CN101617630A - 青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：(1)培养基的配制；(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：1)供体植株与花蕾的选择；2)花蕾灭菌；3)花蕾预处理培养；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装；5)小孢子胚状体的培养；6)再生植株的分化培养；7)再生植株的生根与移栽及8)再生植株的倍性检测。本发明显著提高了青花菜小孢子培养的出胚率、出苗率与再生植株的二倍体率，由常规的80个胚/蕾、50％与50％左右，分别提高为120个胚/蕾、70％及70％以上，从而可提高青花菜的育种效率。该方法可在蔬菜育种单位或企业中推广应用。

Description

青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)又名西兰花、绿花菜，其营养丰富，位于十大抗癌蔬菜的前列，深受消费者的青睐。目前我国青花菜的生产用种绝大多数来自于国外，种子价格昂贵。因为常规选育青花菜杂交新品种及自交亲本的周期均较长，一般F₁代杂种纯合亲本选育需5～6代，再测配组合获得杂交新品种则需6～8年，而利用小孢子培养技术就能快速获得二倍体再生植株的亲本，从而大大加快育种进程，可缩短育种周期3至5年。

青花菜小孢子培养成功最早见于1991年Takahata Y，et al.Plant Science，1991，74：235-242；国内见于1997年张德双等，华北农学报，1999，14(1)：68-72，后来也有陆续报道，如张延国等，中国蔬菜，2005(6)：7-9；方淑桂等，福建农林大学学报(自然科学版)，2005，34(1)：51-55；陆瑞菊等，上海农业学报，2006，22(2)：1-4。但上述研究涉及的主要内容是如何提高由青花菜小孢子培养成胎胚的发生率及植株再生的效率，而并没有提及小孢子再生植株DNA的倍性及如何提高二倍体产生的方法。因为通过小孢子培养获得的青花菜再生植株有单倍体、二倍体、三倍体、四倍体及嵌合体等几种类型，其中除基因型差异外，一般纯合、性状稳定、后代不分离、育种所需要的二倍体再生植株的发生频率仅为50％左右，这就严重抑制了由小孢子培养育种的利用效率。因此，在青花菜育种上寻求一种能提高小孢子再生植株二倍体率的小孢子培养方法是具有重要意义的。

发明内容

本发明目的是，针对现有青花菜小孢子培养技术体系中所存在的出胚率低，再生植株二倍体率低的缺陷，提供一种可提高青花菜小孢子再生植株二倍体率的培养方法，并以该高二倍体率的再生植株为育种亲本，进而达到提高青花菜育种效率的目的。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升所含的重量为：

1)花蕾预处理培养基：B₅液体培养基+0.05-0.2％秋水仙碱+1-3％DMSO，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；

2)胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；

3)胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.05-0.2mg/L+BAP 0.5-2.0mg/L+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂6-10g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；

4)生根培养基：MS培养基+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂8-12g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；

(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：

1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的青花菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；

2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20100μL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；

3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于4mL花蕾预处理培养基上，在4℃下培养2-4d；

4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅拌成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按850-1000rpm离心3-5分钟，弃上清液后再加10mL胚状体诱导培养基继续离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1个花蕾后，再按每4mL培养基中加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖2-5g/L+1g/L活性炭配制、灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6mm或9mm、塑料或玻璃的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；

5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至肉眼可见细胞团出现；再在25℃黑暗下45rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成并成熟；

6)再生植株的分化培养：将培养皿置超净台上从中选取子叶型成熟胚状体，将其胚根插入胚状体分化培养基中，在每天光照16小时、25℃下培养1-3周至形成愈伤组织；再按大小将愈伤组织切成3-5块放置相同培养基与条件下培养，直至分化、长出再生植株；

7)再生植株的生根与移栽：切取正常的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；3周后将生根再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；

8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partec PA倍性分析仪检测各再生植株的DNA倍性，并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本用于育种。

