CN110361479A - 一种检测多种磺胺类药物残留的方法和应用 - Google Patents
一种检测多种磺胺类药物残留的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测多种磺胺类药物残留的方法和应用，属于分析化学的技术领域，其技术方案要点是包括以下步骤：（a）制备磺胺类药物供试样品溶液和对照品溶液；（b）采用高效液相色谱，对步骤（a）供试样品溶液中的磺胺类药物含量进行分析；流动相：水相为0.05‑0.15%乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为35：65~65：35；（c）以峰面积进行磺胺类药物的定量分析，依据对标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出磺胺类药物残留量；所述对照品制作的标准曲线也是依照上述步骤（b），采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件下得出的，该检测方法达到了更加灵敏、准确的检测磺胺类药物的效果。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学的技术领域，特别涉及一种检测多种磺胺类药物残留的方法和应用。
背景技术
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一大类具有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，被用于细菌感染性疾病的预防和治疗。磺胺类药物具有广谱的抗菌性、药效持续稳定、便宜易获取等优点。该药物进入动物体内，可蓄积在肉、卵和乳中，最终经人食用进入人体富集。从而导致人体产生变态、过敏反应，产生细菌性感染耐药性，致畸、致突变、致癌等严重后果。
目前磺胺类药物的检测方法主要有紫外分光光度法、永停滴定法、气相色谱法等。紫外分光光度法是比较经典的方法，但灵敏度不高，由于磺胺类药物具有极其相近的吸收峰容易造成相互干扰，不利于多种磺胺类药物的同时分析。永停滴定法所用试剂毒性大，技术难于掌握，且测定的是磺胺类药物的总量，并不能区分是哪种磺胺类药物。因此，建立一种灵敏、准确的磺胺类药物的检测方法是十分紧迫和必要的。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的目的一在于：提供一种检测多种磺胺类药物残留的方法，以达到灵敏、准确的同时检测多种磺胺类药物的效果。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案得以实现的：一种检测多种磺胺类药物残留的方法，包括以下步骤：
(a)制备磺胺类药物供试样品溶液和对照品溶液；
(b)采用高效液相色谱，对步骤(a)供试样品溶液中的磺胺类药物含量进行分析；
流动相：水相为0.05-0.15％乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为35：65～65：35；
(c)以峰面积进行磺胺类药物的定量分析，依据对标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量；
所述对照品制作的标准曲线也是依照上述步骤(b)，采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件下得出的。
需要说明的是，本发明检测的磺胺类药物主要包括13种：磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、苯酰磺胺、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺吡唑、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶。
通过采用上述方案，采用高效液相色谱分析法，将磺胺类药物供试样品注射进色谱柱，在泵的传输下样品随着流动相在固定相中向前移动，由于被测磺胺类药物中的不同种类的磺胺药物与固定相的作用强度与类型不一样(分配或吸附)，因此在流经色谱柱时会逐渐的分离，以各自的速度通过色谱柱，流经检测器时可以采集到各自的响应形成色谱峰，然后再处理比较这些峰的大小来确认磺胺类药物中各组分的类别及含量。
上述检测多种磺胺类药物残留的方法，可以分析多种磺胺类药物含量，测定结果较简单的紫外分光广度法和永停滴定方法更为准确，具有灵敏度高，准确度高等优点。而且该检测方法消耗时间短，组分不易留在柱中残留，不破坏样品，可多次进样。
本发明进一步设置为：所述流动相：水相为0.08-0.12％的乙酸溶液；有机相中甲醇和乙腈的体积比为45：55～60：40。
通过采用上述方案，进一步优化流动相的组分和配比，可以使供试样品在流动相体系中更稳定的存在，使主峰和杂质峰更好地分离，峰形更良好。
本发明进一步设置为：所述流动相梯度洗脱条件程序包括0-5min：有机相20％；5-13min：有机相20％-40％；13-22min：40％-90％；22-30min：90％-20％；30-35min：有机相20％。
通过采用上述方案，采用梯度洗脱的方式可以缩短不同磺胺类药物的出峰时间差距，且能保证各种磺胺类药物的出峰度符合要求，缩短了整个检测方法的分析时间，减少了时间和试剂的浪费。
本发明进一步设置为：所述步骤(b)中高效液相色谱的检测条件还包括：
流速：0.8～1.2mL/min；
柱温：28-32℃；
进样量：10μL。
通过采用上述方案，流速决定了样品的出峰时间，柱温与色谱柱的磺胺类药物分离效果有一定影响，通过对流速和柱温的优化，可以获得良好的分离效果，进一步提升了同时检测多种磺胺类药物的准确度。
本发明进一步设置为：所述供试样品溶液的制备包括以下步骤：
