CN110338060A - 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法 - Google Patents

一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110338060A
CN110338060A CN201910741451.3A CN201910741451A CN110338060A CN 110338060 A CN110338060 A CN 110338060A CN 201910741451 A CN201910741451 A CN 201910741451A CN 110338060 A CN110338060 A CN 110338060A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microspore
embryoid
regeneration plant
culture
orange colored
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910741451.3A
Other languages
English (en)
Inventor
盛小光
顾宏辉
虞慧芳
王建升
赵振卿
沈钰森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201910741451.3A priority Critical patent/CN110338060A/zh
Publication of CN110338060A publication Critical patent/CN110338060A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，将橙色花椰菜种质资源与普通白色花椰菜材料杂交的F1代作为供体材料，选择处于双核早期的花蕾，分离小孢子，培养游离小孢子至子叶胚状体形成，将子叶胚状体插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株，再生植株插于生根培养基中进行培养，将生根后的再生植株移入基质中，成活后进行小孢子再生植株倍性检测和花球鉴别，获得橙色花椰菜小孢子双单倍体DH(doubled haploid)再生植株。本发明方法获得纯合的橙色花椰菜小孢子DH再生植株，小孢子培养出胚率最高可达35个胚/蕾，胚状体的萌发率平均达45％。

Description

一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法
技术领域
本发明属于及植物组织培养技术领域，具体涉及一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法。
背景技术
花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为食用器官的一个变种，近年来市场上引入了多个栽培种，花球颜色丰富多样，除传统的白色花球外，还出现了绿色、紫色、橙色等类型，不仅营养各有特色，同时也非常吸引眼球，满足了人们对花色多样性的市场需求。
然而，近年来市场上的橙色花椰菜品种十分单一，品种种植表现参差不齐，橙色不够深，抗性和适应性较差，且缺少具有自主知识产权的优良橙色花椰菜新品种。究其原因，主要是对花椰菜橙色性状的遗传规律缺乏认识，同时花椰菜杂交选育需要7～8年，时间长，费时费工，阻碍了橙色花椰菜新品种选育的进程。
结合橙色性状的遗传特点，利用小孢子培养方法能在当代获得纯合的育种材料，翌年就可以获得杂交组合，缩短育种周期至3～4年。小孢子培养技术是花椰菜高效育种的手段之一，对提高橙色花椰菜育种效率和水平具有重要意义。小孢子培养技术较为成熟，花椰菜小孢子培养也有较多研究，但还存在很多难关需要攻克，主要是基因型限制。基因型已经成为小孢子胚胎是否发生和发生多少的关键性制约因素。橙色花椰菜是一类较难进行胚胎发生诱导的基因型之一，主要是橙色花椰菜资源少，橙色花椰菜抽薹开花期与普通花椰菜差别较大，同时橙色花椰菜花蕾发育不整齐，花粉少等问题，至今国内外未见有橙色花椰菜小孢子培养成功获得再生植株的报道。
本申请通过对橙色性状遗传规律进行研究，通过与高出胚率的花椰菜杂交，对其后代橙色花椰菜游离小孢子进行培养，成功获得一定数量的双单倍体(doubled haploid,DH)橙色再生植株，从中筛选出性状优良的单株可直接作为育种亲本进行杂交组合的配制，为培育具有自主知识产权的橙色花椰菜新品种提供技术和材料支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，通过与高出胚率花椰菜杂交，建立橙色花椰菜小孢子培养再生体系，以加快橙色花椰菜的育种进程与效率。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，包括以下步骤：
1)供体植株与花蕾的选择
将橙色花椰菜种质资源与小孢子培养胚胎发生好的普通白色花椰菜材料杂交，将其F1代作为供体材料，选择处于双核早期的花蕾；
2)花蕾小孢子的分离
将花蕾灭菌处理后，加入胚状体诱导培养基，制成悬浮液，过滤收集滤液，离心弃上清液，加入活性炭混合液混配成小孢子悬浮液；
3)小孢子胚状体的培养
将小孢子悬浮液置于恒温培养箱中暗培养至胚状体出现后，振荡培养至子叶形胚状体形成；
4)再生植株的分化与萌发
将子叶形胚状体插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株；
5)再生植株的生根培养与移栽
切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，进行生根培养，将生根后的再生植株移入基质中，覆盖薄膜保湿培养；
6)再生植株的倍性检测
取移栽成活再生植株的嫩叶，用倍性分析仪检测该再生植株的染色体DNA倍性，如检测为双单倍体(doubled haploid，DH)，即为DH再生植株。
进一步的，所述的供体材料来自橙色花椰菜资源与高小孢子出胚率花椰菜的杂交一代，其花蕾的花瓣与花药长度比在1.2～1.4之间。
进一步的，所述的胚状体诱导培养基为：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH 5.6～6.0，过滤灭菌。
进一步的，所述的活性炭混合液为：NLN-13液体培养基+1g/L活性炭，高温灭菌两次。
进一步的，按照0.1mL/10mL胚状体诱导培养基的比例加入活性炭混合液。
进一步的，小孢子胚状体的培养具体为：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶形胚状体形成。
进一步的，所述的胚状体分化培养基为：MS培养基+NAA0.01～0.06mg/L+BAP 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L，pH 5.6～6.0，高温灭菌。
进一步的，所述的生根培养基为：MS培养基+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH 5.8，高温灭菌。
本发明的有益效果为：
本发明首次建立橙色花椰菜DH再生植株生产的方法，橙色花椰菜小孢子培养的出胚率，最高可达35个胚/蕾，胚状体的萌发率，平均达45％，为培育具有自主知识产权的橙色花椰菜新品种提供技术和材料支撑，对加快橙色花椰菜的育种进程与效率具有实际意义。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的具体含量为：
1.1胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH6.0，过滤灭菌，其中NLN-13培养基配方见表1；
1.2胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.02mg/L+BAP 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 6.0，高温灭菌，其中MS培养基配方见表1；
1.3萌发、生根培养基：MS培养基+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8，高温灭菌；