本发明的有益效果是：

一、采用本发明的培养方法明显提高了青花菜小孢子培养的出胚率，最高达120个胚/蕾；而对照方法的出胚率最高仅为80个胚/蕾。

二、本发明提高了胚状体的出苗率，平均达70％；对照胚状体的出苗率平均为50％。

三、本发明显著提高了小孢子再生植株的二倍体率，平均二倍体再生植株数占总植株数的70％以上，而对照二倍体的发生频率一般为50％左右。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：(青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法1)

培养方法按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含的重量为：

1)花蕾预处理培养基：B₅液体培养基+0.1％秋水仙碱+2％DMSO，白糖130g/L，pH5.8，过滤灭菌；

其中，B₅液体培养基配方见表1；

2)胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基，蔗糖130g/L，pH5.8，过滤灭菌；

其中，NLN-13液体培养基配方见表1；

3)胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.05mg/L+BAP1.0mg/L，白糖25g/L，琼脂8g/L，pH5.8，高温灭菌；

其中，MS培养基配方见表1；

表1    NLN-13、B₅及MS培养基的配方

4)生根培养基：MS+白糖30g/L，琼脂10g/L，pH6.0，高温灭菌；

(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：

1)供体植株与花蕾的选择：选择抽苔开花时生长在5-25℃、日光照14小时、NPK营养均衡充足的植株与花蕾生长健康的青花菜作为供体植株；并从中选择刚开花的主花序或侧花序，摘取处于单核中晚期的花蕾10个，判别依据是花蕾中花瓣与花药长度比为0.8；

2)花蕾灭菌：先用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20 100μL配制成灭菌液；将花蕾放入含20mL灭菌液的培养瓶中，置摇床上按80rpm振荡表面消毒18分钟，再在超净台上连续用无菌水清洗5次后，备用；

3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于含花蕾预处理培养基4mL的培养皿中，parafilm膜封口，放入冰箱冷藏室4℃条件下培养3d；

4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上，将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基后，用平头玻棒压碎花蕾、搅拌成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于50mL离心管中，按1000rpm离心3分钟，弃上清液后再加10mL胚状体诱导培养基按1000rpm离心3min后弃上清液；再加入胚状体诱导培养基40mL，使每4mL培养基中含有1个花蕾所含的小孢子量后，再按0.05mL/4mL培养基的比例加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖3g/L+1g/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液0.5mL，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/每皿分装于直径为6mm的无菌塑料培养皿中，共10皿，加盖后用parafilm膜封口，备用；

5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31℃恒温培养箱中，暗培养72小时；后转入25℃恒温培养箱，继续暗培养1-2周至肉眼可见细胞团出现；再在25℃黑暗条件下45rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成并成熟；

6)再生植株的分化培养：在超净台中，选取子叶型胚状体，将其胚根插入胚状体分化培养基中，在每天光照16小时、25℃下培养1-3周至形成愈伤组织；再按大小将愈伤组织切成3-5块放置于相同的培养基与条件下培养，直至分化长出再生植株；

7)再生植株的生根与移栽：切取萌发的有正常生长点的再生植株，插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；3周后，将生根后的再生植株移入含泥炭∶珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，用塑料膜覆盖保湿在25℃条件下培养1周；

8)再生植株的倍性检测：从每株移栽成活再生植株上取嫩叶1cm²，经切割染色后用德国产partec PA倍性分析仪检测再生植株的DNA倍性，从中选取二倍体的再生植株种植于相应容器中，即可作为青花菜育种用亲本材料。

用本例方法培养获得的青花菜小孢子再生植株共658株，经倍性检测，其中二倍体的再生植株数共有472株，二倍体率占总株数的71.7％。

实施例2：(青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法2)