(i)提取：称取3-5g样品组织，加入15-20mL乙腈后混匀，超声提取2-5min，8000-10000g，离心4-6min，回收上清液；重复提取剩余物两次，合并上清液；合并后的上清液用氮气吹干，加入3-5mL乙腈溶解残渣，得到供试样品粗溶液；
(ii)净化：取3-5mL供试样品粗溶液，加入5-7mL正己烷混合均匀，离心弃去正己烷，分取2-3mL下层清液，氮气吹至近干，1-2mL流动相定容，得到供试样品溶液。
通过采用上述方案，采用有机相中使用的乙腈作为有机溶剂来提取样品组织中的磺胺类药物，可以在检测时减少引入新的杂质，提高检测结果的精确度。
采用快速溶剂萃取法净化提取的含磺胺类药物的供试样品溶液，采用的萃取溶剂用量少，操作简单，而且萃取效率高，回收率和重复性好。
本发明进一步设置为：所述对照样品溶液采用乙腈溶液稀释，配置成浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的系列混合标准品溶液。
通过采用上述方案，使用乙腈将磺胺类药物的标准品溶液稀释成一系列浓度的对照样品溶液，可以在使用对照样品溶液检测制作标准曲线时，提高制作的标准曲线的精准度，还可以避免使用其它有机溶剂引入新的杂质而影响检测结果的准确度。
本发明进一步设置为：所述供试样品溶液还包括空白样品溶液，空白样品溶液为流动相。
通过采用上述方案，在采用流动相进行梯度洗脱时，因为基线不稳，加入空白样品溶液显示溶剂峰，在以峰面积进行磺胺类药物的定量分析时扣除溶剂峰，可以提高检测结果的准确度。
本发明的目的二在于：提供上述检测多种磺胺类药物残留的方法在食品行业中监测药物残留中的应用。
我国食品检测行业的检验依据主要有国家标准、行业标准、地方标准和企业标准，现有的磺胺类药物检验标准有近百个，每一个标准都涵盖了一种或几种基质食品，在实际检验操作中，方法标准是检验依据，所以必须严格按照标准执行。本发明中检测13种磺胺类药物，基本涵盖了检测工作中涉及到的常见基质，同时检测多种磺胺类药物的含量，提高了检验效率，减少了实际操作的工作量，扩大了应用范围。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用高效液相色谱，以标准曲线法对多种磺胺类药物含量同时进行分析，解决了现有技术紫外分光光度法和永停滴定法的测定方法灵敏度不高，不利于多组分磺胺类药物的同时分析的技术问题，采用本发明方法能够准确检测多种磺胺类药物的含量，检测结果的准确度高，灵敏度高。
2、本发明方法中样品及流动相配制，整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于实际应用和推广。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
实施例1
1、磺胺类药物的测定
1.1高效液相色谱法的色谱条件：
色谱柱：Agilent HC-C18柱；
流动相组成体积比：水相为0.1％乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为60：40，梯度洗脱见表1；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：270nm；
进样量：10μL。
表1-流动相梯度洗脱条件
| 时间(min) | 水相(％) | 有机相(％) |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 80 | 20 |
| 13 | 60 | 40 |
| 22 | 10 | 90 |
| 30 | 80 | 20 |
| 35 | 80 | 20 |
1.2高效液相色谱测定磺胺类药物的方法，包括以下步骤：
流动相配制：精确称取1mL乙酸用水溶解稀释至1000mL，用0.45μm水系膜过滤，制备水相待用；取0.45μm有机系膜过滤后的乙腈与色谱纯的甲醇按60：40的体积比配成有机相待用；
对照品溶液的制备：精确称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、苯酰磺胺、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺吡唑、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶13种磺胺类药物标准品各10mg，于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的磺胺类药物混合标准溶液，使用前用0.2μm有机系膜过滤，待用；
供试样品溶液的制备：(i)提取：称取3g猪肉样品组织，加入20mL乙腈后混匀，超声提取5min，10000g，离心5min，回收上清液；重复提取剩余物两次，合并上清液；合并后的上清液用氮气吹干，加入5mL乙腈溶解残渣，得到供试样品粗溶液；
(ii)净化：取5mL供试样品粗溶液，加入5mL正己烷混合均匀，离心弃去正己烷，分取3mL下层清液，氮气吹至近干，1mL流动相定容，得到供试样品溶液。
空白样品溶液制备：80％水相+20％流动相；
测定：按上述高效液相色谱法的色谱条件按外标法测定供试品溶液中磺胺类药物的含量。
2、磺胺类药物的测定方法验证
2.1线性关系精密量取上述13种对照品溶液，置于容量瓶中，乙腈定容，摇匀，分别得质量浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的线性溶液。按照上述色谱条件测定，每份线性溶液测定3次，取峰面积平均值，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表2。
表2-十三种磺胺类药物的线性范围和检测限
| 种类 | 线性方程 | R<sup>2</sup> | 检测限(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | A＝10.036c+0.472 | 0.994 | 0.1 |
