CH反向引物序列：ACGCCCTTTACGCCCAATAA；
所述的CH探针序列：cy3-TGCCAGCAGCTGCGGTAATA-BHQ3。
一种检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的方法，所述的方法基于所述的试剂盒，具体包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)分别使用四组引物探针组进行实时PCR反应检测支原体、衣原体、真菌和原核菌。
进一步，所述的实时PCR反应条件为：预变性：94℃反应15min，变性：94℃反应15s，复性：60℃反应10s，延伸：72℃反应15s，反应循环为40个循环。
进一步，所述的实时PCR反应的反应液包括：模板DNA 1ul，2种正向引物共2ul，2种反向引物共2ul，2种探针共1ul，2*PCR混合溶液10ul，ddH2O 3ul，合计20ul。
一种所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在临床制剂领域中的应用。
进一步，所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在细胞制剂领域中的应用。
所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在免疫细胞制剂领域中的应用。
所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在干细胞制剂领域中的应用。
所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在治疗性体细胞制剂领域中的应用。
相对于现有技术，本发明所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用具有以下优势：
(1)本发明所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒具有良好的扩增，灵明度高，已经测试的标本中可低至2000copy/ml。
(2)本发明所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒具有便捷的优点，取得标本后，从核酸提取，到扩增完成，仅需2.5小时(包含加样)。
(3)本发明所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒稳定性高，并且真正做到了多品系微生物的筛查。
附图说明
图1为Ecoli标准品的扩增曲线；
图2为真菌标准品的扩增曲线；
图3为支原体标准品的扩增曲线；
图4为衣原体标准品的扩增曲线；
图5为Ecoli筛查的扩增曲线；
图6为白色念珠菌筛查的扩增曲线；
图7为沙眼衣原体筛查的扩增曲线；
图8为解脲支原体筛查的扩增曲线。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
1、测定体系建立和检测：
E.coli大肠菌购自天根生化科技(北京)有限公司、沙眼衣原体由天津市长征医院张理涛博士惠赠、解脲支原体由天津市长征医院张理涛博士惠赠和白色念珠菌的标准株由天津市长征医院张理涛博士惠赠，然后分别提取核酸；
(1)E.coli大肠菌阳性标准品的制备：收集培养基中的细胞和类细胞成份，将玻璃纤维膜的样品部分撕下，放入1.5ml离心管中，加入10*浓缩裂解液100ul(0.1M Tris-HClph8.5，0.05M EDTA，2％SDS，5％DTT)，并滴加约900ul蒸馏水，95℃或以上保温10分钟，收集上清液得到核酸；利用已提取的核酸，进行定性PCR扩增，产物克隆入T载体，进一步扩增提取质粒定量，并制备成1010、109、108、107、106、105、104的模板标准液；
定量PCR反应体系制备：
模板标准液1ul，E.coli的上下游引物各1ul(合计2ul)(EC-F:GGCGCATACAAAGAGAAGCG，EC-R:CTCCAATCCGGACTACGACG)，E.coli探针1ul(Ec Probe：cy3-TCGCGAGAGCAAGCGGACCT-BHQ3)，2*realtime PCR Mix 10ul，ddH2O 6ul，合计20ul。
Realtime PCR反应条件如下：
预变性：94℃15min；
变性：94℃15s；
复性：60℃10s；
延伸：72℃15s；
反应循环为40个循环；
Ecoli结果如下图1所示。
(2)真菌阳性标准品的制备：利用已提取的核酸，进行定性PCR扩增，产物克隆入T载体。进一步扩增提取质粒定量，并制备成109、108、107、106、105、104的模板标准液。
定量PCR反应体系制备：
模板标准液1ul，真菌的上下游引物各1ul(合计2ul)(FU-F:ACAGAGTTCATGCCCTCACG，FU-R:TTTGGGTTTCCTCTGGCAGG)，真菌探针1ul(Fu Probe:fam-GCTTTGGCAGGCCGTGGAAACAC-tamra)，2*realtime PCR Mix 10ul，ddH2O 6ul，合计20ul。
Realtime PCR反应条件如下：
预变性：94℃15min；
变性：94℃15s；
复性：60℃10s；
延伸：72℃15s；
反应循环为40个循环；
真菌的结果如图2所示。
(3)支原体阳性标准品的制备：利用已提取的核酸，进行定性PCR扩增，产物克隆入T载体。进一步扩增提取质粒定量，并制备成109、108、107、106、105、104的模板标准液。
定量PCR反应体系制备：
模板标准液1ul，支原体的上下游引物各1ul(合计2ul)(MY-F:GCCTTGACGGTACCTTGTCA，MY-R:GCCCCAAGTTTTAACGCCAG)，支原体探针1ul(My Probe:fam-GCAACGGCTAACTATGTGCCA-tamra)，2*realtime PCR Mix10ul，ddH2O 6ul，合计20ul。
Realtime PCR反应条件如下：
预变性：94℃15min；
变性：94℃15s；
复性：60℃10s；
延伸：72℃15s；
反应循环为40个循环；
支原体的结果如图3所示。
(4)衣原体阳性标准品的制备：利用已提取的核酸，进行定性PCR扩增，产物克隆入T载体。进一步扩增提取质粒定量，并制备成109、108、107、106、105、104的模板标准液。
定量PCR反应体系制备：
模板标准液1ul，衣原体的上下游引物各1ul(合计2ul)(CH-F:AAGAAGCACCGGCTAACTCC，CH-R:ACGCCCTTTACGCCCAATAA)，衣原体探针1ul(Ch Probe:cy3-TGCCAGCAGCTGCGGTAATA-BHQ3)，2*realtime PCR Mix 10ul，ddH2O 6ul，合计20ul。
Realtime PCR反应条件如下：
预变性：94℃15min；
变性：94℃15s；
复性：60℃10s；
延伸：72℃15s；
反应循环为40个循环；
衣原体的结果如图4所示。
2、模拟测试：
将获取的E.coli大肠菌、沙眼衣原体、解脲支原体和白色念珠菌的标准株，利用生理盐水特定稀释到109个/ml，按照1：1000(微生物液：人淋巴细胞培养基)的比例，于人淋巴细胞的培养液中(淋巴细胞的浓度为106个/ml)分别加入标准微生物液，制成各自待测样本。
核酸的提取：分别取上述制备好的样本1ml，利用本研究装置及buffer体系提取DNA。
按照以下体系，制备realtime扩增反应体系：
模板DNA 1ul，上下游引物各1ul(合计4ul)，探针各1ul(合计2ul)，2*PCR Mix10ul，ddH2O 3ul，合计20ul。其中引物及对应探针加入的组合方式请按照下表所示，每份标本的组合均采用复孔，具体如表1所示：
表1 标本组合
Realtime PCR反应条件如下：
预变性：94℃15min；
变性：94℃15s；
复性：60℃10s；
延伸：72℃15s；
反应循环为40个循环；
大肠菌、真菌、衣原体和支原体的结果如图5-8所示。
结果说明：
如图1-4所示，含有指数变化浓度的目标样品，测试后显示出其CT值呈现出标准的等差变化，说明本检测体系可以定量化测定样本中的目标基因。如图5-8所示，本核酸提取和PCR测试可以成功的测试各自目标基因，而无假阳性和假阴性测试结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津纽赛生物技术有限公司
<120> 一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atntnvrsna cagagttcat gccctcacgt ttgggtttcc tctggcaggg ctttggcagg 60
ccgtggaaac acggcgcata caaagagaag cgctccaatc cggactacga cgtcgcgaga 120
gcaagcggac ctgccttgac ggtaccttgt cagccccaag ttttaacgcc aggcaacggc 180
taactatgtg ccaaagaagc accggctaac tccacgccct ttacgcccaa taatgccagc 240
agctgcggta ata 253