表1NLN-13和MS培养基配方
2.橙色花椰菜小孢子再生植株的培养：
2.1供体植株与花蕾的选择：选择NPK营养均衡充足、植株与花蕾生长健康，无明显病情的橙色花椰菜植株作供体；选择刚开放1-2朵花的花序，并从中摘取花瓣与花药长度比为1.2，处于单核靠边期至双核早期的花蕾10个；
2.2花蕾灭菌：先用纯净水清洗花蕾3次，然后将其放入灭菌液(0.1％HgCl2+0.1％吐温20)中，摇床轻微摇晃(50-80rpm)进行表面消毒12分钟，再在超净台上用无菌水清洗4次后，备用；
2.3花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将灭菌后的花蕾置于无菌烧杯中，加入1mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾，然后再加入5mL相同培养基，搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清液；再加5mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基，调节至小孢子密度为3.0×106个小孢子/ml。再按0.1mL/10mL培养基比例加入活性炭混合液(配方见上)，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液分装于直径为6cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；
2.4小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于32.5℃恒温培养箱中，暗培养24小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养10-15天至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成；
2.5再生植株的分化与萌发培养：在超净台中将子叶型胚状体，平放于胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养15天至胚状体膨大并再生出新植株；
2.6再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2︰1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；
2.7再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partec PA倍性分析仪检测该再生植株的染色体DNA倍性；
用本例方法培养获得的橙色花椰菜小孢子再生植株共88株，经倍性检测，其中二倍体的再生植株共有40株，二倍体率占总株数的45.5％。
实施例2
本实施例中，选取20个双核早期花蕾，花瓣与花药长度比为1.3；花蕾灭菌后进行小孢子分离，然后加入胚状体诱导培养基，调节至小孢子密度为6.0×106个小孢子/ml。再按0.1mL/10mL培养基比例加入活性炭混合液(配方见上)，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/皿分装于直径为6cm的无菌塑料培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，将培养皿置于31℃条件下培养48小时；获得的胚状体置于胚状体分化培养基MS培养基+NAA0.05mg/L+BAP 0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8中，在每天16小时光照25℃条件下培养18天至胚状体再生出植株；NLN-13、MS培养基配方同表1；其余步骤工艺均同于实施例1。
实施例3
小孢子培养获得的二倍体再生植株为双单倍体，基因型完全纯合，经过花球颜色鉴别，将橙色较深的DH再生植株可作为育种亲本直接进行F1杂交种的配制。利用本实施方案获得DH橙色花椰菜材料，进行大量测配，培育出了具有自主知识产权的，并且在球色、球形及抗性等方面均表现优良的晚熟橙色花椰菜新品种‘浙橙松100’，经过近两年的示范与推广，市场反应良好，有望大面积生产应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供体植株与花蕾的选择
将橙色花椰菜种质资源与小孢子培养胚胎发生好的普通白色花椰菜材料杂交，将其F1代作为供体材料，选择处于双核早期的花蕾；
2)花蕾小孢子的分离
将花蕾灭菌处理后，加入胚状体诱导培养基，制成悬浮液，过滤收集滤液，离心弃上清液，加入活性炭混合液混配成小孢子悬浮液；
3)小孢子胚状体的培养
将小孢子悬浮液置于恒温培养箱中暗培养至胚状体出现后，振荡培养至子叶形胚状体形成；
4)再生植株的分化与萌发
将子叶形胚状体插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株；
5)再生植株的生根培养与移栽
切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，进行生根培养，将生根后的再生植株移入基质中，覆盖薄膜保湿培养；
6)再生植株的倍性检测
取移栽成活再生植株的嫩叶，用倍性分析仪检测该再生植株的染色体DNA倍性。
2.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的供体材料是橙色花椰菜资源与高小孢子出胚率花椰菜的杂交一代，其花蕾的花瓣与花药长度比在1.2～1.4之间。
3.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的胚状体诱导培养基为：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH 5.6～6.0，过滤灭菌。
4.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的活性炭混合液为：NLN-13液体培养基+1g/L活性炭，高温灭菌两次。
5.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，按照0.1mL/10mL胚状体诱导培养基的比例加入活性炭混合液。
6.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，小孢子胚状体的培养具体为：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶形胚状体形成。
7.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的胚状体分化培养基为：MS培养基+NAA 0.01～0.06mg/L+BAP 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L，pH 5.6～6.0，高温灭菌。
8.根据权利要求1所述的一种获得橙色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的生根培养基为：MS培养基+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH 5.8，高温灭菌。
CN201910741451.3A 2019-08-12 2019-08-12 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法 Pending CN110338060A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910741451.3A CN110338060A (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910741451.3A CN110338060A (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110338060A true CN110338060A (zh) 2019-10-18