| 磺胺吡啶 | A＝10.853c+0.371 | 0.998 | 0.1 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | A＝7.657c+0.681 | 0.991 | 0.1 |
| 苯酰磺胺 | A＝10.129c+0.302 | 0.997 | 0.1 |
| 磺胺间甲氧嘧啶 | A＝50.868c-0.085 | 0.999 | 0.1 |
| 磺胺氯哒嗪 | A＝27.753c+1.352 | 0.991 | 0.1 |
| 磺胺甲噁唑 | A＝40.737c-0.538 | 0.996 | 0.1 |
| 磺胺异噁唑 | A＝11.157c-0.642 | 0.997 | 0.1 |
| 磺胺二甲氧哒嗪 | A＝8.143c+0.842 | 0.994 | 0.1 |
| 磺胺吡唑 | A＝10.953c+0.322 | 0.999 | 0.1 |
| 磺胺噁唑 | A＝36.843c-0.643 | 0.998 | 0.1 |
| 磺胺甲基嘧啶 | A＝50.417c-0.056 | 0.999 | 0.1 |
| 磺胺二甲基嘧啶 | A＝48.643c-0.843 | 0.999 | 0.1 |
由表2可见，磺胺类药物浓度在10～5000μg/L范围内，有较好的线性，相关系数R2均大于0.99，检测限为0.1μg/kg，具有较高的检测灵敏度。
2.2测定结果将配制的磺胺类药物供试样品溶液，按照上述色谱条件测定，通过标准曲线计算得出：磺胺类药物的药物浓度见表3，计算公式参照GB29694-2013，计算磺胺类药物的残留量(μg/kg)。
表3-供试样品测试浓度
| 种类 | 峰面积 | 药物浓度(μg/mL) | 残留量(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | 22146 | 2.21 | 0.74 |
| 磺胺吡啶 | 18483 | 1.70 | 0.57 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 20154 | 2.63 | 0.88 |
| 苯酰磺胺 | 26481 | 2.61 | 0.87 |
| 磺胺间甲氧嘧啶 | 20144 | 0.40 | 0.13 |
| 磺胺氯哒嗪 | 24281 | 0.87 | 0.29 |
| 磺胺甲噁唑 | 21256 | 0.52 | 0.17 |
| 磺胺异噁唑 | 20274 | 1.82 | 0.61 |
| 磺胺二甲氧哒嗪 | 18935 | 2.33 | 0.78 |
| 磺胺吡唑 | 26842 | 2.45 | 0.82 |
| 磺胺噁唑 | 24281 | 0.66 | 0.22 |
| 磺胺甲基嘧啶 | 19534 | 0.39 | 0.13 |
| 磺胺二甲基嘧啶 | 21187 | 0.44 | 0.15 |
2.3精密度试验精密称取磺胺类药物标准品10mg，加乙腈适量使溶解，定容至100mL容量瓶中，制成质量浓度为100μg//mL的含磺胺类药物的标准溶液，摇匀，取该溶液重复进样3次，记录峰面积平均值，计算进样精密度，结果见表4。
表4-进样精密度试验结果
由表4可见，进样精密度的峰面积的RSD％小于2％，精密度较高。
2.4准确度——回收率试验采用阴性猪肉样品(磺胺类药物均无检出)进行测定，采用样品中添加标准溶液的方法，在同样的样品处理条件下对13种磺胺类药物进行加标回收率实验，结果见表5。
表5-回收率试验结果
| 种类 | 回收率(％) | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 97.6 | 1.64 |
| 磺胺吡啶 | 99.4 | 1.33 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 97.8 | 1.48 |
| 苯酰磺胺 | 98.6 | 1.87 |
| 磺胺间甲氧嘧啶 | 98.7 | 1.45 |
| 磺胺氯哒嗪 | 99.2 | 1.56 |
| 磺胺甲噁唑 | 102.8 | 1.02 |
| 磺胺异噁唑 | 98.4 | 1.74 |
| 磺胺二甲氧哒嗪 | 101.7 | 1.17 |
| 磺胺吡唑 | 99.3 | 1.63 |
| 磺胺噁唑 | 99.8 | 1.85 |
| 磺胺甲基嘧啶 | 100.4 | 1.66 |
| 磺胺二甲基嘧啶 | 98.9 | 1.7 |
由表5可见，磺胺类药物的平均回收率均大于97％以上，RSD％均小于2％，该检测方法的准确度较高。
实施例2
从实施例1中选取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物，改变色谱条件进行实验。
1、磺胺类药物的测定
1.1高效液相色谱法的色谱条件：
流动相组成体积比：水相为0.15％乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为35：65；其余与实施例1相同。
1.2高效液相色谱测定磺胺类药物的方法，包括以下步骤：
流动相配制：精确称取1.5mL乙酸用水溶解稀释至1000mL，用0.45μm水系膜过滤，制备水相待用；取0.45μm有机系膜过滤后的乙腈与色谱纯的甲醇按50：50的体积比配成有机相待用；
对照品溶液的制备：精确称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物标准品各10mg，于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的磺胺类药物混合标准溶液，使用前用0.2μm有机系膜过滤，待用；
供试样品溶液的制备：与实施例1相同；
空白样品溶液制备：与实施例1相同；