Claims (10)

1.一种细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的引物探针组。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒，其特征在于：所述的引物探针组分为四组，分别为真菌/支原体组、真菌/衣原体组、原核菌/支原体组、原核菌/衣原体组；
所述的真菌/支原体组包括FU引物对、FU探针、MY引物对和MY探针，
所述的真菌/衣原体组包括FU引物对、FU探针、CH引物对和CH探针，
所述的原核菌/支原体组包括EC引物对、EC探针、MY引物对和MY探针，
所述的原核菌/衣原体组包括EC引物对、EC探针、CH引物对和CH探针。
3.根据权利要求2所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒上设有4个试孔，所述的真菌/支原体组、真菌/衣原体组、原核菌/支原体组、原核菌/衣原体组分别位于对应的试孔中。
4.根据权利要求2所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒，其特征在于：每种引物的反应终浓度为200-300nM，每种探针的反应终浓度为80-120nM。
5.一种检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的引物探针组，其特征在于：该引物探针组包括FU引物对、FU探针、EC引物对、EC探针、MY引物对、MY探针、CH引物对和CH探针；
其中，所述的FU引物对包括FU正向引物与FU反向引物：
FU正向引物序列：ACAGAGTTCATGCCCTCACG，
FU反向引物序列：TTTGGGTTTCCTCTGGCAGG；
所述的FU探针序列：fam-GCTTTGGCAGGCCGTGGAAACAC-tamra；
所述的EC引物对包括EC正向引物与EC反向引物：
EC正向引物序列：GGCGCATACAAAGAGAAGCG，
EC反向引物序列：CTCCAATCCGGACTACGACG；
所述的EC探针序列：fam-TCGCGAGAGCAAGCGGACCT-tamra；
所述的MY引物对包括MY正向引物与MY反向引物：
MY正向引物序列：GCCTTGACGGTACCTTGTCA，
MY反向引物序列：GCCCCAAGTTTTAACGCCAG；
所述的MY探针序列：cy3-GCAACGGCTAACTATGTGCCA-BHQ3；
所述的CH引物对包括CH正向引物与CH反向引物：
CH正向引物序列：AAGAAGCACCGGCTAACTCC，
CH反向引物序列：ACGCCCTTTACGCCCAATAA；
所述的CH探针序列：cy3-TGCCAGCAGCTGCGGTAATA-BHQ3。
6.一种检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的方法，其特征在于：所述的方法基于权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，具体包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)分别使用四组引物探针组进行实时PCR反应检测支原体、衣原体、真菌和原核菌。
7.根据权利要求6所述的检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的方法，其特征在于：所述的实时PCR反应条件为：预变性：94℃反应15min，变性：94℃反应15s，复性：60℃反应10s，延伸：72℃反应15s，反应循环为40个循环。
8.根据权利要求6所述的检测支原体、衣原体、真菌和原核菌的方法，其特征在于：所述的实时PCR反应的反应液包括：模板DNA 1ul，2种正向引物共2ul，2种反向引物共2ul，2种探针共1ul，2*PCR混合溶液10ul，ddH2O 3ul，合计20ul。
9.一种权利要求1-4中任一项所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在临床制剂领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒的应用，其特征在于：所述的细胞制剂的微生物安全性评价试剂盒在细胞制剂领域中的应用。
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王军志: "生物技术药物的发展与质量控制", 《齐鲁药事》 *

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