本实施例中，花蕾预处理培养基为B₅液体培养基+蔗糖130g/L+0.05％秋水仙碱+3％DMSO，pH为6.0；选取10个单核中期花蕾，其花瓣与花药长度比为0.6；花蕾在花蕾预处理培养基培养皿中于冰箱冷藏室4℃条件下培养4d；将预处理过的花蕾进行小孢子分离，按850rpm离心5分钟，弃上清，加入40mL胚状体诱导培养基，pH为5.6，并加入0.5mL由NLN-13液体培养基+琼脂糖5g/L+1g/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/每皿分装于直径为6mm的无菌塑料培养皿中，共10皿，加盖后用parafilm膜封口；将培养液置于33℃条件下培养1d；获得的胚状体置于胚状体分化培养基MS+NAA 0.1mg/L+BAP 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L，pH为6.0中；后按大小将愈伤组织切成3-5块放置于相同的培养基与条件下培养，直至分化长出再生植株，再将再生植株移入生根培养基MS+蔗糖25g/L+琼脂12g/L，pH5.6中进行生根培养；NLN-13、B₅及MS培养基的配方同表1，其余步骤、工艺同于实施例1。

实施例3：(青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法3)

本实施例中，花蕾预处理培养基为B₅液体培养基+蔗糖130g/L+0.2％秋水仙碱+1％DMSO，pH为5.6；选取10个单核中晚期花蕾，其花瓣与花药长度比为1.0；花蕾在上述含花蕾预处理培养基培养皿中冰箱冷藏室4℃条件下培养2d；将预处理过的花蕾进行小孢子分离，按900rpm离心4分钟，弃上清，加入40mL胚状体诱导培养基，pH6.0后，再加入0.5mL由NLN-13液体培养基+琼脂糖2g/L+1g/L活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/每皿分装于直径为6mm的无菌玻璃培养皿中，共10皿，加盖后用parafilm膜封口；将培养液置于32.5℃条件下培养2d；获得的胚状体置于胚状体分化培养基MS+NAA 0.2mg/L+BAP 0.5mg/L+白糖20g/L+琼脂6g/L，pH为5.6中；后按大小将愈伤组织切成3-5块放置于相同的培养基与条件下培养，直至分化长出再生植株，再将再生植株移入生根培养基MS+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.8中进行生根培养；NLN-13、B₅及MS培养基的配方同表1，其余步骤、工艺同于实施例1。

实施例4：(二倍体育种亲本材料在青花菜育种中的应用)

对实施例1、2、3中移栽成活的二倍体再生植株进行综合农艺性状的观察记载，将农艺性状好的单株在开花期，进行大量的杂交、测配组合；其中，b07105株型中，坐球高，球形半圆，球略发紫，自交不亲和，于来年3月1日始花；b07312株型小，坐球低，球形半圆，自交不亲和，于来年2月20日始花；杂交后50天收获杂交种子，并于当年8月播种进行杂交组合评价；b07105与b07312的杂交F₁代B0115植株生长整齐，单球均重0.435kg，球形半圆，球略发紫，花球商品性好。

Claims (1)

1、青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含的重量为：

1)花蕾预处理培养基：B₅液体培养基+0.05-0.2％秋水仙碱+1-3％DMSO，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；

2)胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；

3)胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.05-0.2mg/L+BAP 0.5-2.0mg/L+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂6-10g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；

4)生根培养基：MS培养基+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂8-12g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；

(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：

1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的青花菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；

2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20100μL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；

3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于4mL花蕾预处理培养基上，在4℃下培养2-4d；

4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅拌成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按850-1000rpm离心3-5分钟，弃上清液后再加10mL胚状体诱导培养基继续按同法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1个花蕾后，再按每4mL培养基中加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖2-5g/L+1g/L活性炭配制、灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6mm或9mm、塑料或玻璃的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；

5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至肉眼可见细胞团出现；再在25℃黑暗下45rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成并成熟；

6)再生植株的分化培养：将培养皿置超净台上从中选取子叶型成熟胚状体，将其胚根插入胚状体分化培养基中，在每天光照16小时、25℃下培养1-3周至形成愈伤组织；再按大小将愈伤组织切成3-5块放置相同培养基与条件下培养，直至分化、长出再生植株；

7)再生植株的生根与移栽培养：切取正常的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；3周后将生根再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；

8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partec PA倍性分析仪检测各再生植株的DNA倍性，并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本用于育种。