测定：按上述高效液相色谱法的色谱条件按外标法测定供试品溶液中磺胺类药物的含量。
2、磺胺类药物的测定方法验证
2.1线性关系精密量取上述磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种对照品溶液，置于容量瓶中，乙腈定容，摇匀，分别得质量浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的线性溶液。按照上述色谱条件测定，每份线性溶液测定3次，取峰面积平均值，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表6。
表6-三种磺胺类药物的线性范围和检测限
| 种类 | 线性方程 | R<sup>2</sup> | 检测限(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | A＝10.154c+0.371 | 0.996 | 0.1 |
| 磺胺吡啶 | A＝10.775c+0.324 | 0.999 | 0.1 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | A＝7.556c+0.706 | 0.994 | 0.1 |
由表6可见，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物浓度在10～5000μg/L范围内，有较好的线性，相关系数R2均大于0.99，检测限为0.1μg/kg，具有较高的检测灵敏度。
2.2测定结果将配制的磺胺类药物供试样品溶液，按照上述色谱条件测定，通过标准曲线计算得出：磺胺类药物的药物浓度见表7，计算公式参照GB29694-2013，计算磺胺类药物的残留量(μg/kg)。
表7-供试样品测试浓度
| 种类 | 峰面积 | 药物浓度(μg/mL) | 残留量(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | 22217 | 2.19 | 0.73 |
| 磺胺吡啶 | 18376 | 1.71 | 0.57 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 20208 | 2.67 | 0.89 |
由表7与表3的结果比较可知，实施例2中改变流动相的条件，对磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物浓度检测结果和残留量几乎没有影响，证明了本检测方法的检测稳定性好。
2.3精密度试验精密称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物标准品10mg，加乙腈适量使溶解，定容至100mL容量瓶中，制成质量浓度为100μg//mL的含磺胺类药物的标准溶液，摇匀，取该溶液重复进样3次，记录峰面积平均值，计算进样精密度，结果见表8。
表8-进样精密度试验结果
| 种类 | 峰面积 | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 22097 | 1.47 |
| 磺胺吡啶 | 18514 | 1.35 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 20538 | 1.61 |
由表8可见，实施例2改变流动相的条件后，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物的进样精密度的峰面积的RSD％小于2％，精密度较高。
2.4准确度——回收率试验采用阴性猪肉样品(磺胺类药物均无检出)进行测定，采用样品中添加标准溶液的方法，在与实施例1同样的样品处理条件下对13种磺胺类药物进行加标回收率实验，结果见表9。
表9-回收率试验结果
| 种类 | 回收率(％) | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 98.2 | 1.67 |
| 磺胺吡啶 | 99.1 | 1.41 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 98.3 | 1.51 |
由表9可见，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物的平均回收率均大于98％以上，RSD％均小于2％，该检测方法的准确度较高。
实施例3
从实施例1中选取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物，改变色谱条件进行实验。
1、磺胺类药物的测定
1.1高效液相色谱法的色谱条件：
流动相组成体积比：水相为0.05％乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为65：35；其余与实施例1相同。
1.2高效液相色谱测定磺胺类药物的方法，包括以下步骤：
流动相配制：精确称取0.5mL乙酸用水溶解稀释至1000mL，用0.45μm水系膜过滤，制备水相待用；取0.45μm有机系膜过滤后的乙腈与色谱纯的甲醇按50：50的体积比配成有机相待用；
对照品溶液的制备：精确称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物标准品各10mg，于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的磺胺类药物混合标准溶液，使用前用0.2μm有机系膜过滤，待用；
供试样品溶液的制备：与实施例1相同；
空白样品溶液制备：与实施例1相同；
测定：按上述高效液相色谱法的色谱条件按外标法测定供试品溶液中磺胺类药物的含量。
2、磺胺类药物的测定方法验证