Family

ID=68184672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910741451.3A Pending CN110338060A (zh) 2019-08-12 2019-08-12 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110338060A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617631A (zh) * 2009-08-13 2010-01-06 浙江省农业科学院 花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN101617630A (zh) * 2009-08-13 2010-01-06 浙江省农业科学院 青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN108207628A (zh) * 2018-01-08 2018-06-29 江苏省农业科学院 一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617631A (zh) * 2009-08-13 2010-01-06 浙江省农业科学院 花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN101617630A (zh) * 2009-08-13 2010-01-06 浙江省农业科学院 青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN108207628A (zh) * 2018-01-08 2018-06-29 江苏省农业科学院 一种青花菜游离小孢子培养获得再生植株的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. BHATIA ET AL.: "Optimizing protocol for efficient microspore embryogenesis and doubled haploid development in different maturity groups of cauliflower (B. oleracea var. botrytis L.) in India", 《EUPHYTICA》 *
文正华等: "花椰菜小孢子胚状体增殖及植株再生", 《中国瓜菜》 *
李念祖等: "花椰菜游离小孢子培养研究进展", 《长江蔬菜》 *
赵前程等: "花椰菜游离小孢子培养及植株再生研究", 《华北农学报》 *
顾宏辉等: "小孢子培养获得松花型花椰菜DH 再生植株", 《农业生物技术学报》 *
顾宏辉等: "早熟花椰菜小孢子高效胚胎发生及植株再生", 《浙江农业学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101617630B (zh) 青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN101317548B (zh) 黄瓜游离小孢子的培养方法
CN101617631B (zh) 花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法
CN104429952B (zh) 一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法
CN102228003B (zh) 一种羽衣甘蓝小孢子再生植株的培养方法
CN101946629B (zh) 一种快速获得杂种小麦纯系的方法
CN101773072B (zh) 一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法
CN102577962A (zh) 一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法
CN102239803B (zh) 一种青花菜小孢子再生植株的培养方法
CN102106258B (zh) 一种改良麦类作物耐低氮性状的方法
CN102144560B (zh) 一种获得芸薹属a基因组蔬菜新种质的方法及应用方法
CN103299896A (zh) 一种广适性耐抽苔春白菜游离小孢子的培养方法
CN110495393A (zh) 一种获得紫色花椰菜小孢子dh再生植株的方法
CN103392600B (zh) 一种促进羽衣甘蓝顽固基因型小孢子胚胎发生的方法
CN105230473A (zh) 一种耐盐玉米的创制方法
CN101401550B (zh) 诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基
CN102181424B (zh) 原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法
CN110301358A (zh) 一种获得宝塔花椰菜小孢子dh再生植株的方法
CN102362579B (zh) 一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法
CN110338060A (zh) 一种获得橙色花椰菜小孢子dh再生植株的方法
CN103782902A (zh) 一种借助60Co-γ射线诱变和小孢子培养创制大白菜突变体的方法
CN107047317A (zh) 一种诸葛菜胚状体和植株的培养方法
CN103798125A (zh) 一种获得十字花科蔬菜新种质的方法及其应用方法
CN106342680A (zh) 一种适用于多种基因型小麦小孢子培养的方法
CN107494261B (zh) 一种建立菜心悬浮细胞系的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191018

RJ01 Rejection of invention patent application after publication