2.1线性关系精密量取上述磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种对照品溶液，置于容量瓶中，乙腈定容，摇匀，分别得质量浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的线性溶液。按照上述色谱条件测定，每份线性溶液测定3次，取峰面积平均值，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表10。
表10-三种磺胺类药物的线性范围和检测限
| 种类 | 线性方程 | R<sup>2</sup> | 检测限(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | A＝10.113c+0.418 | 0.997 | 0.1 |
| 磺胺吡啶 | A＝10.803c+0.423 | 0.998 | 0.1 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | A＝7.617c+0.571 | 0.994 | 0.1 |
由表10可见，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物浓度在10～5000μg/L范围内，有较好的线性，相关系数R2均大于0.99，检测限为0.1μg/kg，具有较高的检测灵敏度。
2.2测定结果将配制的磺胺类药物供试样品溶液，按照上述色谱条件测定，通过标准曲线计算得出：磺胺类药物的药物浓度见表11，计算公式参照GB29694-2013，计算磺胺类药物的残留量(μg/kg)。
表11-供试样品测试浓度
| 种类 | 峰面积 | 药物浓度(μg/mL) | 残留量(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | 22184 | 2.19 | 0.73 |
| 磺胺吡啶 | 18504 | 1.68 | 0.56 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 20076 | 2.61 | 0.87 |
由表11与表3的结果比较可知，实施例2改变流动相的条件，对磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物浓度检测结果和残留量几乎没有影响，证明了本检测方法中的检测稳定性好。
2.3精密度试验精密称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物标准品10mg，加乙腈适量使溶解，定容至100mL容量瓶中，制成质量浓度为100μg//mL的含磺胺类药物的标准溶液，摇匀，取该溶液重复进样3次，记录峰面积平均值，计算进样精密度，结果见表12。
表12-进样精密度试验结果
| 种类 | 峰面积 | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 22027 | 1.51 |
| 磺胺吡啶 | 18482 | 1.43 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 20126 | 1.71 |
由表12可见，改变流动相的条件后，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物的进样精密度的峰面积的RSD％小于2％，精密度较高。
2.4准确度——回收率试验采用阴性猪肉样品(磺胺类药物均无检出)进行测定，采用样品中添加标准溶液的方法，在同样的样品处理条件下对磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物进行加标回收率实验，结果见表13。
表13-回收率试验结果
由表13可见，磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物的平均回收率均大于98％以上，RSD％均小于2％，该检测方法的准确度较高。
对比例从实施例1中选取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物，改变色谱条件进行实验。
1、磺胺类药物的测定
1.1高效液相色谱法的色谱条件：
流动相：0.1％甲酸+乙腈；其余与实施例1相同。
1.2高效液相色谱测定磺胺类药物的方法，
流动相配制：精确称取1.0mL甲酸用水溶解稀释至1000mL，用0.45μm水系膜过滤，制备水相待用；取0.45μm有机系膜过滤后的乙腈与0.1％甲酸混合待用；
对照品溶液的制备：精确称取磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物标准品各10mg，于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL的磺胺类药物混合标准溶液，使用前用0.2μm有机系膜过滤，待用；
供试样品溶液的制备：与实施例1相同；
空白样品溶液制备：与实施例1相同；
测定：按上述高效液相色谱法的色谱条件按外标法测定供试品溶液中磺胺类药物的含量。
2、磺胺类药物的测定方法验证
2.1线性关系精密量取上述磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种对照品溶液，置于容量瓶中，乙腈定容，摇匀，分别得质量浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的线性溶液。按照上述色谱条件测定，每份线性溶液测定3次，取峰面积平均值，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表14。
表14-三种磺胺类药物的线性范围和检测限
由表2与表14的结果比较可知，对比例的检测限明显不如本实施例1的检测限小，本发明实施例1的检测灵敏度明显高于对比例。
2.2测定结果将配制的磺胺类药物供试样品溶液，按照上述色谱条件测定，通过标准曲线计算得出：磺胺类药物的药物浓度见表15，计算公式参照GB29694-2013，计算磺胺类药物的残留量(μg/kg)。
表15-供试样品测试浓度
| 种类 | 峰面积 | 药物浓度(μg/mL) | 残留量(μg/kg) |
| 磺胺醋酰 | 36384 | 14.31 | 4.77 |
| 磺胺吡啶 | 38647 | 18.88 | 6.29 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 30542 | 10.36 | 3.45 |
2.3精密度试验精密称取磺胺类药物标准品10mg，加乙腈适量使溶解，定容至100mL容量瓶中，制成质量浓度为100μg//mL的含磺胺类药物的标准溶液，摇匀，取该溶液重复进样3次，记录峰面积平均值，计算进样精密度，结果见表16。
表16-进样精密度试验结果
| 种类 | 峰面积 | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 31342 | 2.24 |
| 磺胺吡啶 | 32815 | 2.15 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 27137 | 2.34 |
由表16与表4的结果比较可知，对比例的RSD％均大于2％，本发明实施例1的精确度明显高于对比例。
2.4准确度——回收率试验采用阴性猪肉样品(磺胺类药物均无检出)进行测定，采用样品中添加标准溶液的方法，在同样的样品处理条件下对13种磺胺类药物进行加标回收率实验，结果见表17。
表17-回收率试验结果
| 种类 | 回收率(％) | RSD(％) |
| 磺胺醋酰 | 90.2 | 2.47 |
| 磺胺吡啶 | 91.3 | 2.28 |
| 磺胺甲氧哒嗪 | 92.4 | 2.31 |
由表17与表5的结果比较可知，对比例中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪3种磺胺类药物的平均回收率均低于93％以上，RSD％均大于2％，本发明实施例1的准确度明显高于对比例。
上述具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）制备磺胺类药物供试样品溶液和对照品溶液；
（b）采用高效液相色谱，对步骤（a）供试样品溶液中的磺胺类药物含量进行分析；
流动相：水相为0.05-0.15%乙酸溶液；有机相为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为35：65~65：35；
（c）以峰面积进行磺胺类药物的定量分析，依据对标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出磺胺类药物残留量；
所述对照品制作的标准曲线也是依照上述步骤（b），采用相同的试剂以
及参数，在相同实验条件下得出的。
2.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述流动相：水相为0.08-0.12%的乙酸溶液；有机相中甲醇和乙腈的体积比为45：55~60：40。
3.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述流动相梯度洗脱条件程序包括0-5min：有机相20%；5-13min：有机相20%-40%；13-22min：40%-90%；22-30min：90%-20%；30-35min：有机相20%。
4.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述步骤（b）中高效液相色谱的检测条件还包括：
流速：0.8~1.2mL/min；
柱温：28-32℃；
进样量：10μL。
5.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述供试样品溶液的制备包括以下步骤：
（i）提取：称取3-5g样品组织，加入15-20mL乙腈后混匀，超声提取2-5min，8000-10000g，离心4-6min，回收上清液；重复提取剩余物两次，合并上清液；合并后的上清液用氮气吹干，加入3-5mL乙腈溶解残渣，得到供试样品粗溶液；
（ii）净化：取3-5mL供试样品粗溶液，加入5-7mL正己烷混合均匀，离心弃去正己烷，分取2-3mL下层清液，氮气吹至近干，1-2mL流动相定容，得到供试样品溶液。
6.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述对照样品溶液采用乙腈稀释，配置成浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、2500μg/L和5000μg/L的系列混合标准品溶液。
7.根据权利要求1所述的检测多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于：所述供试样品溶液还包括空白样品溶液，空白样品溶液为流动相。
8.一种按照权利要求1-7任一项所述的检测多种磺胺类药物残留的方法在食品行业中监测磺胺类药物残留量中的应用。
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| CN105259277A (zh) * | 2015-07-23 | 2016-01-20 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 一种牛羊肉中18种磺胺类药物残留量的检测方法 |
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